Summary
המחקר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה של גילוי רמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי לאוצין-עשיר אני חוזר קינאז 2.
Abstract
מוטציות בגן עשיר לאוצין קינאז חוזר 2 (LRRK2) הוכחו להיות מקושר עם משפחתית מחלת פרקינסון (FPD). מאז הפעלת נורמלית של פעילות קינאז LRRK2 היה מעורב בפתוגנזה של המשטרה, זה חיוני להקים שיטה להעריך את רמות פיזיולוגיים של פעילות קינאז LRRK2. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי LRRK2 phosphorylates בני משפחת ראב GTPase, כולל Rab10, בתנאים פיזיולוגיים. למרות זירחון של Rab10 אנדוגני מאת LRRK2 בתאים בתרבית יכול להתגלות על ידי ספקטרומטר מסה, זה היה קשה לזהות את זה על-ידי immunoblotting עקב הרגישות המסכן של נוגדנים ספציפיים זרחון זמין כעת עבור Rab10. כאן, אנו מתארים פשוט שיטת זיהוי הרמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי LRRK2 בהתבסס על immunoblotting ניצול נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) בשילוב עם תג מחייב פוספט (P-תג), אשר הוא N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- טריס (pyridin-2-yl-מתיל) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. בפרוטוקול הנוכחי לא רק מספק דוגמה של המתודולוגיה ניצול P-התג אלא גם מאפשרת את ההערכה של מה מוטציות וכן מעכב טיפול/ניהול או כל גורמים אחרים לשנות באיתות במורד הזרם של LRRK2 ב תאים ורקמות .
Introduction
משטרת היא אחת ממחלות ניווניות הנפוץ ביותר, בעיקר משפיע על נוירונים דופאמין במוח התיכון, והתוצאה היא חוסר תפקוד של מערכות מנוע קשישים1. בעוד רוב החולים לפתח PD באופן סדיר, יש משפחות הורשת המחלה. מוטציות בגנים מספר נמצאו יקושרו עם FPD2. הוא אחד הגנים סיבתי עבור FPD LRRK2, שבו שמונה missense מוטציות (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S ו I2020T) קשורה FPD דומיננטית תורשתית בשם PARK8 כה דווח על3,4,5. מספר מחקרים הגנום כולו האגודה (GWAS) של חולי PD סדיר גם זיהו גנומית וריאציות על מיקומה LRRK2 כגורם סיכון עבור PD, רומז ליקוי בפונקציה של LRRK2 הוא גורם נפוץ הקשורים ניוון מוחיים בשתי סדיר ו PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 הוא חלבון גדול (חומצות אמינו 2,527) בהיקף של תחום אני חוזר לאוצין-עשיר, הראס GTP-איגוד של חלבונים מורכבים (ROC) תחום, C-מסוף של תחום ROC (קור), תחום סרין/תראונין פרוטאין קינאז, תחום אני חוזר WD409. מוטציות FPD שמונה לאתר בתחומים פונקציונליים אלה; N1437H, R1441C/G/H/S בתחום ROC, Y1699C בתחום קור, G2019S ו- I2020T בתחום קינאז. מאז מוטציה G2019S, אשר נמצא לעתים קרובות ביותר מוטציה ב- PD חולים10,11,12, מגביר את פעילות קינאז LRRK2 על ידי קיפול במבחנה2-313, זה המשוערות כי העלייה חריג זירחון של LRRK2 substrate(s) רעיל נוירונים. עם זאת, זה כבר בלתי אפשרי ללמוד אם זירחון של סובסטרטים LRRK2 רלוונטי מבחינה פיזיולוגית היא שונה בחולים PD משפחתית/סדיר עקב המחסור של שיטות להערכת זה בדגימות נגזר החולה.
זירחון חלבונים מזוהה בדרך כלל על-ידי immunoblotting או מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) באמצעות נוגדנים במיוחד להכרת המדינה phosphorylated של חלבונים, או על ידי ניתוח המוני spectrometric. עם זאת, האסטרטגיה לשעבר לפעמים אין אפשרות להחיל בשל הקשיים ביצירת נוגדנים ספציפיים זירחון. תיוג מטבולית של תאים עם פוספט רדיואקטיבי הוא אפשרות נוספת לבחון רמות פיזיולוגיים של זרחון נוגדנים ספציפיים זרחון אינם זמינים. עם זאת, הוא דורש כמות גדולה של חומרים רדיואקטיביים, ולכן כרוך איזה ציוד מיוחד עבור המכון להגנת14. ניתוח spectrometric המוני הוא רגיש יותר לעומת שיטות immunochemical אלה והפך פופולרי בניתוח זירחון חלבונים. עם זאת, הכנת הדוגמא היא גוזלת זמן, כלי נגינה יקר נדרשים לניתוח.
תת-קבוצה של משפחת ראב GTPase כולל Rab10 ו- Rab8 דווח לאחרונה סובסטרטים פיזיולוגיים ישירים עבור LRRK2 בהתבסס על התוצאה של ניתוח phosphoproteomic בקנה מידה גדול15. אנחנו מכן הפגינו זרחון Rab10 הוגדל על ידי מוטציות FPD fibroblasts עובריים בעכבר, הריאות של knockin עכברים16. בדו ח זה, בחרנו להעסיק נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד)-המבוסס על שיטת שבו מולקולה P-תג הוא שותף polymerized לתוך ג'לים מרחביות-דף (P-תג מרחביות-עמוד) לגילוי הרמות אנדוגני של זרחון Rab10, כי נוגדן רגישה מאוד ספציפיות עבור phosphorylated Rab10 היה עדיין חסר. אנחנו נכשלנו לזהות זירחון של Rab8 אנדוגני בשל מידת הבררנות המסכן של נוגדנים זמין כעת עבור Rab8 סה לכן, החלטנו להתמקד זירחון Rab10. LRRK2 phosphorylates Rab10 ב Thr73 באיתור באמצע של אזור מאוד שנשמרת "להחליף II". גבוהה שימור האתרים זרחון בין חלבונים רב יכול להיות אחת הסיבות למה קשה לעשות נוגדנים phosphospecific זיהוי חלבונים ראב ברורים.
זירחון של Rab8A על ידי LRRK2 מעכב את הכריכה של Rabin8, גואנין נוקלאוטיד exchange גורם (בתאוריה) אשר מפעילה Rab8A על ידי החלפת התל מאוגד עם GTP15. זירחון של Rab10 ו- Rab8A על ידי LRRK2 מעכב גם את הכריכה של מעכבי התמ ג-דיסוציאציה (GDIs), המהווה מרכיב חיוני להפעלת ראב חלבונים על-ידי חילוץ התמ ג מכורך ראב חלבונים ממברנות15. באופן קולקטיבי, זה זה שיערו כי זירחון של ראב חלבונים על ידי LRRK2 מונעת מהם ההפעלה למרות המנגנון המולקולרי המדויק ואת ההשלכות הפיזיולוגיות של זירחון אינן ברורות.
P-תג מרחביות-דף שהומצאה על ידי קינוסיטה. et al. 2006: בשיטה זו, אקרילאמיד covalently תמיד עם P-תג, מולקולה לכידת פוספטים עם זיקה גבוהה, אשר copolymerized לתוך מרחביות-דף ג ' לים-17. כי המולקולות P-תג של ג'ל מרחביות-דף מפגר באופן סלקטיבי electrophoretic ניידות של חלבונים phosphorylated, P-תג מרחביות-דף יכול להפריד חלבונים phosphorylated אלה שאינם phosphorylated (איור 1). אם החלבון-של-העניין הוא phosphorylated על משקעים מרובים, יתקיימו סולם של להקות המתאים טפסים באופן שונה phosphorylated. במקרה של Rab10, אנו מבחינים הלהקה שהוסטו אחד בלבד, המציין כי Rab10 הוא phosphorylated רק ב Thr73. היתרון העיקרי של P-תג מרחביות-דף מעל immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים זרחון הוא כי ניתן להבחין phosphorylated Rab10 באמצעות immunoblotting עם נוגדנים לא זרחון-ספציפית (קרי, בזיהוי Rab10 סה) לאחר שהועבר על ממברנות, אשר בדרך כלל יותר ספציפיים, רגיש ו זמין ממקורות מסחריים/אקדמית. יתרון נוסף של השימוש P-תג מרחביות-דף זה כי הוא יכול להשיג אומדן משוער סטויכיומטריה של זרחון, שזה בלתי אפשרי immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים זרחון או על ידי תיוג מטבולית של תאים עם רדיואקטיבי פוספטים.
מלבד השימוש אקרילאמיד P-תג יקר כמה שינויים מזעריים הקשורות אליו, השיטה נוכח גילוי של זרחון Rab10 על ידי LRRK2 כדלקמן פרוטוקול הכללי של immunoblotting.לכן, זה צריך להיות ישירה בקלות הפעלה במעבדות כל איפה immunoblotting אימון כרגיל, עם כל סוגי דגימות כולל חלבונים מטוהרים, lysates תא של רקמת homogenates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מדגם הכנה מרחביות – העמוד P-תג
- להסיר, למחוק את המדיה של 10 ס מ מנות שבו תאים גדלים באמצעות יניקה לשטוף תאים עם באגירה פוספט תמיסת מלח 5 מ"ל Dulbecco (DPBS) על ידי DPBS הוספת הראשון לצד של הכלים כדי שלא להפריע למטופלים את שכבת תאים ואני רוק באופן ידני את הכלים בחזרה הלאה וכמה פעמים.
- להסיר, למחוק את DPBS באמצעות יניקה להוסיף 2 מ של 0.25% (w/v) טריפסין מעורבבת עם DPBS ו רוק בעדינות את הכלים כדי לכסות את שכבת תאים. מכניסים את הכלים CO2 מיכלים (37 ° C, humidified אוויר, 5% CO2) במשך 5 דקות.
- לאחר pipetting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה חד פעמיות לשבור את התאים מנותקת, לאסוף את התליה תא לתוך צינור 15 מ"ל ולמדוד את צפיפות התאים באמצעות hematocytometer תחת מיקרוסקופ18.
- לדלל את התאים כדי 2.5 × 105 תאים למ"ל בינונית נשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין U/mL 100 ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL. להוסיף 2 מ ל (5 × 105 תאים) של התליה תא מדולל כל טוב של לוחות 6-. טוב.
- לגדל את התאים לילה ב- CO2 מיכלים (37 ° C, humidified אוויר, 5% CO2).
- תרביות תאים לתאים HEK293
הערה: אם זירחון של Rab10 אנדוגני להיבדק, להמשיך לצעוד 1.7. פלסמידים המשמשים פרוטוקול זה ניתן לקבל מן המחברים על פי בקשה. ראה טבלה של חומרים עבור מידע קצר, איור S1 עבור הדנ א שלהם רצף.- Aliquot µL 200 של DMEM לתוך צינורות 1.5 mL.
- כדי כל שפופרת, להוסיף שתי µg 0.266 (הריכוז הסופי של 1.33 µg/mL) של פלסמיד קידוד HA-Rab10 ו µg 1.066 (הריכוז הסופי של 5.33 מטרים µg/mL) של פלסמיד קידוד 3 × LRRK2 הדגל של 500 מניות פלסמיד µg/mL. לאחר מכן להוסיף 4 µL של 1 מ"ג/מ"ל תמיסת polyethyleneimine (מומס 20 מ מ HEPES-NaOH, pH 7.0) ומערבבים מיד את הפתרון על ידי vortexing על 5 s.
- תן הצינורות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולהוסיף את תכולת שפופרת אחת dropwise לשימוש אחד טוב של micropipette. בעדינות באופן ידני רוק הלוחות תרבות ואחורה מספר פעמים כדי שהתערובת תרביות תאים מפוזר באופן שווה לאורך כל הבאר.
- תן את התאים גדלים עבור עוד 24-36 h ב- CO2 מיכלים (37 ° C, humidified אוויר, 5% CO2).
- אם זירחון של Rab10 אנדוגני להיבדק, יטפל בתאים עם ובלי LRRK2 מעכבי לשעה לפני lysing תאים.
- להכין מלאי פתרונות של מעכבי LRRK2 על ידי המסת את מעכבי ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-10 מ מ. אנו ממליצים להשתמש MLi-2 ו- GSK2578215A, שהינם מעכבי LRRK2 ספציפיים מאוד, חזק. פתרונות מלאי החנות ב-80 מעלות צלזיוס.
- להכין עבודה מניות של מעכבי על ידי דילול מניות הפתרונות עם דימתיל סולפוקסיד: MLi 2, להתכונן 10 מיקרומטר ו- 30 מיקרומטר אנדוגני, overexpressed LRRK2, בהתאמה. עבור GSK2578215A, להכין 1 מ 3 מ מ עבור אנדוגני, overexpressed LRRK2, בהתאמה.
- להוסיף 2 µL של המניות לעבוד MLi-2 או GSK2578215A לאמצע אחד טוב באמצעות micropipette ו בעדינות סלע את הצלחת באופן ידני ואחורה מספר פעמים כדי לאפשר את מעכבי מפוזר באופן שווה לאורך כל הבאר.
- להוסיף 2 µL של דימתיל סולפוקסיד באר אחרת כפקד שלילי באופן דומה לחומר המדכא בשלב 1.8.3.
- ! תחזירו את הצלחות בחזרה אל החממה, התרבות התאים לשעה.
- Lyse התאים.
- לשים את הצלחות תרבות על קרח. להסיר ולמחוק את התקשורת. לשטוף את התאים על ידי הראשון mL 2 הוספת DPBS לצד של הכלים כדי שלא להפריע למטופלים התא שכבה ו סלע באופן ידני את הכלים ואחורה מספר פעמים.
- להסיר, למחוק את DPBS, ולהוסיף µL תאים 100 המאגר פירוק (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 1% (v/v) אתר polyoxyethylene(10)-octylphenyl, 1 מ"מ EGTA (אתילן גליקול-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic), orthovanadate נתרן 1 מ מ, 50 מ מ נתרן פלואוריד, 10 מ מ β-glycerophosphate, 5 מ מ נתרן רב-תכליתי, 0.1 µg/mL microcystin-LR, סוכרוז 270 מ מ, מעכב פרוטאז קוקטייל).
- להטות את הצלחות על קרח, לגרד את התאים באמצעות המגרד של התא כדי לאסוף כמה שיותר תא lysate ככל האפשר. לאסוף את lysates באמצעות micropipette לתוך צינורות 1.5 mL (טרום מקורר על הקרח).
התראה: Microcystin-LR יכולה להיות קטלנית אם נבלע או במגע עם העור.
- תן הצינורות לעמוד על קרח למשך 10 דקות על פירוק השלם. להבהיר את lysates התא על ידי צנטריפוגה (20,000 × g, 10 דקות ב 4 ° C) ולהעביר את supernatants חדש צינורות 1.5 mL טרום מקורר על קרח.
- למדוד ריכוז חלבון (µg/µL) lysates שנוקה על ידי שיטת ברדפורד.
- להכין שור אלבומין (BSA) סטנדרטים (0.2 0.4, 0.6, 0.8, 1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול הפתרון מניות עם מים מזוקקים. לדלל את התא lysates על ידי 20-fold עם מים מזוקקים.
- לשים 5 µL היטב את הסטנדרטים BSA, ריק (מים מזוקקים), וכל אחד מדולל תא lysate לתוך צלחת 96-ובכן כן.
- להוסיף 150 µL טוב מהתרכובת assay ברדפורד באמצעות 12-ערוץ micropipette ותנו את הצלחת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- למדוד את ספיגת-595 nm על הקורא צלחת עם השוואה לסטנדרטים BSA.
- היכונו µL 100 דגימות מרחביות-דף. ריכוז החלבון של הדגימות הוא µg 1/µL עבור overexpressed HA-Rab10 2 µg/µL עבור Rab10 אנדוגני.
- באמצעות ריכוז כימות מהשלב 1.11.4, לחשב את עוצמת הקול (µL) את lysates תא שקול ל- 100 µg (HA overexpressed-Rab10) או µg 200 (Rab10 אנדוגני) על-ידי חלוקת הסכום חלבון (100 µg או 200 µg) על-ידי ריכוז חלבון lysates (ממוצע g/µL).
- להוסיף 25 µL של 4 × Laemmli מרחביות-דף לדוגמה מאגר (62.5 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, 8% (w/v) מרחביות, 40% (v/v) גליצרול, כחול bromophenol 0.02% (w/v), 4% (v/v) β-mercaptoethanol) צינורות 1.5 mL החדש המשיך בטמפרטורת החדר.
- הוסף את הנפח מחושב של התא lysates לכל צינור ומערבבים על ידי vortexing על 5 s בטמפרטורת החדר.
- להביא את הנפח הכולל 100 µL עם פירוק מאגר, מיקס על ידי vortexing על 5 s בטמפרטורת החדר.
- תוספת עם 10 מ מ MnCl2 כדי להרוות את מכלט. להוסיף 1 µL של 500 מ מ MnCl2. מיקס על ידי vortexing על 5 s בטמפרטורת החדר.
הערה: ייתכן דגימות המכיל MnCl2 לא להיות מתאים מרחביות רגיל-דף.
2. יציקה ג'לים P-תג מרחביות – דף
הערה: ג'לים צריכה להיעשות באותו יום כמו של משטחים. ג'לים יכולים להתבצע בתנאים אור מקיף.
- להכין 5 מ מ P-תג אקרילאמיד מניות פתרון על ידי המסת הראשון 10 מ ג של אבקת/מלא P-תג אקרילאמיד לחלוטין עם µL 100 של מתנול, ואז להביא עד 3.3 מ"ל על-ידי הוספת מים מזוקקים כפול.
הערה: P-תג אקרילאמיד הוא רגיש אור. יש לאחסן את הפתרון מוכן בחושך ב 4 ° C עד השימוש. - צלחות נקי רגיל והן מחורץ על ידי ריסוס אתנול 70% ו לקנח עם מגבת נייר. להרכיב את הצלחות ג'ל. הממדים של הלוחות ג'ל בשימוש פרוטוקול מסוים זה הם 80 או 100 מ מ ארוך על ידי 100 מ מ רחב. מפרידי סיליקון נקי מוכנסים בין רגיל, לוחות מחורצים עם הלוחיות שהורכב כשכרטיס עם קלסר קליפים.
הערה: כל סוג של צלחות ג'ל הפועלים למען חברה דמוקרטית רגיל-דף ניתן להשתמש. - לשים מסרק להיות בשימוש (מסרק הפלסטיק. ובכן 17) לתוך צלחות ג'ל שהורכבו ו מארק בצלחת ג'ל המיקום של החלק התחתון של הבארות עם סמן קבוע.
- הכינו 10 מ"ל של 10% אקרילאמיד ג'ל תערובת (10% (w/v) אקרילאמיד (acrylamide:bis-אקרילאמיד = 29:1), 375 מ"מ טריס-HCl (pH 8.8), 0.1% (w/v) מרחביות) בשפופרת 15 מ"ל.
הערה: ריכוז אופטימלי של אקרילאמיד עשוי להשתנות בהתאם ריאגנטים בשימוש. Persulfate Tetramethylethylenediamine (TEMED), אמוניום (APS) לא להוסיף בשלב זה. - להוסיף 100 µL של אקרילאמיד P-תג 5 מ מ ו- µL 10 של 1 מ' MnCl2 פתרונות בריכוזים הסופי של 50 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר, בהתאמה.
הערה: ריכוז אופטימלי של אקרילאמיד תג P ו- MnCl2 יכול גם להשתנות בהתאם ריאגנטים בשימוש. - להוסיף 15 µL של TEMED לתערובת ג'ל-ריכוז סופי של 0.15% (v/v) ולאחר מכן 50 µL של 10% (w/v) APS-ריכוז סופי של 0.05% (w/v). מערבבים היטב על ידי בעדינות מתערבל הצינור עבור 5 s ו לשפוך לתוך הלוחות מורכבים באופן מיידי עד לגובה זה 2 מ מ מתחת המיקום מסומן בשלב 2.3.
- בעדינות שכבה 2-פרופנול אל הפתרון ג'ל כדי לשטח את החלק העליון של הפרדת מוצקים.
- תן את ג'לים לעמוד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. . זה לא הכרחי להגן על ג'לים מפני אור.
הערה: ייתכן שיידרשו ג'לים להגדיר תחת קר בטמפרטורת החדר מעט יותר זמן. Degassing את התערובת ג'ל לפני הוספת TEMED ו APS מסייעת להאיץ את שלב זה. למטרה זו, ניתן להכין לתערובת ג'ל בבקבוקון Erlenmeyer 100-200 מ"ל מחובר יניקה. דגה הפתרון עבור 10 דקות. - הסר את 2-פרופנול שכבתית ע י קליטת עם מגבת נייר.
- לשטוף את החלל העליון היחסי של ג'ל על ידי ממלא את החלל עם מים מזוקקים מבקבוק שטיפת ולמחוק את המים על ידי שנוטפת לאגן. חזור על נטילת 3 פעמים.
- להסיר שאריות מים שנותרו בחלל העליון היחסי של ג'ל על ידי קליטת עם מגבת נייר.
- להכין 3 מ"ל של 4% אקרילאמיד ג'ל תערובת (4% (w/v) אקרילאמיד (ת crylamide:bis-אקרילאמיד = 29:1), 125 מ מ טריס-HCl (pH 6.8), 0.1% (w/v) מרחביות) צינור 15 מ"ל.
הערה: לא להוסיף תג P אקרילאמיד או MnCl2 פתרון לתערובת ג'ל הערימה. - להוסיף 7.5 µL של TEMED ו- µL 24 של 10% (w/v) APS בריכוזים הסופי של 0.25% (v/v) ו 0.08% (w/v), בהתאמה. מערבבים היטב על ידי בעדינות מתערבל הצינור עבור 5 s ולשפוך התערובת על גבי הג'ל ההפרדה. מיד לשים מסרקים המתאים (מסרק פלסטיק 17-ובכן להכיל עד 25 µL של דגימות, לדוגמה).
- תן את ג'לים לעמוד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. . זה לא הכרחי להגן על ג'לים מפני אור. לאחר ג'לים לערום הגדר, להפעיל אותם ללא אחסון נוסף.
3. מרחביות – דף ו- Immunoblotting
- הסר את המסרקים ג'לים. ואז להסיר את הסיליקון מפרידי ולאחר מכן קליפים ג'לים.
- מכניסים את ג'לים casted ג'ל טנקים ולתקן את הג'ל למיכל על ידי מחבר חובק למעקה עם הקליפים בינדר.
- שופכים את המאגר המצטבר (25 מ"מ. טריס, 192 מ"מ גליצין, 0.1% (w/v) מרחביות) בחלק התחתון העליון היחסי של ג'ל. וולס נקי על ידי שטיפה המאגר פועל באמצעות מזרק 5 מ ל מחט 21G כדי להסיר חתיכות ג'ל.
- להסיר בועות אוויר מן החלל התחתון היחסי של ג'ל באמצעות מחט כפוף המצורפת מזרק. כדי להפוך את מחט כפוף, באופן ידני לכופף מחט 21G באמצע המחט כך הזווית בין הטיפ הבסיס של המחט הופכת 30-45 מעלות.
- ספין למטה פוחת משקעים הנגרמת על ידי התוספת של MnCl2 ב g × 20,000 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל דוגמאות ברורות.
- לטעון 10 חלבונים µg לגילוי זירחון של overexpressed Rab10 וחלבונים µg 30 עבור Rab10 אנדוגני.
הערה: חיוני כדי לטעון את נפח שווה של דגימות בבארות כל. מסלולים ריקים ייטען באמצעות מאגר מדגם של Laemmli × 1 עמודים מרחביות. אם הדגימות מכילים MnCl2, להוסיף הדגימות דמה ריכוז זהה של MnCl2 . - ובכן טעון עם סמן משקל מולקולרי (MWM) גם יש להשלימה באמצעות מאגר דגימה של 1 × Laemmli מרחביות-דף אז הנפח של דגימות טעון הוא זהה בבארות כל.
הערה: שוב, אם הדגימות מכילים MnCl2, להוסיף ריכוז זהה של MnCl2 MWM. לחלופין, ניתן להשתמש MWM נטולת EDTA. - הפעל ג'לים 50 V עבור סידור בערימה (כ- 30 דקות) עד לחזית לצבוע חוצה את הג'ל ההפרדה.
- לאחר הדגימות מחסנית, לשנות את המתח ל 120 V להפרדה עד לחזית צבע מגיע לתחתית היחסי של ג'ל (מינימום כ 50 ו 80 על 80 ו 100 ממ זמן רב ג'ל, בהתאמה).
הערה: דפוס ההעברה של MWM צפוי להיות שונה מזו על ג'לים מרחביות-דף רגיל. זה לא צריך לשמש עבור הערכת משקל מולקולרי של חלבונים על P-תג מרחביות-דף ג'לים אבל יכול לשמש כדי לבדוק את הפארמצבטית של ג'ל P-תג. עיין בדיון לפרטים. - לשטוף את ג'לים להסיר את MnCl2 ג'ל.
- יוצקים העברת מאגר (48 מ"מ טריס, 39 מ מ. גליצין, 20% (v/v) מתנול) המכילה EDTA 10 מ ל- 0.05% (w/v) מרחביות לתוך מכולה (למשל, גדול במשקל של סירות).
הערה: השתמש מאגר טריים עבור כל כביסה.
- מניחים נייר סינון (10x7 ס מ) על משטח ספוג להעברה. להניח את הג'ל על נייר הסינון. ודא כי ישנם אין בועות אוויר בין נייר הסינון הג'ל.
- לשים הג'ל קרום (10x7 ס מ) וודא כי ישנם אין בועות אוויר בין הג'ל הקרום.
- לשים נייר סינון נוסף (10x7 ס מ) על הקרום, שוב, לוודא שאין אין בועות אוויר בין הקרום נייר הסינון.
- לשים עוד כרית ספוג על נייר הסינון. הכניסו ערימת הניירות ממברנה/סינון קלטת להעברה.
- לשים את הקלטת לתוך טנק העברה, מוודא כי הקרום ממוקם בין הג'ל האנודה הטעון חיובית.
- להתחבר הטנק ספק כוח, בקופסא הטנק styrene קצף מלא במים קפואים. התחל העברה ב- 100 וולט למשך 180 דקות.
הערה: העברה ממושכת הכרחי, מאחר שההעברה של חלבונים P-תג מרחביות-דף ג לא יעיל כמו זה של ג'לים מרחביות-דף רגיל. קירור יעיל הוא חיוני כדי למנוע התכה ג'לים במהלך ההעברה.
- הסר את הממברנות ג'לים באמצעות פינצטה ומשרים את הקרומים בפתרון צבע מאכל פונסו S (0.1% (w/v) צבע מאכל פונסו S, חומצה אצטית 5% (v/v)) כתם חלבונים שהועברו על הממברנות במיכל פלסטיק. הנפח של הפתרון צריך להיות מספיק לכסות את קרום.
- דגירה של ממברנות 1 דקות בטמפרטורת החדר במוזיקת באופן ידני.
הערה: סולם של להקות צריך להיות גלוי כל ליין. - להרים את הקרום הפתרון מכתימים עם פינצטה ולראות אם הסולם של להקות יש דפוס אחיד ועוצמה מכל סמטה היכן הדגימות שנטענו.
- לאחר בדיקת ההכתמה, להסיר את הפתרון מכתימים ולהוסיף TBST מאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate). היקף המאגר צריך להיות מספיק לכסות את קרום.
הערה: הפתרון S צבע מאכל פונסו אפשר לאסוף, מחדש נעשה שימוש מספר פעמים. - לנענע את ריריות TBST על מטרף נדנדה (~ 60 סל ד) בטמפרטורת החדר עד להקות גלוי להישאר על הממברנות.
- חזור על השלב כביסה עם TBST טריים במשך 5 דקות.
הערה: זמן החשיפה עשוי להשתנות בהתאם הפתרון ECL המשמש לצורך זיהוי של chemiluminescence את המחשב.
- הפעל imager מצויד with a מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD) והמחשב מחובר םלצה. הפעלת התוכנה הבקרה עבור הצלם. המתן עד הטמפרטורה של המצלמה CCD הגיעה--25 ° C.
- לשים 1 מ"ל של הפתרון ECL עבור ממברנה אחת ניילון נצמד על ספסל.
- לשים ג'ל ממברנה-צד-up על הפתרון ECL ולאחר מכן במהירות להפוך אותו כך שני הצדדים של הקרום הם מצופים הפתרון.
- לאסוף את הקרום וסוחטים בלתת צד אחד של המגע ממברנה מגבת נייר עבור 5 s.
- לשים קרום בין סרטים ברורה (למשל, כיסים נייר נקי).
הערה: ניילון נצמד לא מומלץ עבור גלישת בקרום. הסרטים ברור המשמש עבור גלישת הקרום צריך להיות שטוח ככל האפשר ללא קמטים גלויים כדי להימנע רקע לא אחיד. - מניחים את הקרום על מגש שחור. מכניסים את המגש םלצה וסגור את הדלת.
- לחץ על לחצן "התמקדות" חלון של תוכנת שליטה. בדוק כי הקרום ימוקם בצורה נכונה. לחץ על לחצן "להחזיר".
- בחר "דיוק" עבור "סוג חשיפה". בחר "ידני" עבור "זמן חשיפה" ולהגדיר את זמן החשיפה 1 s.
- בחר 'גבוהה' עבור 'רגישות/פתרון'. השאר "הוסף תמונה דיגיטציה" לא מסומנת. לחץ על לחצן "התחל" כדי לקחת תמונה.
- לשמור את התמונה שהופיעו בתצוגה במחשב בתור קובץ TIFF.
- חזור על לקיחת תמונות עם חשיפה מעת 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s, עד 180 s. כשאתה לוקח את התמונה האחרונה, בדוק "הוסף תמונה דיגיטציה" אז התמונה הדיגיטלית, לא chemiluminescence, של הקרום שניתן לנקוט בעת ובעונה אחת.
- בחר את התמונה הטובה ביותר עם הטווח הדינמי הגדול ביותר וללא כל הפיקסלים saturating (מוצג באדום) הלהקות עניין.
הערה: סרטי רנטגן קונבנציונלי יכול לשמש גם עבור זיהוי19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביטוי מערכת: זירחון של HA-Rab10 על-ידי 3 × הדגל-LRRK2 ב HEK293 תאים:
HEK293 התאים היו transfected עם µg 0.266 של HA-Rab10 פראי-סוג של 1.066 µg של 3 × הדגל-LRRK2 (מוטציה פראי-סוג, לא פעיל-קינאז (K1906M), או מוטציות FPD). זרחון Rab10 נבדק על ידי P-תג מרחביות עמודים ואחריו immunoblotting באמצעות של אנטי-HA נוגדנים (איור 2). 10 µg של חלבונים היו להפעיל על ג'ל 10% (80 x 100 x 1 מ מ) המכיל 50 מיקרומטר P-תג אקרילאמיד ו- 100 מיקרומטר MnCl2. זמן חשיפה הג'ל P-תג (החלונית העליונה) בת 10 s באמצעות פתרון ECL סטנדרטי. Co-ביטוי של LRRK2 עם Rab10 גרם shift הלהקה על הג'ל P-תג (מסומן עם עיגול פתוח בחלונית העליונה; להשוות מסלולים 2 ו- 4). לעומת זאת, ביטוי משותף עם מוטציה קינאז-פעיל (K1906M) LRRK2 נכשל לשנות את הניידות של Rab10 (להשוות מסלולים 4 ו-5), המציין המשמרת הלהקה היא בשל פעילות קינאז LRRK2. משמרת הלהקה הוגדל על ידי כל FPD מוטציות (להשוות מסלולים 4 ו- 6-13) מסכים עם ה-הדוח הקודם15.
מערכת אנדוגניים: זירחון של Rab10 על ידי LRRK2 בתאים בתרבית:
תאים עובריים פיברובלסט 3T3-שוויצרי לבקן העכבר טופלו עם או בלי מעכב (GSK2578215A) LRRK220 -ריכוז סופי של מיקרומטר 1 לשעה (איור 3 א). אמבריולוגיה A549 קרצינומה של תאים טופלו עם או בלי עוד מעכב (MLi-2) LRRK221 ב ריכוז סופי של 10 ננומטר לשעה (איור 3B). זרחון Rab10 אנדוגני מאת LRRK2 אנדוגני נבדק על ידי P-תג מרחביות עמודים ואחריו immunoblotting עם נוגדן anti-Rab10. 30 µg של חלבונים היו פועלים על 10% ג'ל (100 x 100 x 1 מ מ עבור תאים לבקן 3T3-שוויצרי) ו- 80 מ"מ עבור A549 תאים המכילים 50 מיקרומטר P-תג אקרילאמיד ו- 100 מיקרומטר MnCl2. החשיפה של הג'ל P-תג (החלונית העליונה) ב איור 3A ו- 3B איור היו 3 דקות ו 90 s, בהתאמה. משמרת הלהקה המתאים phosphorylated Rab10 אנדוגני נצפתה על הג'ל P-תג (מסומן עם עיגול פתוח הדף פאנל; השווה מסלולים 1-2 ו 3-4) אשר נעלם עם הטיפול של תאים עם GSK2578215A או MLi 2. היעילות של מעכבי LRRK2 שהוכח על ידי נסיונות immunoblotting באמצעות נוגדן LRRK2 אנטי-pSer935 (לוח השלישית מלמטה), אשר הוא ומבוססת readout LRRK2 עיכוב תאים22.
איור 1. תיאור סכמטי של P-תג מרחביות – דף. כאשר תערובת של phosphorylated (עיגולים אדומים) ו- phosphorylated (העיגולים הכחולים) חלבונים (למשל, Rab10) עובר ג'ל איפה P-תג אקרילאמיד שיתוף polymerized, הניידות של חלבונים phosphorylated רק מפגרים עקב החזקים האינטראקציה של חלבונים phosphorylated מולקולות P-תג (שבור חצים). מאחר Rab10 הוא phosphorylated על ידי LRRK2-משקע יחיד Thr73, Rab10 פועל כמו שתי להקות: הלהקה העליון מייצג phosphorylated Rab10 ו הלהקה התחתון מייצג שאינו phosphorylated Rab10. כאשר תאים מטופלים עם מעכבי LRRK2, הלהקה העליון אמור להיעלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. תוצאת נציג האבן החשופה P-תג: ביטוי המערכת. הלוח העליון מציג את האבן החשופה P-תג באמצעות של אנטי-HA נוגדן, איפה Rab10 phosphorylated ו- phosphorylated מסומנים פתוחות (○) וסגורות עיגולים (●), בהתאמה. הלוחות המוצג להלן האבן החשופה P-תג הם immunoblots על ג'לים מרחביות-דף רגיל באמצעות של אנטי-חה, אנטי-דגל נגד-α-טובולין, נוגדנים אנטי-GAPDH. HA חשופה דגל חשופה מוצגים להבטחת את ביטוי של HA-Rab10 ו 3xFLAG-LRRK2, בהתאמה. Α-טובולין שהכלים GAPDH מוצגים להבטחת ההעמסה שווה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תוצאת נציג האבן החשופה P-תג: מערכת אנדוגני. שני תאים קווי, כלומר תאים 3T3-שוויצרי לבקן (A) ו- (B) A549 תאים, שימשו. שתי ספרות, הלוחות המובילים להראות ש-p-התג אבנים בודדות באמצעות נוגדן anti-Rab10, איפה phosphorylated ו- phosphorylated Rab10 אנדוגני מסומנים פתוח (○) וסגרו עיגולים (●), בהתאמה. הלוחות המוצג להלן P-תג שהכלים הם immunoblots על ג'לים מרחביות-דף רגיל באמצעות של אנטי-Rab10, אנטי-pSer935 LRRK2, אנטי-LRRK2 נוגדנים anti-α-טובולין. Rab10 ואת LRRK2 מוצגים להבטחת ביטוי דומה של אנדוגני Rab10 ו LRRK2 בין הדגימות, בהתאמה. האבן החשופה LRRK2 pSer935 מוצגים להבטחת הזה GSK2578215A (א) ועבד MLi-2 (ב') כצפוי. האבן החשופה α-טובולין מוצגים להבטחת ההעמסה שווה. התמונות של שהכלים P-תג נקודות המגע המוצגים עם הסמן משקל מולקולרי מוצגים באיור S4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור S1. רצפי DNA של פלסמידים. רצפי ה-DNA פלסמיד קידוד HA-Rab10/pcDNA5 והשפלתם, של 3 × × הדגל-LRRK2/p3 הדגל-CMV-10. כל פלסמידים המשמשים פרוטוקול זה הינם זמינים מן המחברים על פי בקשה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
איור S2. דוגמה של אופטימיזציה של P-תג מרחביות-דף. אותה קבוצה של דוגמאות כמו זה המשמש ב- 3A איור שימש אופטימיזציה הדף מרחביות P-תג. ארבעה תנאים שונים נבדקו כפי שמוצג באיור. הלהקות המתאים Rab10 phosphorylated ו- phosphorylated מודגשים עם קו מקווקו ומוצקה מלבנים, בהתאמה.מבוסס על ניסוי זה, התנאי עם 10% אקרילאמיד, 50 מיקרומטר P-תג אקרילאמיד 100 מיקרומטר MnCl2 נתן ההפרדה הטוב ביותר של שתי הלהקות, הן באיתור באמצע הג'ל. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
איור S3. השוואה של התבנית ההעברה של סמן משקל מולקולרי. דה מרקר משקל מולקולרי (MWM) הופעל על ג'ל מרחביות-דף רגיל (פאנל שמאלי) או על ג'ל P-תג מרחביות-דף (לוח האמצעי), ג'לים היו מוכתמים מאת Coomassie מכתים. החלונית ' נכון ' מראה של immunoblot של הדגימות בשימוש איור 2 (ליין 4 ו- 5) על הג'ל P-תג מרחביות-דף אותו כמו הלוח האמצעי כדי להראות את העמדות של Rab10 phosphorylated ו- phosphorylated. החץ בצד ימין של immunoblot מציין המיקום של אחד MWM על הג'ל P-תג מרחביות-דף. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
איור S4. המיקום של סימן משקל מולקולרי על P-תג מרחביות-דף ג'לים. תמונות דיגיטליות של הממברנות משמש דמות 3A ו- 3B איור מוצגים (A) ו-(B), בהתאמה. Immunoblots המוצגת באיור 3 נקודות המגע המוצגים להראות את המיקום היחסי של דה מרקר משקל מולקולרי (MWM). MWM להעביר היטב הקרומים, אבל דה מרקר (חץ) ב- S3 איור באופן עמום אבל בעקביות נצפתה. המיקום של MWM מסומן עם קווים מנוקדים. שימו לב כי נתיבים לא רלוונטי הדמויות בין MWM את המסלולים של עניין הם חצו את. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה נתיישב חזקה של גילוי Rab10 זרחון על ידי LRRK2 ברמות אנדוגני בהתבסס על המתודולוגיה P-תג. כי הנוגדן זמין כעת נגד phosphorylated Rab10 עובד רק עם חלבונים overexpressed15, השיטה נוכח ניצול P-תג מרחביות-דף היא הדרך היחידה להערכת רמות אנדוגני של זרחון Rab10. יתר על כן, השיטה הנוכחית מאפשרת את אומדן סטויכיומטריה של זרחון Rab10 בתאים. מאחר המתודולוגיה P-תג חל כללי פוספו-חלבונים, בפרוטוקול הנוכחי ניתן "טיפוס" להקמת שיטות דומות פוספו-חלבונים אחרים.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם הליהוק ג'לים והכנת דוגמאות. P-תג אקרילאמיד הוא ריאגנט יציב יחסית צילום ואת היכולת מפגר ניידות electrophoretic של חלבונים phosphorylated אובד לפעמים לאחר אחסון לטווח ארוך ב 4 º C. חוקרים צריך לקחת כל טיפול למנוע חשיפת P-תג אקרילאמיד להדליק. יתר על כן, המולקולה P-תג צריך להקים מתחם עם Mn2 + יונים כדי ללכוד פוספטים. לפיכך, דגימות אינו צריך להכיל chelating סוכני כגון EDTA, שהם מרכיבים הרגיל מאגרי מדגם זמינים מסחרית מרחביות-דף. אנו ממליצים להשתמש מאגר מדגם של Laemmli הקלאסית כדי להתכונן דגימות P-תג מרחביות-דף.
נקודה קריטית נוספת היא ביסודיות לייעל את ריכוזי אקרילאמיד, P-תג אקרילאמיד ו- MnCl2 התערובת ג'ל ההפרדה (איור S2). המרחקים ההעברה של להקות phosphorylated ו- phosphorylated משתנה בהתאם ריאגנטים בשימוש (הרבה, טוהר, וכו '), אופטימיזציה של ריכוז תקין על-ידי בדיקת מספר ריכוזים שונים בשילוב חובה (למשל, P-תג אקרילאמיד (25, 50, 75 מיקרומטר), MnCl2 (1:2 או 1:3 שן טוחנת יחס P-תג אקרילאמיד), ואת אקרילאמיד (7.5, 10, 12.5%)). הלהקות phosphorylated ו- phosphorylated אמור להופיע באמצע ג'לים ומופרדים היטב אחד מהשני. לתהליך אופטימיזציה, מומלץ להשתמש overexpressed Rab10 כי הלהקה שהוסטו לזיהוי בקלות. המחברים יכול לספק דגימות הבקרה עבור פרוטוקול זה.
לאחד הבלבול הגדול פרוטוקול זה יכול לגרום יהיה בשל ההבדל של דפוסי ההגירה MWM בין קבוע P-תג מרחביות-דף ג'לים. כפי שמוצג באיור S3, דפוסי ההגירה MWM רגיל ו P-תג מרחביות-דף ג'לים (שני 10%) הם מאוד שונים וגם את MWM עבור הערכת משקל מולקולרי של חלבונים על P-תג מרחביות-דף ג'לים. עם זאת, ב- P-תג מרחביות-דף ג'ל, לאחד MWM בולטת על-ידי העברת לאמצע של הג'ל (חץ ב S3 איור), אשר נצפית בעקביות בין מוצקים (ראה איור S4). זה עם אמא תמיד נודד בין הלהקות של Rab10 phosphorylated ו- phosphorylated. לכן, סמן זה הוא שימושי לא רק כדי להבטיח כי P-תג מרחביות-דף עובד לפני העברה אלא גם כנקודת ציון שיש תחושה קשה של איפה ניתן לראות הלהקות של Rab10 phosphorylated ו- phosphorylated.
גילוי של להקות על immunoblots, השתמשנו imager מצויד with a מצלמה מצלמות מקורר (ראה טבלה של חומרים) גם כמו רנטגן קונבנציונאלי לסרטי בפיתוח מערכת, ומצא כי שתי מערכות עובד טוב. גילוי של רמות אנדוגני של זרחון Rab10 בתאים בתרבית, יש צורך להשתמש שורות תאים אשר יש רמות ביטוי גבוהה LRRK2 אנדוגני, כמו העכבר מתחלקים fibroblasts (ראשית או תרבותי או מונצחים (קווים תא הלבקן 3T3-שוויצרי, וכו ')) אמבריולוגיה נגזר קרצינומה של תאים A549. גילוי של רמות אנדוגני של זרחון Rab10 ברקמות העכבר, מומלץ להשתמש ריאות16.
כימות של זרחון Rab10 אינה מעבר immunoblotting הרגיל. אם סטויכיומטריה של זרחון Rab10 הוא נמוך מאוד (כמוצג באיור3), האינטנסיביות של הלהקה ללא phosphorylated (מסומן עם מעגל סגור) נוטה להיות הרחק מעל רמת רוויה, ביצוע קביעת מדויק סטויכיומטריה בלתי אפשרי. בכל זאת, הערכה איכותית היא עדיין אפשרי בכל מקרה, אשר אינה השגה ללא שימוש בשיטת ההווה. מאז הגילוי של זירחון של Rab10 אנדוגני דורש חשיפה ממושכת, שם נוטה להיות כמה להקות לא ספציפית להופיע על התג P כתם למרות נוגדן anti-Rab10 בשימוש פרוטוקול זה נותן immunoblots נקייה למדי לשימוש רגיל . כדי להבחין בין חלבונים phosphorylated להקות לא ספציפית, חיוני להשתמש בפקד מעכב-טיפול, שבה להקות phosphorylated, אבל להקות לא ספציפי, צריך להיעלם. LRRK2 phosphorylates Rab8 חוץ Rab1015, לנו יש הוחלו בהצלחה בפרוטוקול הנוכחי Rab8A גם כן (נתונים לא מוצג). בפרוטוקול הנוכחי פוטנציאל ניתן לבחון את זרחון של חלבונים כלשהם, אם כי ייתכנו קשיים טכניים אם החלבון גדולה (> 100 kDa) או להכפיל phosphorylated. מאחר Rab10 הוא חלבון קטן (25 kDa) ביחידים phosphorylated בשעה Thr73 על-ידי LRRK2, התוצאה של P-תג מרחביות-דף הוא פשוט שם הלהקה שהוסטו היחיד הוא ציין.
בעתיד הקרוב, זה יהיה קריטי להקים את השיטה באופן כמותי לזהות את פעילות קינאז LRRK2 בדגימות החולה נגזר באופן תפוקה גבוהה כדי להעריך את שינוי של פעילות קינאז LRRK2 בחולים PD, כמו גם להעריך ולאתר השפעת הסמים על LRRK2 בניסויים קליניים. מאז דם היקפיים אנושי תאי תאים (PBMCs) אקספרס רמות גבוהות יחסית של אנדוגני LRRK223, PBMCs או עוד יותר מבודד כדוריות הדם יהיה שווה בדיקה של זרחון Rab10 אנדוגני. השיטה הנוכחית לא רק להועיל בחקירת הביולוגיה בסיסי של LRRK2 איתות, אלא גם לסייע בהשגת בסיסי הוכחה-של-קונספט להחלטה איזו דגימה בדגימות נגזר החולה היא כדי להיות מנותח במחקרים בקנה מידה גדול כזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר טאקאשי Iwatsubo (אוניברסיטת טוקיו, יפן) בחביבות לספק את פלסמידים קידוד 3xFLAG-LRRK2 WT ו מוטנטים. אנו מודים גם ד ר אולאסי דריו (אוניברסיטת של דנדי, בריטניה) למתן בחביבות MLi-2 ואת פלסמיד קידוד HA-Rab10. עבודה זו נתמכה על ידי החברה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) KAKENHI גרנט מספר JP17K08265 (ג'י. איי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).
