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Immunology and Infection

स्तन कैंसर में HER2 जीन प्रवर्धन की विविधता का आकलन करने के लिए एक उच्च प्रवाह जांच मंच का निर्माण

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

HER2 के विषम वितरण-सकारात्मक कोशिकाओं स्तन कैंसर का एक सबसेट में देखा जा सकता है और नैदानिक दुविधाओं उत्पन्न करता है. यहां, हम एक विश्वसनीय और लागत प्रभावी प्रोटोकॉल को परिभाषित करने, यों, और विषम प्रसंस्कृत स्तन कैंसर की एक बड़ी श्रृंखला में HER2 अंतर ट्यूमर आनुवंशिक विविधता तुलना परिचय ।

Abstract

मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2) के खिलाफ लक्षित चिकित्सा मौलिक HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर के साथ रोगियों के परिणाम बदल दिया है । हालांकि, मामलों की एक अल्पसंख्यक HER2-सकारात्मक कोशिकाओं है, जो प्रमुख नैदानिक चुनौतियों उत्पंन की एक विषम वितरण प्रदर्शित करता है । तिथि करने के लिए, बड़े साथियों में HER2 विषम जीन प्रवर्धन के लक्षण वर्णन और ठहराव के लिए कोई विश्वसनीय और मानकीकृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव किया गया है । यहां, हम एक उच्च प्रवाह पद्धति के लिए एक साथ कई स्तन कैंसर के विभिंन स्थलाकृतिक क्षेत्रों में HER2 स्थिति का आकलन वर्तमान । विशेष रूप से, हम प्रयोगशाला प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए बढ़ाया ऊतक microarrays (TMAs) ट्यूमर का एक लक्षित मानचित्रण शामिल निर्माण । सभी TMA मानकों को विशेष रूप से formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) स्तन ऊतकों की सीटू संकरण (शिष्यवृत्तीची) में चांदी के लिए अनुकूलित किया गया है । शकुन और पूर्वानुमानित Immunohistochemical का विश्लेषण (यानी, ईआर, पीआर, Ki67, और HER2) स्वचालित प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाना चाहिए । एक स्वनिर्धारित शिष्यवृत्तीची प्रोटोकॉल कई ऊतकों कि विभिंन निर्धारण, प्रसंस्करण, और भंडारण प्रक्रियाओं के पार एक उच्च गुणवत्ता आणविक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए लागू किया गया है । इस अध्ययन में, हम एक सबूत के सिद्धांत प्रदान करते है कि विशिष्ट डीएनए दृश्यों एक कुशल और लागत प्रभावी विधि का उपयोग कर कई और विषम प्रसंस्कृत स्तन कैंसर के अलग स्थलाकृतिक क्षेत्रों में एक साथ स्थानीयकृत किया जा सकता है ।

Introduction

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HER2 एक आद्य-oncogene है कि और अधिक व्यक्त और सभी इनवेसिव स्तन कैंसर के 15-30% में प्रवर्धितहै1, 2 । HER2 एक्सप्रेस की उपस्थिति से आस्थगित है > 10 मजबूत झिल्ली immunohistochemical (आइएचसी) धुंधला (3 +) के साथ% कोशिकाओं, जबकि जीन प्रवर्धन का मूल्यांकन किया जा सकता है जब या तो HER2/centromere अनुपात ≥ 2 या जीन प्रति संख्या है ≥ 6, पर गिनती पर सीटू संकरण (ISH)3 में से कम से 20 कोशिकाओं ।

अंतर ट्यूमर आनुवंशिक विविधता व्यापक रूप से स्तन कैंसर में वर्णित किया गया है, के लिए एक संभावित प्रतिकूल योगदानकर्ता जा रहा है और परीक्षण उपचार प्रतिक्रिया4। कॉलेज ऑफ अमेरिकन पैथोलॉजिस्ट (कैप) के अनुसार, HER2 विविधता मौजूद है यदि HER2 में परिवर्धित है > 5% और ट्यूमर कोशिकाओं को घुसपैठ करने का < 50%5। अफसोस की बात है, स्तन कैंसर में HER2 स्थानिक विविधता की वास्तविक घटना पैथोलॉजिस्ट के बीच विवाद का विषय बनी हुई है, कुछ लेखकों को बनाए रखने के साथ कि यह एक बेहद दुर्लभ घटना है, और दूसरों के सुझाव है कि मामलों के ४०% तक कर रहे है HER2-विषम1,5,6,7,8,9,10. जैविक तंत्र है कि इस हालत underpin अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे है के बावजूद, शकुन और अंतर ट्यूमर HER2 विविधता के नैदानिक प्रभावों स्तन कैंसर रोगियों के लिए महत्वपूर्ण है11

हाल ही में, उज्ज्वल क्षेत्र आणविक तकनीक, जैसे chromogenic ish (CISH) और चांदी ish (शिष्यवृत्तीची) के रूप में, विविधता ऊतकों में HER2 FFPE का पता लगाने के लिए विश्वसनीय तरीके के रूप में उभरा है, फ्लोरोसेंट ISH (मछली)12की तुलना में कुछ लाभ के साथ. अफसोस, एकल मामलों के थोक विश्लेषण बड़े पलटन अनुसंधान अध्ययन में अव्यावहारिक रहता है । कई समूहों ने सुझाव दिया है कि histochemistry, आइएचसी के संयोजन, और TMA प्रौद्योगिकियों के साथ ISH कैंसर जीव विज्ञान13,14,15,16के अध्ययन में एक मूल्यवान रणनीति का प्रतिनिधित्व कर सकता है । इस व्यापक रूप से अपनाया विधि के साथ, विभिन्न रोगियों से ऊतक के नमूने समवर्ती विश्लेषण किया जा सकता, ऊतक और रिएजेंट को कम करने और इस तरह के मामलों की एक बड़ी श्रृंखला के समान विश्लेषण को बढ़ावा देने के14. हालांकि, कोई प्रोटोकॉल के लिए एक साथ उच्च प्रवाह आणविक लक्षण वर्णन के लिए उपलब्ध है एकाधिक ऊतक नमूनों कि रिएजेंट, निर्धारण समय के संदर्भ में विभिंन प्रसंस्करण से गुजरा, और संरक्षण के तरीके कार्यरत हैं, ऐसे अभिलेखीय के रूप में ब्लॉक.

स्तन कैंसर में HER2 स्थानिक विविधता के शकुन और नैदानिक निहितार्थ को देखते हुए हमने विषम प्रसंस्कृत मामलों की बड़ी श्रृंखलाओं में इसका आकलन करने के लिए एक एकीकृत आणविक मंच विकसित किया. यहां, हम प्रयोगशाला रणनीतियों चित्रित करने के लिए उत्पंन और शिष्यवृत्तीची के माध्यम से स्तन कैंसर के उच्च उपज TMAs में HER2 प्रवर्धन के इंट्रा ट्यूमर विविधता का विश्लेषण । निंनलिखित प्रोटोकॉल को मापने ट्यूमर के लिए विकसित किया गया है > 5 मिमी (> टीएनएम २०१७ के अनुसार pT1b)17। छोटे घावों के लिए, हम पूर्ण चेहरा धारावाहिक वर्गों पर विश्लेषण करने की सलाह देते हैं । हमारी प्रक्रिया के लिए एक साथ आइएचसी और शिष्यवृत्तीची विश्लेषण के लिए अनुमति देता है अप करने के लिए 30 स्तन कैंसर, प्रत्येक मामले के लिए 6 अलग क्षेत्रों (रेंज 4-8) के एक मतलब को शामिल । कुल मिलाकर, १८० व्यास में 1 मिमी के ऊतक कोर, कोर के बीच ५०० µm के साथ, और ग्रिड और किनारों के बीच 2 मिमी प्रत्येक TMA ब्लॉक के लिए उत्पंन किया जाएगा ।

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Protocol

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इस अध्ययन को संस्थागत समीक्षा बोर्डों द्वारा IRCCS सीए ' Granda फाउंडेशन, Policlinico हॉस्पिटल, मिलान, इटली से अनुमोदित किया गया.

1. रोगियों और ऊतक नमूनों का चयन

  1. सभी मामलों के अभिलेखीय स्लाइड प्राप्त सभी उपलब्ध hematoxylin और eosin (एच एंड ई) और मूल निदान से आइएचसी स्लाइड सहित, विश्लेषण किया जा करने के लिए, अगर वर्तमान, एक एच एंड ई मिलान गैर नवोत्पादित स्तन ऊतक के (जैसे, शल्य मार्जिन) .
  2. मामले की समीक्षा करते हैं ।
    नोट: इस कार्य के लिए, स्तन विकृति में अनुभव के साथ कम से कम दो पैथोलॉजिस्ट नैदानिक स्लाइड पर चर्चा और असहमति collegially हल करना चाहिए. या तो एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप या telepathology उपकरण का प्रयोग करें (केंद्रिक अध्ययन में बाद एहसान) । यदि कोई हो, सभी बेताल मामलों को बाहर ।
    1. सभी मामलों के विश्व स्वास्थ्य संगठन के नवीनतम संस्करण के अनुसार ऊतकीय पुनः वर्गीकरण प्रदर्शन (डब्ल्यूएचओ) स्तन के ट्यूमर के वर्गीकरण18
    2. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक मामले के लिए सामांय ऊतक, यदि अभिलेखीय नैदानिक नमूनों में मौजूद है, कम-से-नवोत्पादित टर्मिनल डक्टर-lobular इकाई शामिल है ।
    3. एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर विषम कोशिकाविज्ञान, वास्तु, या आइएचसी सुविधाओं को दिखाने वाले सभी नवोत्पादित क्षेत्रों की पहचान (संयुक्त रूप से एक पैथोलॉजिस्ट और तकनीशियन (ओं) जो TMAs का निर्माण होगा द्वारा प्रदर्शन किया जाएगा).
  3. कांच स्लाइड पर मार्कर के साथ या डिजिटल स्लाइड सॉफ्टवेयर पर उचित उपकरण के साथ असतत स्थलाकृतिक क्षेत्रों को हाइलाइट करें (चित्र 1a) ।
  4. चयनित स्लाइड्स के आधार पर, अभिलेखागार से इसी FFPE ब्लॉक पुनः प्राप्त करें ।
    नोट: TMA निर्माण का अनुकूलन करने के लिए, ऊतक कमी से बचने के लिए, और TMA पंच संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए, < 1 mm-मोटी अवशिष्ट ऊतक के साथ मामलों को बाहर रखा जाना चाहिए ।

2. Kononen तकनीक के आधार पर डिजाइन और निर्माण TMAs

  1. बनाएं और प्रत्येक मामले के विभिंन क्षेत्रों के अभिलेखों को शामिल एक नई स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलें । अलग कॉलम पर निंनलिखित डेटा शामिल करें, तालिका 1 में उदाहरण के रूप में: केस आईडी, ब्लॉक आईडी, क्षेत्र आईडी, ऊतक प्रकार (उदा., सामांय ऊतक, आक्रामक घटक histotype, सीटू घटक histotype में ), स्थलाकृति (उदा, ट्यूमर कोर, इनवेसिव फ्रंट), आकृति विज्ञान (जैसे, परमाणु ग्रेड, वास्तुकला, mitoses, कोशिकाविज्ञान सुविधाओं), (यानी, एस्ट्रोजन रिसेप्टर (एर), प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीआर), Ki67, और HER2), और अन्य सभी आइएचसी सुविधाओं उपलब्ध है ।
    1. दस्तावेज़ सहेजें ।
  2. एक TMA प्रोजेक्ट बनाएं ।
    1. स्थापित करें और TMA डिज़ाइनर सॉफ़्टवेयर खोलें ।
    2. TMA प्राप्तकर्ता ब्लॉक (ओं) को परिभाषित: मेनू फ़ाइल के माध्यम से प्रवेश > नई > ब्लॉक या CTRL + B का उपयोग करके ।
    3. टैब कुंजी को भरने या दबाने के लिए पहले फ़ील्ड में क्लिक करें, और आयल ब्लॉक के आयामों में लिखें: चौड़ाई ३५ (मिमी), ऊंचाई 20 (मिमी) । "मार्जिन" वैल्यू (यानी, मिमी में आयल एज से दूरी) (आंकड़ा 1b) के रूप में "2" टाइप करें । उचित बटन क्लिक करके डेटा को सहेजें । प्राप्तकर्ता ब्लॉक के नए टेम्पलेट अब सहेजा गया है और नए ऊतक सरणी टेम्पलेट्स में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है.
    4. एक ऊतक सरणी परियोजना बनाएं: मेनू फ़ाइल तक पहुंच > नई > ऊतक सरणी या CTRL + टी का उपयोग करके ।
    5. ऊतक सरणी, टिप्पणियां, और लेखक के नाम भरें, तो क्लिक करें "अगला." "आयात" चिह्न पर क्लिक करें, पहले बनाए गए प्राप्तकर्ता ब्लॉक की टेम्पलेट फ़ाइल चुनें और "अगला" क्लिक करें.
    6. गोल बटन पर क्लिक करके स्थान आकार के रूप में 1 mm चुनें । स्थान रिक्ति जो पड़ोसी धब्बे के दो केंद्रों के बीच अंतरिक्ष है के रूप में ५०० µm चुनें । २३१ होना चाहिए जो बनाए गए धब्बे की कुल संख्या की गणना करने के लिए कैलकुलेटर आइकन पर क्लिक करें । "अगला" क्लिक करें ।
    7. उस पर एक बार क्लिक करके स्थान क्रमांकन मोड परिभाषित करें । बटन पर क्लिक करें "परिभाषित" ग्रिड और सब-ग्रिड बनाने के लिए । केंद्रीय पंक्ति (पंक्ति 6) और स्तंभ 8 और 15 को हटाएँ । ओरिएंटेशन के लिए 1 लाइन के 3 स्थानों को बनाए रखने । अंतिम नक्शा १८३ स्थानों की कुल संख्या शामिल है, के रूप में चित्रा 2में प्रतिनिधित्व करना चाहिए ।
    8. ऊतक प्रकार की सूची को परिभाषित: मेनू फ़ाइल के माध्यम से प्रवेश > नई > ऊतक प्रकार की सूची या CTRL + L का उपयोग करके
    9. ऊतक वर्णन पहले से परिभाषित डालें । प्रेस नीचे तीर या एक पंक्ति जोड़ने के लिए + बटन पर क्लिक करें ।
    10. परियोजना को परिभाषित: मेनू फ़ाइल के माध्यम से प्रवेश > नई > बूस्टर परियोजना या CTRL + पी का उपयोग करके ।
    11. ऊतक सरणी, टिप्पणियां, और लेखक के नाम भरें, तो क्लिक करें "अगला." स्प्रेडशीट फ़ाइल, ऊतक प्रकार की सूची, और ऊतक सरणी मॉडल पहले उचित माउस को क्लिक करके बनाया आयात करें ।
    12. क्लिक करें "सभी का चयन करें" और प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए स्थानों की संख्या को परिभाषित; सेटिंग्स लागू करने के लिए "मैच" बटन पर क्लिक करें । एक तालिका जो नमूना लिया जाएगा और इस प्रोजेक्ट में प्राप्तकर्ता ब्लॉकों में स्थानांतरित कोर की कुल संख्या दिखाई देगा । प्रोजेक्ट को सहेजें और प्रोग्राम को बंद करें ।
  3. स्वीकार्य ब्लॉक (s) (चित्र 1b) तैयार करें ।
    1. ६५ डिग्री सेल्सियस पर लोचदार आयल के साथ शुद्ध धातु molds भरें ।
    2. आयल ब्लॉक्स को छोड़ कर मेटल मोल्ड्स के अंदर रातोंरात कमरे के तापमान को ठंडा कर दें ।
    3. धातु molds से आयल ब्लॉक निकालें । यदि दरारें होती हैं, तो ब्लॉक को छोड़ें और 2.3.1-2.3.3 चरण दोहराएँ.
  4. TMA का निर्माण एक स्वचालित या अर्द्ध स्वचालित सरणी19का उपयोग कर ।
    1. सभी चयनित FFPE ब्लॉकों और इसी एच और ई वर्गों एनोटेशन के साथ पुनः प्राप्त ।
    2. सरणीर चालू करें और स्वीकारकर्ता ब्लॉक (s) को सरणी कैरोसल पर डालें.
    3. सरणी नियंत्रण स्टेशन सॉफ्टवेयर खोलें, पर क्लिक करें "नई ऊतक सरणी", और पहले से बनाया परियोजना लोड (चित्रा 1C) ।
    4. क्लिक करें "जारी रखें" और मेनू से दाता ब्लॉक (ओं) की स्थिति का चयन ।
    5. प्रत्येक प्राप्तकर्ता ब्लॉक पर प्रारंभिक स्थिति निर्धारित करें: लेजर लाइट ले जाने के लिए तीर कुंजियों का उपयोग और प्राप्तकर्ता ब्लॉक के आयल पर ऊपर-बाएं किनारे के साथ संरेखित ।
    6. "अगला" क्लिक करें और अनुलंब संरेखण के लिए दोहराएं ।
    7. प्राप्तकर्ता (स्वीकारकर्ता) ब्लॉक के पहले से निर्धारित समंवय में एक छिद्र स्वचालित रूप से बनाने के लिए "अगला" क्लिक करें ।
    8. पंच खाली.
    9. नमूने के लिए दाता ब्लॉक स्थिति और ब्याज की पहले से व्याख्या क्षेत्र से एक ऊतक कोर को हटा दें ।
    10. प्राप्तकर्ता (स्वीकारकर्ता) ब्लॉक में छेद में दाता ऊतक कोर डालें ।
    11. दाता ब्लॉक को सरणी से निकाल दें ।
    12. दोहराएं चरण 2.4.5-2.4.11 TMA पूर्ण होने तक ।
  5. एक बाँझ रिक्त स्लाइड पर नव उत्पन्न TMA ब्लॉक के टिशू साइड रखो और उन्हें 5 मिनट के लिए ४५ डिग्री सेल्सियस पर लैब ओवन में जगह है ।
  6. धीरे ऊतक कोर समतल करने के लिए 5 एस के लिए स्लाइड पर ब्लॉक दबाएँ. दोहराएं एक बार (कुल 2 बार के लिए) ।
  7. TMA ब्लॉक एक साथ ओवन से स्लाइड के साथ निकालें, उन्हें फ्लिप, और धीरे स्लाइड से ब्लॉक अलग.
  8. ६५ डिग्री सेल्सियस पर लोचदार तेल की एक पतली परत के साथ TMA ऊतक सतह को कवर ।
  9. 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर TMA ब्लॉक छोड़ दें ।
  10. 24 घंटे के लिए 4 ° c पर TMA ब्लॉक स्थानांतरण ।
    नोट: TMA ब्लॉक 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा किया जा सकता है जब तक थकावट ।

3. Histochemical और Immunohistochemical िरा

  1. कट TMA वर्गों ।
    1. TMA स्वीकारकर्ता ब्लॉक (ओं) के साथ एक-10 ° c सतह पर 10 मिनट के लिए आयल चिल अप के साथ नीचे प्लेस ।
    2. ultrapure पानी के साथ एक फ्लोटिंग स्नान भरें और ३८ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी सेट ।
    3. एक रोटरी microtome पर एक नया ब्लेड प्लेस और microtome चक में ब्लॉक डालें तो मोम ब्लॉक ब्लेड चेहरे और ऊर्ध्वाधर विमान में गठबंधन है ।
    4. ब्लेड के साथ ध्यान से ब्लॉक दृष्टिकोण और स्थिति सही है सुनिश्चित करने के लिए कुछ पतली वर्गों में कटौती; यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें ।
    5. कट 3 µm-मोटी वर्गों ।
    6. चिमटी का उपयोग कर वर्गों उठाओ और पानी स्नान की सतह पर उन्हें नाव ।
    7. नियमित और आइएचसी/ISH ग्लास स्लाइड पर जल स्नान बाहर वर्गों उठाओ ।
    8. एक रैक पर स्लाइड प्लेस और उंहें ४५ डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रातोंरात स्टोर ।
      नोट: एक बार तैयार, TMA वर्गों 24 एच के भीतर दाग होना चाहिए ।
  2. प्रदर्शन histochemical धुंधला (एच एंड ई) एक दाग का उपयोग कर ।
    1. पर दाग रैक में स्लाइड डालें और उंहें ६० ° c पर 10 मिनट के लिए जगह है ।
    2. एक मानक एच एंड ई क्लिप का सामना करना पड़ के साथ लोड स्टेशनों में से एक में TMA स्लाइड के साथ रैक डालने और दाग के लोड दराज खोलें ।
    3. एक बार दराज बंद कर दिया है, क्लिप स्वचालित रूप से प्रणाली द्वारा मांयता प्राप्त हो जाएगा और निंनलिखित प्रोटोकॉल शुरू हो जाएगा: ३७ डिग्री सेल्सियस (6 मिनट), xylene (2 मिनट), xylene (2 मिनट), इथेनॉल १००% (2 मिनट), इथेनॉल १००% (2 मिनट), इथेनॉल ९५% (2 मिनट), इथेनॉल ९५% (2 मिनट) में ओवन स्टेशन , आसुत जल (4 मिनट), है Carazzi hematoxylin (9 मिनट), कम दबाव पानी चल (2 मिनट), eosin 1% (1 मिनट), कम दबाव पानी चल (2 मिनट), इथेनॉल ९५% (20 एस), ९५% इथेनॉल (20 एस), इथेनॉल ९५% (20 एस), इथेनॉल ९५% (20 एस), इथेनॉल १००% (15 एस), इथेनॉल १००% (15 एस) , xylene (30 एस), xylene (30 एस) ।
    4. दराज से रैक उतारना और एक कवर पर्ची के साथ स्लाइड माउंट ।
      1. एक पिपेट के साथ माउंट की एक बूंद ले लीजिए और इसे कवर स्लाइड के एक बाहरी छोर पर डाल दिया ।
      2. स्लाइड पर कवर स्लिप के गीले साइड प्लेस और चलो 30 मिनट के लिए सूखी माउंट ।
  3. एक स्वचालित immunostainer का उपयोग कर एर, पीआर, Ki67, और HER2 के लिए आइएचसी धुंधला प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: एक धुंधला चलाने शुरू करने से पहले, सिस्टम शुरू, और उपभोग्य एजेंट की बोतलें (सामग्री की तालिका) और अपशिष्ट कंटेनरों की जांच करें ।
    1. 10 मिनट के लिए ६० ° c पर विश्लेषण करने के लिए TMA स्लाइड रखें ।
    2. immunostainer साधन और सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं ।
    3. होम दृश्य पर, प्रोटोकॉल बटन क्लिक करें, और फिर प्रोटोकॉल बनाएं/
    4. मूल टेंपलेट को संशोधित करने के लिए मानक ढाब (3, 3 '-diaminobenzidine) आइएचसी कार्यविधि का चयन करें ।
    5. बॉक्स सूची में "Deparaffinization" फ्लैग करें और मध्यम तापमान ७२ डिग्री सेल्सियस पर सेट करें ।
    6. cc1 मास्किंग समाधान फ्लैग करें, ९५ डिग्री सेल्सियस पर मध्यम तापमान सेट, और ३६ मिनट में मशीन समय ।
    7. प्राथमिक एंटीबॉडी बॉक्स फ्लैग करें, ईआर इनलाइन मशीन की आईडी डालें (साधन सॉफ्टवेयर एजेंट हिंडोला पर मशीन की पहचान करेगा), और 16 मिनट में मशीन समय निर्धारित किया है ।
    8. Counterstaining बॉक्स में, का चयन करें Hematoxylin मैं, और 12 मिनट में मशीन समय निर्धारित करें ।
    9. "इस रूप में सहेजें" बटन क्लिक करें और प्रोटोकॉल का नाम ।
    10. चरणों को दोहराएँ 3.3.3-शेष एंटीबॉडी निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन का उपयोग कर के लिए 3.3.9: पीआर 16 मिनट, Ki67 16 मिनट, और HER2 12 मिनट. पूर्व पतला तैयार करने के लिए उपयोग (्टू) एंटीबॉडी का उपयोग करें.
    11. मुख पृष्ठ दृश्य पर, लेबल बनाएं बटन क्लिक करें ।
    12. प्रोटोकॉल बटन क्लिक करें और एर, पीआर, Ki67, और HER2 प्रोटोकॉल का विश्लेषण करने के लिए TMA में से प्रत्येक के लिए जोड़ें ।
    13. क्लिक/Print बंद करेंबटन है ।
    14. जैसा कि लेबल टेंपलेट प्रकट होता है, लेबल के लिए TMA IDs दर्ज करें ।
    15. लेबल मुद्रित करने के लिए मुद्रण बटन क्लिक करें, और तब उंहें TMA स्लाइड पर लागू है ।
    16. साधन आइकन पर क्लिक करें और "तैयार" के रूप में साधन स्टार्टअप मोड सेट.
    17. डाकू है कि रिएजेंट हिंडोला शामिल खोलो, पता लगाने प्रणाली जगह है, और प्राथमिक एंटीबॉडी, तो डाकू बंद करो ।
    18. इसे खोलने के लिए स्लाइड दराज पर फ्रंट बटन पर क्लिक करें, TMA स्लाइड को लोड करके उसी बटन पर क्लिक करके दराज को बंद कर दीजिये ।
    19. इंस्ट्रूमेंट स्टार्टअप मोड को "रनिंग" के रूप में सेट करें और निर्देशों का पालन करें ।
    20. रन के अंत में, साधन स्लाइड नियंत्रण पर पूर्ण स्लाइड बटन के साथ खुले सभी दराज दबाकर TMA स्लाइडों को अनलोड और किसी भी शेष एजेंट को दूर करने के लिए उन्हें गर्म साबुन के पानी में कुल्ला ।
    21. कम दबाव ठंड चल रहे पानी के तहत स्लाइड धो, TMA स्लाइड निर्जलीकरण, और प्रत्येक स्लाइड के लिए एक गिलास coverslip लागू होते हैं ।
  4. अमेरिकन सोसायटी ऑफ क्लिनिकल ऑन्कोलॉजी (ASCO)/CAP दिशानिर्देश, और Ki67 के स्तन कैंसर कार्य समूह (तालिका 2) में अंतरराष्ट्रीय Ki67 की सिफारिशों के अनुसार के बाद एर, पीआर, और HER2 के आइएचसी विश्लेषण करते हैं ।
    नोट: यह विश्लेषण स्तन विकृति में एक अनुभव के साथ एक पैथोलॉजिस्ट द्वारा असतत ऊतक स्थानों में अलग से किया जाना चाहिए ।
    1. यदि ≥ 1% ट्यूमर सेल नाभिक immunoreactive20,21,22,23है के रूप में एर अभिव्यक्ति सकारात्मक का आकलन करें ।
    2. सकारात्मक के रूप में पीआर अभिव्यक्ति का आकलन अगर ≥ ट्यूमर सेल नाभिक के 1% immunoreactive20,21,22,23रहे हैं ।
    3. के रूप में HER2 अभिव्यक्ति का आकलन करें: एक) 3 स्कोर अगर circumferential झिल्ली धुंधला है कि पूर्ण और तीव्र है, ख) स्कोर 2 + यदि circumferential झिल्ली धुंधला अधूरा है और/या कमजोर/के भीतर और > 10% इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं के या पूर्ण और circumferential झिल्ली धुंधला तीव्र और इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं के ≤ 10% के भीतर है, ग) स्कोर 1 + यदि अपूर्ण झिल्ली धुंधला है बेहोश/बमुश्किल प्रत्यक्ष और भीतर > इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं के 10%, d) नकारात्मक अगर कोई धुंधला मौजूद है या झिल्ली धुंधला अधूरा और बेहोश/बमुश्किल प्रत्यक्ष और ≤ के भीतर 10% इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं के3,24
    4. Ki67 सूचकांक के रूप में परमाणु धुंधला के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में न्यूनतम १,००० नवोत्पादित कोशिकाओं पर बेतरतीब ढंग से चयनित 10 उच्च शक्ति क्षेत्रों (आवर्धन, 400X)25का आकलन करें ।

4. HER2 का शिष्यवृत्तीची विश्लेषण

  1. कट TMA वर्गों (दोहराने चरण ३.१) ।
  2. किसी स्वचालित immunostainer का उपयोग करके HER2 के लिए शिष्यवृत्तीची निष्पादित करें ।
    1. 10 मिनट के लिए ६० ° c पर विश्लेषण करने के लिए TMA स्लाइड रखें ।
    2. immunostainer साधन और सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं ।
    3. होम दृश्य पर, प्रोटोकॉल बटन क्लिक करें, और फिर प्रोटोकॉल बनाएं/
    4. मूल टेम्पलेट को संशोधित करने के लिए "U डुएल ISH CKT" कार्यविधि का चयन करें ।
    5. बॉक्स सूची में "सुखाने" फ्लैग करें और 20 मिनट के लिए ६३ डिग्री सेल्सियस पर तापमान निर्धारित किया है ।
    6. "कक्ष कंडीशनिंग" बॉक्स सूची में, फिर "सेल कंडीशनिंग CC2" फ्लैग करें, और 4 मिनट में ८६ ° c और मशीन समय पर तापमान सेट करें ।
    7. CC2 हल्के (1 चक्र), मानक (चक्र 2), और विस्तारित (चक्र 3) 8 मिनट, 12 मिनट, और 8 मिनट, क्रमशः के लिए फ्लैग करें ।
    8. "ISH-छेड़ो 3" बॉक्स सूची में फ्लैग करें और 16 मिनट में मशीन समय निर्धारित किया है ।
    9. जांच HER2DNP और CHR17DIG का चयन करें और 6 एच में मशीन समय निर्धारित किया है ।
    10. 8 मिनट के लिए ७६ ° c पर धुलाई सेट ।
    11. ३२ मिनट पर शिष्यवृत्तीची multimer (एसआईएल ISH DNP एचआरपी) मशीन समय निर्धारित करें ।
    12. 4 मिनट में सिल्वर chromogen (एसआईएल ISH DNP CHRC) मशीन समय निर्धारित करें ।
    13. 24 मिनट में लाल multimer (लाल ISH खुदाई एपी) मशीन समय निर्धारित करें ।
    14. 8 मिनट में लाल chromogen (लाल ISH खुदाई FR) मशीन समय निर्धारित करें ।
    15. "Counterstaining" बॉक्स सूची में, "HEMATOXYLIN द्वितीय" का चयन करें, और 8 मिनट में मशीन समय निर्धारित फ्लैग करें ।
    16. "पोस्ट-Counterstaining" बॉक्स सूची में, "BLUING रिएजेंट" का चयन करें, और 4 मिनट में मशीन समय सेट फ्लैग करें ।
    17. 3.3.11-3.3.15 से चरणों को दोहराएँ (संशोधित यू दोहरी ISH CKT प्रोटोकॉल का चयन करें).
    18. डाकू है कि रिएजेंट हिंडोला कवर खोलो, धोने और ISH जांच प्रणालियों जगह है, तो डाकू बंद करो ।
    19. 3.3.18-3.3.21 से चरण दोहराएँ ।
  3. प्रदर्शन शिष्यवृत्तीची विश्लेषण के लिए HER2: सकारात्मक रूप में HER2 जीन प्रवर्धन का आकलन करें यदि HER2/CEP17 अनुपात एक औसत प्रतिलिपि संख्या HER2 ४.० संकेतों के साथ प्रति कक्ष, और नकारात्मक अगर HER2 अनुपात < 2.0 है के साथ/CEP17 २.० है एक औसत HER2 प्रतिलिपि संख्या < 4.0 संकेतों के साथ3,24
    नोट: आइएचसी के लिए इसी तरह, यह विश्लेषण स्तन विकृति में अनुभव के साथ एक पैथोलॉजिस्ट द्वारा असतत ऊतक स्थानों में अलग से किया जाना चाहिए ।

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Representative Results

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कुल मिलाकर, ४४४ इनवेसिव स्तन कैंसर विशेष रूप से ISH विश्लेषण के लिए अनुकूलित 15 TMAs में शामिल किया गया । २,६६४ स्पॉट नमूने के अलावा, २,६५१ (९९.५%) पहले से चयनित क्षेत्रों के प्रतिनिधि थे और इसलिए बाद में विश्लेषण के लिए उत्तरदायी माना जाता है । इंट्रा ट्यूमर विविधता आइएचसी और शिः के माध्यम से निर्धारित किया गया था, ट्यूमर के विशिष्ट स्थलाकृतिक क्षेत्रों में HER2-सकारात्मक क्लोनों के विषम वितरण पर एक विशेष ध्यान के साथ । तालिका 3 में विश्लेषित मामलों की जीवविज्ञान विशेषताओं को दर्शाया गया है, जो विभिन्न histotypes के भीतर ईआर, पीआर, Ki67 और HER2 स्थिति पर ध्यान केंद्रित कर रहा है । विशेष रूप से, मामलों के 18% में HER2-सकारात्मक कोशिकाओं को प्रदर्शित पाया गया > ट्यूमर कोशिकाओं के 10%, और इसलिए HER2 धनात्मकता मूल्यांकन के लिए विशेषताओं का मिलान किया । दिलचस्प है, यह मान HER2-सकारात्मक स्तन कैंसर की रिपोर्ट घटना रेंज के निचले छोर के करीब है । दूसरी ओर, HER2 स्थिति दोनों HER2 के असतत क्षेत्रों में चर रहा था-सकारात्मक और HER2-नकारात्मक स्तन कैंसर (चित्रा 3, तालिका 4), धारणा है कि स्तन कैंसर एक अत्यंत विषम रोग है पर आगे बल प्रदान जीनोमिक तर. शिष्यवृत्तीची विश्लेषण की असफलता की दर ०.८% थी, जिसमें 2629/2651 स्पॉट की कुल संख्या के साथ dinitrophenol-tagged जांच लक्ष्य दृश्यों के लिए बाध्य ।

Figure 1
चित्र 1 : स्तन कैंसर के बड़े साथियों में HER2 विविधता के विश्लेषण के लिए एक उच्च प्रवाह मंच की प्राप्ति में आधारशिला चरणों का प्रतिनिधित्व । () नमूने के लिए क्षेत्रों का चयन कोशिकाविज्ञान, वास्तु, या आइएचसी विविधता के साथ सभी क्षेत्रों की पहचान और हाइलाइट शामिल करना चाहिए. (B) इस कार्यविधि के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक उच्च-गुणवत्ता वाले स्वीकारकर्ता ब्लॉक का निर्माण होता है, यह देखते हुए कि एक सूक्ष्म दरार सीटू संकरण विश्लेषणों में बाद की निरंतरता का अनुमान भी कर सकती है । (C) Kononen तकनीक पर आधारित उच्च उपज TMA का निर्माण करने के लिए 1 मिमी व्यास वाली सुई के साथ डिजिटली निर्देशित सरणी को नियोजित करना महत्वपूर्ण है । (D) TMA परियोजना का निर्माण TMA के आयामों और सीमाओं की परिभाषा से प्रारंभ होना चाहिए । () सभी आइएचसी और ISH विश्लेषण डिजिटल पैथोलॉजी उपकरणों का उपयोग किया जाना चाहिए, ताकि जल्दी से TMA भर में नेविगेट करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Planimetric प्रतिनिधित्व के TMA इस प्रोटोकॉल के लिए एहसास हुआ. 1 मिमी व्यास, ५०० µm के अलावा १८० स्थानों की कुल संख्या, सीटू संकरण में एक इष्टतम के लिए अनुमति देते हैं । सघन TMAs समग्र गुणवत्ता और एक एकल स्थान के आधार पर एक उच्च विफलता दर के साथ सभी स्थानों में प्रतिक्रियाओं की एकरूपता के मामले में अनुत्पादक परिणाम प्रदान करते हैं । ग्रिड के ऊपर-और मध्य-बाएं में "ओरिएंटेशन" स्पॉट को नोट करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ दिखा रहे चांदी सीटू में एक HER2-विषम स्तन कैंसर के संकरण विश्लेषण । इस paradigmatic उदाहरण में, कोई विशेष प्रकार के एक उच्च ग्रेड इनवेसिव स्तन कैंसर के दो अलग अलग स्थानों (BR_121) centromeric गणन जांच 17 (लाल) की तुलना में HER2 जीन (काला) प्रवर्धन के संदर्भ में विभिंन परिणाम दिखाया । विशेष रूप से, एक क्षेत्र ट्यूमर कोर से संबंधित है और cytokeratin दिखा 7 अनियमित धुंधला पैटर्न HER2 परिवर्धित (एक) था, जबकि इनवेसिव सामने (यानी, ट्यूमर के किनारे से एक ही स्थान) एक जंगली प्रकार HER2 प्रदर्शित प्रतिमान (B) । स्केल बार्स = ५० µm (presets में 20 µm). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

केस आईडी ब्लॉक आईडी क्षेत्र ID ऊतक स्थलाकृति विज्ञान er pr Ki67 her2 अन्य आइएचसी सुविधाएँ
BR_121 a5 एक सामान्य सर्जिकल मार्जिन
BR_121 a1 एक nst ट्यूमर कोर g2 CK7 +
BR_121 a1 बी nst ट्यूमर कोर g3 CK7 +/
BR_121 a3 एक nst ट्यूमर कोर Mucinous स्ट्रोमा ९० १०० 12 2 +
BR_121 a3 बी nst इनवेसिव फ्रंट ट्यूबलर १०० १०० ३५ 2 +
BR_121 a4 एक nst इनवेसिव फ्रंट g3
BR_121 a3 सी DCIS (EIC +) इनवेसिव फ्रंट से सटे उच्च ग्रेड १०० १०० ४५ 2 +

तालिका 1: एक मामले के प्रतिनिधि रिकॉर्ड अध्ययन में शामिल. इस मामले (BR_121) फोकल myxoid स्ट्रोमा के साथ कोई विशेष प्रकार के एक उच्च ग्रेड इनवेसिव कार्सिनोमा था, घाव की परिधि में एक मामूली ट्यूबलर घटक दिखा रहा है, और CK7 immunoexpression के फोकल अनियमित नुकसान । immunohistochemical विशेषताएं, जिनमें शामिल हैं, की रिपोर्टिंग, निदान के समय निष्पादित विश्लेषणों को संदर्भित करता है । NST, कोई विशेष प्रकार के इनवेसिव कार्सिनोमा; DCIS, सीटू मेंडक्टर कार्सिनोमा; EIC +, व्यापक intraductal घटक; CK7, cytokeratin 7.

मार्कर क्लोन कंपनी कमजोर उदीयमान Antigen पुनर्प्राप्ति एंटीबॉडी की मशीन स्कोरिंग प्रणाली
er sp1 ventana ्टू ७२ डिग्री सेल्सियस पर ईज़ी तैयारी ३६ मिनट के लिए ९५ ° c पर cc1 16 min ASCO/कैप दिशानिर्देश23
pr 1E2 ventana ्टू ७२ डिग्री सेल्सियस पर ईज़ी तैयारी ३६ मिनट के लिए ९५ ° c पर cc1 17 min ASCO/कैप दिशानिर्देश23
her2 4b5 ventana ्टू ७२ डिग्री सेल्सियस पर ईज़ी तैयारी ३६ मिनट के लिए ९५ ° c पर cc1 18 min ASCO/कैप दिशानिर्देश3
Ki67 30-9 ventana ्टू ७२ डिग्री सेल्सियस पर ईज़ी तैयारी ३६ मिनट के लिए ९५ ° c पर cc1 12 min अंतर्राष्ट्रीय स्तन कैंसर कार्य समूह सिफारिशों में Ki6725

तालिका 2: एंटीबॉडी, क्लोन, कमजोर पड़ने, प्रतिजन लाने के तरीकों की सूची, और स्कोरिंग प्रणालियों immunohistochemical विश्लेषण के लिए अपनाया. एर, एस्ट्रोजन रिसेप्टर; पीआर, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर; ्टू, रेडी-टू-उपयोग ।

Histotype n (%) एर + (%) पीआर + (%) Ki67-कम (%) Ki-६७-उच्च (%) HER2 + (%)
कोई विशेष प्रकार के इनवेसिव कार्सिनोमा ३४४ (७७.५) ३०१ (८७.५) २५७ (७४.७) ८५ (२४.७) २५९ (७५.३) ७१ (२०.६)
इनवेसिव lobular कार्सिनोमा ५३ (११.९) ५३ (१००.०) ४४ (८३.०) ३६ (६७.९) 17 (३२.०) 4 (७.५)
इनवेसिव कार्सिनोमा, मिश्रित प्रकार 9 (२.०) 8 (८८.९) 6 (६६.७) 0 (०.०) 9 (१००.०) 1 (११.१)
ट्यूबलर कार्सिनोमा 8 (१.८) 8 (१००.०) 8 (१००.०) 8 (१००.०) 0 (०.०) 0 (०.०)
Mucinous कार्सिनोमा 11 (२.४) 11 (१००.०) 9 (८१.८) 7 (६३.६) 4 (३६.४) 0 (०.०)
Micropapullary कार्सिनोमा 7 (१.६) 7 (१००.०) 7 (१००.०) 5 (७१.४) 2 (२८.६) 2 (२८.६)
अपोक्राइन featueres के साथ इनवेसिव कार्सिनोमा 5 (१.१) 3 (६०.०) 1 (२०.०) 1 (२०.०) 4 (८०.०) 3 (६०.०)
इल्लों कार्सिनोमा 1 (०.२) 0 (०.०) 0 (०.०) 0 (०.०) 1 (१००.०) 0 (०.०)
दिमाग़ी कार्सिनोमा 4 (०.९) 0 (०.०) 1 (२५.०) 0 (०.०) 4 (१००.०) 0 (०.०)
Metaplastic कार्सिनोमा 2 (०.५) 0 (०.०) 0 (०.०) 0 (०.०) 2 (१००.०) 0 (०.०)
कुल ४४४ ३९१ (८८.०) ३३३ (७५.०) १४२ (३२.०) ३०२ (६८.०) ८१ (१८.२)

तालिका 3: स्तन कैंसर histotypes, रिसेप्टर स्थिति, और HER2 विविधता स्थिति. एर, एस्ट्रोजन रिसेप्टर; पीआर, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर; Ki67-ंयून, Ki67 अनुक्रमणिका < 18%; Ki67-उच्च, Ki67 > 18% ।

व्याख्यात्मक नवोत्पादित धब्बे HER2-पॉजिटिव स्पॉट (%) हार्मोन रिसेप्टर्स स्थिति HER2-विषम मामले
6 5 (८३) सकारात्मक 10
6 5 (८३) नकारात्मक 1
6 4 (६७) सकारात्मक 7
6 4 (६७) नकारात्मक 1
6 2 (३३) नकारात्मक 1
6 1 (17) सकारात्मक 1
5 3 (६०) सकारात्मक 10
5 1 (20) सकारात्मक 2
4 3 (७५) सकारात्मक 9
4 2 (५०) सकारात्मक 8
4 1 (25) नकारात्मक 1
3 2 (६७) सकारात्मक 5
3 1 (३३) सकारात्मक 2
४६ 25 (५४) ५३ (९३) ५७

तालिका 4: HER2 व्यंजक, हार्मोन रिसेप्टर स्थिति, और HER2-विषम मामले. बीच में ५७ HER2-विषम मामलों, 4 (7%) मामले थे एर-नकारात्मक और पीआर-नकारात्मक, HER2 विविधता का आकलन करने के नैदानिक महत्व की पुष्टि ।

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Discussion

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यहां, हम है प्रयोगशाला रणनीतियों विस्तृत करने के लिए HER2 जीन और इसके इसी centromere के शिष्यवृत्तीची विश्लेषण प्रदर्शन विषम प्रसंस्कृत स्तन कैंसर के उच्च उपज TMAs में । यह विधि लागत प्रभावी है और सबसे प्रयोगशालाओं में स्तन कैंसर के बड़े साथियों में HER2 जीन प्रवर्धन विविधता के अध्ययन के लिए किया जा सकता है प्राप्त फार्म पैथोलॉजी अभिलेखागार ।

स्तन कैंसर में HER2 परीक्षण के नैदानिक महत्व और अपनी विषम अभिव्यक्ति द्वारा उत्पंन चुनौतियों के कारण, हम अंतर का आकलन करने के लिए एक उच्च प्रवाह परीक्षण प्रोटोकॉल विकसित की है और इंटर ट्यूमर HER2 आनुवंशिक विविधता । विश्लेषण क्षेत्रों में विशिष्ट कोशिकाविज्ञान, वास्तु, और आइएचसी सुविधाओं के आधार पर पूर्व इनवेसिव और आक्रामक घटकों, शामिल हैं ।

वहां कई महत्वपूर्ण चरणों है कि ध्यान से इस प्रोटोकॉल में प्रबंधित किया जाना चाहिए रहे हैं । एक आवश्यक कदम ब्याज के क्षेत्रों का चयन है । हमने निर्धारित किया है कि एक multidisciplinary दृष्टिकोण के माध्यम से विभिंन स्थलाकृतिक क्षेत्रों की एनोटेशन अंतिम आणविक विश्लेषण की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए निर्णायक है । विशेष रूप से, नैदानिक स्लाइड के संयुक्त संशोधन एक पैथोलॉजिस्ट द्वारा प्रदर्शन किया और एक तकनीशियन पर्याप्त स्थानों की संख्या में भारी वृद्धि (यानी, स्थानों स्लाइड पर पहचान क्षेत्र को दर्शातीहै) और बाद में की असफलता की दर को कम एकल स्पॉट विश्लेषण । हालांकि, कई आइएचसी और ISH विश्लेषण के लिए धारावाहिक वर्गों के बाद अनेक ट्यूमर धब्बे खो सकते हैं । इस असुविधा को दूर करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं TMAs के निर्माण में डुप्लिकेट या तपसिल, यदि सभी संभव ऊतक उपलब्धता के आधार पर. इसके अलावा, हम TMAs के लिए स्वीकारकर्ता FFPE ब्लॉकों के निर्माण के लिए सख्त प्रयोगशाला प्रक्रियाओं को परिभाषित करने के महत्व पर प्रकाश डाला । दरअसल, हमने देखा है कि TMA ब्लॉक में एक ंयूनतम दरार गुणवत्ता, reproducibility, और प्रतिक्रिया की स्पष्टता के मामले में पूरे ISH विश्लेषण अनुमान हो सकता है । यदि दरारें होती हैं, तो दाता ब्लॉक TMA निर्माण के लिए अवहेलना की जानी चाहिए । यह स्वीकार किया जाना चाहिए, तथापि, कि आइएचसी भी इष्टतम TMAs में प्रदर्शन किया जा सकता है, और इस तरह के विश्लेषण के दौरान तकनीकी समस्याओं का कोई सबूत हमारे अनुभव में मनाया गया है ।

बावजूद इसके कि इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से उच्च उपज स्तन TMAs के HER2 शिष्यवृत्तीची विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, यह ध्यान देने की है कि मछली और आइएचसी के रूप में अंय विश्लेषण, मज़बूती से कई ऊतक प्रकार में प्रदर्शन किया जा सकता है, जैसा कि पहले14वर्णित है, 19,26. हालांकि, हमने स्तन कैंसर के नमूनों में उच्च-गुणवत्ता वाले और प्रतिलिपि शिष्यवृत्तीची विश्लेषणों को सुनिश्चित करने के लिए TMA के स्थानों और स्थलाकृतिक विशेषता के आदर्श संख्या को परिभाषित किया है । एक और महत्वपूर्ण बात मानक का आकार देने स्वचालित शिष्यवृत्तीची प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करने के लिए कई नमूनों की ख़ासियत मैच का विश्लेषण किया जाना है । दरअसल, निर्माताओं के दिशानिर्देश आम तौर पर पारंपरिक पूर्ण चेहरा वर्गों के आणविक विश्लेषण के लिए किए गए हैं, और इसलिए अभिलेखीय FFPE ब्लॉकों से ऐसे TMAs में के रूप में विषम संसाधित ऊतकों के नमूनों पर उच्च मानकों तक पहुंचने में सक्षम नहीं हैं । इस अंत करने के लिए, हम इन समस्याग्रस्त नमूनों में शिष्यवृत्तीची विश्लेषण के लिए एक विश्वसनीय अनुकूलित प्रोटोकॉल का एक कदम दर कदम विवरण प्रदान की है ।

यह बहुत ही स्तन कैंसर में अंय नैदानिक कार्रवाई आणविक के निशान के विषम वितरण के संबंध में HER2 अभिव्यक्ति और जीन प्रवर्धन के विविधता का पता लगाने के लिए लाभप्रद होगा । इस अंत करने के लिए, आगे अनुवाद अनुसंधान अध्ययन के लिए अंय नैदानिक प्रासंगिक आणविक विश्लेषण के लिए हमारे विधि की वैधता का पता लगाने की जरूरत है, ऐसे मैट्रिक्स के रूप में असिस्टेड लेजर desorption/ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (मालदी-MSI)27। हाल ही में, मालदी के लिए FFPE ऊतकों के प्रबंधन-MSI विश्लेषण संभव हो गया है, हालांकि चुनौतीपूर्ण । यह सीटू में proteomic तकनीक स्तन कैंसर सहित रोग ऊतक वर्गों में प्रोटीन और पेप्टाइड्स के स्थानिक वितरण के दृश्य के लिए अनुमति देता है ।

इस प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण कदम है कि संभावित अंतिम विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । सबसे पहले, विशेष ध्यान अलग अंतर्निहित HER2 प्रवर्धन तंत्र की ओर भुगतान किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, गुणसूत्र 17 polysomy एक आनुवंशिक वाकया है कि स्तन कैंसर में हो सकता है11, बढ़ी हुई HER2 प्रतिलिपि संख्या के लिए एक अच्छी तरह से ज्ञात वैकल्पिक तंत्र का प्रतिनिधित्व । इस हालत, हालांकि अक्सर नहीं, न केवल कैंसर जैविक सुविधाओं और रोगी प्रबंधन पर भी ISH विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं । दूसरा, यह वर्णन किया गया है कि अंतर ट्यूमर आनुवंशिक विविधता भी एक एकल सेल स्तर पर और न केवल विभिंन नवोत्पादित क्षेत्रों में होते हैं । यह प्रोटोकॉल पूर्ण-फ़ेस अनुभागों की तुलना में इस विशेष शर्त का पता लगाने की शक्ति को बढ़ाने में सक्षम नहीं है । इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि TMA-स्थानिक विविधता के अध्ययन पर आधारित कुछ आंतरिक सीमाएं हैं, पूरे अनुभाग के एक व्यापक विश्लेषण की कमी भी शामिल है । इस अध्ययन, तथापि, एक सबूत के सिद्धांत पर विचार किया जाना चाहिए कि HER2 जीन प्रवर्धन के विविधता एक उच्च प्रवाह और लागत प्रभावी मंच के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है, मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर । इसके अलावा HER2-विषम मामलों के धारावाहिक पूर्ण चेहरा वर्गों का विश्लेषण अध्ययन, अत्याधुनिक आणविक अध्ययन और मरीजों के नैदानिक डेटा के साथ युग्मित इस प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.

अंत में, विषम HER2 स्तन कैंसर नमूनों में HER2 स्थिति की व्यापक मानचित्रण और संभावित चालक आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की जांच HER2-नकारात्मक घटकों में कई नवोत्पादित क्षेत्रों के विश्लेषण पर निर्भर होना चाहिए । यह विश्लेषण असहनीय लागत और मानक नैदानिक सुविधाओं का उपयोग करने के प्रयासों की आवश्यकता होगी । इस विधि के कई और विषम प्रसंस्कृत स्तन कैंसर के बड़े सेट में HER2 आनुवंशिक विविधता के एक साथ लक्षण वर्णन के लिए एक विश्वसनीय उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

कोई.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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References

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स्तन कैंसर में HER2 जीन प्रवर्धन की विविधता का आकलन करने के लिए एक उच्च प्रवाह जांच मंच का निर्माण
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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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