Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bygge opp en høy gjennomstrømming Screening plattform å vurdere heterogenitet HER2 genet forsterkning i brystkreft

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Heterogen distribusjon av HER2-positiv celler kan observeres i et delsett av brystkreft og genererer klinisk dilemmaer. Her introduserer vi en pålitelig og kostnadseffektiv protokoll for å definere kvantifisere og sammenligne HER2 intra-svulst genetisk heterogenitet i en stor serie heterogeneously behandlet brystkreft.

Abstract

Målrettet terapi mot menneskelig epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2) har radikalt forandret utfallet av pasienter med HER2-positiv brystkreft. Et mindretall av tilfellene viser imidlertid en heterogen fordeling av HER2-positiv celler, som genererer store klinisk utfordringer. Hittil har foreslått ingen pålitelig og standardiserte protokollene for karakterisering og kvantifisering HER2 heterogene gene forsterkning i store kohorter. Her presenterer vi en høy gjennomstrømming metodikk for å evaluere samtidig HER2 over ulike topografiske områder på flere brystkreft. Spesielt illustrere vi laboratorium prosedyre for å lage forbedret vev microarrays (TMAs) omfatter en målrettet tilordning av tumorer. Alle TMA-parameterne er spesifikt optimalisert for sølv i situ hybridization (SISH) av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) bryst vev. Immunohistochemical analyse av de prognostiske og prediktiv biomarkers (dvs., ER, PR, Ki67 og HER2) skal utføres ved hjelp av automatiserte prosedyrer. En tilpasset SISH protokollen er implementert for å tillate en høy kvalitet molekylær analyse over flere vev som gjennomgikk forskjellige fiksering, behandling og lagring prosedyrer. I denne studien gir vi bevis på prinsippet-at spesifikke DNA-sekvenser kan være lokalisert samtidig i forskjellige topografiske områder av flere og heterogeneously behandlet brystkreft ved hjelp av en effektiv og kostnadseffektiv metode.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HER2 er en proto-oncogene som overexpressed og forsterket i 15-30% av alle invasiv bryst kreft1,2. HER2 overuttrykte utledes av tilstedeværelsen av > 10% celler med sterk membran immunohistochemical (IHC) flekker (3 +), mens gene forsterkning kan vurderes ved HER2/centromere er ≥2 eller genet kopi er ≥6, på telling på minst 20 celler av i situ hybridisering (ISH)3.

Intra-svulst genetisk heterogenitet har blitt mye beskrevet i brystkreft, være en potensielt uønskede bidragsyter til biomarkers evaluering og behandling respons4. Etter College av amerikanske patologer (CAP), HER2 heterogenitet finnes hvis HER2 forsterkes i > 5% og < 50% av infiltrere tumor celler5. Dessverre faktiske forekomsten av HER2 romlige heterogene i brystkreft er omstridt blant patologer, med noen forfattere innledningsvis at det er en svært sjelden hendelse og andre tyder på at opp til 40% av tilfellene er HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Til tross for de biologiske mekanismene som understøtter denne tilstanden er ikke ennå fullt ut avklart, prognostiske og klinisk virkningene av intra-svulst HER2 heterogenitet er avgjørende for breast cancer pasienter11.

Nylig, lyse-feltet molekylær teknikker, som kromogent ISH (CISH) og sølv ISH (SISH), har dukket opp som pålitelig metoder å oppdage HER2 heterogenitet i FFPE vev, med noen fordeler sammenlignet med fluorescerende ISH (fisk)12. Dessverre fortsatt bulk analyse av enkelt tilfeller upraktisk i stor-kohort forskningsstudier. Flere grupper har antydet at kombinasjonen av histochemistry, IHC og ISH med TMA teknologier kan representere en verdifull strategi i studiet av kreft, biologi,13,,14,,15,,16. Med denne vidt vedtatt metoden kan vevsprøver fra pasienter analyseres samtidig, minimere vev og reagenser ansatt og dermed fremme uniform analyse av en stor rekke tilfeller14. Men er ingen protokoller tilgjengelig for samtidig høy gjennomstrømming molekylær karakterisering av flere vevsprøver som gjennomgikk ulike behandling reagenser, fiksering ganger og bevaring metoder ansatt, slik som arkivering blokker.

Gitt prognostiske og klinisk implikasjonene av HER2 romlige heterogenitet i brystkreft, utviklet vi en integrert molekylær plattform for å vurdere det i stor serie heterogeneously behandlet tilfeller. Her portrettere vi laboratorium strategier for å generere og analysere den intra-svulst heterogenitet HER2 forsterkning i høy avkastning TMAs for brystkreft med SISH. Følgende protokollen er utviklet for svulster måle > 5 mm (> pT1b ifølge TNM 2017)17. For mindre lesjoner anbefaler vi utføre analyser på hele føljetong deler. Vår prosedyre tillater samtidig IHC og SISH analyse av opptil 30 brystkreft, omfatter et gjennomsnitt på 6 forskjellige områder (range 4-8) for hvert enkelt tilfelle. Helt, 180 vev prosessorkjerner 1 mm i diameter, med 500 µm mellom kjerner og 2 mm mellom rutenettet og kanter genereres for hver TMA-blokk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne studien ble godkjent av den Institutional Review Boards fra IRCCS Ca' Granda Foundation, Policlinico Hospital, Milano, Italia.

1. valg av pasienter og vevsprøver

  1. Hente arkivering lysbilder av alle tilfeller skal analyseres, inkludert alle tilgjengelige hematoxylin og eosin (H & E) og IHC lysbilder fra den opprinnelige diagnosen, og hvis en H & E på matchet ikke-neoplastic brystvev (f.eks, kirurgisk marg) .
  2. Utføre små vurderinger.
    Merk: For denne oppgaven bør minst to patologer med erfaring i bryst patologi diskutere diagnostiske lysbildene og løse uenigheter collegially. Bruke en konvensjonell mikroskop eller telepathology verktøy (favorisere sistnevnte i multicentric studier). Eventuelt utelate alle discordant tilfeller.
    1. Utføre histologiske re klassifiseringen av alle saker etter den nyeste utgaven av Verdens helseorganisasjon (WHO) klassifisering av tumorer av brystet18.
    2. Kontroller at den normale vev for hvert tilfelle, hvis den finnes i arkivering klinisk utvalgene, omfatter minst ett ikke-neoplastic terminal ductal-lobular enhet.
    3. Identifisere alle neoplastic områder som viser heterogene fargemaskin, arkitektur eller IHC funksjoner ved hjelp av lys-feltet mikroskop (skal utføres i fellesskap av en patologen og technician(s) som skal bygge på TMAs).
  3. Markere de diskrete topografiske områdene med en markør på glass lysbilde eller med riktig verktøy på en digital lysbildet programvare (figur 1A).
  4. Basert på de merkede lysbildene, hente den tilsvarende FFPE blokker fra arkivene.
    Merk: for å optimalisere TMA konstruksjon, unngå vev uttømming og bevare TMA punch strukturelle integritet, saker med < 1 mm tykke gjenværende vev bør utelukkes.

2. Konstruer og TMAs basert på Kononen teknikken

  1. Opprette og åpne en ny regnearkfil omfatter postene av forskjellige i hvert enkelt tilfelle. Inkluderer følgende data på separate kolonner, som eksemplifisert i tabell 1: sak ID, blokk-IDen, område-IDen, vev type (f.eks, normalt vev, invasiv komponenten histotype, i situ komponenten histotype), topografi (f.eks, svulst kjerne, invasiv foran), morfologi (f.eks, nuclear grade, arkitektur, mitoses, fargemaskin funksjoner), biomarkers status (dvs., østrogenreseptor (ER), progesteron reseptoren (PR), Ki67 og HER2), og alle andre IHC funksjoner tilgjengelig.
    1. Lagre dokumentet.
  2. Opprett et TMA-prosjekt.
    1. Installer og åpne TMA designer programvare.
    2. Definere TMA mottakeren block(s): tilgang gjennom menyen Fil > Ny > blokker eller ved å bruke CTRL + B.
    3. Klikk i det første feltet fyll eller trykk TAB, og skriv inn dimensjonene av parafin blokken: bredde 35 (mm), høyde 20 (mm). Type "2" som "margin" verdi (dvs., avstanden fra parafin kant i mm) (figur 1B). Lagre dataene ved å klikke riktig. Den nye malen mottaker blokk er nå lagret og klar til å brukes i nye vev utvalg maler.
    4. Opprette et vev matrise prosjekt: tilgang til fil > Ny > vev matrise eller ved å bruke CTRL + T.
    5. Fylle inn navnet vev-matrise, kommentarer og forfatter, og klikk "neste". Klikk på "import"-ikonet, Velg malfilen mottaker blokk opprettet, og klikk "neste".
    6. Velg 1 mm som størrelsen ved å klikke runde. Velg 500 µm som spot avstanden som er avstanden mellom to sentre av nærliggende steder. Klikk på Kalkulator-symbolet til å beregne antall plasser opprettet, som bør være 231. Klikk "neste".
    7. Definere spot nummerering modus ved å klikke én gang på den. Klikk på knappen "Definer" for å lage rutenett og delrutenett. Slette central-linjen (linje 6) og 8 og 15. Opprettholde 3 stedene i linje 1 til orientering. Den endelige kartet skal omfatte totalt 183 flekker, som vist i figur 2.
    8. Definere listen typer vev: tilgang gjennom menyen Fil > Ny > listen typer vev eller ved å bruke CTRL + L.
    9. Sett inn vev beskrivelsene tidligere definert. Trykk pil ned eller klikk på + for å legge til en linje.
    10. Definere prosjektet: tilgang gjennom menyen Fil > Ny > økte prosjekt eller bruke CTRL + s.
    11. Fylle inn navnet på vev matrise, kommentarer og forfatter, og klikk "neste". Importere regnearkfilen, listen typer vev og vev array modell opprettet ved å klikke riktig ikonene.
    12. Klikk "select all" og definere antall plasser for hver vev; Klikk på "match"-knappen for å bruke innstillingene. En tabell over antall kjerner som skal samples og overført til mottakeren blokker i dette prosjektet vises. Lagre prosjektet og lukker programmet.
  3. Forberede acceptor block(s) (figur 1B).
    1. Fylle renset metall støpeformer med elastisk parafin på 65 ° C.
    2. La parafinblokkene avkjøles til romtemperatur over natten i metall formene.
    3. Pakk ut parafinblokkene fra metall formene. Hvis sprekker oppstår, forkaste blokken og gjentar trinn 2.3.1-2.3.3.
  4. Konstruere TMA bruker en automatisert eller halvautomatisk arrayer19.
    1. Hente alle valgte FFPE blokker og de tilsvarende H & E delene med merknader.
    2. Slå på arrayer og sett acceptor block(s) på arrayer karusellen.
    3. Åpne arrayer kontroll stasjon programvaren, klikk på "Ny vev Array" og laste inn prosjektet opprettet (figur 1 c).
    4. Klikk "Fortsett" og velg plasseringen av donor block(s) fra menyen.
    5. Definerer posisjonen til hver mottaker blokk: Bruk piltastene for å flytte laserlys og plasser den over kanten øverst til venstre på parafinen av mottakeren blokken.
    6. Klikk "neste" og gjenta for loddrett justering.
    7. Klikk "neste" for å automatisk lage et hull i tidligere definerte koordinaten av mottakeren (acceptor) blokken.
    8. Tømme slag.
    9. Posisjonere donor blokken for prøvetaking og fjerne en vev kjerne fra tidligere kommenterte området av interesse.
    10. Sett inn donor vev kjernen i hullet i mottakeren (acceptor) blokken.
    11. Fjern donor blokken fra arrayer.
    12. Gjenta trinn 2.4.5-2.4.11 til TMA er fullført.
  5. Legg vev av nygenererte TMA blokken i et sterilt tomt lysbilde og plassere dem i lab ovnen ved 45 ° C i 5 minutter.
  6. Trykk forsiktig blokken av lysbildet, 5 s å flate vev kjernene. Gjenta en gang (for totalt 2 ganger).
  7. Fjerne TMA blokken med lysbildet fra ovnen, snu dem og forsiktig koble blokken fra lysbildet.
  8. Dekke TMA vevet overflaten med et tynt lag av elastisk parafin på 65 ° C.
  9. La TMA blokken ved romtemperatur for 2T.
  10. Overføre TMA blokken ved 4 ° C i 24 timer.
    Merk: TMA blokken kan lagres på 4 ° C før utmattelse.

3. histochemical og Immunohistochemical analyser

  1. Kuttet TMA deler.
    1. Plass TMA acceptor block(s) med parafin-side på-10 ° C underlag for 10 min å chill parafinen.
    2. Fyll en floatation bad med ultrapure vann og setter varmen til 38 ° C.
    3. Plasser et nytt blad på en roterende mikrotom og sett blokken inn mikrotomen chuck så voks blokken ansikter bladet og justeres loddrett.
    4. Tilnærming blokken nøye med blad og kutte noen tynne deler for å sikre at plasseringen er riktig. Juster om nødvendig.
    5. Klipp 3 µm tykke deler.
    6. Ta opp snittene ved hjelp av pinsett og flyte dem på bad vannflaten.
    7. Velg avsnittene ut vannbad på regelmessig og IHC/ISH glass lysbilder.
    8. Legg lysbildene på en rack og lagre dem i ovnen på 45 ° C over natten.
      Merk: Når forberedt, delene TMA bør være farget innen 24 timer.
  2. Utføre histochemical flekker (H & E) med en autostainer.
    1. Sett inn lysbildene i autostainer rack og legg dem på 60 ° C i 10 min.
    2. Åpne mateskuffen autostainer og brettet med TMA lysbilder i en av load stasjoner med standard H & E clip vender utover.
    3. Når skuffen er lukket, klippet oppdages automatisk av systemet og følgende protokollen startes: ovn stasjonen på 37 ° C (6 min), xylen (2 min), xylen (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 95% (2 min), etanol 95% (2 min) , destillert vann (4 minutter), Carazzi's hematoxylin (9 min), lavt trykk vann (2 min), eosin 1% (1 min), lavt trykk vann (2 min), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 100% (15 s), etanol 100% (15 s) , xylen (30 s), xylen (30 s).
    4. Fjerne brett fra skuffen og montere lysbildet med en cover slip.
      1. Samle en dråpe montere med en pipette, og sette den på en ytterkant dekk lysbildet.
      2. Plasser de våte side av cover slip på lysbildet og la fjellet tørke 30 min.
  3. Utføre IHC flekker for ER, PR, Ki67 og HER2 bruker en automatisert immunostainer.
    Merk: Før du starter en flekker kjøre, starter opp systemet, sjekke forbruksvarer reagensflaskene (Tabell for materiale) og avfall beholdere.
    1. Plass TMA lysbildene analysere ved 60 ° C i 10 min.
    2. Start immunostainer instrument og programvare.
    3. Klikk protokoller på visningen hjem, og klikk deretter Opprett/Rediger protokoller.
    4. Velg standard DAB (3, 3-diaminobenzidine) IHC prosedyre for å endre den grunnleggende malen.
    5. Flagg "Deparaffinization" i listen boksen og angi middels temperaturen på 72 ° C.
    6. Flagge cc1 avsløre løsningen, stille Medium temperaturen på 95 ° C og inkubasjon tiden 36 minutter.
    7. Flagge boksen primære antistoff, sette inn IDen til ER innebygd dispenser (instrument programvaren gjenkjenner dispenser på reagens karusellen) og stilles inkubasjon 16 minutter.
    8. Flagge boksen Counterstaining, Velg Hematoxylin jeg, og sett den inkubasjon tiden 12 minutter.
    9. Klikk "Lagre som" og navn protokollen.
    10. Gjenta trinn 3.3.3-3.3.9 for gjenværende antistoffer ved hjelp av følgende primære antistoffer inkubasjon tider: PR 16 min, Ki67 16 min og HER2 12 min. bruker pre utvannet klar til bruk (RTU) antistoffer.
    11. Klikk Opprett etiketten på visningen hjem.
    12. Klikk knappen protokoller og Legg ER, PR, Ki67 og HER2 protokollene for hver av TMA analysere.
    13. Klikk Lukk /Print.
    14. Som etikett malen vises, angi IDene som TMA for etiketten.
    15. Klikk Skriv ut for å skrive ut etikettene og deretter bruke dem på TMA lysbildene.
    16. Klikk ikonet instrument og angi oppstartsmodus instrument som "Klar".
    17. Åpne Shack som dekker reagenser karusellen, plassere oppdagelsen system og primære antistoffer, Lukk panseret.
    18. Klikk knappen foran på en lysbilde skuff å åpne den, laste TMA lysbildene, og Lukk skuffen ved å klikke den samme knappen.
    19. Angi oppstartsmodus instrument som "går" og følg instruksjonene.
    20. På slutten av det løpe, losse TMA lysbilder ved å trykke på åpne alle skuffer med fullført lysbilder-knappen på apparatet skyve kontroll og skyll varmt dem i såpevann for å fjerne resterende reagenser.
    21. Vask lysbildene under lavt trykk kaldt vann, tørke TMA lysbildene og et glass dekkglassvæske gjelder hvert lysbilde.
  4. Utføre IHC analyse ER, PR og HER2 etter amerikanske samfunn av Clinical onkologi (ASCO) / CAP retningslinjer og Ki67 i henhold til anbefalingene av den internasjonale Ki67 i brystkreft arbeidsgruppe (tabell 2).
    Merk: Denne analysen bør utføres separat i diskret vev flekker av en patologen en opplevelse i bryst patologi.
    1. Vurdere ER uttrykket som positiv hvis ≥ 1% av svulst celle kjerner immunoreactive20,21,22,23.
    2. Vurdere PR uttrykket som positiv hvis ≥ 1% av svulst celle kjerner immunoreactive20,21,22,23.
    3. Vurdere HER2 uttrykket som: a) score 3 + Hvis omkrets membran flekker som er komplett og intens, b) scorer 2 + Hvis omkrets membran flekker er ufullstendig og/eller svak/moderat og > 10% av invasiv kreftceller eller fullstendig og omkrets membran flekker er intens og ≤ 10% av invasiv kreftceller, c) score 1 + Hvis ufullstendig membran flekker er svak/knapt merkbar og > 10% av invasiv kreftceller, d) negative hvis ingen flekker eller membran flekker er ufullstendig og svak/knapt merkbar i ≤ 10% av invasiv svulst cellene3,24.
    4. Vurdere Ki67 indeksen prosentandelen av celler med kjernefysiske flekker i minst 1000 neoplastic celler tilfeldig valgt over 10 høyeffekts felt (forstørrelse, 400 X)25.

4. SISH analyse av HER2

  1. Kuttet TMA deler (gjenta trinn 3.1).
  2. Utføre SISH for HER2 bruker en automatisert immunostainer.
    1. Plass TMA lysbildene analysere ved 60 ° C i 10 min.
    2. Start immunostainer instrument og programvare.
    3. Klikk protokoller på visningen hjem, og klikk deretter Opprett/Rediger protokoller.
    4. Velg "U Dual ISH CKT" fremgangsmåten til å endre den grunnleggende malen.
    5. Flagg "Tørking varm" i listen boksen og Still inn temperaturen på 63 ° C i 20 min.
    6. Flagg "Celle condition" i listen for deretter "celle condition CC2", og Still inn temperaturen på 86 ° C og inkubasjon tiden 4 minutter.
    7. Flagget CC2 Mild (Cycle 1), Standard (syklus 2) og utvidet (syklus 3) for 8 min, 12 min og 8 min, henholdsvis.
    8. Flagg "ISH-Protease 3" i boksen listen og stilles inkubasjon 16 minutter.
    9. Velg sonder HER2DNP og CHR17DIG og angi inkubasjon tiden på 6 h.
    10. Angi vask på 76 ° C i 8 min.
    11. Angi SISH multimer (SIL ISH DNP HRP) inkubasjon tiden 32 minutter.
    12. Angi sølv chromogen (SIL ISH DNP CHRC) inkubasjon tiden 4 minutter.
    13. Angi den røde multimer (rød ISH grave AP) inkubasjon tiden 24 minutter.
    14. Angi den røde chromogen (rød ISH grave FR) inkubasjon tiden på 8 min.
    15. Flagg "Counterstaining" i listen boksen Velg "HEMATOXYLIN II", og stilles inkubasjon 8 minutter.
    16. Flagg "Etter Counterstaining" i listen boksen, velg "BLUING REAGENS" og stilles inkubasjon 4 minutter.
    17. Gjenta trinnene fra 3.3.11-3.3.15 (Velg endret U Dual ISH CKT protocol).
    18. Åpne hette som dekker reagenser karusellen, vask og ISH detection system, og deretter lukke panseret.
    19. Gjenta fra 3.3.18-3.3.21.
  3. Utføre SISH analyser for HER2: vurdere HER2 genet forsterkning som positivt om HER2/CEP17 forholdet er ≥2.0 med en gjennomsnittlig HER2 kopi nummer ≥4.0 signaler per celle, og negativ Hvis HER2/CEP17 forholdet er < 2.0 med en gjennomsnittlig HER2 kopiere nummer < 4.0 signaler/mobiltelefon3,24.
    Merk: Ligner IHC, denne analysen bør utføres separat i diskret vev flekker av en patologen med erfaring i bryst patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Samlet, 444 invasiv bryst kreft ble innlemmet i 15 TMAs spesielt optimalisert for ISH analyser. Blant de 2,664 stedene samplet, 2,651 (99,5%) ble representert av tidligere valgte områdene og derfor vurdert mottakelig for senere analyser. Intra-svulst heterogenitet identifiserte IHC og SIH, med særlig fokus på heterogene distribusjonen av HER2-positiv kloner innen forskjellige topografiske tumorer. Tabell 3 viser biologiske egenskapene til sakene analysert, med fokus på statusen ER, PR, Ki67 og HER2 innen forskjellige histotypes. Spesielt 18% av tilfellene ble funnet for å vise HER2-positiv celler i > 10% av kreftceller, og derfor matchet egenskapene for HER2 positivitet vurdering. Interessant, er denne verdien nærmere den nedre enden av rapporterte forekomsten utvalg av HER2-positiv brystkreft. På den annen side, var statusen HER2 variabel i separate områder av både HER2-positiv og HER2-negativ brystkreft (Figur 3 Tabell 4), gir ytterligere tro på forestillingen om at brystkreft er en svært heterogen sykdom på genomic nivået. The failure rate av SISH analysen var 0,8%, med totalt 2629/2,651 stedene der dinitrophenol-merket sonden bundet til målet sekvenser.

Figure 1
Figur 1 : Representasjon av hjørnestein faser i realisering av en høy gjennomstrømming plattform for analyse av HER2 heterogenitet i store kohorter av brystkreft. (A) utvalg av områder å prøve bør inkludere identifikasjon og høydepunkt alle områder med fargemaskin, arkitektur eller IHC heterogenitet. (B) en av de viktigste trinnene i denne fremgangsmåten er etableringen av en høy kvalitet acceptor blokk, gitt at selv en mikroskopisk sprekk kan antyde konsistensen av påfølgende i situ hybridisering analysene. (C) det er viktig å ansette en digitalt guidede arrayer med en 1 mm-diameter nål å konstruere høy dekkevne TMA basert på Kononen teknikken. (D) etableringen av TMA prosjektet bør starte fra definisjonen av dimensjonene og grenser til TMA. (E) alle IHC og ISH analyser bør utføres med digitale patologi verktøy, for å navigere raskt over TMA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Planimetric representasjon av TMA realisert for denne protokollen. Totalt 180 flekker av 1 mm diameter, 500 µm hverandre, gir en optimal i situ hybridisering. Tettere TMAs gir uproduktive resultater med hensyn til kvaliteten og ensartethet av reaksjoner over alle flekker, med en høyere strykprosent på enkelt-spot basis. Merk "orientering" flekker i topp - og midt-venstre i rutenettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representative micrographs viser sølv i situ hybridisering analyse av en HER2-heterogene brystkreft. I dette paradigmatiske to distinkte flekker av høyverdig invasiv brystkreft av ingen spesiell type (BR_121) viste ulike resultater i form av HER2 genet (svart) forsterkning sammenlignet centromeric opplisting sonden 17 (rød). Spesielt ett område tilhører svulst kjernen og viser cytokeratin 7 uregelmessig flekker mønster var HER2 forsterket (A), mens en enkelt sted fra invasiv foran (dvs., svulst kanten) vises en vill-type HER2 mønster (B). Skalere barer = 50 µm (20 µm i senkninger). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Case-ID Blokk-IDen Område-IDen Vev Topografi Morfologi ER PR Ki67 HER2 Andre IHC funksjoner
BR_121 A5 en Normal Kirurgisk marg
BR_121 A1 en NST Svulst kjernen G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Svulst kjernen G3 CK7 +/-
BR_121 A3 en NST Svulst kjernen Mucinous stroma 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Invasiv foran Stålrør 100 100 35 2 +
BR_121 A4 en NST Invasiv foran G3
BR_121 A3 c DCIS (EIC +) Tilstøtende til invasiv foran Høyverdig 100 100 45 2 +

Tabell 1: representant rekord av ett tilfelle inkludert i studien. Denne saken (BR_121) var en høyverdig invasiv karsinom av ingen spesiell type med fokal myxoid stroma, viser en mindre rørformede komponent på utkanten av lesjonen, og fokus-uregelmessig tap av CK7 immunoexpression. De immunohistochemical funksjonene, inkludert biomarkers rapportering, refererer til analyser utført på diagnosetidspunktet. NST, invasiv karsinom av ingen spesiell type; DCIS, ductal karsinom i situ; EIC +, omfattende intraductal komponent; CK7, cytokeratin 7.

Markør Klone Selskapet Fortynning Dewaxing Antigen henting Antistoff inkubasjon Poengsystem
ER SP1 Ventana RTU EZ prep ved 72 ° C CC1 ved 95 ° C i 36 min 16 min ASCO/CAP retningslinjer23
PR 1E2 Ventana RTU EZ prep ved 72 ° C CC1 ved 95 ° C i 36 min 17 min ASCO/CAP retningslinjer23
HER2 4B5 Ventana RTU EZ prep ved 72 ° C CC1 ved 95 ° C i 36 min 18 min ASCO/CAP retningslinjer3
Ki67 30-9 Ventana RTU EZ prep ved 72 ° C CC1 ved 95 ° C i 36 min 12 min Internasjonale Ki67 i brystkreft arbeider gruppe anbefalinger25

Tabell 2: oversikt over antistoffer, kloner, fortynninger, antigen uttaksmetodene dine og scoring systemer vedtatt for immunohistochemical analyser. ER, østrogenreseptor; PR, progesteron reseptor; RTU, klar til bruk.

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) Ki67 lav (%) KI-67-høy (%) HER2 + (%)
Invasiv karsinom av ingen spesiell type 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74.7) 85 (24,7) 259 (75.3) 71 (20.6)
Invasiv lobular karsinom 53 (11,9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67,9) 17 (32.0) 4 (7,5)
Invasiv karsinom, blandet-type 9 (2.0) 8 (88.9) 6 (66,7) 0 (0.0) 9 (100.0) 1 (11.1)
Rørformede karsinom 8 (1.8) 8 (100.0) 8 (100.0) 8 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
Mucinous karsinom 11 (2,4) 11 (100.0) 9 (81,8) 7 (63.6) 4 (36,4) 0 (0.0)
Micropapullary karsinom 7 (1.6) 7 (100.0) 7 (100.0) 5 (71.4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Invasiv karsinom med Apokrine featueres 5 (1.1) 3 (60.0) 1 (20,0) 1 (20,0) 4 (80.0) 3 (60.0)
Papillary karsinom 1 (0,2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0)
Medullær karsinom 4 (0,9) 0 (0.0) 1 (25.0) 0 (0.0) 4 (100.0) 0 (0.0)
Metaplastic karsinom 2 (0,5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0)
Totalt 444 391 (88.0) 333 (75.0) 142 (32.0) 302 (68.0) 81 (18.2)

Tabell 3: bryst kreft histotypes, reseptor status og HER2 heterogenitet status. ER, østrogenreseptor; PR, progesteron reseptor; Ki67-lav, Ki67 indeks < 18%. Ki67 høy, Ki67 > 18%.

Interpretable neoplastic flekker HER2-positiv flekker (%) Hormon reseptorer status HER2-heterogene tilfeller
6 5 (83) positiv 10
6 5 (83) negativ 1
6 4 (67) positiv 7
6 4 (67) negativ 1
6 2 (33) negativ 1
6 1 (17) positiv 1
5 3 (60) positiv 10
5 1 (20) positiv 2
4 3 (75) positiv 9
4 2 (50) positiv 8
4 1 (25) negativ 1
3 2 (67) positiv 5
3 1 (33) positiv 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tabell 4: HER2 uttrykk, hormonet reseptor status og HER2-heterogene tilfeller. Blant 57 HER2-heterogene tilfeller var 4 (7%) tilfeller ER-negativ og PR-negativ, bekrefter klinisk betydning vurdere HER2 heterogenitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her har vi detaljerte laboratorium-strategier for å utføre SISH analyser av HER2 genet og det tilsvarende centromere i høy avkastning TMAs av heterogeneously behandlet brystkreft. Denne metoden er kostnadseffektive og kan utføres i de fleste laboratorier for studier av HER2 genet forsterkning heterogenitet i store kohorter av bryst kreft Hentet skjemaet patologi arkiver.

På grunn av klinisk viktigheten av HER2 testing i brystkreft og utfordringene generert av heterogene uttrykket, utviklet vi en høy gjennomstrømming testing protokoll for å vurdere intra - og inter - tumor HER2 genetisk heterogenitet. Analysert områdene inkluderer pre invasive og invasive komponenter, basert på spesifikke fargemaskin, arkitektoniske og IHC funksjoner.

Det er flere viktige faser som bør håndteres med forsiktighet i denne protokollen. Ett viktig skritt er utvalget av regionene rundt. Vi har funnet ut at merknaden av ulike topografiske områder gjennom en tverrfaglig tilnærming er avgjørende å sikre kvaliteten på den endelige molekylære analysen. Spesielt felles revisjon av diagnostiske lysbildene utført av en patologen og en tekniker øker enormt antall tilstrekkelig kapasitet (dvs., flekker som gjenspeiler området identifisert på lysbildet), og deretter redusere the failure rate av single-spots analysen. Men kan flere svulst flekker være tapt etter føljetong deler for flere IHC og ISH analyser. For å overvinne dette medfører, anbefaler vi konstruere TMAs i to og tre eksemplarer, hvis overhodet mulig basert på vev tilgjengelighet. Videre markere vi betydningen av definere strenge laboratorium prosedyrer for etableringen av acceptor FFPE blokker for TMAs. Ja, vi har observert at en minimal sprekk i TMA blokken kan utlede hele ISH analysen kvalitet, reproduserbarhet og klarhet av reaksjonen. Hvis sprekker oppstår, bør donor blokken bli oversett TMA bygging. Det bør bli anerkjent, men at IHC kan utføres i suboptimal TMAs, og ingen bevis tekniske problemer under slike analyser er observert i vår erfaring.

Til tross for at denne protokollen er spesielt optimalisert for HER2 SISH analyser av høy dekkevne bryst TMAs, det er verdt å merke at andre analyser, som fisk og IHC, kan pålitelig utføres i forskjellige vev, som beskrevet tidligere14, 19,26. Men har vi her definert ideelt antall flekker og topografiske karakteristisk for TMA å sikre høy kvalitet og reproduserbar SISH analyser av HER2 genet i bryst kreft eksemplarer. Et annet viktig punkt representeres av gjenreisningen av standardprotokoller automatiske SISH tilsvarer eiendommelighet flere prøvene skal analyseres. Faktisk produsentenes retningslinjer er vanligvis laget for molekylær analysene av konvensjonelle hele seksjoner, og er derfor ikke kan nå høye standarder på heterogeneously behandlet vev prøver, som i TMAs fra arkivering FFPE blokker. Dette har vi gitt en detaljert beskrivelse av en pålitelig tilpasset protokoll for SISH analyser i prøvene problematisk.

Det ville være svært gunstig å utforske heterogenitet HER2 uttrykk og gene forsterkning i respekt for heterogene fordelingen av andre klinisk praktisk molekylær biomarkers i brystkreft. Dette ytterligere for translasjonsforskning studier å utforske gyldigheten av vår metode for andre klinisk relevante molekylær analyser, som matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering massespektrometri bildebehandling (MALDI-MSI)27. Nylig, styring av FFPE vev for MALDI-MSI analyse har blitt mulig, men utfordrende. Denne i situ proteomic teknikken tillater visualisering av den romlige fordelingen av proteiner og peptider i patologisk vev deler, inkludert brystkreft.

Denne protokollen har flere avgjørende skritt som kan forstyrre den endelige analysen. Første, spesiell oppmerksomhet bør vies mot ulike mekanismene bak HER2 forsterkning. Kromosom 17 polysomy er for eksempel en genetisk avvik som kan oppstå i bryst kreft11representerer en velkjent alternativ mekanisme for økt HER2 kopi nummeret. Denne tilstanden, kan men ikke hyppige, påvirke ikke bare kreft biologiske egenskaper og pasient ledelse, men også ISH analysene. Andre, har det blitt beskrevet at intra-svulst genetisk heterogenitet oppstår også på en enkeltcelle nivå og ikke bare i ulike neoplastic områder. Denne protokollen er ikke øke oppdagelsen kraften i denne spesielle tilstanden i forhold til hele seksjoner. Videre er det viktig å understreke at TMA-baserte studier av romlige heterogenitet har noen iboende begrensninger, inkludert mangel på en omfattende analyse av hele delen. Denne studien imidlertid anses som bevis på prinsippet-at heterogenitet HER2 genet forsterkning kan vurderes ved hjelp av en høy gjennomstrømming og kostnadseffektiv plattform, bruker standard laboratorieutstyr. Videre studier analysere føljetong hele deler av HER2-heterogene tilfeller, kombinert med banebrytende molekylære studier og pasientens kliniske data må godkjenne denne protokollen.

Avslutningsvis bør omfattende tilordningen av HER2 status i heterogene HER2 bryst kreft prøver og etterforskning av potensialet sjåfør genetiske mutasjoner i HER2-negativ komponenter stole på analyse av flere neoplastic områder. Denne analysen vil kreve uutholdelig kostnader og arbeid med diagnostiske standardfasiliteter. Denne metoden representerer et pålitelig verktøy for samtidige karakterisering av HER2 genetisk heterogenitet i store datasett flere og heterogeneously behandlet brystkreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136, (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232, (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31, (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12, (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133, (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54, (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64, (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25, (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136, (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25, (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27, (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15, (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10, (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68, (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16, (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26, (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68, (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29, (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70, (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28, (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22, (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103, (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14, (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11, (6), 1507-1514 (2015).
Bygge opp en høy gjennomstrømming Screening plattform å vurdere heterogenitet HER2 genet forsterkning i brystkreft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter