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Immunology and Infection

Mise en place d’une plateforme de criblage à haut débit afin d’évaluer l’hétérogénéité d’Amplification de gène HER2 dans les Cancers du sein

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Une distribution hétérogène de cellules HER2-positif peut être observée dans un sous-ensemble des cancers du sein et génère des dilemmes cliniques. Ici, nous introduisons un protocole fiable et rentable pour définir, quantifier et comparer HER2 une hétérogénéité génétique intra-tumeur dans une grande série de cancers du sein traités de façon hétérogène.

Abstract

Des thérapies ciblées contre le récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) de 2 ont changé radicalement les résultats des patients atteints de cancers du sein HER2-positif. Cependant, une minorité de cas affiche une distribution hétérogène de cellules HER2-positif, qui génère des défis cliniques majeurs. A ce jour, aucun protocole fiable et standardisé pour la caractérisation et la quantification des hétérogène amplification de gène HER2 dans des cohortes n’ont été proposées. Nous présentons ici une méthode de haut débit afin d’évaluer en même temps le statut HER2 dans différentes zones topographiques de plusieurs cancers du sein. En particulier, nous illustrons la procédure de laboratoire pour construire des microarrays de tissu amélioré (TMA) incorporant un mappage ciblé des tumeurs. Tous les paramètres TMA ont été spécialement optimisés pour l’hybridation d’argent in situ (SISH) fixés au formol les tissus mammaires (FFIP) inclus en paraffine. L’analyse immunohistochimique des biomarqueurs pronostiques et prédictifs (c.-à-d., ER, PR, Ki67 et HER2) doit être effectuée à l’aide de procédures automatisées. Un protocole SISH personnalisé a été appliqué pour permettre une analyse moléculaire de haute qualité à travers de nombreux tissus qui ont subi des procédures de fixation, de traitement et de stockage différentes. Dans cette étude, nous fournissons une preuve du principe que les séquences d’ADN spécifiques pourraient être cancers mammaires simultanément localisées dans des zones distinctes de topographiques de multiple et hétérogène transformés à l’aide d’une méthode efficace et rentable.

Introduction

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HER2 est un proto-oncogène qui est surexprimé et amplifié dans 15 à 30 % de tous les invasive breast cancer1,2. La surexpression de HER2 est déduite par la présence de > 10 % des cellules avec membrane forte immunohistochimie (IHC) coloration (3 +), tandis que l’amplification de gène peut être évaluée lorsque le ratio de HER2/centromère est ≥ 2 ou que le nombre de copies du gène est ≥6, sur le comptage au moins 20 cellules par in situ hybridation (ISH)3.

Une hétérogénéité génétique intra-tumeur a été largement décrite dans les cancers du sein, étant un contributeur néfastes à l’évaluation de biomarqueurs et traitements réponse4. Selon le College of American Pathologists (CAP), hétérogénéité HER2 existe si HER2 est amplifié chez > 5 % et < 50 % d’infiltration tumorale sériés5. Malheureusement, l’incidence réelle de l’hétérogénéité spatiale HER2 dans les cancers du sein reste un sujet de controverse entre les pathologistes, avec certains auteurs soutenant que c’est un événement extrêmement rare, et d’autres suggérant que jusqu'à 40 % des cas sont HER2-hétérogènes1,5,6,7,8,9,10. Malgré les mécanismes biologiques qui sous-tendent cette condition sont pas encore totalement clarifiées, les effets cliniques et pronostiques de l’hétérogénéité intra-tumeurs HER2 sont cruciales pour breast cancer patients11.

Récemment, lumineux-zone des techniques moléculaires, comme chromogène ISH (CISH) et argent ISH (SISH), étaient devenus des méthodes fiables pour détecter les HER2 hétérogénéité dans les tissus FFIP, avec quelques avantages par rapport aux fluorescents ISH (poisson)12. Malheureusement, l’analyse en vrac des cas unique reste impraticable dans les études de cohorte importante. Plusieurs groupes ont suggéré que la combinaison d’histochimie, IHC et ISH avec technologies TMA pourrait constituer une stratégie utile dans l’étude du cancer biology13,14,15,16. Avec cette méthode largement adoptée, des échantillons de tissus provenant de patients différents peuvent être analysés en même temps, réduisant au minimum le tissu et les réactifs utilisés et favorisant ainsi l’analyse uniforme d’une grande série de cas14. Cependant, aucun des protocoles ne sont disponibles pour la caractérisation moléculaire simultanée de haut débit de plusieurs échantillons de tissus qui a subi une transformation différente en termes de réactifs, temps de fixation et des méthodes de conservation indépendants, par exemple sous le nom d’archives pâtés de maisons.

Étant donné les implications pronostiques et cliniques de l’hétérogénéité spatiale HER2 dans les cancers du sein, nous avons développé une plateforme intégrée moléculaire pour évaluer en grande série de cas hétérogène transformés. Ici, nous dépeindre les stratégies de laboratoire pour générer et analyser l’hétérogénéité intra-tumorale de HER2 amplification dans la TMA de rendement élevé de cancer du sein au moyen de l'ES. Le protocole suivant a été développé pour les tumeurs mesurant > 5 mm (> pT1b selon la classification TNM 2017)17. Pour les lésions plus petites, nous recommandons de procéder l’analyse sur des coupes sériées intégral. Notre procédure permet l’analyse simultanée d’IHC et recueillent des jusqu'à 30 cancers du sein, qui englobe une moyenne de 6 zones distinctes (intervalle de 4 à 8) pour chaque cas. Au total, 180 carottes de tissu de 1 mm de diamètre, avec 500 µm entre les noyaux et de 2 mm entre la grille et les bords seront générés pour chaque bloc TMA.

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Protocol

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Cette étude a été approuvée par le Conseil de révision institutionnelle de IRCCS Ca' Granda Foundation, l’hôpital Policlinico, Milan, Italie.

1. sélection des Patients et des échantillons de tissus

  1. Récupérer les slides d’archivage de tous les cas à analyser, y compris toutes les disponible hématoxyline et éosine (H & E) IHC diapositives depuis le diagnostic initial et, le cas échéant, un H & E d’égalé le tissu mammaire non néoplasiques (p. ex., marge chirurgicale) .
  2. Effectuer les révisions de cas.
    Remarque : Pour cette tâche, au moins deux pathologistes avec expérience en pathologie mammaire devraient discuter les diapositives de diagnostics et résoudre les désaccords collégialement. Utiliser un microscope classique ou outils de télépathologie (favorable à ces derniers dans des études multicentriques). Le cas échéant, exclure tous les cas discordants.
    1. Effectuer la re-classification histologique de tous les cas, selon la dernière édition de la classification de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) des tumeurs du sein18.
    2. S’assurer que le tissu normal pour chaque cas, s’il est présent dans les échantillons cliniques d’archivage, comprend au moins une unité canalaire-lobulaire terminale non néoplasiques.
    3. Identifier toutes les zones néoplasiques voir hétérogènes cytologiques, architectural, ou IHC caractéristiques à l’aide d’un microscope lumineux-zone (doit être effectuée conjointement par un pathologiste et techniciens qui construira la TMA).
  3. Mettez en surbrillance les zones topographiques discrets avec un marqueur sur la lame de verre ou avec le bon outil sur un logiciel de diapositives numériques (Figure 1 a).
  4. Se fondant sur les diapositives sélectionnées, récupérer les blocs FFIP correspondants provenant des archives.
    Remarque : Pour optimiser la TMA construction, afin d’éviter l’appauvrissement des tissus et de préserver la TMA punch intégrité structurale, cas avec < 1 mm d’épaisseur tissu résiduel doit être exclu.

2. concevoir et construire des TMA basée sur la Technique de Kononen

  1. Créer et ouvrir un nouveau fichier de feuille de calcul comportant les comptes rendus des zones distinctes de chaque cas. Comprennent les données suivantes sur des colonnes distinctes, comme illustré dans le tableau 1 : ID de cas, bloc ID, ID de zone, type de tissu (par exemple, les tissus normaux, composant envahissantes histotype, in situ composant histotype), topographie (p. ex., noyau de la tumeur, avant envahissante), morphologie (p. ex., qualité nucléaire, architecture, mitoses, caractéristiques cytologiques), statut des biomarqueurs (p. ex., récepteurs de œstrogènes (ER), récepteur de progestérone (PR), Ki67 et HER2) et toutes les autres fonctionnalités d’IHC disponibles.
    1. Enregistrez le document.
  2. Créez un projet TMA.
    1. Installez et ouvrez le logiciel de concepteur de TMA.
    2. Définir le destinataire de la TMA ou des blocs : accès via le menu File > New > bloc ou en utilisant CTRL + B.
    3. Cliquez dans le premier champ à remplir ou appuyez sur la touche de tabulation et tapez dans les dimensions du bloc de paraffine : largeur 35 (mm) hauteur (mm) 20. Tapez « 2 » comme valeur « marge » (c'est-à-dire, la distance du bord de la paraffine en mm) (Figure 1 b). Enregistrer les données en cliquant sur le bouton approprié. Le nouveau modèle du bloc destinataire est maintenant enregistrée et prête à être utilisée dans les nouveaux modèles de tableau de tissu.
    4. Créez un projet de tableau des tissus : accès au menu File > New > tissu Array ou à l’aide de CTRL + T.
    5. Indiquer le nom de l’auteur, commentaires et tableau tissu, puis cliquez sur « suivant ». Cliquez sur l’icône « import », choisissez le fichier de modèle de bloc destinataire créée précédemment et cliquez sur « suivant ».
    6. Choisissez 1 mm comme taille de spot en cliquant sur le bouton rond. Choisissez 500 µm comme spot espacement qui est l’espace entre deux centres de spots voisins. Cliquez sur l’icône représentant une calculatrice pour calculer le nombre total de spots créés, qui devrait être 231. Cliquez sur « suivant ».
    7. Définir le mode de numérotation spot en cliquant une fois dessus. Cliquez sur le bouton « définir » pour créer des grilles et des grilles. Supprimez la ligne centrale (ligne 6) et les colonnes 8 et 15. Maintenir les 3 points de la ligne 1 pour l’orientation. La carte finale devrait porter sur un nombre total de 183 points, tel que représenté dans la Figure 2.
    8. Définir la liste des types de tissus : accès via le menu File > New > Liste des types de tissus ou à l’aide de CTRL + L.
    9. Insérer les descriptions de tissus préalablement définies. Appuyez sur flèche vers le bas ou cliquez sur le bouton + pour ajouter une ligne.
    10. Définir le projet : accès via le menu Fichier > Nouveau > projet Booster ou à l’aide de CTRL + p.
    11. Indiquer le nom de la gamme de tissus, commentaires et auteur, puis cliquez sur « suivant ». Importer le fichier de feuille de calcul, la liste des types de tissus et le modèle de tableau de tissus créé précédemment en cliquant l’icône appropriée.
    12. Cliquez sur « tout sélectionner » et définissez le nombre de places pour chaque type de tissu ; Cliquez sur le bouton « match » pour appliquer les paramètres. Un tableau énumérant le nombre total de cœurs qui sera échantillonné et transférés aux bénéficiaires blocs dans ce projet s’affiche. Enregistrez le projet et fermer le programme.
  3. Préparer les blocs de l’accepteur (Figure 1 b).
    1. Remplir des moules métalliques nettoyés avec paraffine élastique à 65 ° C.
    2. Laissez les blocs de paraffine pour refroidir à température ambiante pendant une nuit à l’intérieur des moules métalliques.
    3. Extrait les blocs de paraffine les moules métalliques. En cas de fissures, jeter le bloc et répétez les étapes 2.3.1-2.3.3.
  4. Construire la TMA en utilisant un arrayer automatisée ou semi-automatisée19.
    1. Récupérer toutes les blocs FFIP et les sections correspondantes de H & E avec des annotations.
    2. Activer l’arrayer et insérer l’accepteur ou des blocs sur le carrousel arrayer.
    3. Ouvrez le logiciel de station de contrôle arrayer, cliquez sur « Nouveau tissu Array » et chargez le projet précédemment créé (Figure 1).
    4. Cliquez sur « Continuer » et sélectionnez la position du ou des blocs du donneur dans le menu.
    5. Définir la position de départ sur chaque bloc destinataire : utilisez les touches fléchées pour déplacer le faisceau laser et l’aligner avec le bord supérieur gauche sur la paraffine du bloc destinataire.
    6. Cliquez sur « suivant » et répéter pour l’alignement vertical.
    7. Cliquez sur « suivant » pour créer automatiquement un trou dans la coordonnée définie précédemment du bloc destinataire (accepteur).
    8. Vider le poinçon.
    9. Placez le bloc de donateurs pour l’échantillonnage et retirer un noyau de tissus de la zone précédemment annotée d’intérêt.
    10. Insérez le noyau de tissu donneur dans l’orifice du bloc destinataire (accepteur).
    11. Retirer le bloc de donateurs de l’arrayer.
    12. Répétez les étapes 2.4.5-2.4.11 jusqu'à ce que l’ordre des médecins sont terminée.
  5. Mettez l’intrados du bloc TMA nouvellement généré sur une diapositive vierge stérile et placez-les dans le four de laboratoire à 45 ° C pendant 5 min.
  6. Appuyez doucement sur le bloc sur la lame pendant 5 s pour aplatir les noyaux du tissu. Répéter une fois (pour un total de 2 fois).
  7. Retirer le bloc TMA avec la diapositive du four, retourner et détacher délicatement le bloc de la diapositive.
  8. Couvrir la surface du tissu TMA avec une fine couche de paraffine élastique à 65 ° C.
  9. Laissez le bloc TMA à température ambiante pendant 2 h.
  10. Transfert du bloc TMA à 4 ° C pendant 24 h.
    Remarque : Le bloc TMA peut être stocké à 4 ° C jusqu'à l’épuisement.

3. histochimiques et Analyses immunohistochimiques

  1. Couper des sections de la TMA.
    1. Placez les TMA accepteur ou des blocs avec la paraffine-face vers le bas sur une surface de-10 ° C pendant 10 min refroidir la paraffine.
    2. Remplir un bain flottant avec de l’eau ultrapure et régler chaleur à 38 ° C.
    3. Placez une lame neuve sur un microtome rotatif et insérez le bloc dans le mandrin de microtome, donc le bloc de cire fait face à la lame et est aligné dans le plan vertical.
    4. Approcher le bloc délicatement avec la lame et couper quelques coupes minces afin d’assurer que le positionnement est correct ; ajuster si nécessaire.
    5. Couper 3 sections µm d’épaisseur.
    6. Ramasser les sections à l’aide de la pince à épiler et elles flottent sur la surface l’eau de la baignoire.
    7. Choisir les sections sur l’eau du bain sur lames de verre ordinaire et IHC/ISH.
    8. Placez les diapositives sur une grille et stockez-les dans le four à 45 ° C durant la nuit.
      Remarque : Une fois préparés, les sections TMA devraient être colorées sous 24h.
  2. Effectuer une coloration histochimique (H & E) à l’aide d’un appareil.
    1. Insérer les diapositives dans le support de l’appareil et placez-les à 60 ° C pendant 10 min.
    2. Ouvrir le tiroir de chargement de l’appareil et insérer que le panier avec le TMA glisse dans l’une des stations de charge avec une pince standard de H & E vers l’extérieur.
    3. Une fois que le tiroir est fermé, le clip sera automatiquement reconnu par le système, et débutera le protocole suivant : station de four à 37 ° C (6 min), xylène (2 min), xylène (2 min), l’éthanol 100 % (2 min), l’éthanol 100 % (2 min), éthanol à 95 % (2 min), éthanol à 95 % (2 min) , distillée eau (4 min), hématoxyline de Carazzi (9 min), l’eau courante à basse pression (2 min), éosine 1 % (1 min), l’eau courante à basse pression (2 min), éthanol à 95 % (20 s), éthanol à 95 % (20 s), éthanol à 95 % (20 s), éthanol à 95 % (20 s), éthanol 100 % (15 s), l’éthanol 100 % (15 s) , xylène (30 s), xylène (30 s).
    4. Décharger les grilles du tiroir et monter la lame avec une lamelle couvre-objet.
      1. Recueillir une goutte de monture avec une pipette et le mettre sur un bord extérieur de la diapositive de la couverture.
      2. Placez le côté humide de la lamelle couvre-objet sur la diapositive et laisser le support sécher pendant 30 min.
  3. Effectuer IHC coloration pour ER, PR, Ki67 et HER2 à l’aide d’une immunostainer automatique.
    Remarque : Avant de commencer une course coloration, démarrage du système et vérifier les flacons de réactifs consommables (Table des matières) et les conteneurs à déchets.
    1. Placez les glissières TMA pour analyser à 60 ° C pendant 10 min.
    2. Démarrer l’instrument immunostainer et le logiciel.
    3. À la vue de l’accueil, cliquez sur protocoles, puis puis cliquez sur créer/modifier des protocoles.
    4. Sélectionnez la norme DAB (3, 3'-diaminobenzidine) procédure d’IHC pour modifier le modèle de base.
    5. Drapeau « Déparaffinage » dans la zone de liste et la valeur de la température moyenne à 72 ° C.
    6. Drapeau de la solution de démasquer cc1, la valeur de la température moyenne à 95 ° C et le temps d’incubation à 36 min.
    7. Drapeau de la boîte de l’anticorps primaire, insérez l’ID du distributeur en ligne ER (le logiciel instrument reconnaîtra le distributeur sur le Carrousel de réactif) et régler la durée de l’incubation à 16 min.
    8. Drapeau de la boîte de Counterstaining, sélectionnez l’hématoxyline I, ainsi que le temps d’incubation à 12 min.
    9. Cliquez sur le bouton « Enregistrer sous » et le nom du protocole.
    10. Répétez les étapes 3.3.3-3.3.9 pour les autres anticorps utilisant les temps d’incubation d’anticorps primaires à l’adresse suivante : PR 16 min, Ki67 16 min et HER2 12 min utilisent des anticorps préalablement diluée prêt à l’emploi (RTU).
    11. À la vue de l’accueil, cliquez sur créer des étiquettes.
    12. Cliquez sur protocoles et ajouter les protocoles ER, PR, Ki67 et HER2 pour chacun de la LMC à analyser.
    13. Cliquez sur le bouton de /Print étroite.
    14. Comme le modèle d’étiquette s’affiche, entrez les codes de la TMA pour l’étiquette.
    15. Cliquez sur le bouton imprimer pour imprimer les étiquettes et de les appliquer ensuite sur les diapositives de la TMA.
    16. Cliquez sur l’icône de l’appareil et réglez le mode de démarrage instrument comme « Prêt ».
    17. Ouvrez le capot qui couvre le Carrousel de réactifs et placer le système de détection des anticorps primaires, puis fermez le capot.
    18. Cliquez sur le bouton frontal sur un tiroir de diapositive pour ouvrir et fermer le tiroir en cliquant sur le bouton même charger les lames de la TMA.
    19. Définissez le mode de démarrage de l’instrument comme « opérationnel » et suivez les instructions.
    20. À la fin de l’exécution, décharger la TMA glisse en appuyant sur l’ouvrir tous les tiroirs à rincer et bouton rempli de diapositives sur l’instrument de contrôle de glisser en réchauffent l’eau savonneuse pour enlever tout réactifs restants.
    21. Laver les diapositives sous basse pression eau froide, déshydrater les diapositives TMA et d’appliquer une lamelle de verre à chaque diapositive.
  4. Effectuer une analyse IHC de ER, PR et HER2 suite à l’American Society of Clinical Oncology (ASCO) / CAP des lignes directrices et de Ki67 conformément aux recommandations de la Ki67 International au groupe de travail Cancer du sein (tableau 2).
    Remarque : Cette analyse doit être effectuée séparément dans les taches de tissus distincts par un pathologiste avec une expérience en pathologie mammaire.
    1. Évaluer l’expression de ER comme positif si ≥ 1 % des noyaux de cellules de tumeur sont immunoréactives20,21,22,23.
    2. Évaluer l’expression PR comme positif si ≥ 1 % des noyaux de cellules de tumeur sont immunoréactives20,21,22,23.
    3. Évaluer l’expression de HER2 comme : a) score 3 + si membrane circonférentielle coloration complète et intense, b) score 2 + si membrane circonférentielle la coloration est incomplète et/ou faible ou modérée et au sein de > 10 % des cellules tumorales envahissantes ou complète et coloration de la membrane circonférentielle est intense et à ≤ 10 % des cellules de tumeur invasive, c) score 1 + si membrane incomplète la coloration est faible/à peine perceptible et à > 10 % des cellules de tumeur invasive, d) négatif si aucune coloration n’est présente ou membrane la coloration est incomplète et faibles/à peine perceptible et au sein de ≤ 10 % de la tumeur invasive cellules3,24.
    4. Évaluer l’indice Ki67 comme le pourcentage de cellules présentant une coloration nucléaire au moins 1 000 cellules néoplasiques au hasard sélectionné plus de 10 domaines de forte puissance (grossissement 400 X)25.

4. SISH analyse de HER2

  1. Coupes de TMA (répétez l’étape 3.1).
  2. Effectuer SISH pour HER2 à l’aide d’une immunostainer automatique.
    1. Placez les glissières TMA pour analyser à 60 ° C pendant 10 min.
    2. Démarrer l’instrument immunostainer et le logiciel.
    3. À la vue de l’accueil, cliquez sur protocoles, puis puis cliquez sur créer/modifier des protocoles.
    4. Sélectionnez la procédure « U double ISH CKT » pour modifier le modèle de base.
    5. Pavillon « Séchage » dans la zone de liste et régler la température à 63 ° C pendant 20 min.
    6. Drapeau « Cellule conditionnement » dans la zone de liste, puis « cellule conditionnement CC2 » et réglez la température sur les temps d’incubation et de 86 ° C à 4 min.
    7. Drapeau CC2 doux (Cycle 1), Standard (Cycle 2) et étendu (Cycle 3) pendant 8 min, 12 min et 8 min, respectivement.
    8. Drapeau « ISH-protéase 3 » dans la zone de liste et définir le temps d’incubation à 16 min.
    9. Sélectionnez les sondes HER2DNP et CHR17DIG et définissez le temps d’incubation à 6 h.
    10. Mettre le linge à 76 ° C pendant 8 min.
    11. Régler la durée de l’incubation de polymère (SIL ISH DNP HRP) recueillent à 32 min.
    12. Régler la durée d’incubation d’argent chromogène (SIL ISH DNP CCDP) à 4 min.
    13. Régler la durée de l’incubation multimères rouge (rouge ISH creuser AP) à 24 min.
    14. Régler la durée d’incubation de chromogène rouge (rouge ISH creuser FR) à 8 min.
    15. Drapeau « Counterstaining » dans la zone de liste, sélectionnez « Hématoxyline II » et régler la durée de l’incubation à 8 min.
    16. Drapeau « contre-coloration post » dans la zone de liste, sélectionnez « Réactif de BLEUISSEMENT » et régler la durée de l’incubation à 4 min.
    17. Répétez les étapes de 3.3.11-3.3.15 (sélectionnez modification Protocole U double ISH CKT).
    18. Ouvrir le capot qui couvre le Carrousel de réactifs, placez le linge et les systèmes de détection d’ISH, puis fermez le capot.
    19. Répétez les étapes de 3.3.18-3.3.21.
  3. Effectuer une analyse de l'ES pour HER2: évaluer l’amplification de gène HER2 positif si le rapport de /CEP17 de HER2est ≥2. 0 avec une moyenne HER2 copie numéro ≥4.0 signaux par cellule et négatif si le ratio de /CEP17 de HER2est < 2.0 avec une moyenne de HER2 copier nombre < 4.0 signaux/cellule3,24.
    Remarque : Comme pour IHC, cette analyse doit être effectuée séparément dans les taches de tissus distincts par un pathologiste avec expérience en pathologie mammaire.

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Representative Results

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Au total, 444 du sein envahissant les cancers ont été incorporées au 15 TMAs spécialement optimisés pour les analyses de l’ISH. Parmi les 2 664 points échantillonnés, 2 651 (99,5 %) étaient représentatifs des domaines précédemment sélectionnés et donc considérés comme propices pour les analyses suivantes. L’hétérogénéité intra-tumeur a été déterminée par IHC et SIH, avec un accent particulier sur la répartition hétérogène de clones de HER2-positif dans les zones topographiques distinctes des tumeurs. Tableau 3 illustre les caractéristiques biologiques des cas analysés, en se concentrant sur le statut HER2, Ki67, ER et PR au sein de différentes histotypes. En particulier, 18 % des cas ont été trouvés pour afficher des cellules HER2-positif > 10 % des cellules tumorales et par conséquent mis en correspondance les caractéristiques pour évaluation de positivité de HER2. Fait intéressant, cette valeur se rapproche de l’extrémité inférieure des cancers du sein incidence signalée gamme de HER2-positif. En revanche, le statut HER2 était variable dans les zones distinctes de HER2-positif tant HER2-négatif cancer du sein (Figure 3, tableau 4), fournissant davantage foi à l’idée que le cancer est une maladie extrêmement hétérogène à niveau génomique. Le taux d’échec de l’analyse de l'ES a été de 0,8 %, avec un total de 2 629/2 651 points dans lesquels la sonde dinitrophénol-tag lié aux séquences cibles.

Figure 1
Figure 1 : Représentation de la pierre angulaire des phases dans la réalisation d’une plate-forme haut débit pour l’analyse de l’hétérogénéité des cohortes des cancers du sein HER2. (A) sélection des zones d’échantillonner doit inclure l’identification et le point culminant de toutes les régions où cytologiques, architectural, ou l’hétérogénéité de l’IHC. (B), une des étapes plus critiques de cette procédure est la création d’un bloc d’accepteur de haute qualité, étant donné que même une fissure microscopique pouvait inférer la cohérence des analyses subséquentes en situ hybridation. (C) il est important d’employer un arrayer numériquement guidée avec une aiguille de 1 mm de diamètre pour construire la TMA de haut rendement basé sur la technique de Kononen. (D) la création du projet TMA devrait commencer à partir de la définition des dimensions et des frontières de la LMC. IHC tout (E) et ISH analyses devraient être effectuées à l’aide outils de pathologie numérique, afin de naviguer rapidement à travers la TMA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Une représentation planimétrique de la TMA s’est rendu compte de ce protocole. Le nombre total de 180 points de 1 mm de diamètre, 500 µm, permettre une hybridation optimale in situ . TMAs plus denses les resultats improductives en termes de qualité globale et l’uniformité des réactions dans l’ensemble de toutes les taches, avec un taux d’échec plus élevé sur une base unique place. Noter les taches « orientation » en haut et moyen-à gauche de la grille. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Représentant micrographies montrant l’argent in situ analyse par hybridation d’un cancer du sein HER2-hétérogène. Dans cet exemple paradigmatique, deux taches distinctes d’un cancer du sein invasif à haute teneur d’aucun modèle spécial (BR_121), a montré des résultats différents en termes de HER2 amplification de gène (noir) par rapport à la sonde centromérique énumération 17 (rouge). En particulier, un domaine appartenant au noyau tumoral et montrant cytokératine 7 irréguliers modèle de marquage était HER2 amplifié (A), tout en un seul endroit du front envahissant (c.-à-d., tumeur edge) affiche un sauvage HER2 schéma (B). Barreaux de l’échelle = 50 µm (20 µm dans les cartons). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

ID d’affaire ID de bloc ID de zone Tissu Topographie Morphologie ER PR KI67 HER2 Autres caractéristiques de l’IHC
BR_121 A5 un Normal Marge chirurgicale
BR_121 A1 un NST Base de la tumeur G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Base de la tumeur G3 CK7 +/-
BR_121 A3 un NST Base de la tumeur Stroma mucineux 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Invasive avant Tubulaire 100 100 35 2 +
BR_121 A4 un NST Invasive avant G3
BR_121 A3 c CCIS (CPN +) Adjacent au front envahissante Haute qualité 100 100 45 2 +

Tableau 1 : enregistrement représentatif d’un cas visés par l’étude. Ce cas (BR_121) était un carcinome invasif à haute teneur d’aucun type spéciale avec le stroma production focal, montrant une composante mineure tubulaire à la périphérie de la lésion et la perte de focale-irrégulier de CK7 immunoexpression. Les caractéristiques immunohistochimiques, y compris les biomarqueurs reporting, fait état des analyses effectuées au moment du diagnostic. NST, carcinome invasif d’aucun type spécial ; CCIS, le carcinome canalaire in situ; EIC +, composante intracanalaire vaste ; CK7, cytokératine 7.

Marqueur Clone Compagnie Dilution Décirage Recherche d’antigène Incubation des anticorps Système de notation
ER SP1 Ventana RTU Prép EZ à 72 ° C CC1 à 95 ° C pendant 36 min 16 min ASCO/CAP guidelines23
PR 1E2 Ventana RTU Prép EZ à 72 ° C CC1 à 95 ° C pendant 36 min 17 min ASCO/CAP guidelines23
HER2 4 B 5 Ventana RTU Prép EZ à 72 ° C CC1 à 95 ° C pendant 36 min 18 min ASCO/CAP lignes directrices3
KI67 30-9 Ventana RTU Prép EZ à 72 ° C CC1 à 95 ° C pendant 36 min 12 min Ki67 International in Breast Cancer working group recommandations25

Tableau 2 : liste des anticorps, clones, dilutions, les méthodes de récupération de l’antigène et les systèmes de notation adoptées pour l’analyse immunohistochimique. ER, récepteur des oestrogènes ; PR, récepteur de la progestérone ; RTU, prêt à l’emploi.

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) KI67 faible (%) Ki-67-haute (%) HER2 + (%)
Carcinome invasif d’aucun type spécial 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74,7) 85 (24,7) 259 (75,3) 71 (20,6)
Carcinome lobulaire infiltrant 53 (11,9) 53 (100,0) 44 (83,0) 36 (67,9) 17 (32,0) 4 (7,5)
Carcinome invasif, type mixte 9 (2.0) 8 (88,9) 6 (66,7) 0 (0,0) 9 (100,0) 1 (11,1)
Carcinome tubulaire 8 (1,8) 8 (100,0) 8 (100,0) 8 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Carcinome mucineux 11 (2,4) 11 (100,0) 9 (81,8) 7 (63,6) 4 (36,4) 0 (0,0)
Carcinome Micropapullary 7 (1.6) 7 (100,0) 7 (100,0) 5 (71,4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Carcinome invasif avec featueres apocrines 5 (1.1) 3 (60,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 4 (80,0) 3 (60,0)
Carcinome papillaire 1 (0,2) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100,0) 0 (0,0)
Carcinome médullaire 4 (0,9) 0 (0,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 4 (100,0) 0 (0,0)
Carcinome métaplasique 2 (0,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100,0) 0 (0,0)
Total 444 391 (88,0) 333 (75,0) 142 (32,0) 302 (68,0) 81 (18,2)

Tableau 3 : Breast cancer histotypes, état du récepteur et HER2 hétérogénéité. ER, récepteur des oestrogènes ; PR, récepteur de la progestérone ; KI67 faible, Ki67 indice 18 < % ; KI67 élevé, Ki67 > 18 %.

Interprétables taches néoplasiques Taches de HER2-positif (%) Statut des récepteurs d’hormone Cas de HER2-hétérogènes
6 5 (83) positif 10
6 5 (83) négatif 1
6 4 (67) positif 7
6 4 (67) négatif 1
6 2 (33) négatif 1
6 1 (17) positif 1
5 3 (60) positif 10
5 1 (20) positif 2
4 3 (75) positif 9
4 2 (50) positif 8
4 1 (25) négatif 1
3 2 (67) positif 5
3 1 (33) positif 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tableau 4 : HER2 expression, état des récepteurs d’hormone et HER2-hétérogène cas. Parmi les 57 cas de HER2-hétérogènes, 4 cas (7 %) ont été ER négatifs et PR-négative, confirmant l’importance clinique de l’évaluation de HER2 hétérogénéité.

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Discussion

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Ici, nous avons détaillé les stratégies de laboratoire pour effectuer les analyses SISH du gène HER2 et son centromère correspondante dans la TMA de rendement élevé des cancers du sein traités de façon hétérogène. Cette méthode est rentable et peut être effectuée dans la plupart des laboratoires pour l’étude de l’hétérogénéité amplification du gène HER2 dans des cohortes des archives de pathologie du sein Cancer Récupérée forme.

En raison de l’importance clinique de HER2 dans le cancer du sein et les défis générés par son expression hétérogène, nous avons développé un protocole d’analyse haut débit afin d’évaluer l’intra - et inter - tumor HER2 hétérogénéité génétique. Les zones analysées incluent des composants pré-invasives et invasives, sur la base de précis cytologiques et architecturales et caractéristiques de l’IHC.

Il y a plusieurs phases critiques qui devraient être gérés avec soin dans le présent protocole. Une étape essentielle est la sélection des régions d’intérêt. Nous avons déterminé que l’annotation des différentes zones topographiques grâce à une approche multidisciplinaire est essentielle pour assurer la qualité de l’analyse moléculaire finale. En particulier, la révision conjointe des diapositives Diagnostics effectué par un pathologiste et un technicien augmenter considérablement le nombre de places suffisants (c.-à-d., les taches qui reflète la zone identifiée sur la diapositive) et par la suite réduire le taux d’échec de l’analyse de single-taches. Toutefois, plusieurs spots de tumeur peuvent être perdus après des coupes sériées de multiples analyses IHC et ISH. Pour pallier cet inconvénient, nous recommandons de construire TMA en double ou triple exemplaire, si à tout possible selon la disponibilité de tissus. En outre, nous mettons en évidence l’importance de définir des procédures strictes de laboratoire pour la création de blocs FFIP accepteur pour la TMA. En effet, nous avons observé qu’une fissure minime dans le bloc TMA pourrait déduire toute l’analyse en termes de qualité, la reproductibilité et la clarté de la réaction de ISH. En cas de fissures, le bloc de donateurs devrait être écarté pour la construction de la TMA. Il convient de reconnaître, cependant, que IHC pourrait être réalisée même en TMA sous-optimal, et aucun signe de problèmes techniques au cours de cette analyse n’ont été observées dans notre expérience.

Malgré que ce protocole a été spécifiquement optimisé pour les analyses SISH HER2 de rendement élevé du sein TMA, il est à noter que d’autres analyses, comme le poisson et IHC, peuvent être effectuées avec fiabilité dans plusieurs types de tissus, comme précédemment décrit14, 19,26. Cependant, nous avons défini dans les présentes le nombre idéal de taches et de la caractéristique topographique de la TMA pour garantir qualité et reproductibles des analyses SISH du gène HER2 dans les échantillons de cancer du sein. Un autre point important est représenté par la refonte des protocoles standard de l'ES automatisées pour correspondre à la particularité des multiples échantillons à analyser. En effet, les directives du fabricant font généralement les analyses moléculaires des articles intégraux classiques et ne sont donc pas capables d’atteindre des normes élevées sur des échantillons de tissus transformés de façon hétérogène, comme dans la TMA de d’archivage blocs FFIP. À cette fin, nous avons fourni une description étape par étape d’un protocole personnalisé fiable pour analyses recueillent dans des échantillons de ces problématiques.

Il serait extrêmement bénéfique pour explorer l’hétérogénéité de l’expression de HER2 et amplification génique à l’égard de la distribution hétérogène des autres biomarqueurs moléculaires exploitables sur le plan clinique dans le cancer du sein. À cette fin, des études de recherche translationnelle supplémentaires sont nécessaires pour explorer la validité de notre méthode pour les autres analyses moléculaires cliniquement pertinents, tels que la désorption-ionisation laser assistée par matrice spectrométrie de masse d’imagerie de la (MALDI-MSI)27. Récemment, la gestion des tissus FFIP pour analyse de MALDI-MSI est devenue possible, quoique difficile. Cette technique de protéomique in situ permet la visualisation de la distribution spatiale des protéines et des peptides dans des coupes de tissus pathologiques, y compris le cancer.

Ce protocole a plusieurs étapes cruciales qui peuvent potentiellement interférer avec l’analyse finale. Première, une attention particulière devrait être accordée vers les différents mécanismes qui sous-tendent l’amplification HER2 . Par exemple, le chromosome 17 polysomie est une aberration génétique qui peut-être survenir dans la poitrine du cancer11, ce qui représente un mécanisme bien connu pour le nombre de copies de HER2 accru. Cette condition, quoique peu fréquents et peut-être affecter non seulement les caractéristiques biologiques du cancer et la gestion des patients mais aussi les analyses de l’ISH. Deuxièmement, il a été décrit qu’une hétérogénéité génétique intra-tumeur se produire également à un niveau unicellulaire et pas seulement dans les différents domaines néoplasiques. Ce protocole n’est pas en mesure d’augmenter la puissance de détection de cette affection particulière par rapport aux articles intégraux. En outre, il est important de souligner que l’étude dispensés d’hétérogénéité spatiale a quelques limitations intrinsèques, notamment l’absence d’une analyse exhaustive de l’ensemble de la section. Cette étude, cependant, devrait être considérée une démonstration du principe que l’hétérogénéité de l’amplification du gène HER2 peut être évaluée au moyen d’une plate-forme haut débit et rentable, à l’aide de matériel de laboratoire standard. D’autres études analysant des cas HER2-hétérogènes, couplées à des études moléculaires et les données cliniques des patients coupes sériées intégrale devra valider ce protocole.

En conclusion, la cartographie complète du statut HER2 dans hétérogènes échantillons de cancer du sein HER2 et l’enquête de possibles mutations génétiques pilote dans les composants de HER2-négatif devraient reposer sur l’analyse de plusieurs régions néoplasiques. Cette analyse nécessiterait des coûts insupportables et des efforts à l’aide des fonctionnalités de diagnostiques standard. Cette méthode représente un outil fiable pour la caractérisation simultanée de l’hétérogénéité génétique HER2 dans les grands ensembles de multiple et de cancers du sein traités de façon hétérogène.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Aucun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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References

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Mise en place d’une plateforme de criblage à haut débit afin d’évaluer l’hétérogénéité d’Amplification de gène HER2 dans les Cancers du sein
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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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