Summary
Föreliggande studie beskriver en enkel metod för att upptäcka endogena nivåerna av Rab10 fosforylering av leucin-rika upprepa kinase 2.
Abstract
Mutationer i leucin-rika upprepa kinase 2 (LRRK2) har visat sig vara kopplad till familjär Parkinsons sjukdom (FPD). Eftersom onormal aktivering av Kinas aktiviteten av LRRK2 har varit inblandade i patogenesen av PD, är det viktigt att fastställa en metod för att utvärdera de fysiologiska nivåerna av kreatinkinas aktiviteten av LRRK2. Senare studier visade att LRRK2 phosphorylates Rab GTPase familjemedlemmar, inklusive Rab10, under fysiologiska betingelser. Även om fosforyleringen av endogena Rab10 av LRRK2 i odlade celler kunde ha upptäckts av masspektrometri, har det varit svårt att upptäcka det av immunoblotting på grund av dålig känslighet av för närvarande tillgängliga fosforylering-specifika antikroppar för Rab10. Här, vi beskriver en enkel metod för att upptäcka de endogena nivåerna av Rab10 fosforylering av LRRK2 baserat på immunoblotting utnyttja sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) i kombination med en fosfat-bindande taggen (P-taggen), som är N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-metyl) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Detta protokoll inte bara innehåller ett exempel på den metod som utnyttjar den P-tag men gör också att bedömningen av hur mutationer samt hämmare behandling/administration eller andra faktorer förändrar de nedströms signalering av LRRK2 i celler och vävnader .
Introduction
PD är en av de vanligaste neurodegenerativa sjukdomarna, huvudsakligen påverkar dopaminerga nervceller i mellanhjärnan, vilket resulterar i dysfunktion av de motoriska system i äldre1. Medan de flesta patienter utvecklar PD en sporadisk sätt, finns det familjer ärva sjukdomen. Mutationer i flera gener har hittats kopplas med FPD2. En av orsakande gener för FPD är LRRK2, där åtta missense mutationer (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S och I2020T) kopplad till en dominant ärftlig FPD kallas PARK8 hittills varit rapporterade3,4,5. Flera genome-wide associationsstudier (GWAS) av sporadiska PD patienter har också identifierat genetiska variationer på det LRRK2 locus som en riskfaktor för PD, tyder på att abnormitet i fungera av LRRK2 är en vanlig orsak till neurodegeneration i både sporadiska och PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 är ett stort protein (2 527 aminosyror) som består av en leucin-rika upprepa domän, en GTP-bindande Ras av komplexa proteiner (ROC) domän, en C-terminal ROC (ReK) domän, en serin/treonin protein kinase domän och en WD40 upprepa domän9. De åtta FPD-mutationerna lokalisera i dessa funktionella domäner; N1437H och R1441C/G/H/S i domänen ROC, Y1699C i domänen ReK, G2019S och I2020T i domänen tyrosinkinashämmare. Eftersom G2019S mutation, som är de vanligaste mutationen i PD patienter10,11,12, ökar kinase aktiviteten av LRRK2 av 2-3 gånger i vitro13, det är en hypotes om att den onormala ökningen av fosforylering av LRRK2 substrate(s) är giftigt för nervceller. Det har dock varit omöjligt att undersöka om fosforyleringen av fysiologiskt relevanta LRRK2 substrat ändras i familjär/sporadiska PD patienter på grund av metoder utvärdera det i härledda patientprover.
Protein fosforylering är allmänt identifieras av immunoblotting eller enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) med hjälp av antikroppar specifikt erkänner tillståndet fosforyleras proteiner eller genom massa spektrometriska analys. Dock kan den tidigare strategin ibland inte tillämpas på grund av svårigheter att skapa fosforylering-specifika antikroppar. Metaboliska märkning av celler med radioaktiva fosfat är ett annat alternativ att undersöka fysiologiska nivåer av fosforylering när fosforylering-specifika antikroppar inte är lätt tillgängliga. Men det kräver en stor mängd radioaktivt material och därför innebär vissa specialutrustning för strålskyddet14. Massa spektrometriska analys är känsligare jämfört dessa immunokemisk metoder och blev populär i analysera protein fosforylering. Dock provberedningen är tidskrävande och dyra instrument krävs för analysen.
En delmängd av Rab GTPase familjen inklusive Rab10 och Rab8 var nyligen rapporterat som direkta fysiologiska substrat för LRRK2 baserat på resultatet av en storskalig phosphoproteomic analys15. Vi visade sedan att Rab10 fosforylering ökade FPD mutationer i mus embryonala fibroblaster och i lungorna av knockin möss16. I detta betänkande, vi valde att anställa en sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE)-baserad metod där en P-taggen molekyl är samtidig polymeriserat i SDS-PAGE geler (P-taggen SDS-PAGE) för att upptäcka de endogena nivåerna av Rab10 fosforylering, eftersom en mycket känslig antikropp som är specifik för fosforylerade Rab10 saknades fortfarande. Vi har inte lyckats upptäcka fosforyleringen av endogena Rab8 på grund av dålig selektivitet av för närvarande tillgängliga antikroppar för totala Rab8. Därför har vi beslutat att fokusera på Rab10 phosphorylationen. LRRK2 phosphorylates Rab10 i Thr73 att hitta i mitten av regionen mycket ”växla II”. Höga naturvärden av fosforylering platser bland Rab proteiner kan vara en av anledningarna till varför phosphospecific antikroppar erkänner distinkta Rab proteiner är svåra att göra.
Fosforyleringen av Rab8A av LRRK2 hämmar bindningen av Rabin8, en guanin nukleotid exchange faktor (GEF) som aktiverar Rab8A genom att utbyta bundna BNP med GTP15. Fosforylering av Rab10 och Rab8A av LRRK2 också hämmar bindningen av BNP-dissociation-hämmare (GDIs), som är avgörande för aktiveringen av Rab proteiner genom att extrahera BNP-bundna Rab proteiner från membran15. Sammantaget är det en hypotes om att fosforyleringen av Rab proteiner av LRRK2 hindrar dem från att aktivering även om de exakta molekylära mekanismen och fysiologiska konsekvenser av fosforyleringen förblir oklart.
P-taggen SDS-PAGE uppfanns av Kinoshita et al. 2006: I den här metoden var akrylamid kovalent tillsammans med P-taggen, en molekyl som fånga fosfater med hög affinitet, vilket copolymerized i SDS-PAGE geler17. Eftersom P-taggen molekylerna i en SDS-PAGE gel selektivt fördröja elektroforetiska mobilitet av fosforyleras proteiner, P-taggen SDS-PAGE kan separera fosforyleras proteiner från de icke-fosforyleras (figur 1). Om de protein-of-intressen är fosforyleras på flera rester, kommer en stege av band som motsvarar differentially fosforyleras former att iakttas. När det gäller Rab10 observerar vi bara ett skiftat band, vilket indikerar att Rab10 är fosforyleras endast på Thr73. Den stora fördelen med P-taggen SDS-PAGE över immunoblotting med fosforylering-specifika antikroppar är att fosforyleras Rab10 kan upptäckas av immunoblotting med icke-fosforylering-specifika antikroppar (dvsigenkännande totala Rab10) efter överförs på membran, som är generellt mer särskilda, känsliga och tillgänglig från kommersiella/akademiska källor. En annan fördel med att använda P-taggen SDS-PAGE är att man kan få ungefärlig uppskattning av stökiometri av fosforylering, som är omöjligt av immunoblotting med fosforylering-specifika antikroppar eller metabola märkning av celler med radioaktivt fosfater.
Förutom användningen av billiga P-taggen akrylamid och några mindre modifieringar som anknyter till det, följer denna metod för detektion av Rab10 fosforylering av LRRK2 en allmän protokollet av immunoblotting.Det bör därför enkel och lätt körbar i alla laboratorier där immunoblotting är en vanlig praxis, med alla typer av prover inklusive renade proteiner, cell lysates och vävnad homogenates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. provberedning för P-taggen SDS – Sidan
- Ta bort och kassera media från 10 cm rätter där celler odlas genom sugning och tvätta cellerna med 5 mL Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) av första att lägga till DPBS till sidan av rätterna att undvika att störa det cell-lagret, och manuellt rock rätter tillbaka och tillbaka flera gånger.
- Ta bort och kassera den DPBS genom sugning och tillsätt 2 mL av 0,25% (w/v) trypsin utspätt i DPBS och skaka försiktigt av rätter för att täcka det cell-lagret. Sätta rätterna i en CO2 inkubator (37 ° C, fuktad luft, 5% CO2) i 5 min.
- Efter pipettering upp och ner med disponibla pipett för att bryta upp fristående celler, samla cellsuspensionen i en 15 mL tub och mäta cell densiteten med hjälp av en hematocytometer under ett Mikroskop18.
- Späd cellerna till 2,5 × 105 celler/mL med Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin. Tillsätt 2 mL (5 × 105 celler) av de utspädda cellsuspensionen till varje brunn 6 brunnar.
- Odla cellerna över natten i en CO2 inkubator (37 ° C, fuktad luft, 5% CO2).
- Transfection i HEK293 celler
Obs: Om fosforylering av endogena Rab10 ska för att undersökas, gå till steg 1,7. Plasmider som används i detta protokoll kan erhållas från författarna på begäran. Se Tabell för material för kort information och Figur S1 för deras DNA sekvenser.- Alikvotens 200 µL DMEM i 1,5 mL rör.
- Till varje rör, lägga båda 0.266 µg (slutlig koncentration på 1,33 µg/mL) av en plasmid kodning HA-Rab10 och 1.066 µg (slutlig koncentration på 5,33 µg/mL) på en plasmid kodning 3 × flagga-LRRK2 från 500 µg/mL plasmid lager. Tillsätt sedan 4 µL av 1 mg/mL lösning av polyethyleneimine (upplöst i 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0) och omedelbart blanda lösningen genom vortexa för 5 s.
- Låt rören stå i rumstemperatur i 10 min och lägga till innehållet i en tub droppvis till en brunn med en mikropipett. Försiktigt och manuellt rock kultur plattorna och tillbaka flera gånger för att låta transfection blandningen diffust jämnt i hela brunnen.
- Låt cellerna växa för en annan 24-36 h i en CO2 inkubator (37 ° C, fuktad luft, 5% CO2).
- Om fosforylering av endogena Rab10 ska för att undersökas, behandla celler med och utan LRRK2-hämmare för 1 h innan lyseringslösning cellerna.
- Förbereda stamlösningar av LRRK2 hämmare genom att lösa upp de-hämmare av dimetyl sulfoxid (DMSO) på 10 mM. Vi rekommenderar att du använder MLi-2 och GSK2578215A, som är mycket specifika och potenta LRRK2-hämmare. Lagra stamlösningar vid-80 ° C.
- Förbereda arbetande bestånd av hämmare genom spädning av stamlösningar med DMSO: för MLi-2, förbereda 10 µM och 30 µM för endogena och överuttryckt LRRK2, respektive. För GSK2578215A, förbereda 1 mM och 3 mM för endogena och överuttryckt LRRK2, respektive.
- Tillsätt 2 µL av arbetande bestånden av antingen MLi-2 eller GSK2578215A till mitten av en brunn med hjälp av en mikropipett och skaka försiktigt plattan manuellt fram och tillbaka flera gånger för att låta de hämmare diffust jämnt i hela brunnen.
- Tillsätt 2 µL av DMSO till en annan brunn som en negativ kontroll på ett liknande sätt som hämmaren i steg 1.8.3.
- Sätt plattorna tillbaka till inkubatorn och odla cellerna för 1 h.
- Lysera celler.
- Sätta kultur plattorna på is. Avlägsna och kassera media. Tvätta cellerna med första lägga 2 mL DPBS vid sidan av rätterna att undvika att störa cellen lager och manuellt rock rätter fram och tillbaka flera gånger.
- Ta bort och kassera DPBS, och lägga till de celler 100 µL av lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl eter, 1 mM EGTA (etylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid), 1 mM natrium orthovanadate, 50 mM natriumfluorid, 10 mM β-glycerofosfat, 5 mM natrium pyrofosfat, 0,1 µg/mL microcystin-LR, 270 mM sackaros, proteashämmare cocktail).
- Tilt plattorna på is och skrapa de celler som använder en cell skrapa för att samla så mycket cell lysate som möjligt. Samla de lysates med hjälp av en mikropipett i 1,5 mL rör (pre kyld på is).
Försiktighet: Microcystin-LR kan vara dödlig om förtäring eller hudkontakt.
- Låt stå på is för 10 min för komplett Lys rören. Klargöra den cell lysates genom centrifugering (20 000 × g, 10 min vid 4 ° C) och överföra supernatanterna till nya 1,5 mL rör pre kyld på is.
- Mäta proteinkoncentration (µg/µL) av den rensade lysates Bradford assay.
- Förbereda bovint serumalbumin (BSA) standarder (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 och 1 mg/mL) genom att späda ut stamlösning med destillerat vatten. Späd den rensade cell lysates av 20-faldigt med destillerat vatten.
- Lägg 5 µL per brunn av standarderna som BSA, tom (destillerat vatten) och varje utspädda cell lysate i en plattan med 96 brunnar i tre exemplar.
- Tillsätt 150 µL per brunn av Bradford assay reagens med 12-kanals mikropipett och låt plåten stå i rumstemperatur i 5 min.
- Mät absorbansen vid 595 nm på en Plattläsare och jämför BSA standarder.
- Förbereda 100 µL av prover för SDS-PAGE. Protein koncentrationen av proverna är 1 µg/µL för överuttryckt HA-Rab10 och 2 µg/µL för endogen Rab10.
- Använder de kvantifierade koncentrationerna från steg 1.11.4, beräkna volym (µL) av den cell lysates motsvarande 100 µg (överuttryckt HA-Rab10) eller 200 µg (endogena Rab10) genom att dividera mängden protein (100 µg eller 200 µg) av protein koncentrationen av lysates (µ g/µL).
- Tillsätt 25 µL's 4 × Laemmli SDS-PAGE prov buffert (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% (w/v) SDS, 40% (v/v) glycerol, 0,02% (w/v) bromophenol blå, 4% (v/v) β-merkaptoetanol) i nya 1,5 mL rör vid rumstemperatur.
- Lägg till den beräknade volymen av cellen lysates till varje rör och blanda genom vortexa för 5 s vid rumstemperatur.
- Att den totala volymen för 100 µL med lyseringsbuffert och mix genom vortexa för 5 s vid rumstemperatur.
- Komplettera med 10 mM MnCl2 att släcka kelatbildare. Tillsätt 1 µL 500 mM MnCl2. Mix av vortexa för 5 s vid rumstemperatur.
Obs: Prover som innehåller MnCl2 kanske inte lämplig för normala SDS-PAGE.
2. gjutning geler för P-taggen SDS-PAGE
Obs: Gels bör göras samma dag som kör gelerna. Geler kan göras under omgivande ljusförhållanden.
- Förbereda 5 mM P-taggen akrylamid stamlösning av första upplösning på 10 mg pulver/solid P-taggen akrylamid helt med 100 µL av metanol och sedan ta till 3,3 mL genom att lägga till dubbel destillerat vatten.
Obs: P-taggen akrylamid är ljuskänsligt. Den beredda lösningen ska förvaras i mörker vid 4 ° C fram till användning. - Ren både vanligt och skårade plattor av sprutning 70% etanol och torka med hushållspapper. Montera gel plattorna. Måtten på gel plattorna används i detta särskilda protokoll är 80 eller 100 mm lång 100 mm breda. Ren kisel distanser sätts mellan slätten och skårade plattor och monterade plattorna spänns fast med bindemedel klipp.
Obs: Någon typ av gel plattor som fungerar för vanliga SDS-PAGE kan användas. - Sätta en kam att användas (17-väl plast kam) in i monterade gel plattor och märket på gelplattan position botten av brunnarna med en permanent spritpenna.
- Förbereda 10 mL 10% akrylamid gel blandning (10% (w/v) akrylamid (acrylamide:bis-akrylamid = 29: 1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (w/v) SDS) i en 15 mL tub.
Obs: Den optimala koncentrationen av akrylamid kan variera beroende på de reagens som används. Tetramethylethylenediamine (TEMED) och ammonium persulfatoxidation (APS) bör inte läggas på denna punkt. - Tillsätt 100 µL av 5 mM P-taggen akrylamid och 10 µL 1 M MnCl2 lösningar på slutliga koncentrationer av 50 µM och 100 µM, respektive.
Obs: De optimala koncentrationerna i P-taggen akrylamid och MnCl2 kan också variera beroende på de reagens som används. - Lägg till 15 µL TEMED till gel blandningen med en slutlig koncentration på 0,15% (v/v) och sedan 50 µL 10% (w/v) APS med en slutlig koncentration på 0,05% (w/v). Blanda väl genom att försiktigt virvlande röret för 5 s och häll monterade plattorna omedelbart upp till en höjd som är 2 mm nedan ställning markerades i steg 2,3.
- Försiktigt layer 2-propanol på gellösningen platta toppen av separera geler.
- Låt gelen stå i 30 min i rumstemperatur. Det är inte nödvändigt att skydda gelerna från ljus.
Obs: Det kan ta längre tid för geler att ställa under kalla rumstemperatur. Avgasning gel blandningen innan du lägger TEMED och APS hjälper påskynda detta steg. För detta ändamål, kan gel blandningen tillagas i en 100-200 mL Erlenmeyer-kolv ansluten till en sug. Avlufta lösningen för 10 min. - Ta bort de lager 2-propanol genom att absorbera med en pappershandduk.
- Tvätta det övre utrymmet av gelerna genom att fylla utrymmet med destillerat vatten från en tvättflaska och släng vattnet genom att hälla ut i bassängen. Upprepa tvättningen 3 gånger.
- Ta bort kvarstående vatten kvar i övre loppet av gelerna genom att absorbera med en pappershandduk.
- Förbered 3 mL 4% akrylamid gel blandning (4% (w/v) akrylamid (a: crylamide:bis-akrylamid = 29: 1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% (w/v) SDS) i en 15 mL tub.
Obs: Lägg inte till P-taggen akrylamid eller MnCl2 lösning till stapling gel blandningen. - Lägg till 7,5 µL TEMED och 24 µL 10% (w/v) APS i slutliga koncentrationer på 0,25% (v/v) och 0,08% (w/v), respektive. Blanda väl genom att försiktigt virvlande röret för 5 s och Häll blandningen ovanpå separationsgelen. Omedelbart sätta lämpliga kammar (17-väl plast kammar som rymmer upp till 25 µL av prover, till exempel).
- Låt gelen stå i 30 min i rumstemperatur. Det är inte nödvändigt att skydda gelerna från ljus. När stapling gelerna angett kör dem utan ytterligare lagring.
3. SDS-PAGE och Immunoblotting
- Ta bort kammar från gelerna. Sedan bort silicon distanser och sedan klipp från gelerna.
- Sätta de gjutna gelerna i gel tankar och fixa gelen till tanken genom fastspänning med bindemedel klipp.
- Häll det rinnande buffert (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% (w/v) SDS) i botten och toppen av gelerna. Ren brunnar genom att spola det rinnande buffert med en 5 mL spruta och en 21G nål ta bort gel bitar.
- Avlägsna luftbubblor från botten utrymme av gelerna med en böjd nål som bifogas en spruta. För att göra en böjd nål, manuellt böj en 21G nål i mitten av nålen så att vinkeln mellan spetsen och basen av nålen blir 30-45 °.
- Snurra ner fällningar som orsakas av tillägg av MnCl2 vid 20 000 × g i 1 min i rumstemperatur för att erhålla tydliga prover.
- Ladda 10 µg proteiner för att upptäcka fosforyleringen av överuttryckt Rab10 och 30 µg proteiner för endogen Rab10.
Obs: Det är viktigt att läsa lika stor volym av prover i alla brunnar. Tom körfält ska laddas med 1 × Laemmli SDS-PAGE prov buffert. Om proven innehåller MnCl2, lägga till dummy proverna samma koncentration av MnCl2 . - Den väl laddad med en molekylvikt markör (MWM) bör också kompletteras med 1 × Laemmli SDS-PAGE prov buffert så volymen av prover laddade är densamma i alla brunnar.
Obs: Igen, om proven innehåller MnCl2, lägga till samma koncentration av MnCl2 MWM. Alternativt kan en EDTA-fria MWM användas. - Kör geler på 50 V för stapling (ca 30 min) tills dye fronten passerar in i separation gel.
- När proverna stack, ändra spänningen till 120 V för separation tills dye framdel når botten av gelerna (cirka 50 och 80 min för 80 och 100 mm lång geler, respektive).
Obs: Migration mönstret för MWM förväntas vara annorlunda än den normala SDS-PAGE geler. Det bör inte användas för att uppskatta molekylvikten för proteiner på P-taggen SDS-PAGE geler men kan användas för att kontrollera reproducerbarheten av P-taggen geler. Se diskussion för mer information. - Tvätta gelerna för att ta bort MnCl2 från gelerna.
- Häll överföringen buffert (48 mM Tris, 39 mM glycin, 20% (v/v) metanol) innehållande 10 mM EDTA och 0,05% (w/v) SDS i en behållare (t.ex., stora väger båtar).
Obs: Använd färska buffert för varje tvätt.
- Placera ett filterpapper (10 x 7 cm) på en svamp pad för överföring. Placera gelen på pappersfiltret. Kontrollera att det finns några luftbubblor mellan pappersfiltret och gelen.
- Sätta ett membran (10 x 7 cm) på gelen och se till att det finns några luftbubblor mellan gel och membranet.
- Sätter en annan filterpapper (10 x 7 cm) på membranet och, igen, se till att det finns några luftbubblor mellan membranet och pappersfiltret.
- Sätta en annan svamp pad på pappersfiltret. Placera bunten med membranfilter/papper i en kassett för överföring.
- Placera kassetten i en överföring tank, se till att membranet är beläget mellan gel och positivt laddade anoden.
- Anslut tanken till en strömkälla och sätta tanken i en styren skum låda fylld med iskallt vatten. Starta överföring på 100 V för 180 min.
Obs: Långvarig överföringen är nödvändig eftersom överföringen av proteiner från P-taggen SDS-PAGE geler inte är lika effektiva som från normala SDS-PAGE geler. Effektiv kylning är viktigt att undvika smältande geler under överföringen.
- Ta bort hinnor från de geler som använder pincett och Blötlägg membranen i en Ponceau S lösning (0,1% (w/v) Ponceau S, 5% (v/v) ättiksyra) att färga överförda proteiner på membranen i en plastbehållare. Volymen av lösningen bör vara tillräckliga för att täcka ett membran.
- Inkubera membran för 1 min i rumstemperatur genom att vagga manuellt.
Obs: En stege av banden bör bli synlig i varje körfält. - Plocka membranet upp ur färglösningen med pincett och om stegen av banden har enhetligt mönster och intensiteten i varje lane där proverna har lästs.
- Efter kontroll färgningen, bort färgningslösningen och lägga till TBST buffert (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan lösning). Volymen av bufferten bör vara tillräckliga för att täcka ett membran.
Obs: Ponceau S lösningen kan samlas och återanvändas flera gånger. - Rock membranen i TBST på en gungande skakapparat (~ 60 rpm) i rumstemperatur tills inga synliga band kvar på membranen.
- Upprepa tvätt med färska TBST i 5 min.
Obs: Exponeringstid kan variera beroende på ECL lösningen och det system som används för detektion av chemiluminescence.
- Aktivera en kameran utrustad med en laddning – tillsammans enhet (CCD) kamera och en dator ansluten till kameran. Starta programvaran kontroll för kameran. Vänta tills temperaturen i kamerans CCD har nått-25 ° C.
- Placera 1 mL av ECL lösningen för ett membran på en plastfolie som sprids på en bänk.
- Sätta en membran gel-side-up på ECL lösning och snabbt vänder så att båda sidor av membranet är belagda med lösningen.
- Plocka membranet upp och tömma den genom att låta ena sidan av membranet touch en pappershandduk för 5 s.
- Sätta membranet mellan tydliga filmer (t.ex., tydliga papper fickor).
Obs: Plastfolie rekommenderas inte för inslagning membran. De tydliga filmer som används för inslagning membranet måste vara lika platt som möjligt utan synliga rynkor att undvika ojämna bakgrund. - Placera membranet på en svart bricka. Ställ in i kameran och Stäng luckan.
- Klicka på knappen ”fokusera” i fönstret av programvaran kontroll. Kontrollera att membranet är korrekt placerade. Klicka på knappen ”återgå”.
- Välj ”Precision” för ”Exposure Type”. Välj ”Manuell” för ”exponeringstid” och ange exponeringstiden till 1 s.
- Välj ”hög” för ”känslighet/upplösning”. Kryssa ”Lägg till digitalisering bild”. Klicka på knappen ”Start” för att ta en bild.
- Spara bilden som dök upp på displayen i datorn som en TIFF-fil.
- Upprepa med bilder med exponeringstiden från 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s och upp till 180 s. När du tar den sista bilden, kolla ”lägga till digitalisering bilden” så den digitala bilden, inte chemiluminescence, av membranet kan tas samtidigt.
- Välj bästa bilden med den största dynamikomfång och utan några mättar pixlar (visas i rött) i banden av intresse.
Obs: Konventionell röntgen filmer kan också användas för upptäckt19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Överuttryck System: Fosforylering av HA-Rab10 3 × flagga-LRRK2 i HEK293 celler:
HEK293 celler var transfekterade med 0.266 µg HA-Rab10 vildtyp och 1.066 µg 3 × flagga-LRRK2 (vildtyp, Kinas-inaktiva mutant (K1906M) eller FPD mutanter). Rab10 fosforylering undersöktes av P-taggen SDS-PAGE följt av immunoblotting använder en anti-HA antikroppar (figur 2). 10 µg av proteiner kördes på en 10% gel (80 x 100 x 1 mm) innehållande 50 µM P-taggen akrylamid och 100 µM MnCl2. Exponeringstiden för P-taggen gelen (övre panelen) var 10 s med en standardlösning ECL. Co-överuttryck av LRRK2 med Rab10 orsakade bandet skift på P-taggen gel (markerad med en öppen cirkel i den övre panelen; jämför körfält 2 och 4). Däremot Co uttryck med en tyrosinkinashämmare-inaktiva mutant (K1906M) LRRK2 misslyckades ändra rörligheten för Rab10 (jämför körfält 4 och 5), vilket indikerar att bandet skiftet är på grund av LRRK2 kinase aktiviteten. Band skiftet ökade alla FPD mutationer (jämför körfält 4 och 6-13) i samförstånd med de föregående rapport15.
Endogena System: Fosforylering av Rab10 av LRRK2 i odlade celler:
Mus 3T3-schweiziska albino embryonala fibroblast celler behandlades med eller utan en LRRK2 hämmare (GSK2578215A)20 med en slutlig koncentration på 1 µM för 1 h (figur 3A). Mänskliga lungceller carcinom A549 behandlades med eller utan en annan LRRK2 hämmare (MLi-2)21 med en slutlig koncentration på 10 nM för 1 h (figur 3B). Endogena Rab10 fosforylering av endogena LRRK2 undersöktes med P-taggen SDS-PAGE följt av immunoblotting med en anti-Rab10 antikropp. 30 µg av proteiner kördes på en 10% gel (100 x 100 x 1 mm för 3T3-schweiziska albino celler) och 80 mm för A549 celler innehållande 50 µM P-taggen akrylamid och 100 µM MnCl2. Exponeringen för P-taggen gelen (övre panelen) i figur 3A och figur 3B var 3 min och 90 s, respektive. Band skiftet motsvarar fosforyleras endogena Rab10 observerades på P-taggen gel (märkt med en öppen cirkel i den övre panelen; jämför körfält 1-2 och 3-4) som försvann vid behandling av celler med GSK2578215A eller MLi-2. Effekten av de LRRK2-hämmare validerades av immunoblotting med den anti-pSer935 LRRK2 antikroppen (tredje panelen från botten), som är en väletablerad avläsning av LRRK2 hämning i celler22.
Figur 1. Av P-taggen SDS-PAGE. När en blandning av fosforylerade (röda cirklar) och icke-fosforyleras (blå cirklar) proteiner (t.ex., Rab10) körs genom en gel där P-taggen akrylamid är samtidig polymeriserat, retards rörlighet endast fosforyleras proteiner på grund av den starka samspelet mellan fosforyleras proteiner med P-taggen molekylerna (bruten pilar). Eftersom Rab10 är fosforyleras av LRRK2 på en enda rest Thr73, Rab10 körs som två band: övre bandet representerar fosforylerade Rab10 och nedre bandet representerar icke-fosforyleras Rab10. När celler behandlas med LRRK2-hämmare, ska övre bandet försvinna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa resultat av P-taggen blot: överuttryck system. Den övre panelen visar P-taggen blot använder en anti-HA-antikropp, där fosforyleras och icke-fosforyleras Rab10 markeras med öppna (○) och slutna (●) cirklar, respektive. Panelerna nedan P-taggen blot är immunoblots på normala SDS-PAGE geler med hjälp av en anti-HA, anti-Flag, anti-α-tubulin och anti-GAPDH antikroppar. De HA blot och flagga blot visas för att säkerställa överuttryck av HA-Rab10 och 3xFLAG-LRRK2, respektive. De α-tubulin och GAPDH blotting visas för att säkerställa lika lastning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa resultat av P-taggen blot: endogena systemet. Två cellinjer, nämligen (A) 3T3-schweiziska albino och (B) A549 celler, användes. I båda siffror Visa panelerna övre P-taggen blotting använder en anti-Rab10 antikropp, där fosforyleras och icke-fosforyleras endogena Rab10 markeras med öppna (○) och stängd (●) cirklar, respektive. De paneler som visas nedan P-taggen blopparna är immunoblots på normala SDS-PAGE geler med hjälp av en anti-Rab10, anti-pSer935 LRRK2, anti-LRRK2 och anti-α-tubulin antikroppar. De Rab10 och LRRK2 visas för att säkerställa ett liknande uttryck för endogen Rab10 och LRRK2 mellan proven, respektive. PSer935 LRRK2 blot visas för att säkerställa att GSK2578215A (A) och MLi-2 (B) fungerade som förväntat. Α-tubulin blot visas för att säkerställa lika lastning. Bilder av P-taggen blopparna överlagrade med molekylvikt markören visas i Figur S4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1. DNA-sekvenser av plasmidsna. De DNA-sekvenserna av Plasmiden kodning HA-Rab10/pcDNA5 FRT till och med 3 × flagga-LRRK2/p3 × flagga-CMV-10. Alla plasmider används i detta protokoll finns tillgängliga från författarna på begäran. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S2. Ett exempel på optimering av P-taggen SDS-PAGE. Samma uppsättning prover som används i figur 3A användes för att optimera den P-taggen SDS-PAGE. Fyra olika villkor testades som visas i figuren. De band som motsvarar fosforyleras och icke-fosforyleras Rab10 markeras med fast och streckade linjen rektanglar, respektive.Baserat på detta experiment, gav villkoret med 10% akrylamid, 50 µM P-taggen akrylamid och 100 µM MnCl2 bästa separation av de två banden, båda lokalisering mitt i gelen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S3. Jämförelse av migration mönstret av en molekylvikt markör. Molekylvikt markören (MWM) kördes på en vanlig SDS-PAGE gel (till vänster) eller på en P-taggen SDS-PAGE gel (mellersta panelen) och gelerna var målat av Coomassie färgning. Den högra panelen visar en immunoblot av de prover som används i figur 2 (lane 4 och 5) på samma P-taggen SDS-PAGE gel som panelen mellersta att visar positionerna för fosforyleras och icke-fosforyleras Rab10. Pilspetsen på höger sida av immunoblot anger positionen för en av MWM på P-taggen SDS-PAGE gel. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S4. Placeringen av en molekylvikt markör på P-taggen SDS-PAGE geler. Digitaliserade bilder av membranen som används för figur 3A och figur 3B visas som (A) och(B), respektive. De immunoblots som visas i figur 3 är ovanpå varandra för att visa den relativa positionen för den molekylvikt markören (MWM). MWM överförde inte väl till membranen men markören (pilspets) i Figur S3 observerades svagt men konsekvent. Placera av MWM markeras med streckade linjer. Observera att körfält irrelevant för siffrorna mellan MWM och köer av intresse är överstruken. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en lättköpt och robust metod för att upptäcka Rab10 fosforylering av LRRK2 på endogena nivåer baserat på metoden som P-taggen. Eftersom den för närvarande tillgängliga antikroppen mot fosforylerade Rab10 fungerar endast med överuttryckt proteiner15, är den nuvarande metoden utnyttja P-taggen SDS-PAGE det enda sättet att bedöma endogena nivåerna av Rab10 fosforylering. Dessutom tillåter denna metod uppskattning av stökiometri av Rab10 fosforylering i celler. Eftersom metoden för P-taggen är allmänt tillämpligt på phospho-proteiner, kan detta protokoll vara en 'prototyp' för att upprätta liknande metoder för andra phospho-proteiner.
Kritiska steg i protokollet är gjutning geler och preparering av proverna. P-taggen akrylamid är ett relativt foto-labila reagens och möjligheten att fördröja det elektroforetiska mobilitet av fosforyleras proteiner bryts ibland efter långtidslagring vid 4 ° C. Forskare bör ta varje hand att undvika att utsätta P-taggen akrylamid i ljuset. Dessutom behöver P-taggen molekylen bildar ett komplex med Mn2 + joner att fånga fosfater. Prover bör således inte innehålla kelatbildare som EDTA, som är vanliga komponenter i kommersiellt tillgängliga SDS-PAGE prov buffertar. Vi rekommenderar att du använder den klassiska Laemmli prov buffert för att förbereda prover för P-taggen SDS-PAGE.
En annan kritisk punkt är att noggrant optimera koncentrationerna av akrylamid, P-taggen akrylamid och MnCl2 i separation gel blandningen (Figur S2). Migration distanserar av fosforyleras och icke-fosforyleras band kommer att variera beroende på de reagens som används (hel, renhet, etc.), och optimering av ordentlig koncentrationer genom att testa flera olika koncentrationer i kombination är obligatoriska (t.ex. P-taggen akrylamid (25, 50, 75 µM), MnCl2 (1:2 eller 1:3 molar förhållandet till P-taggen akrylamid), och akrylamid (7,5, 10, 12,5%)). Banden fosforyleras och icke-fosforyleras ska visas i mitten av gelerna och separerade väl från varandra. För optimeringsprocessen rekommenderas det att använda överuttryckt Rab10 eftersom skiftade bandet är lätt upptäckas. Författarna kan ge kontrollprover för detta protokoll.
En av den största förvirring som detta protokoll kan orsaka kommer att bero på skillnaden av flyttmönster av MWM mellan ordinarie och P-taggen SDS-PAGE geler. Som visas i Figur S3, flyttmönster av MWM på regelbunden och P-taggen SDS-PAGE geler (10%) är mycket annorlunda och man kan inte använda MWM för att uppskatta molekylvikten för proteiner på P-taggen SDS-PAGE geler. Dock på P-taggen SDS-PAGE geler sticker en av MWM ut genom att migrera till mitten av gelen (pilspets i Figur S3), som konsekvent observeras bland geler (se Figur S4). Detta MWM migrerar alltid mellan musikbanden av fosforyleras och icke-fosforyleras Rab10. Denna markör är därför användbar inte bara för att säkerställa att P-taggen SDS-PAGE fungerar innan överföringen men också som ett landmärke för att ha en grov känsla av där i fosforyleras och icke-fosforyleras Rab10 band kommer att ses.
För påvisande av band på immunoblots, vi har använt en kameran utrustad med en kylda CCD-kamera (se Tabell av material) samt som en konventionell röntgen film utveckla systemet, och fann att båda systemen fungerar väl. För påvisande av endogena nivåerna av Rab10 fosforylering i odlade celler är det nödvändigt att använda cellinjer som har höga nivåer av endogena LRRK2, såsom mus embryonala fibroblaster (antingen primära odlade och förevigade cell linjer ( 3T3-schweiziska albino, etc.)) och människans lung carcinom-derived A549 celler. För påvisande av endogena nivåerna av Rab10 fosforylering i mus vävnader, är det rekommenderat att använda lung16.
Kvantitering av Rab10 fosforylering är inte utöver det vanliga immunoblotting. Om stökiometri av Rab10 fosforylering är mycket låg (som visas i figur 3), tenderar intensiteten i icke-fosforyleras band (markerad med en sluten cirkel) att vara långt över mättnadsnivån, att göra den exakt bestämningen av stökiometri omöjligt. Kvalitativ bedömning är dock fortfarande möjligt i alla fall som är inte kan erhållas utan att använda denna metod. Eftersom påvisande av fosforyleringen av endogena Rab10 kräver långvarig exponering, tenderar där till vara några ospecifik band som förekommer på P-taggen blot trots att anti-Rab10 antikroppen används i detta protokoll ger ganska ren immunoblots för normal användning . För att skilja fosforyleras proteiner från ospecifik band, är det viktigt att använda en hämmare-behandling kontroll, där fosforyleras band, men inte ospecifik band, bör försvinna. LRRK2 phosphorylates Rab8 förutom Rab1015, och vi har framgångsrikt tillämpat detta protokoll till Rab8A samt (inga data anges). Detta protokoll kan potentiellt användas för att undersöka fosforyleringen av några proteiner, även om det kan finnas tekniska svårigheter om proteinet är stor (> 100 kDa) eller multiplicera fosforyleras. Eftersom Rab10 är ett litet protein (25 kDa) och fosforyleras ensamma på Thr73 av LRRK2, resultatet av P-taggen SDS-PAGE är enkelt där bara ett skiftat band observeras.
Inom en snar framtid, kommer att det vara avgörande att fastställa metoden för att påvisa kvantitativt kinase aktiviteten av LRRK2 i patientderiverade prover på en hög genomströmning sätt att bedöma förändring av Kinas aktiviteten av LRRK2 i PD patienter samt för att utvärdera effekten av läkemedel på LRRK2 i kliniska prövningar. Sedan människans perifera mononukleära blodceller (PBMC) express relativt höga nivåer av endogena LRRK223, PBMC eller ytterligare isolerade blodkroppar kommer att vara värt att testa för endogen Rab10 fosforylering. Denna metod kommer inte bara vara användbar i att undersöka grundläggande biologi LRRK2 signalering utbildningsavsnitt, men också stöd i att få en grundläggande proof-of-concept för att bestämma vilka prov i patientderiverade prover är som ska analyseras i sådana storskaliga studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo, Japan) för vänligt att ge plasmidsna kodning 3xFLAG-LRRK2 WT och mutanter. Vi tackar också Dr Dario Alessi (universitetet i Dundee, UK) Vänligen förse MLi-2 och plasmiden kodning HA-Rab10. Detta arbete stöds av Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHI Grant nummer JP17K08265 (G.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).
