Summary
O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.
Abstract
Mutações no rico em leucina repetição quinase 2 (LRRK2) foram mostradas para ser associada com a doença de Parkinson familiar (FPD). Como ativação anormal da atividade da quinase de LRRK2 tem sido implicada na patogênese da DP, é essencial estabelecer um método para avaliar os níveis fisiológicos da atividade da quinase de LRRK2. Estudos recentes revelaram que LRRK2 fosforila membros da família Rab GTPase, incluindo Rab10, sob condições fisiológicas. Embora a fosforilação de Rab10 endógeno por LRRK2 em pilhas cultivadas pode ser detectada por espectrometria de massa, tem sido difícil detectá-lo pelo immunoblotting devido à sensibilidade pobre de anticorpos de fosforilação específicos disponíveis atualmente para Rab10. Aqui, descrevemos um simples método de detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10 por LRRK2 baseado na immunoblotting utilizando sódio Dodecil sulfato poliacrilamida electroforese do gel (SDS-PAGE) combinado com uma marca de ligação de fosfato (P-tag), que é N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N «,N «- tris (piridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. O presente protocolo não só fornece um exemplo da metodologia utilizando a tag-P, mas também permite a avaliação de como mutações, bem como inibidor de tratamento/administração ou quaisquer outros fatores alteram a sinalização a jusante de LRRK2 em células e tecidos .
Introduction
PD é uma das mais comuns doenças neurodegenerativas, predominantemente, afetando os neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo, resultando em disfunção dos sistemas de motor em idosos1. Enquanto a maioria dos pacientes desenvolvem PD de forma esporádica, há famílias herdar a doença. Mutações em vários genes foram encontradas para ser ligado com FPD2. Um dos genes causadores de FPD é LRRK2, em que oito mutações missense (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T), ligadas a um FPD predominantemente hereditária chamada PARK8 até agora têm sido relatados3,4,5. Vários estudos de associação de genoma-larga (GWAS) de pacientes com DP esporádicos também identificaram variações genômicas no locus LRRK2 como um fator de risco para a polícia, sugerindo que a anormalidade na função do LRRK2 é uma causa comum de neurodegeneração em ambos os casos esporádicos e PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 é uma proteína grande (2.527 aminoácidos), consistindo de um domínio de repetição rico em leucina, um Ras-GTP-vinculação do domínio de proteínas complexas (ROC), um C-terminal do domínio, um domínio da quinase serina/treonina proteína e um domínio de WD409ROC (CR). As oito mutações FPD localizar estes domínios funcionais; N1437H e R1441C/G/H/S no domínio do ROC, Y1699C no domínio do CR, G2019S e I2020T no domínio de cinase. Desde que a mutação G2019S, que é o mais frequentemente encontrada mutação em PD pacientes10,11,12, aumenta a atividade da quinase de LRRK2 por 2-3 vezes em vitro13, supor que o aumento anormal da fosforilação de LRRK2 substrate(s) é tóxico para os neurônios. No entanto, tem sido impossível estudar se a fosforilação de substratos LRRK2 fisiologicamente relevantes é alterada em pacientes com DP familiar/esporádicas devido à falta de métodos para avaliá-lo em amostras derivadas de pacientes.
Fosforilação de proteínas é geralmente detectada pelo immunoblotting ou ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando anticorpos especificamente, reconhecendo o estado fosforilado de proteínas ou por análise de espectrometria de massa. No entanto, a estratégia anterior às vezes não pode ser aplicada devido às dificuldades em criar anticorpos específicos de fosforilação. Etiquetando metabólica das células com fosfato radioativo é outra opção para examinar os níveis fisiológicos de fosforilação quando anticorpos específicos fosforilação não estão prontamente disponíveis. No entanto, ele requer uma grande quantidade de materiais radioativos e, portanto, envolve alguns equipamentos especializados para protecção contra as radiações14. Análise de espectrometria de massa é mais sensível em relação a esses métodos imunoquímicos e tornou-se popular na análise de fosforilação de proteínas. No entanto, a preparação da amostra é demorada e caros instrumentos são necessários para a análise.
Um subconjunto da família Rab GTPase, incluindo Rab10 e Rab8 foi relatado recentemente como substratos fisiológicos diretos para LRRK2 com base no resultado de uma análise de phosphoproteomic em grande escala15. Em seguida demonstramos que a fosforilação de Rab10 foi aumentada por mutações FPD em fibroblastos embrionários de rato e nos pulmões de ratos16de knockin. Neste relatório, nós escolhemos a empregar uma eletroforese em gel de poliacrilamida sódio Dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método em que uma molécula de P-marca é co polimerizada em geles de SDS-PAGE (P-marca SDS-PAGE) para detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10, baseado em Porque um altamente sensível anticorpos específicos Rab10 fosforilada ainda estava faltando. Nós não conseguiram detectar a fosforilação de endógena Rab8 devido a seletividade pobre de anticorpos disponíveis atualmente para Rab8 total. Por isso, decidimos focar a fosforilação de Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 em Thr73 localizar no meio da região altamente conservadas "alternar II". Alta conservação dos sítios entre proteínas Rab fosforilação pode ser uma das razões por que os anticorpos phosphospecific reconhecer proteínas Rab distintas são difíceis de fazer.
A fosforilação de Rab8A por LRRK2 inibe a ligação do Rabin8, um fator da troca do nucleotídeo guanina (GEF) que ativa Rab8A trocando o PIB ligado com GTP15. A fosforilação de Rab10 e Rab8A por LRRK2 também inibe a ligação dos inibidores de PIB-dissociação (GDIs), que são essenciais para a ativação de proteínas Rab extraindo as proteínas Rab ligados a PIB de membranas15. Coletivamente, supor que a fosforilação de proteínas Rab por LRRK2 impede que a ativação embora o mecanismo molecular preciso e consequências fisiológicas da fosforilação permanecem obscuros.
P-marca SDS-PAGE foi inventado por Kinoshita et al em 2006: neste método, acrilamida covalentemente foi acoplada com P-tag, uma molécula capturando fosfatos com alta afinidade, que copolymerized em SDS-PAGE geles17. Porque as moléculas de P-etiqueta em um gel de SDS-PAGE seletivamente retardam mobilidade eletroforética de proteínas fosforiladas, P-marca SDS-PAGE pode separar proteínas fosforiladas aqueles não-fosforilada (Figura 1). Se a proteína de interesse é fosforilado em múltiplos resíduos, uma escada de bandas correspondentes às formas diferencialmente fosforiladas será observada. No caso de Rab10, observamos apenas uma banda deslocada, indicando que o Rab10 é phosphorylated apenas em Thr73. A grande vantagem de P-marca SDS-PAGE sobre immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação é que Rab10 fosforilada pode ser detectado pelo immunoblotting com anticorpos de fosforilação específico (ou seja, reconhecendo Rab10 total) após ser transferido nas membranas, que é geralmente mais específica, sensível e disponível de fontes comerciais/acadêmico. Outra vantagem de usar P-marca SDS-PAGE é que um pode obter a estimativa aproximada da estequiometria da fosforilação, que é impossível pelo immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação ou através da marcação metabólica das células com radioativo fosfatos.
Aparte o uso de barato P-marca acrilamida e algumas pequenas modificações relacionadas a ela, o presente método de detecção de fosforilação de Rab10 por LRRK2 segue um protocolo geral de immunoblotting.Portanto, deve ser simples e facilmente executável em alguns laboratórios onde immunoblotting é uma prática usual, com todos os tipos de amostras, incluindo proteínas purified, lisados celulares e tecido homogenates.
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Protocol
1. amostra preparação para o P-marca SDS-PAGE
- Remover e descartar os meios de comunicação de pratos de 10 cm na qual as células são cultivadas usando uma sucção lavar as células com fosfato salino de 5ml Dulbecco (DPBS) pelo primeiro DPBS adicionando ao lado dos pratos, para evitar perturbar a camada de células e agitar manualmente os pratos de volta e para trás várias vezes.
- Remover e descartar o DPBS usando uma sucção adicionar 2 mL de tripsina 0,25% (p/v), diluída em DPBS e agitar suavemente os pratos para cobrir a camada de células. Colocar os pratos em uma incubadora2 CO (37 ° C, ar umidificado, 5% CO2) por 5 min.
- Depois de pipetagem acima e para baixo usando uma pipeta descartável para quebrar células isoladas, coletar a suspensão de células em um tubo de 15 mL e medir a densidade de células usando um hematocytometer sob um microscópio,18.
- Dilua as células de 2,5 × 105 células/mL com meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) suplementadas com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL. Adicione 2 mL (5 × 105 células) de suspensão de célula diluídos a cada poço de placas boas 6.
- Crescem as células durante a noite em uma incubadora de CO2 (37 ° C, ar umidificado, 5% CO2).
- Transfection em células HEK293
Nota: Se a fosforilação de Rab10 endógeno é a ser examinado, vá para etapa 1.7. Plasmídeos utilizados neste protocolo podem ser obtidos dos autores mediante pedido. Consulte Tabela de materiais para breve informação e Figura S1 para seu DNA sequências.- Alíquota 200 µ l de DMEM para tubos de 1,5 mL.
- A cada tubo, adicione ambos 0.266 µ g (concentração final de 1,33 g/mL) de um plasmídeo codificação HA-Rab10 e 1.066 µ g (concentração final de 5.33 µ g/mL) de um plasmídeo codificação 3 × bandeira-LRRK2 de 500 ações de plasmídeo µ g/mL. Em seguida, adicione 4 µ l da solução de 1 mg/mL de polyethyleneimine (dissolvido em 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0) e misture a solução vortexing para 5 s.
- Deixe os tubos ficar à temperatura ambiente durante 10 minutos e adicione o conteúdo de um tubo gota a gota para um bem utilizando uma micropipeta. Suavemente e manualmente de rock as placas de cultura e para trás várias vezes para deixar a mistura de transfeccao difusa uniformemente em todo o poço.
- Deixe que as células crescem para outro 24-36 h numa incubadora de CO2 (37 ° C, ar umidificado, 5% CO2).
- Se a fosforilação de Rab10 endógeno é a ser examinado, trate células com e sem inibidores de LRRK2 para 1 h antes de lise de células.
- Prepare soluções estoque de inibidores LRRK2, dissolvendo os inibidores em dimetilsulfóxido (DMSO) em 10 milímetros. Nós recomendamos usar MLi-2 e GSK2578215A, que são altamente específicos e potentes inibidores da LRRK2. Soluções conservadas em estoque de loja a-80 ° C.
- Preparar acções de trabalho dos inibidores diluindo as soluções estoque com DMSO: para MLi-2, prepare-se 10 µM e 30 µM para endógena e Blumental LRRK2, respectivamente. Para GSK2578215A, prepare-se 1 mM e 3 mM para endógena e Blumental LRRK2, respectivamente.
- Adicionar 2 µ l das existências do MLi-2 ou GSK2578215A trabalhar no meio de um bem, utilizando uma micropipeta e suavemente rock a placa manualmente para frente e para trás várias vezes para deixar os inibidores difusa uniformemente em todo o poço.
- Adicione 2 µ l de DMSO para um bem diferente como um controle negativo de forma semelhante ao inibidor na etapa 1.8.3.
- Colocar as placas para a incubadora e cultura das células por 1h.
- Lise as células.
- Coloque as placas de cultura no gelo. Remova e descarte a mídia. Lave as células primeiro adicionando 2 ml DPBS ao lado dos pratos para não comprometer a célula da camada e agitar manualmente os pratos e para trás várias vezes.
- Remover e descartar o DPBS e adicionar as células 100 µ l da lise (pH 50 mM Tris-HCl 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octilfenil éter, 1mm EGTA (glicol de etileno-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético), ortovanadato de sódio de 1 mM, 50 mM fluoreto de sódio, β-glicerofosfato de 10mm, pirofosfato de sódio de 5 mM, 0,1 µ g/mL microcistina-LR, 270 mM de sacarose, coquetel de inibidor de protease).
- Incline as placas no gelo e raspe as células com uma espátula de célula para reunir tanto celular lisado quanto possível. Recolha os lysates utilizando uma micropipeta para tubos de 1,5 mL (pré-refrigerados no gelo).
Atenção: Microcistina-LR pode ser fatal se ingerido ou em contato com a pele.
- Deixe os tubos no gelo por 10 min para lise completa. Esclarecer os lisados celulares por centrifugação (20.000 × g, 10 min a 4 ° C) e transferir os sobrenadantes para novos tubos de 1,5 mL previamente refrigerados no gelo.
- Medir a concentração de proteína (µ g / µ l) dos lysates apuradas pelo ensaio de Bradford.
- Preparar a albumina de soro bovino padrões (BSA) (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1 mg/mL) diluindo a solução com água destilada. Diluir os lysates célula desmarcada por 20 vezes com água destilada.
- Colocar 5 µ l/poço de cada célula diluída, em branco (água destilada) e os padrões de BSA lisado em uma placa de 96 poços em triplicado.
- Adicionar 150 µ l/poço do reagente Bradford ensaio usando micropipeta 12 canais e deixar a placa à temperatura ambiente por 5 min.
- Medir a absorvância em 595 nm em um leitor de placas e comparar com padrões de BSA.
- Prepare-se 100 µ l de amostras para SDS-PAGE. A concentração de proteína das amostras é de 1 µ g / µ l para Blumental HA-Rab10 e 2 µ g / µ l para Rab10 endógena.
- Usando as concentrações quantificadas da etapa 1.11.4, calcular o volume (µ l) dos lisados celulares equivalentes a 100 µ g (Blumental HA-Rab10) ou 200 µ g (Rab10 endógenos), dividindo a quantidade de proteína (100 µ g ou 200 µ g) pela concentração de proteína de lisados (µ µ g/l).
- Adicione 25 µ l de tampão de amostra SDS-PAGE do 4 × Laemmli (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8% (p/v) SDS, 40% (v/v) glicerol, azul de bromofenol 0,02% (p/v), 4% (v/v) β-Mercaptoetanol) para novos tubos de 1,5 mL, mantidos em temperatura ambiente.
- Adicionar o volume calculado da célula lysates a cada tubo e misture por num Vortex para 5 s à temperatura ambiente.
- Trazer o volume total de 100 µ l com a Lise e a mistura vortexing por 5 s à temperatura ambiente.
- Suplemento com 10mm MnCl2 para saciar o agente quelante. Adicione 1 µ l de 500mm MnCl2. Mix vortexing para 5 s à temperatura ambiente.
Nota: As amostras que contêm MnCl2 podem não ser adequadas para SDS-PAGE normal.
2. fundição géis para P-marca SDS-PAGE
Nota: O gel deve ser feita no mesmo dia como correr os géis. Gel pode ser feita sob condições de luz ambiente.
- Preparar solução de acrilamida 5mm P-marca dissolvendo a 10 mg de pó/sólido P-marca do acrilamido completamente com 100 µ l de metanol e depois trazer a 3,3 mL adicionando água bidestilada.
Nota: P-marca acrilamida é sensível à luz. A solução preparada deve ser armazenada no escuro a 4 ° C até o uso. - Limpeza simples e entalhadas placas etanol a 70% de pulverização e limpando com uma toalha de papel. Monte as placas de gel. As dimensões das placas de gel usadas neste protocolo particular são 80 ou 100 mm de comprimento por 100 mm de largura. Silicone limpa espaçadores colocados entre a planície e entalhadas chapas e as chapas montadas são presas com grampos da pasta.
Nota: Pode ser usado qualquer tipo de placas de gel que trabalham para SDS-PAGE ordinário. - Colocar um pente ser usado (17-bem plastico) em placas de gel montado e marca na posição de fundo dos poços da placa de gel com um marcador permanente.
- Prepare-se 10 mL da mistura de gel de acrilamida 10% (10% (p/v) de acrilamida (acrylamide:bis-acrilamida = 29:1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (p/v) SDS) em um tubo de 15 mL.
Nota: A concentração ideal de acrilamida pode variar consoante os reagentes utilizados. Tempted (TEMED) e amônio persulfato (APS) não deve ser adicionado neste ponto. - Adicione 100 µ l de acrilamida P-marca de 5 mM e 10 µ l de 1m MnCl2 soluções em concentrações finais de 50 µM e 100 µM, respectivamente.
Nota: As concentrações ideais dos P-marca acrilamida e MnCl2 também podem variar dependendo os reagentes utilizados. - Adicione 15 µ l de TEMED para a mistura de gel em uma concentração final de 0,15% (v/v) e depois de 50 µ l de 10% (p/v) APS em uma concentração final de 0,05% (p/v). Misturar bem agitando suavemente o tubo para 5 s e despeje nas placas montadas imediatamente até uma altura que é de 2 mm abaixo da posição marcada na etapa 2.3.
- Suavemente a camada para a solução de gel para achatar a parte superior do gel de separação de 2-propanol.
- Deixe o gel descansar por 30 min à temperatura ambiente. Não é necessário proteger os géis de luz.
Nota: Pode levar mais tempo para géis definir sob temperatura ambiente fria. A mistura de gel de desgasificação antes de adicionar TEMED e APS ajuda a acelerar a esta etapa. Para este efeito, a mistura de gel pode ser preparada em um Erlenmeyer de 100-200 mL, conectado a um sistema de sucção. Desgaseifica a solução durante 10 minutos. - Remova o 2-propanol em camadas absorventes com uma toalha de papel.
- Lavar o espaço superior a géis preenchendo o espaço com água destilada de um frasco de lavagem e descarte a água derramando fora em bacia. Repeti 3 vezes de lavagem.
- Remova a água residual, permanecendo no espaço superior a géis absorvendo com uma toalha de papel.
- Prepare-se 3 mL da mistura de gel do acrilamido 4% (4% (p/v) de acrilamida (r: crylamide:bis-acrilamida = 29:1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% (p/v) SDS) em um tubo de 15 mL.
Nota: Não adicione P-marca acrilamida ou MnCl2 solução para a mistura de gel de empilhamento. - Adicione 7,5 µ l de TEMED e 24 µ l de 10% (p/v) APS em concentrações finais de 0,25% (v/v) e 0,08% (p/v), respectivamente. Misture bem e agitando suavemente o tubo para 5 s e despeje a mistura em cima do gel de separação. Imediatamente colocar pentes adequados (17-bem plásticos pentes que acomodar até 25 µ l de amostras, por exemplo).
- Deixe o gel descansar por 30 min à temperatura ambiente. Não é necessário proteger os géis de luz. Depois de define o gel de empilhamento, executá-los sem mais armazenamento.
3. SDS-PAGE e Immunoblotting
- Retire os pentes os géis. Então retire os espaçadores de silício e depois clipes os géis.
- Colocar os géis fundidos em gel de tanques e corrigir o gel para o tanque, fixando com os grampos da pasta.
- Despeje o buffer de execução (25 mM Tris, 192mm glicina, 0,1% (p/v) SDS) na parte inferior e superior dos géis. Limpos poços pela liberação de buffer corrente, usando uma seringa de 5 mL e uma agulha 21G para remover pedaços de gel.
- Remova as bolhas de ar do espaço de fundo os géis usando uma agulha torta, ligada a uma seringa. Para tornar uma agulha torta, dobre manualmente uma agulha 21G no meio da agulha para que o ângulo entre a ponta e a base da agulha torna-se 30-45 °.
- Spin para baixo precipitados causados pela adição de MnCl2 a 20.000 × g por 1 min à temperatura ambiente para obter amostras de claras.
- Carrega 10 µ g proteínas para detectar a fosforilação de Rab10 Blumental e 30 µ g proteínas para Rab10 endógena.
Nota: É essencial para carregar um volume igual de amostras em todos os poços. Corredores vazios devem ser carregados com amortecedor da amostra do 1 × Laemmli SDS-PAGE. Se as amostras contêm MnCl2, adicione a mesma concentração de MnCl2 para as amostras de manequim. - O bem carregado com um marcador de peso molecular (MWM) deve também ser complementado com tampão de amostra SDS-PAGE do 1 × Laemmli para que o volume de amostras carregado é o mesmo em todos os poços.
Nota: Novamente, se as amostras contêm MnCl2, adicione a mesma concentração de MnCl2 para a MWM. Alternativamente, um MWM de EDTA livre pode ser usado. - Execute géis em 50 V para empilhamento (cerca de 30 min) até a frente da tintura cruza para o gel de separação.
- Depois que as amostras de pilha, mudar a tensão de 120 V para a separação até a frente do corante atinge a parte inferior dos géis (aproximadamente 50 e 80 min para 80 e 100 mm comprimento géis, respectivamente).
Nota: O padrão de migração do MWM deverá ser diferente em geles de SDS-PAGE normais. Ele não deve ser usado para estimar o peso molecular das proteínas em geles de SDS-PAGE de P-marca, mas pode ser usado para verificar a reprodutibilidade dos géis P-marca. Consulte a discussão para mais detalhes. - Lave os geles para remover os géis MnCl2 .
- Despeje a transferência de reserva (48 mM Tris, 39mm glicina, 20% (v/v) de metanol) contendo 10 mM EDTA e 0,05% (p/v) SDS em um recipiente (por exemplo, grandes barcos de pesagem).
Nota: Use buffer fresco para cada lavagem.
- Coloque um papel de filtro (10 x 7 cm) num bloco de esponja para transferência. Coloque o gel sobre o papel de filtro. Certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre o papel de filtro e o gel.
- Ponha o gel de uma membrana (10 x 7 cm) e certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre o gel e a membrana.
- Coloque outro papel de filtro (10 x 7 cm) sobre a membrana e, novamente, certifique-se que há nenhuma bolha de ar entre a membrana e o papel de filtro.
- Colocar outra esponja almofada sobre o papel de filtro. Coloque a pilha de papéis de filtro de membrana/em uma gaveta para transferência.
- Coloque a fita em um tanque de transferência, certificando-se que a membrana está localizada entre o gel e o ânodo positivamente carregado.
- Conectar uma fonte de alimentação do tanque e colocar o tanque em uma caixa de espuma de estireno cheia com água gelada. Inicie transferência a 100 V para 180 min.
Nota: Transferência prolongada é necessária desde que a transferência de proteínas do gel de SDS-PAGE de P-marca não são tão eficientes como que de normais geles de SDS-PAGE. Resfriamento eficiente é essencial para evitar derretimento géis durante a transferência.
- Remova as membranas os géis usando uma pinça e mergulhe as membranas em uma solução de Ponceau S (0,1% (p/v), Ponceau S, 5% (v/v) de ácido acético) para manchar proteínas transferidas em membranas em um recipiente de plástico. O volume da solução deve ser suficiente para cobrir uma membrana.
- Incube as membranas para 1 min à temperatura ambiente agite-o manualmente.
Nota: Uma escada das bandas deve tornar-se visível em cada raia. - Pegue a membrana fora a solução de coloração com uma pinça e ver se a escada das bandas tem uniforme padrão e intensidade em cada pista, onde as amostras foram carregadas.
- Depois de verificar a coloração, retirar a solução de coloração e adicionar tampão TBST (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, monolaurato de polyoxyethylenesorbitan de 0,1% (v/v)). O volume da reserva deve ser suficiente para cobrir uma membrana.
Nota: A solução de Ponceau S pode ser recolhida e reutilizados várias vezes. - Virar as membranas em TBST num agitador de balanço (~ 60 rpm) à temperatura ambiente, enquanto não visíveis bandas permanecem sobre as membranas.
- Repita a etapa de lavagem com TBST fresco por 5 min.
Nota: O tempo de exposição pode variar dependendo da solução ECL e o sistema usado para detecção de quimioluminescência.
- Ligue um Imageador equipado com uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) e um computador ligado para a câmera. Inicie o software de controle para a câmera. Espere até que a temperatura da Câmara CCD chegou a-25 ° C.
- Colocar 1 mL da solução por uma membrana ECL em um envoltório plástico espalhar num banco.
- Colocar uma membrana gel-lado-para cima sobre a solução de ECL... e então rapidamente vire-o para que ambos os lados da membrana são revestidos com a solução.
- Pegue a membrana e drená-lo, deixando um lado do toque da membrana, uma toalha de papel para 5 s.
- Coloca a membrana entre os filmes claros (por exemplo, bolsas de papel claro).
Nota: O plástico não é recomendado para envolvimento das membranas. Os filmes claros usados para envolver a membrana precisam ser tão liso quanto possível sem rugas visíveis, para evitar o fundo irregular. - Coloque a membrana em uma bandeja preta. Coloque a bandeja no tonalizador e feche a porta.
- Clique no botão de "Focalização" na janela do software controle. Verifica que a membrana está posicionada corretamente. Clique no botão "Voltar".
- Selecione "Precisão" para "Tipo de exposição". Selecione "Manual" para "Tempo de exposição" e definir o tempo de exposição a 1 s.
- Selecione "Alto" para "Sensibilidade/resolução". "Adicionar imagem de digitalização" Deixe desmarcada. Clique no botão "Iniciar" para criar a imagem.
- Salve a imagem que apareceu no visor no computador como um arquivo TIFF.
- Repetir a tomada de imagens com o tempo de exposição de 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s e até 180 s. Quando se toma a última imagem, verifique se "Adicionar imagem de digitalização" para a imagem digital, não a quimioluminescência, da membrana pode ser tomada simultaneamente.
- Selecione a melhor imagem com a maior gama dinâmica e sem qualquer saturação pixels (mostrados em vermelho) nas bandas de interesse.
Nota: Películas de raio x convencional também podem ser usadas para a deteção de19.
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Representative Results
Superexpressão sistema: Fosforilação de HA-Rab10 por 3 × bandeira-LRRK2 em HEK293 de células:
Células HEK293 foram transfectadas com 0.266 µ g de HA-Rab10 selvagem-tipo e 1.066 µ g de 3 × bandeira-LRRK2 (mutante tipo selvagem, quinase-inativo (K1906M), ou mutantes FPD). Fosforilação de Rab10 foi examinada por P-marca SDS-PAGE seguido immunoblotting usando um anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g de proteínas foram executados em um gel de 10% (80 x 100 x 1 mm), contendo 50 µM P-marca acrilamida e 100 µM MnCl2. O tempo de exposição para o gel P-marca (painel superior) foi de 10 s usando uma solução-padrão de ECL. Co-superexpressão de LRRK2 com Rab10 causou a mudança de banda no gel P-marca (marcado com um círculo aberto no painel superior; comparar pistas 2 e 4). Em contraste, expressão co com um mutante da quinase inactiva LRRK2 (K1906M) falha ao alterar a mobilidade dos Rab10 (compare faixas 4 e 5), indicando que a mudança de banda é devido a atividade da quinase LRRK2. O turno da banda aumentou em todas as mutações de FPD (compare faixas 4 e 6-13) de acordo com o relatório anterior15.
Sistema endógeno: Fosforilação de Rab10 por LRRK2 em pilhas cultivadas:
Células de fibroblastos embrionários rato 3T3-Swiss albino foram tratadas com ou sem inibidor (GSK2578215A) LRRK220 em uma concentração final de 1 µM de 1h (Figura 3A). Células de carcinoma A549 pulmão humano foram tratadas com ou sem outro LRRK2 inibidor (MLi-2)21 em uma concentração final de 10 nM de 1h (Figura 3B). Phosphorylation endógeno de Rab10 por LRRK2 endógena foi examinado por P-marca SDS-PAGE seguido immunoblotting com anticorpos anti-Rab10. 30 µ g de proteínas foram executados em um gel de 10% (100 x 100 x 1 mm para células 3T3-Swiss albino) e 80 mm para A549 células contendo 50 µM P-marca acrilamida e 100 µM MnCl2. A exposição para o gel P-marca (painel superior) na Figura 3A e Figura 3B foram 3 min e 90 s, respectivamente. Observou-se a mudança de banda correspondente a Rab10 endógeno fosforilada no gel P-marca (marcado com um círculo aberto no painel superior; comparar pistas 1-2 e 3-4) que desapareceram após o tratamento das células com GSK2578215A ou MLi-2. A eficácia de inibidores da LRRK2 foi validada pelo immunoblotting utilizando o anticorpo de LRRK2 anti-pSer935 (o terceiro painel do fundo), que é uma leitura bem estabelecida de inibição LRRK2 em células22.
Figura 1. Representação esquemática da P-marca SDS-PAGE. Quando uma mistura de fosforilada (círculos vermelhos) e não-fosforilada (círculos azuis) proteínas (por exemplo, Rab10) é executado através de um gel de acrilamida P-marca Cadê co polimerizada, a mobilidade das proteínas fosforiladas apenas retarda devido a forte interação das proteínas fosforiladas com as moléculas de P-marca (quebrado setas). Desde que Rab10 é fosforilada pela LRRK2 em um único resíduo, Thr73, Rab10 é executado como duas bandas: a banda superior representa Rab10 fosforilada e a banda inferior representa não-fosforilada Rab10. Quando as células são tratadas com inibidores LRRK2, a banda superior deve desaparecer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Resultado representativo do blot P-marca: sistema de superexpressão. O painel superior mostra o blot P-marca usando um antianticorpo, onde Rab10 fosforilada e não-fosforilada são marcados com HA abrir (○) e fechados círculos (●), respectivamente. Os painéis mostrados abaixo o blot P-marca são immunoblots em geles de SDS-PAGE normais usando um anti-HA, anti-FLAG, anti-α-tubulina e anticorpos anti-GAPDH. O Borrão HA e borrão de bandeira são mostradas para assegurar a superexpressão de HA-Rab10 e 3xFLAG-LRRK2, respectivamente. A α-tubulina e borrões GAPDH são mostrados para assegurar o carregamento igual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resultado representativo do blot P-marca: sistema endógeno. Duas células de linhas, ou seja, células 3T3-Swiss albino de (A) e (B) A549 células, foram usados. Em ambas as figuras, os painéis top mostram que o P-tag borrões usando um anticorpo anti-Rab10, onde Rab10 endógeno fosforilada e não-fosforilada são marcados com aberta (○) e fechados círculos (●), respectivamente. Os painéis mostrados abaixo os borrões de P-marca são immunoblots em geles de SDS-PAGE normais usando um anti-Rab10, anti-pSer935 LRRK2, anti-LRRK2 e anticorpos anti-α-tubulina. O Rab10 e LRRK2 são mostradas para garantir a expressão semelhante de endógena Rab10 e LRRK2 entre as amostras, respectivamente. PSer935 LRRK2 blot são mostrados para garantir que GSK2578215A (A) e MLi-2 (B) funcionou como esperado. O borrão de α-tubulina são mostradas para assegurar o carregamento igual. As imagens dos borrões de P-marca sobrepostas com o marcador de peso molecular são mostradas na Figura S4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S1. Sequências de DNA de plasmídeo o. As sequências de DNA do plasmídeo codificação FRT HA-Rab10/pcDNA5 para e o de 3 × × bandeira-LRRK2/p3 bandeira-CMV-10. Todos os plasmídeos utilizados neste protocolo estão disponíveis a partir dos autores mediante pedido. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S2. Um exemplo de otimização dos P-marca SDS-PAGE. O mesmo conjunto de amostras que o usado na Figura 3A foi usado para otimizar o P-marca SDS-PAGE. Quatro diferentes condições foram testadas como mostrado na figura. As bandas correspondentes a Rab10 fosforilada e não-fosforilada são realçadas com retângulos de linha tracejada e sólido, respectivamente.Baseado nesta experiência, a condição com acrilamida 10%, do acrilamido de P-marca 50 µM e 100 µM MnCl2 deu a melhor separação das duas bandas, ambos localizando no meio do gel. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S3. Comparação do padrão de migração de um marcador de peso molecular. O marcador de peso molecular (MWM) foi executado em um gel de SDS-PAGE regular (painel esquerdo) ou em um gel de SDS-PAGE de P-marca (painel central), e os géis foram corados pela coloração Coomassie. O painel direito mostra um immunoblot das amostras utilizadas na Figura 2 (pista 4 e 5) no mesmo gel P-marca SDS-PAGE como o painel médio para mostrar as posições de Rab10 fosforilada e não-fosforilada. A ponta da seta do lado direito do immunoblot indica a posição de um do MWM sobre o gel de SDS-PAGE de P-marca. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S4. A posição de um marcador de peso molecular em geles de SDS-PAGE de P-marca. Imagens digitalizadas das membranas utilizadas para Figura 3A e Figura 3B são mostradas como (A) e(B), respectivamente. Os immunoblots mostrados na Figura 3 são sobrepostos para mostrar a posição relativa do marcador de peso molecular (MWM). A MWM não se transferiu para as membranas, mas o marcador (seta) na Figura S3 foi observado fraca mas consistentemente. A posição da MWM está marcada com linhas pontilhadas. Observe que pistas irrelevantes para os números entre a MWM e as vias de interesse estão riscadas. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, descrevemos um método robusto e fácil de detectar a fosforilação de Rab10 por LRRK2 níveis endógenos com base na metodologia do P-marca. Porque o anticorpo atualmente disponível contra fosforilada Rab10 só funciona com proteínas Blumental15, o presente método utilizando P-marca SDS-PAGE é a única maneira de avaliar os níveis endógenos de fosforilação Rab10. Além disso, o presente método permite a estimativa da estequiometria da fosforilação de Rab10 nas células. Porque a metodologia de P-marca é genericamente aplicável a fosfo-proteínas, o presente protocolo pode ser um "protótipo" para o estabelecimento de métodos semelhantes para outros phospho-proteins.
Passos críticos no protocolo são géis de fundição e preparação de amostras. P-marca acrilamida é um reagente relativamente foto-labile e a capacidade de retardar a mobilidade eletroforética de proteínas fosforiladas às vezes é perdida após o armazenamento a longo prazo a 4 ° C. Pesquisadores devem tomar todos os cuidados para evitar a exposição do acrilamido P-marca à luz. Além disso, a molécula de P-marca precisa formar um complexo com íons de Mn2 + para capturar fosfatos. Assim, as amostras não devem conter agentes quelantes como o EDTA, que são componentes usuais de buffers de amostra de SDS-PAGE comercialmente disponíveis. Nós recomendamos usar o amortecedor da amostra do Laemmli a clássica para preparar amostras para P-marca SDS-PAGE.
Outro ponto crítico é otimizar completamente a concentração de acrilamida, P-marca acrilamida e MnCl2 a mistura de gel de separação (Figura S2). As distâncias de migração das bandas fosforiladas e não-fosforilada variam de acordo com os reagentes utilizados (monte, pureza, etc.), e otimização das concentrações adequadas testando vários diferentes concentrações em combinação é obrigatório (por exemplo, P-marca de acrilamida (25, 50, 75 µM), MnCl2 (1:2 ou 1:3 razão molar de acrilamida P-marca) e do acrilamido (7,5, 10, 12,5%)). As bandas fosforiladas e não-fosforilada devem aparecer no meio do gel e bem separaram umas das outras. Para o processo de otimização, é recomendável usar Rab10 Blumental, porque a banda deslocada é facilmente detectável. Os autores podem fornecer amostras de controle para este protocolo.
Uma das maiores confusões que este protocolo pode causar será devido à diferença dos padrões de migração do MWM entre normal e geles de SDS-PAGE de P-marca. Como mostrado na Figura S3, os padrões de migração do MWM na regular e géis P-marca SDS-PAGE (ambos 10%) são muito diferentes e um não pode usar o MWM para estimar o peso molecular das proteínas em geles de SDS-PAGE de P-marca. No entanto, em geles de SDS-PAGE de P-marca, um do MWM destaca-se, migrando para o meio do gel (ponta de seta na Figura S3), que é consistentemente observado entre os géis (ver Figura S4). Este MWM sempre migra entre as bandas de Rab10 fosforilada e não-fosforilada. Portanto, este marcador é útil não só para garantir que o P-marca SDS-PAGE funciona antes da transferência, mas também como um marco por ter uma sensação áspera de onde as bandas de fosforilada e não-fosforilada Rab10 vão ser vistas.
Para detecção de bandas na immunoblots, nós usamos um Imageador equipado com uma câmera CCD refrigerada (ver Tabela de materiais), bem como um raio-x convencional filme sistema em desenvolvimento e encontraram que ambos os sistemas funcionam bem. Para detecção de níveis endógenos de fosforilação de Rab10 em culturas de células, é necessário utilizar linhas celulares que têm níveis de alta expressão de LRRK2 endógenos, tais como fibroblasto embrionário de rato (primária ou cultivadas ou imortalizado (linhas de célula 3T3-Swiss albino, etc.)) e células de A549 de derivado de carcinoma de pulmão humano. Para a detecção de níveis endógenos de fosforilação de Rab10 em tecidos de rato, é recomendável usar o pulmão16.
A quantificação da fosforilação de Rab10 não é além do habitual immunoblotting. Se a estequiometria da fosforilação de Rab10 é muito baixa (como mostrado na Figura 3), a intensidade da banda não-fosforilada (marcada com um círculo fechado) tende a ser muito acima do nível de saturação, fazendo com que a determinação precisa da estequiometria impossível. Não obstante, estimativa qualitativa ainda é possível em qualquer caso, o que não é alcançável sem usar o método presente. Uma vez que a detecção da fosforilação de Rab10 endógena exige exposição prolongada, tende a haver algumas bandas inespecíficas aparecendo na P-marca borre mesmo que o anticorpo anti-Rab10, usado no presente protocolo dá immunoblots razoavelmente limpa para utilização normal . Para distinguir proteínas fosforiladas de bandas inespecíficas, é fundamental usar um controle inibidor-tratamento, em que bandas fosforiladas, mas bandas não inespecíficas, devem desaparecer. LRRK2 fosforila Rab8 além de Rab1015, e nós bem sucedida do presente protocolo para Rab8A também (dados não mostrados). O presente protocolo potencialmente pode ser usado para examinar a fosforilação de qualquer proteínas, embora possa haver dificuldades técnicas se a proteína é grande (> 100 kDa) ou multiplicar fosforilada. Porque Rab10 é uma pequena proteína (25 kDa) e isoladamente phosphorylated em Thr73 por LRRK2, o resultado de P-marca SDS-PAGE é simples, onde apenas uma banda deslocada é observada.
Num futuro próximo, será fundamental para estabelecer o método para detectar quantitativamente a atividade da quinase de LRRK2 em amostras de paciente-derivado de uma forma de alto rendimento para avaliar a alteração da atividade da quinase de LRRK2 em pacientes com DP, bem como na avaliação o efeito de drogas na LRRK2 em ensaios clínicos. Desde sangue periférico humano células mononucleares (PBMC) expressam níveis relativamente elevados de endógena LRRK223, PBMCs ou mais células isoladas de sangue será vale a pena testar para phosphorylation endógeno de Rab10. O presente método irá não só ser útil na investigação da biologia básica do LRRK2 via de sinalização, mas também ajuda na obtenção de um prova de conceito básico para decidir qual amostra em amostras de paciente-derivado deve ser analisado em tais estudos em grande escala.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio, Japão) por gentilmente fornecendo os plasmídeos codificação 3xFLAG-LRRK2 WT e mutantes. Agradecemos também o Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee, Reino Unido) para fornecer gentilmente MLi-2 e o plasmídeo codificação HA-Rab10. Este trabalho foi apoiado pela sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI Grant número JP17K08265 (G.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).
