Summary
Bu da çalışmanın Rab10 fosforilasyon endojen düzeyleri lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 algılama basit bir yöntem açıklanır.
Abstract
Lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 (LRRK2) mutasyonların ailesel Parkinson hastalığı ile (FPD) bağlanacak şekilde gösterilmiştir. LRRK2 kinaz aktivitesinin anormal harekete geçirmek PD patogenezinde karıştığı olmuştur, bu LRRK2 kinaz aktivitesinin fizyolojik düzeylerini değerlendirmek için bir yöntem kurmak için gereklidir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda LRRK2 fizyolojik koşullar altında Rab10, Rab GTPazlar ailesinin üyeleri phosphorylates ortaya koydu. Her ne kadar tarafından LRRK2 kültürlü hücrelerde endojen Rab10 fosforilasyon tarafından kütle spektrometresi tespit edilemedi, immunoblotting için şu anda mevcut fosforilasyon özgü antikorların zavallı duyarlılık nedeniyle tarafından tespit etmek zor oldu Rab10. İşte, biz basit bir tarif Rab10 fosforilasyon tarafından LRRK2 endojen düzeylerini tespit yöntemi bir fosfat bağlayıcı etiketi (P-etiket), ile birlikte Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) kullanan immunoblotting dayalı olan N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Mevcut Protokolü sadece P etiketi kullanan metodoloji örneği sağlar ama aynı zamanda hücre ve dokulara LRRK2 aşağı akım sinyal mutasyonlar yanı sıra inhibitörü tedavisi/yönetim veya herhangi bir diğer etken nasıl değiştirmek değerlendirmek sağlar .
Introduction
PD en sık görülen nörodejeneratif hastalıklar, ağırlıklı olarak orta dopaminerjik nöronlarda disfonksiyon yaşlı insanlar1motor sistemleri sonuçlanan etkileyen biridir. Hastaların çoğunda PD sporadik bir şekilde geliştirmek iken hastalığı devralan aileler. Bazı genlerdeki mutasyonlar FPD2ile bağlantılı olarak tespit edilmiştir. FPD için sorumlu gen biridir LRRK2, sekiz missense PARK8 denilen bir baskın devralınan FPD bağlı mutasyonlar (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S ve I2020T) şimdiye bildirilen3,4,5olmuştur. Çeşitli genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) sporadik PD hastaların da LRRK2 odağı genomik varyasyonları bir risk faktörü PD, anormallik LRRK2 işlevindeki ateş sporadik hem de yaygın bir nedeni olduğunu düşündüren için belirledik ve PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 lösin yönünden zengin tekrar alanının bir etki alanı, GTP bağlayıcı Ras karmaşık proteinleri (ROC) etki alanı, C-terminal ROC (COR) etki alanı, bir serin/treonin protein kinaz etki ve WD40 tekrar etki alanı9oluşan büyük bir protein (2527 amino asitler) olduğunu. Sekiz FPD mutasyonlar bu işlevsel etki alanlarında bulun; N1437H ve R1441C/G/H/S Y1699C COR etki alanında, G2019S ve I2020T kinaz etki alanındaki ROC etki alanında. Bu yana en sık mutasyon PD hastalar10,11,12' bulundu, G2019S mutasyon LRRK2 kinaz aktivitesinin 2-3 kat vitro13tarafından artırır, onaylanmadığına karar LRRK2 substrate(s) fosforilasyon anormal artış nöronlar için toksik. Ancak, fizyolojik ilgili LRRK2 yüzeylerde fosforilasyon hasta türetilmiş örneklerinde değerlendiren yöntemler eksikliği nedeniyle ailesel/sporadik PD hastalarında değişmiş olup olmadığını incelemek mümkün olmuştur.
Protein fosforilasyon genellikle immunoblotting ya da özellikle devletin fosforile proteinlerin veya kitle spektrometrik analizi tarafından tanıma antikorları kullanarak enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından algılanır. Ancak, eski strateji fosforilasyon özgü antikor oluşturma zorlukları nedeniyle bazen uygulanamaz. Radyoaktif fosfat içeren hücrelerin metabolik etiketleme fosforilasyon özel antikorlar kolayca kullanılabilir olduğunda fosforilasyon fizyolojik düzeyleri incelemek için başka bir seçenektir. Ancak, radyoaktif malzeme büyük miktarda gerektirir ve bu nedenle bazı özel ekipman radioprotection14için içerir. Kitle spektrometrik analizi daha duyarlı bu immunochemical yöntemlerine göre ve protein fosforilasyon analiz popüler oldu. Ancak, örnek hazırlıktır zaman alıcı ve pahalı aletler analiz için gereklidir.
LRRK2 için doğrudan fizyolojik yüzeylerde bir büyük ölçekli phosphoproteomic analiz15sonucuna dayalı olarak bir alt Rab10 ve Rab8 de dahil olmak üzere Rab GTPazlar ailesinin son zamanlarda bildirildi. O zaman Rab10 fosforilasyon FPD mutasyonlar fare embriyonik fibroblastlar ve fareler16knockin akciğerler yükseltilmiştir gösterdi. Bu raporda, biz bir Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) istihdam için seçti-P-etiket molekül Rab10 fosforilasyon, endojen düzeylerini saptamak için SDS-sayfa jelleri (P-tan SDS-sayfası) içine co polimerli yöntemi dayalı Çünkü son derece hassas antikor için fosforile Rab10 belirli hala eksik. Şu anda kullanılabilir antikorlar kötü selectivity nedeniyle endojen Rab8 fosforilasyon için toplam Rab8 algılamak başarısız oldu. Bu nedenle, Rab10 fosforilasyon üzerinde odaklanmaya karar verdi. LRRK2 Rab10 Thr73 son derece korunmuş geçiş"II" bölgesinin ortasında bulma phosphorylates. Yüksek koruma Rab proteinler arasında fosforilasyon sitelerin neden farklı Rab proteinler tanıma phosphospecific antikorlar yapmak zor nedenlerinden biri olabilir.
Rab8A LRRK2 tarafından fosforilasyon Rabin8, GTP15ile ilişkili GSYİH değiş tokuş ederek Rab8A etkinleştiren bir guanin nükleotid Satım faktörü (GEF) bağlama engeller. Fosforilasyon, Rab10 ve LRRK2 tarafından Rab8A de GSYİH bağlı Rab proteinler membran15ayıklayarak Rab proteinleri harekete geçirmek için gerekli olan GSYİH-ayrılma inhibitörleri (GDIs), bağlama engeller. Topluca, hassas moleküler mekanizması ve fosforilasyon fizyolojik sonuçları belirsiz kalır, ancak fosforilasyon tarafından LRRK2 Rab proteinlerin onları aktivasyon engellediğini onaylanmadığına karar.
P-etiket SDS-sayfa 2006 yılında Kinoshita vd tarafından icat edilmiştir: Bu yöntemde, Akrilamid kovalent P etiketi ile birleştiğinde, bir molekül fosfat SDS-sayfa copolymerized yüksek benzeşimli yakalama17jelleri. SDS-sayfa jel P etiketi molekülleri seçerek fosforile proteinlerin elektroforetik hareketlilik geri zekalı çünkü P etiketi SDS-sayfa fosforile proteinlerin sigara fosforile olanlardan ayırabilirsiniz (şekil 1). Faiz protein üzerinde birden fazla artıkları fosforile Eğer bir merdiven differentially fosforile biçimlerine karşılık gelen gruplarından gözlenir. Rab10 söz konusu olduğunda, biz Rab10 sadece Thr73 fosforile gösteren tek bir grup değiştirdi, gözlemlemek. İmmunoblotting fosforilasyon özel antikorlar ile büyük avantaj P etiketi SDS-sayfanın fosforile Rab10 fosforilasyon spesifik antikorlar (Yani, tanıma toplam Rab10) ile immunoblotting tarafından tespit edilebilir olduğunu membranlar transfer sonra genellikle ticari/akademik kaynaklardan daha belirli, hassas ve kullanılabilir olduğu. Bir immunoblotting fosforilasyon özel antikorlar ile veya radyoaktif hücrelerle metabolik etiketlerine göre hangi imkansız fosforilasyon, stoichiometry yaklaşık tahmini elde edebilirsiniz P etiketi SDS-sayfa kullanmanın bir diğer avantajı olduğunu fosfatlar.
Ucuz P etiketi Akrilamid ve bazı küçük değişiklikler ile ilgili kullanımı dışında Rab10 fosforilasyon LRRK2 tarafından algılanması için mevcut yöntemi immunoblotting genel bir protokol izler.Bu nedenle, immunoblotting örnek saf proteinler, hücre lysates ve doku homogenates dahil herhangi bir türde her zamanki bir uygulama nerede herhangi bir laboratuarlarında basit ve kolayca çalıştırılabilir olması gerektiği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. numune hazırlama için P-tan SDS-sayfası
- Kaldırmak ve hücreleri bir emme kullanarak yetiştirilmektedir 10 cm yemekleri medyadan atmak ve 5 mL Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) tarafından ilk ekleyerek DPBS bulaşıkları tarafına hücre katmanı rahatsız edici önlemek için hücrelerle yıkama ve el ile geri yemekleri rock ve birkaç defa ileri.
- Kaldırmak ve bir emme kullanarak DPBS atmak ve DPBS içinde seyreltilmiş %0.25 (w/v) tripsin 2 mL ekleyin ve hafifçe hücre katmanı kapsayacak şekilde yemekleri rock. Bulaşıkları bir CO2 kuluçka (37 ° C, oksijen hava, % 5 CO2) 5 min için içine koymak.
- Müstakil hücreleri kırmak için tek kullanımlık bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting sonra hücre süspansiyon 15 mL tüp içine toplamak ve bir hematocytometer bir mikroskop18altında kullanarak hücre yoğunluğu ölçün.
- % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş 2.5 × 105 hücre/mL Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) ile hücrelere sulandırmak. 2 mL (5 × 105 hücreleri) seyreltilmiş hücre süspansiyon 6-şey plakaları her şey için ekleyin.
- Gecede bir CO2 kuluçka (37 ° C, oksijen hava, % 5 CO2) hücreleri büyümek.
- HEK293 hücre içine transfection
Not: endojen Rab10 fosforilasyon incelenmesine ise 1.7 adıma devam edin. Plazmid bu protokol için kullanılan istek üzerine yazarlardan elde edilebilir. Kısa bilgi için Malzemeler tablo ve Şekil S1 DNA'ları için sequences konusuna bakın.- DMEM aliquot 200 µL 1,5 mL tüpler içine.
- Her tüp için kodlama HA-Rab10 ve 1,066 µg (son konsantrasyon 5,33 µg/mL) bir plazmid kodlama 3 × bayrak-LRRK2 500 µg/mL plazmid hisse senetleri üzerinden bir plazmid, her iki 0,266 µg (son konsantrasyon 1.33 µg/mL) ekleyin. O zaman 4 µL (20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0 çözünmüş) polyethyleneimine 1 mg/mL çözüm ve hemen vortexing 5 tarafından çözüm karıştırın s.
- Oda sıcaklığında 10 dakikadır stand ve bir tüp içeriğini dropwise bir de bir micropipette kullanarak eklemek tüp ver. Yavaşça ve el ile Kültür tabaklar ileri geri birkaç kez iyi eşit olarak diffüz transfection karışım izin için rock.
- Başka bir 24-36 h (37 ° C, oksijen hava, % 5 CO2) CO2 kuluçka için büyümek hücreleri izin.
- Endojen Rab10 fosforilasyon incelenmesine ise, hücre ve 1 h için LRRK2 inhibitörleri olmayan hücreleri lysing önce tedavi.
- Hisse senedi çözümleri LRRK2 inhibitörleri, Dimetil sülfoksit (DMSO) 10 mm inhibitörleri çözülerek hazırlayın. Mlı-2 ve GSK2578215A, son derece özel ve güçlü LRRK2 inhibitörleri kullanmanızı öneririz. Hisse senedi çözümleri-80 ° C'de depolayın
- İnhibitörleri çalışma stokları DMSO hisse senedi çözümlerle sulandrarak hazırlamak: mlı-2, sırasıyla 10 µM ve 30 µM endojen ve overexpressed LRRK2 için hazır olun. GSK2578215A için 1 mM ve 3 mM endojen ve overexpressed LRRK2 için sırasıyla hazırlayın.
- 2 µL mlı-2 veya GSK2578215A çalışma stoklarının bir de kullanarak bir micropipette ortasına kadar ekleyin ve hafifçe plaka kuyu eşit olarak diffüz inhibitörleri bildirmek için el ile ileri geri birkaç kez rock.
- 2 µL DMSO, farklı bir şey adım 1.8.3 inhibitörü için benzer bir şekilde bir negatif kontrol ekleyin.
- Tabakları da kuluçka için geri koy ve 1 h için hücreleri kültür.
- Hücreleri parçalayıcı.
- Kültür plakaları buza koy. Kaldırmak ve medya atın. Hücreleri ilk ekleyerek 2 hücre rahatsız edici önlemek için DPBS bulaşıkları tarafına katman ve el ile ileri geri birkaç kez bulaşıkları rock mL tarafından yıkayın.
- Kaldırın ve DPBS atmak ve lizis arabellek hücreleri 100 µL ekleyin (50 mM Tris-HCl pH 7.5, %1 (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl eter, 1 mM EGTA (etilen glikol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic asit), 1 mM sodyum orthovanadate, 50 mM sodyum florür, 10 mM β-gliserofosfat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.1 µg/mL microcystin-LR, 270 mM Sükroz, proteaz inhibitörü kokteyl).
- Buz tabakalarına eğilme ve kadar hücre olabildiğince lysate toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyorum. (Buz üzerinde önceden soğutulmuş) 1,5 mL tüpler içine bir micropipette kullanarak lysates toplamak.
Dikkat: Microcystin-LR yuttu veya cilt ile temasında ölümcül olabilir.
- Tam lizis için 10 dakika buz üzerinde durmak tüpleri ver. Santrifüjü (20.000 × g, 10 min 4 ° C'de) tarafından hücre lysates açıklamak ve buz üzerinde önceden soğutulmuş yeni 1,5 mL tüpler supernatants aktarmak.
- Bradford tahlil tarafından temizlenen lysates ölçü protein konsantrasyonu (µg/µL).
- Sığır serum albumin (BSA) standartları hazırlamak (0,2 0,4, 0.6, 0.8 ve 1 mg/mL) saf su ile hisse senedi çözüm sulandrarak tarafından. Tarafından temizlenen hücrenin lysates 20 seyreltik distile su ile.
- 5 µL/iyi BSA standartları, boş (distile su) ve seyreltilmiş her hücre lysate nüsha bir 96-şey tabağına koyun.
- 150 µL/iyi 12 kanallı micropipette kullanarak Bradford tahlil reaktif eklemek ve oda sıcaklığında 5 min için stand plaka.
- 595 Absorbans ölçmek nm bir plaka okuyucu ve BSA standartları Karşılaştırılacak.
- Örneklerin 100 µL SDS-sayfa için hazırlayın. Örnekleri protein konsantrasyonu 1 µg/µL overexpressed HA-Rab10 için ve 2 µg/µL endojen Rab10 için olduğunu.
- Adım 1.11.4 quantified konsantrasyonları kullanarak, birim (µL) hücre lysates 100 µg (overexpressed HA-Rab10) eşdeğer veya 200 µg (endojen Rab10) protein miktar (100 µg veya 200 µg) bölünmesi ile lysates (µ protein konsantrasyonu tarafından hesaplama g/µL).
- Oda sıcaklığında muhafaza yeni 1,5 mL tüpler için 4 × Laemmli'nın SDS-sayfa örnek arabelleği (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 8 (w/v) SDS, % 40 (v/v) gliserol, %0.02 (w/v) bromophenol mavi, %4 (v/v) β-mercaptoethanol) 25 µL ekleyin.
- Hücrenin her lysates tüp ve mix vortexing 5 tarafından hesaplanan birim ekleme, oda sıcaklığında s.
- Vortexing için 5 tarafından 100 µL lizis arabellek ve karışımı ile Toplam hacim getirmek s, oda sıcaklığında.
- 10 mM ile bağlayıcı Ajan gidermek için MnCl2 ek. 500 mM MnCl21 µL ekleyin. Karıştırmak yanında vortexing için 5 s, oda sıcaklığında.
Not: Örnekleri içeren MnCl2 normal SDS-sayfa için uygun olmayabilir.
2. döküm jelleri P-tan SDS-sayfası için
Not: Jelleri jelleri çalışan olarak aynı gün yapılmalıdır. Jelleri ortam ışık koşulları altında yapılabilir.
- 5 mM P etiketi Akrilamid hisse senedi çözüm toz/kalın P etiketi Akrilamid 10 mg 100 µL metanol ile tamamen çözülerek hazırlamak ve ardından Çift Kişilik distile su ekleyerek için 3,3 mL alın.
Not: P-etiket Akrilamid ışığa duyarlı olduğunu. Hazır çözüm kadar kullanmak karanlıkta 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. - % 70 etanol püskürtme ve bir kağıt havlu ile silinerek tarafından temiz hem düz hem çentikli tabaklar. Jel levha bir araya getirin. Bu belirli protokol için kullanılan jel levha boyutlarının 80 olduğundan ya da 100 mm 100 mm genişliğinde uzun. Temiz silikon çubukları arasında düz konur ve çentikli plakaları ve birleştirilmiş plakaları bağlayıcı klipleri ile sabitlenmiş.
Not: İş sıradan SDS-sayfa için jel kaplamalar her türlü kullanılabilir. - Bir tarak koymak (17-şey plastik tarak) monte jel Kaplamalar ve mark jel tabakta kuyu dibinde konumunu içine kalıcı bir kalem ile eskiden.
- 10 mL % 10 Akrilamid jel karışım hazırlamak (% 10 (w/v) Akrilamid (acrylamide:bis-Akrilamid 29:1 =), 375 mM Tris-HCl (pH 8.8), % 0,1 (w/v) SDS) 15 mL tüp içinde.
Not: Akrilamid en iyi konsantrasyon kullanılan reaktifler bağlı olarak değişebilir. Tetramethylethylenediamine (TEMED) ve amonyum persülfat (APS) bu noktada eklenmelidir değil. - 5 mM P etiketi Akrilamid 100 µL ve 1 M MnCl2 çözümleri 10 µL 50 µM ve 100 µM, son konsantrasyonları sırasıyla ekleyin.
Not: P-etiket Akrilamid ve MnCl2 en iyi konsantrasyonları da kullanılan reaktifler bağlı olarak değişebilir. - TEMED 15 µL % 0.15 (v/v) son bir konsantrasyon, jel karışıma ekleyip sonra 50 µL % 10 (w/v) APS, %0.05 (w/v) son bir konsantrasyon. De yavaşça 5 s ve dökmek için tüp içine monte plakayı hemen konumu adım 2.3 işaretlenmiş yüksekliği yani 2 mm aşağıda kadar dönen tarafından karıştırın.
- Yavaşça 2-propanol jelleri ayıran üst düzleştirmek için jel çözüm üzerine katman.
- Oda sıcaklığında 30 dakika stand jelleri izin. Işıktan jelleri korumak gerekli değildir.
Not: Soğuk oda sıcaklığında altında ayarlamak jeller için uzun sürebilir. TEMED ve APS eklemeden önce jel karışım gaz giderme bu adımı hızlandırmak yardımcı olur. Bu amaçla, jel karışımı bir 100-200 mL Erlenmeyer şişesi bir emme için bağlı olarak hazırlanabilir. 10 dk için çözüm degas. - Katmanlı 2-propanol bir kağıt havlu ile emerek kaldırın.
- Yıkama şişe distile su ile boşluk doldurma yukarıya tarafından jelleri en iyi yer yıkama ve su Havzası kapalı dökerek atın. Yıkama 3 kez tekrarlayın.
- Artık su bir kağıt havlu ile emerek jelleri üst uzayda kalan kaldırın.
- 3 mL % 4 Akrilamid jel karışım hazırlamak (%4 (w/v) Akrilamid (a: crylamide:bis-Akrilamid 29:1 =), 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), % 0,1 (w/v) SDS) 15 mL tüp içinde.
Not: P-etiket Akrilamid veya MnCl2 çözüm yığın jel karışıma ekleyin değil. - TEMED 7.5 µL ve 24 µL % 10 (w/v) APS %0.25 (v/v) ve %0,08 (w/v), son konsantrasyonlarda sırasıyla ekleyin. De yavaşça 5 s ve üstüne ayrılık jel karışımı dökmek için tüp dönen tarafından karıştırın. Hemen uygun tarak (örneğin örnekleri, en çok 25 µL karşılamak 17-şey plastik tarak) koymak.
- Oda sıcaklığında 30 dakika stand jelleri izin. Işıktan jelleri korumak gerekli değildir. Yığın jelleri ayarladıktan sonra onları daha fazla depolama çalıştırın.
3. SDS-sayfa ve Immunoblotting
- Taraklari jelleri kaldırın. Silikon çubukları ve klipleri jelleri kaldır.
- Döküm jelleri jel tankı koymak ve jel tankı için bağlayıcı klipleri ile sıkma tarafından düzeltin.
- Alt ve üst kısmında jelleri çalışan arabellek (25 mM Tris, 192 mM glisin, % 0,1 (w/v) SDS) dökün. Jel adet kaldırmak için 5 mL şırınga ve 21 G iğne kullanarak çalışan arabellek kızarma tarafından temiz kuyu.
- Hava kabarcıkları bir şırıngaya bağlı bir bükülmüş iğne kullanarak jelleri alt alanı kaldırın. Bükülmüş bir iğne yapmak için belgili tanımlık uç ve iğne Bankası arasındaki açı 30-45 ° olur, böylece 21 G iğne iğne ortasında el ile viraj.
- MnCl2 ' de 20.000 × g oda sıcaklığında 1 dk. için ek açık örneklerini almak için neden precipitates spin.
- Overexpressed Rab10 ve 30 µg protein fosforilasyon endojen Rab10 için algılamak için 10 µg proteinler yükleyin.
Not: Bütün Wells örnekleri eşit ses yüklemek için önemlidir. Boş yolları 1 × Laemmli'nın SDS-sayfa örnek arabellek ile yüklenmesi. Örnekleri MnCl2içeriyorsa, MnCl2 aynı konsantrasyonu kukla örnekleri ekleyin. - Yüklü örnekleri hacmi bütün Wells aynı yani de yüklü bir molekül ağırlığı marker (MWM) ile de 1 × Laemmli'nın SDS-sayfa örnek arabellek ile takıma.
Not: örnekleri MnCl2içeriyorsa, MnCl2 aynı yoğunlukta MWM için yeniden ekleyin. Alternatif olarak, bir EDTA ücretsiz MWM kullanılabilir. - Boya ön ayırma jel haçlar kadar (yaklaşık 30 dakika) istifleme için 50 V jelleri çalıştırın.
- Örnekler yığını sonra boya açık jelleri sonuna ulaşana kadar gerilim için 120 V ayrılması için değiştirin (yaklaşık 50 ve 80 dk 80 ve 100 mm için uzun jelleri, sırasıyla).
Not: MWM geçiş desen normal SDS-sayfa jeller üzerinde farklı olması bekleniyor. P-tan SDS-sayfası jeller üzerinde Proteinlerin moleküler ağırlık tahmin etmek için kullanılmamalıdır ancak P etiketi jelleri tekrarlanabilirlik kontrol etmek için kullanılabilir. Tartışma için ayrıntılı bilgi için bakın. - MnCl2 jelleri kaldırmak için jeller yıkayın.
- Aktarım arabellek (48 mM Tris, 39 mM glisin, %20 (v/v) metanol) içeren 10 mM EDTA ve %0,05 (w/v) SDS (örneğin, tekneler ağırlığında büyük) bir kaba dökün.
Not: taze arabellek her yıkama için kullanın.
- Transfer için bir sünger yastık üzerinde bir filtre kağıdı (10 x 7 cm) yerleştirin. Jel üzerinde filtre kağıdı yerleştirin. Hiçbir hava kabarcıkları filtre kağıdı ve jel arasında olduğundan emin olun.
- Bir membran (10 x 7 cm) üzerinde jel koymak ve hiçbir hava kabarcıkları jel ve membran arasında olduğundan emin olun.
- Başka bir filtre kağıdı (10 x 7 cm) membran üzerinde koymak ve tekrar, yok hava kabarcıkları membran ve filtre kağıdı arasında olduğundan emin olun.
- Başka bir sünger filtre kağıdı koymak. Membran/filtre kağıt yığını transfer için bir kaset koy.
- Kaset membran jel ve pozitif yüklü anot arasında yer olduğundan emin bir transfer tankı içine koymak.
- Tank bir güç kaynağına bağlayın ve stiren köpük kutusunda buz gibi su dolu tank koydu. 100 V 180 dk için Aktarım'ı başlatın.
Not: uzun süreli aktarım proteinler transferi P etiketi SDS-sayfa jelleri değildir beri bu kadar normal SDS-sayfa jelleri verimli gereklidir. Verimli soğutma jelleri aktarım sırasında erime önlemek için önemlidir.
- Membranlar cımbız kullanarak jelleri kaldırmak ve bir plastik kap içinde membranlar üzerinde aktarılan proteinler leke bir çözümde Ponceau S (%0,1 (w/v) Ponceau S, %5 (v/v) Asetik asit) membranlar ıslatın. Çözüm hacmi bir membran kapak için yeterli olmalıdır.
- Oda sıcaklığında 1 dk. için membranlar el ile rock yaparak kuluçkaya.
Not: Bir merdiven gruplarından her şeritte görünür hale gelmelidir. - Membran dışında boyama çözüm cımbızla al ve grup merdiven nerede örnekleri yüklü her şeritte tek tip desen ve yoğunluğu olup olmadığına bakın.
- Sonra kontrol boyama, boyama çözüm kaldırın ve TBST arabellek (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, % 0,1 (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate) ekleyin. Arabellek hacmi bir membran kapak için yeterli olmalıdır.
Not: Ponceau S çözüm toplanabilir ve birkaç kez yeniden kullanılır. - Hiçbir görünür bantları membranlar kalıncaya kadar TBST oda sıcaklığında sallanan bir shaker (~ 60 rpm) üzerinde membranlar rock.
- 5 min için taze TBST ile çamaşır yineleyin.
Not: Pozlama süresi ECL çözüm ve Kemiluminesan tespiti için kullanılan sistemi bağlı olarak değişebilir.
- Şarj kuplajlı cihaz (CCD) fotoğraf makinesi ile donatılmış bir Imager ve bir bilgisayar için Imager bağlı açın. Denetim yazılımı için Imager başlatın. CCD kamera sıcaklığı-25 ° c ulaşmıştır kadar bekleyin
- ECL çözüm bir membran için 1 mL plastik bir şal bir bankta yaymak koymak.
- Bir membran jel-yan-up ECL çözüm üzerinde koymak ve böylece çözüm her iki membran kaplı sonra hızlı bir şekilde çevirmek.
- Membran pick up ve 5 için bir kağıt havlu membran dokunmatik bir tarafı izin vererek boşaltmak s.
- NET filmleri (örneğin, net kağıt cepler) arasındaki zar koymak.
Not: Membranlar sarma için plastik wrap tavsiye edilmez. Membran sarma için kullanılan net filmleri düzensiz arka plan önlemek için görünür kırışıklık olmadan mümkün olduğu kadar düz olması gerekir. - Membran siyah bir tepsiye yerleştirin. Imager içinde belgili tanımlık tepsi koymak ve kapıyı kapatın.
- Kontrol yazılımı penceresinde "Odaklama" düğmesini tıklatın. Membran doğru yerleştirilmiş kontrol edin. "Geri" düğmesini tıklatın.
- "Hassas" "Pozlama türü için" seçin. "El ile" "Pozlama süresi için" seçeneğini ve pozlama süresi 1 olarak küme s.
- "İçin duyarlılık/çözüm" "Yüksek" seçin. "Sayısallaştırma yansıması Ekle'yi" işaretlemeyin. Bir görüntü çekmek için "Başlat" düğmesini tıklatın.
- Çıktı görüntü bilgisayar sergilenen bir TIFF dosyası olarak kaydedin.
- 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 çekim hızı ile alma görüntüleri tekrar s ve 180 s. Son görüntü çekerken, "Sayısallaştırma yansıması Ekle'yi" kontrol dijital görüntü, membran Kemiluminesan değil aynı anda alınabilir.
- En iyi görüntüyü en büyük dinamik alan ve herhangi bir doyurarak piksel (kırmızı ile gösterilen) olmayan faiz bantlarında seçin.
Not: Konvansiyonel röntgen filmleri de algılama19için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overexpression sistemi: HA-Rab10 3 tarafından fosforilasyon × bayrak-LRRK2 içinde HEK293 hücreleri:
HEK293 hücreleri HA-Rab10 vahşi tipi ve 1,066 µg 3 × bayrak-LRRK2 (yaban-tipi, etkin olmayan kinaz mutant (K1906M) veya FPD mutantlar) 0,266 µg ile transfected. Rab10 fosforilasyon P etiketi SDS-sayfa bir anti kullanarak immunoblotting tarafından takip tarafından muayene-HA antikor (Şekil 2). proteinlerin 10 µg 50 µM P etiketi Akrilamid ve 100 µM MnCl2içeren bir % 10 üzerinde jel (80 x 100 x 1 mm) çalıştırmak. P-etiket jel (üst panel) için çekim hızı 10 yapıldı s standart ECL çözüm kullanarak. Co-overexpression Rab10 ile LRRK2, neden grup üst karakter üzerinde P etiketi jel (üst panel açık bir daire ile işaretlenmiş; yolları 2 ve 4 karşılaştırın). Buna ek olarak, kinaz etkin olmayan bir mutant ile ortak ifade başarısız oldu (K1906M) LRRK2 Rab10 hareketliliğini değiştirmek (4 ve 5 şerit karşılaştırmak), LRRK2 kinaz aktivitesi nedeniyle grup değişikliğidir gösteren. Grup üst karakter mutasyonlar (4 ve 6-13 şerit karşılaştırmak) bütün FPD ile anlaşma önceki rapor15arttı.
Endojen sistemi: Rab10 tarafından LRRK2 kültürlü hücrelerde fosforilasyon:
Fare 3T3-Swiss albino embriyonik fibroblast hücreleri içeren veya içermeyen bir LRRK2 inhibitörü (GSK2578215A)20 1 µM 1 h (şekil 3A) için son bir konsantrasyon, tedavi edildi. İnsan akciğer Karsinomu A549 hücreleri tedavi ile veya olmadan başka bir LRRK2 inhibitörü (mlı-2)21 10 son bir konsantrasyon, nM 1 h (şekil 3B) için. Endojen Rab10 fosforilasyon tarafından endojen LRRK2 P-etiket SDS-sayfa immunoblotting bir anti-Rab10 antikor ile izledi tarafından incelenmiştir. 30 µg proteinlerin % 10 jel (100 x 100 x 1 mm 3T3-Swiss albino hücreler için) ve A549 hücreler için 80 mm içeren 50 µM P etiketi Akrilamid ve 100 µM MnCl2çalıştırmak. Şekil 3A ve şekil 3B P etiketi jel (üst panel) için poz vardı 3 dk ve 90 s, anılan sıraya göre. Fosforile endojen Rab10 için karşılık gelen grup kayması gözlendi tedavi GSK2578215A veya mlı-2 içeren hücrelerin üzerine kayboldu (üst panel; Karşılaştır yolları 1-2 ve 3-4 açık bir daireyle işaretlenmiş) P-etiket jel üzerinde. LRRK2 inhibitörleri etkinliğini LRRK2 inhibisyon hücreleri22köklü bir okuma olan anti-pSer935 LRRK2 antikor (alttan üçüncü Pano), kullanarak immunoblotting tarafından doğrulandı.
Şekil 1. P-tan SDS-sayfası şematik tasviri. Fosforile (kırmızı daireler) ve sigara fosforile (mavi daireler) proteinler (örneğin, Rab10) karışımı bir jel ile P-etiket Akrilamid co polimerli nerede çalıştığında, tek fosforile proteinlerin hareketlilik nedeniyle güçlü geciktirir (kırık ok) P-etiket molekülleri ile etkileşimi fosforile proteinlerin. Rab10 tarafından LRRK2 de bir tek kalıntı Thr73 fosforile beri Rab10 iki şeritler halinde çalışır: en iyi grup fosforile Rab10 ve sigara fosforile Rab10 alt grubu temsil eder. Hücreleri LRRK2 inhibitörleri ile tedavi ederken, üst grup yok olacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. P-etiket leke temsilcisi sonucu: overexpression sistemi. Üst paneldeki bir anti kullanarak P etiketi leke gösterir-HA antikor, nerede fosforile ve sigara fosforile Rab10 ile işaretlenir (○) açık ve kapalı (●) daireler, anılan sıraya göre. P-etiket leke gösterilen panelleri bir anti kullanarak normal SDS-sayfa jeller üzerinde immunoblots vardır-HA, Anti-bayrak, anti-α-tübülin ve anti-GAPDH antikorlar. HA leke ve bayrak leke overexpression HA-Rab10 ve 3xFLAG-LRRK2, sırasıyla sağlamak için gösterilir. α-tübülin ve GAPDH lekesi eşit yükleme sağlamak için gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. P-etiket leke temsilcisi sonucu: endojen sistemi. İki satır, yani(a)3T3-Swiss albino hücreleri ve (B) A549 hücreleri, hücre kullanıldı. Hem rakamlar üst panelleri nerede fosforile ve sigara fosforile endojen Rab10 ile Aç (○) işaretlenir ve sırasıyla (●) daireler, kapalı bir anti-Rab10 antikor kullanarak P etiketi çöplerinizi göster. P-etiket lekesi gösterilen immunoblots bir anti-Rab10, anti-pSer935 LRRK2, anti-LRRK2 ve anti-α-tübülin antikorları kullanarak normal SDS-sayfa jeller üzerinde panelleridir. Rab10 ve LRRK2 endojen Rab10 ve LRRK2 benzer ifade örnekleri arasında sırasıyla sağlamak için gösterilir. PSer935 LRRK2 leke are göstermek sağlamak için o GSK2578215A(a)ve mlı-2 (B) beklendiği gibi çalıştı. α-tübülin leke eşit yükleme sağlamak için gösterilir. Moleküler ağırlık marker ile üst üste P etiketi lekesi görüntülerini Şekil S4içinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil S1. Plazmid DNA dizileri. HA-Rab10/pcDNA5 FRT için ve bu 3 × bayrak-LRRK2/p3 × bayrak-CMV-10 kodlama plazmid DNA dizisi. Bu protokol için kullanılan tüm plazmid yazarlardan istek üzerine mevcuttur. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S2. P-tan SDS-sayfası optimizasyonu örneği. Örnek olarak şekil 3A içinde kullanılan aynı kümesini P-tan SDS-sayfası optimize etmek için kullanıldı. Dört farklı koşullar şekilde gösterildiği gibi test edildi. Fosforile ve sigara fosforile Rab10 için karşılık gelen grup ile düz ve kesikli çizgi dikdörtgenler, sırasıyla vurgulanır.Bu deney üzerinde bağlı olarak, % 10 Akrilamid, 50 µM P etiketi Akrilamid ile 100 µM MnCl2 koşul iki grup, en iyi ayrılması her iki yerinin ortasında jel verdi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S3. Bir molekül ağırlığı marker geçiş desen karşılaştırılması. Moleküler ağırlık işaretleyici (MWM) düzenli SDS-sayfa jel (sol panelde) veya P-tan SDS-sayfası jel (orta Masası) çalıştırıldığı ve jelleri lekeli Coomassie boyama tarafından. Doğru kapı aynası bir immunoblot Şekil 2 ' de (lane 4 ve 5) kullanılan örnekleri aynı P etiketi SDS-sayfa jel fosforile ve sigara fosforile Rab10 konumları göstermek için orta panel olarak gösterir. Önizlemedeki immunoblot sağ tarafta bir P-tan SDS-sayfası jel üzerinde MWM konumunu gösterir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Şekil S4. P-tan SDS-sayfası jeller üzerinde bir molekül ağırlığı işaretleyicisinin konumunu. Şekil 3A ve şekil 3B için kullanılan membranların sayısallaştırılmış görüntüleri (A) gösterilir ve(B), anılan sıraya göre. Şekil 3 ' te gösterilen immunoblots molekül ağırlığı işaretleyici (MWM) göreli konumunu göstermek için üst üste. MWM membranlar için de transfer değil ama Şekil S3 işaretleyicisinde (ok ucu) hafifçe ama sürekli gözlendi. MWM konumunu noktalı çizgilerle işaretlenir. Şerit MWM ve faiz hatlarının arasındaki rakamlara alakasız çaprazlaştı unutmayın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, Rab10 fosforilasyon tarafından LRRK2 P-etiket yöntembilimi'ne dayalı endojen düzeylerde tespit facile ve sağlam yöntemi açıklanmaktadır. Fosforile Rab10 karşı şu anda mevcut antikor ile sadece15overexpressed proteinler çalıştığından, P-tan SDS-sayfası kullanan mevcut yöntemi Rab10 fosforilasyon endojen düzeylerini değerlendirmek için tek yolu bu. Ayrıca, mevcut yöntemi Rab10 fosforilasyon hücrelerdeki stoichiometry tahmin sağlar. P-etiket metodoloji fosfo-proteinler için genel olarak uygulanabilir olduğu için mevcut Protokolü diğer fosfo-proteinler için benzer yöntemler kurmak için bir "prototip" olabilir.
Döküm jelleri ve örnekleri hazırlanması protokolündeki önemli adımlardır. P-etiket Akrilamid nispeten fotoğraf değişken bir reaktif ve elektroforetik hareketlilik fosforile proteinlerin geri zekalı yeteneği bazen uzun vadeli depolama 4 ° C'de sonra kayıp Araştırmacılar ışık için P-etiket Akrilamid kullanılmasını önlemek için her Bakımı almalıdır. Ayrıca, P-etiket molekül fosfat yakalamak için Mn2 + iyonları ile bir kompleks oluştururlar, gerekiyor. Böylece, örnekleri piyasada bulunan SDS-sayfa örnek arabellekleri her zamanki bileşenleri olan şelat ajanlar gibi EDTA, içermelidir. Klasik Laemmli'nın örnek arabellek örnekleri P-tan SDS-sayfası için hazırlamak için kullanmanızı öneririz.
Başka bir kritik nokta iyice Akrilamid, P-etiket Akrilamid ve MnCl2 ayrılık jel karışımı (Şekil S2) konsantrasyonları optimize etmektir. Fosforile ve sigara fosforile gruplarından geçiş mesafeleri kullanılan reaktifler bağlı olarak (çok, saflık, vb) değişir ve birkaç farklı konsantrasyonları birlikte test ederek uygun konsantrasyonlarda optimizasyonu zorunlu (Örneğin, P-etiket Akrilamid (25, 50, 75 µM), MnCl2 (1:2 veya 1:3 molar oranı P etiketi Akrilamid) ve Akrilamid (7.5, 10, % 12.5)). Fosforile ve sigara fosforile bantları jelleri ortasında görünür ve de birbirinden ayrılmış. En iyi duruma getirme işlemi için kolayca algılanabilir ötelenen grubudur çünkü overexpressed Rab10 kullanılması önerilir. Yazarlar bu iletişim kuralı için kontrol örnekleri sağlar.
Bu iletişim kuralı neden olabilir en büyük karışıklık MWM geçiş şekillerinin düzenli ve P-tan SDS-sayfası jelleri arasındaki farkı nedeniyle biri olacak. Şekil S3içinde gösterildiği gibi normal ve P-tan SDS-sayfası jelleri (her iki % 10) üzerinde MWM geçiş şekillerinin büyük ölçüde farklıdır ve bir P-tan SDS-sayfası jeller üzerinde Proteinlerin moleküler ağırlık tahmin etmek için MWM kullanamazsınız. Ancak, P-tan SDS-sayfası jeller üzerinde MWM biri (bkz. Şekil S4) jeller arasında sürekli olarak görülmektedir ( Şekil S3içinde ok ucu), jel ortasında göç öne çıkmaktadır. Bu MWM her zaman fosforile ve sigara fosforile Rab10 bantları arasında geçirir. Bu nedenle, bu işaret değil sadece P-etiket SDS-sayfa transferi önce aynı zamanda fosforile ve sigara fosforile Rab10 bantları nerede görülecektir kaba bir fikir sahibi olmak için bir dönüm noktası olarak çalışır sağlanması için kullanışlıdır.
İmmunoblots bands tespiti için biz-si olmak kullanılmış soğutmalı bir CCD fotoğraf makinesi ile donatılmış bir Imager ( Tablo malzemelerigörmek) de gelişmekte olan sistem konvansiyonel röntgen filmi ve her iki sistem de iş buldum. Rab10 fosforilasyon kültürlü hücrelerde endojen düzeylerinin tespiti için (her iki birincil kültürlü ya da ölümsüzleştirilmiş hücre hatları (fare embriyonik fibroblastlar gibi endojen LRRK2 yüksek ifade düzeyine sahip hücre hatları kullanmak gereklidir 3T3-Swiss albino, vb)) ve insan akciğer Karsinomu kaynaklı A549 hücreleri. Fare dokularda Rab10 fosforilasyon endojen düzeylerinin tespiti için akciğer16kullanılması önerilir.
Rab10 fosforilasyon Nefelometri bu her zamanki immunoblotting değil. Stoichiometry Rab10 fosforilasyon ( şekil 3gösterildiği gibi) çok düşük ise, Sigara fosforile bant (kapalı bir daire ile işaretlenmiş) yoğunluğu çok doygunluk seviyesinden stoichiometry kesin olarak belirlenmesi yapma olma eğilimindedir imkansız. Yine de, nitel tahmini ne olursa olsun, hangi mevcut yöntemi kullanmadan elde edilebilecek değil hala mümkündür. Endojen Rab10 fosforilasyon tespiti uzun süre maruz gerektirdiğinden, orada düz-se bile bu protokol için kullanılan anti-Rab10 antikor oldukça temiz immunoblots için normal kullanım verir bazı spesifik olmayan Grup P etikette görünen leke olmak eğilimindedir . Fosforile proteinlerin nonspesifik bantları ayırt etmek için hangi fosforile bantları, ama değil belirsiz bantları, kaybolur bir önleyici tedavi denetimini kullanmak için önemlidir. LRRK2 Rab8 phosphorylates Rab1015yanı sıra, ve biz başarılı bir şekilde mevcut protokol Rab8A için de (veri gösterilmez) uygulamış. Protein büyük ise teknik sorunlar olabilir rağmen mevcut Protokolü herhangi bir protein fosforilasyon incelemek için kullanılabilir (> 100 kDa) veya çarpma fosforile. Rab10 küçük bir protein (25 kDa) ve tek başına Thr73 LRRK2 tarafından fosforile çünkü tek kayar bant gözlenen nerede P etiketi SDS-sayfa basit sonucudur.
Yakın gelecekte, hasta kaynaklı örneklerinde değişiklik PD hastalarında de değerlendirmek için LRRK2 kinaz aktivitesinin değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek şekilde kantitatif LRRK2 kinaz aktivitesinin algılamaya yöntem kurmak için kritik olacak klinik çalışmalarda uyuşturucu etkisi üzerinde LRRK2. Beri insan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) hızlı endojen LRRK223, PBMCs nispeten yüksek düzeyde veya daha fazla izole kan hücrelerinin endojen Rab10 fosforilasyon için test değer-ecek var olmak. Mevcut yöntemi sadece yol sinyal temel Biyoloji LRRK2, soruşturma yararlı, ama aynı zamanda bir temel,-hangi örneğin hasta kaynaklı örneklerinde bu tür büyük ölçekli çalışmalarda çözümlenmesi için karar vermek için prototip elde etmek yardım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo, Japonya) lütfen 3xFLAG-LRRK2 WT ve mutantlar kodlama plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz de Dr Dario Alessi (Dundee Üniversitesi, İngiltere) nazikçe mlı-2 ve HA-Rab10 kodlama plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser bilim promosyon (JSP'ler) KAKENHI Grant numarası JP17K08265 (G.I.) için Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).
