Summary
Lo studio presente descrive un metodo semplice per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione dalla leucina-ricche ripetere chinasi 2.
Abstract
Mutazioni in leucina-ricche ripetere chinasi 2 (LRRK2) sono state indicate per essere collegati con la malattia del Parkinson familiare (FPD). Poiché l'attivazione anormale di attività della chinasi di LRRK2 è stato implicato nella patogenesi del PD, è essenziale per stabilire un metodo per valutare i livelli fisiologici di attività della chinasi di LRRK2. Studi recenti hanno rivelato che LRRK2 fosforila membri della famiglia Rab GTPase, tra cui Rab10, in condizioni fisiologiche. Anche se la fosforilazione di Rab10 endogeni di LRRK2 in cellule coltivate potrebbe essere rilevata mediante spettrometria di massa, è stato difficile da rilevare a causa della scarsa sensibilità di anticorpi specifici per fosforilazione attualmente disponibili per immunoblotting Rab10. Qui, descriviamo un semplice metodo per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione di LRRK2 basato su immunoblotting utilizzando elettroforesi dodecilica del sodio solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) combinato con un tag di fosfato-associazione (P-tag), che è N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (piridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Il presente protocollo non solo fornisce un esempio della metodologia che utilizza il tag P ma consente anche la valutazione di come le mutazioni così come inibitore trattamento/amministrazione o altri fattori alterano la segnalazione a valle di LRRK2 in cellule e tessuti .
Introduction
PD è una delle più comuni malattie neurodegenerative, che interessa principalmente i neuroni dopaminergici nel midbrain, conseguente disfunzione dei sistemi motore in persone anziane1. Mentre la maggior parte dei pazienti sviluppano PD in maniera sporadica, ci sono famiglie di ereditare la malattia. Mutazioni in diversi geni sono state trovate per essere collegati con FPD2. Uno dei geni causativi per FPD è LRRK2, in cui otto mutazioni di senso sbagliato (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T) collegate a un dominante ereditato FPD chiamato PARK8 finora sono stati segnalati3,4,5. Diversi studi di associazione genome-wide (GWAS) di pazienti sporadici di PD sono identificati varianti genomiche del locus LRRK2 come un fattore di rischio per PD, suggerendo che l'anomalia nella funzione di LRRK2 è una causa comune di neurodegenerazione in entrambi sporadici e PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 è una grossa proteina (2.527 aminoacidi) costituito da un dominio ripetizione leucina-ricche, un Ras GTP-legante del dominio di proteine complesse (ROC), un C-terminale del dominio, un dominio della chinasi serina/treonina proteina e un dominio ripetere di WD409ROC (COR). Le mutazioni di FPD otto individuare in questi domini funzionali; N1437H e R1441C/G/H/S nel dominio di ROC, Y1699C nel dominio COR, G2019S e I2020T nel dominio chinasico. Poiché la mutazione G2019S, che è trovato il più delle volte la mutazione del PD pazienti10,11,12, aumenta l'attività della chinasi di LRRK2 da 2-3 volte in vitro13, è supposto che l'aumento anormale nella fosforilazione di LRRK2 overesprimessero è tossico ai neuroni. Tuttavia, è Impossibile studiare se la fosforilazione di substrati LRRK2 fisiologicamente rilevanti è alterata nei pazienti del palladio familiare/sporadici a causa della mancanza di metodi valutarla nei campioni derivati.
Fosforilazione della proteina viene generalmente rilevata dal immunoblotting o enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) utilizzando anticorpi che riconoscono specificamente lo stato fosforilato di proteine o dall'analisi di spettrometria di massa. Tuttavia, la strategia ex a volte non può essere applicata a causa delle difficoltà nella creazione di anticorpi specifici per fosforilazione. Etichettatura metabolica delle cellule con fosfato radioattivo è un'altra opzione per esaminare i livelli fisiologici di fosforilazione quando fosforilazione specifici anticorpi non sono prontamente disponibili. Tuttavia, esso richiede una grande quantità di materiali radioattivi e quindi comporta alcune attrezzature specializzate per la protezione dalle radiazioni14. Analisi di spettrometria di massa è più sensibile rispetto a questi metodi immunochimici ed è diventato popolare nell'analizzare la fosforilazione della proteina. Tuttavia, la preparazione del campione è che richiede tempo e costosi strumenti sono necessari per l'analisi.
Un sottoinsieme della famiglia Rab GTPase tra cui Rab10 e Tab8 recentemente è stato segnalato come substrati fisiologici diretti per LRRK2 basano sul risultato di analisi su larga scala fosfoproteomica15. Abbiamo quindi dimostrato che la fosforilazione Rab10 è stata aumentata da mutazioni di FPD in fibroblasti embrionali di topo e nei polmoni dei topi16di knockin. In questo rapporto, abbiamo scelto di impiegare un'elettroforesi del gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato (SDS-PAGE)-basato su metodo in cui è co-polimerizzata in gel di SDS-PAGE (tag P SDS-PAGE) per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione, una molecola di tag P perché un anticorpo altamente sensibile di Rab10 fosforilato era ancora carente. Non siamo riusciti a rilevare la fosforilazione di endogeno Tab8 a causa della scarsa selettività di anticorpi attualmente disponibili per Tab8 totale. Pertanto, abbiamo deciso di concentrarsi sulla fosforilazione di Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 alle Thr73 di posizionamento al centro della regione altamente conservata "passare II". Alta conservazione dei siti di fosforilazione tra proteine Rab potrebbe essere uno dei motivi per cui phosphospecific anticorpi riconoscendo distinte proteine Rab sono difficili da fare.
La fosforilazione di Rab8A di LRRK2 inibisce il legame di Rabin8, un fattore di scambio di nucleotide della guanina (GEF) che attiva Rab8A scambiando il PIL associato con GTP15. Fosforilazione di Rab10 e Rab8A di LRRK2 inibisce anche il legame degli inibitori di PIL-dissociazione (GDIs), che sono essenziali per l'attivazione delle proteine Rab estraendo le proteine Rab PIL associati da membrane15. Collettivamente, è supposto che la fosforilazione delle proteine Rab di LRRK2 impedisce loro di attivazione anche se il preciso meccanismo molecolare e conseguenze fisiologiche della fosforilazione rimangono poco chiare.
P-tag SDS-PAGE è stato inventato da Kinoshita et nel 2006: In questo metodo, acrilammide in covalenza è stato accoppiato con tag P, una molecola catturando fosfati con alta affinità, che copolymerized in SDS-PAGE gel17. Poiché le molecole di P-tag in un gel di SDS-PAGE ritardano selettivamente mobilità elettroforetica delle proteine fosforilate, tag P SDS-PAGE possibile separare proteine fosforilate da quelli non-fosforilate (Figura 1). Se la proteina di interesse è fosforilata su residui multipli, sarà osservata una scaletta delle bande corrispondenti alle forme differenzialmente fosforilate. Nel caso di Rab10, osserviamo soltanto una fascia spostata, che indica che Rab10 è fosforilata solo a Thr73. Il vantaggio principale di SDS-PAGE tag P sopra immunoblotting con anticorpi specifici per fosforilazione è che Rab10 fosforilata può essere rilevato dall'immunoblotting con gli anticorpi non specifici di fosforilazione (cioè, riconoscendo Rab10 totale) Dopo essere stato trasferito sulle membrane, che è generalmente più specifico, sensibile e disponibile da fonti commerciali/accademico. Un altro vantaggio dell'utilizzo di tag P SDS-PAGE è che si può ottenere una stima approssimativa della stechiometria di fosforilazione, che è impossibile da immunoblotting con anticorpi specifici per fosforilazione o mediante marcatura metabolica delle cellule con radioattivo fosfati.
Oltre all'uso di poco costoso tag P acrilammide e alcune piccole modifiche ad esso correlati, il presente metodo per il rilevamento di Rab10 fosforilazione di LRRK2 segue un protocollo generale di immunoblotting.Di conseguenza, dovrebbe essere semplice e facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio dove immunoblotting è una pratica abituale, con tutti i tipi di campioni tra cui proteine purificate, lisati cellulari e degli omogeneati del tessuto.
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Protocol
1. preparazione del campione per il tag P SDS-PAGE
- Rimuovere e scartare i media dai piatti di 10 cm in cui le cellule sono coltivate con un'aspirazione e lavare le cellule con soluzione tampone fosfato di 5ml Dulbecco (DPBS) dal primo DPBS aggiunta al lato dei piatti per non disturbare lo strato delle cellule e manualmente i piatti indietro e indietro più volte.
- Rimuovere e scartare il DPBS utilizzando un'aspirazione e aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% (p/v) diluita in DPBS e scuotere delicatamente i piatti per coprire lo strato delle cellule. Mettere i piatti in un incubatore a CO2 (37 ° C, aria umidificata, 5% CO2) per 5 min.
- Dopo il pipettaggio su e giù usando una pipetta monouso per rompere le cellule di staccato, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e misurare la densità delle cellule usando un hematocytometer sotto un microscopio18.
- Diluire le cellule a 2,5 × 105 cellule/mL con il mezzo di Eagle per di Dulbecco modificato (DMEM) completate con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Aggiungere 2 mL (5 × 105 cellule) della sospensione delle cellule diluito in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti.
- Crescere le cellule durante la notte in un incubatore a CO2 (37 ° C, aria umidificata, 5% CO2).
- Trasfezione in cellule HEK293
Nota: Se la fosforilazione di Rab10 endogeni deve essere esaminato, procedere al punto 1.7. Plasmidi utilizzati nel presente protocollo possono essere ottenuti dagli autori su richiesta. Vedere Tabella materiali per brevi informazioni e Figura S1 per il loro DNA sequenze.- Aliquotare 200 µ l di DMEM in provette da 1,5 mL.
- In ogni provetta, aggiungere entrambi 0,266 µ g (concentrazione finale di 1,33 µ g/mL) di un plasmide che codifica HA-Rab10 e 1,066 µ g (concentrazione finale di 5,33 µ g/mL) di un plasmide codifica 3 × bandiera-LRRK2 dalle scorte di plasmide 500 µ g/mL. Quindi 4 µ l di soluzione 1 mg/mL di polyethyleneimine (disciolto in 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0) e miscelare immediatamente la soluzione nel Vortex per 5 s.
- Lasciare decantare le provette riposare a temperatura ambiente per 10 min e aggiungere il contenuto di un tubetto goccia a goccia per un bene usando una micropipetta. Delicatamente e manualmente rock le piastre di coltura avanti e indietro più volte per lasciare che la miscela di transfezione di diffondere in modo uniforme in tutto il pozzo.
- Lasciate che le cellule crescono per altri 24-36 h in un incubatore a CO2 (37 ° C, aria umidificata, 5% CO2).
- Se la fosforilazione di Rab10 endogeni deve essere esaminato, è possibile trattare le cellule con e senza LRRK2 inibitori per 1 h prima di lisi di cellule.
- Preparare soluzioni di riserva di LRRK2 inibitori sciogliendo gli inibitori in dimetilsolfossido (DMSO) a 10 mM. Si consiglia di utilizzare MLi-2 e GSK2578215A, che sono altamente specifici e potenti inibitori di LRRK2. Soluzioni di riserva archivio a-80 ° C.
- Preparare scorte di lavoro degli inibitori diluendo le soluzioni madri con DMSO: per MLi-2, preparare 10 µM e 30 µM per endogena e overexpressed LRRK2, rispettivamente. Per GSK2578215A, preparare 1 mM e 3 mM per endogena e overexpressed LRRK2, rispettivamente.
- Aggiungere 2 µ l delle scorte lavoro di MLi-2 o GSK2578215A al centro di uno bene usando una micropipetta e scuotere delicatamente la piastra manualmente avanti e indietro più volte per consentire gli inibitori diffusa in modo uniforme in tutto il pozzo.
- Aggiungere 2 µ l di DMSO per un ben diverso come controllo negativo in modo simile all'inibitore nel passaggio 1.8.3.
- Ricollocare le piastre per l'incubatrice e cultura le cellule per 1 h.
- Lisare le cellule.
- Mettere le piastre di coltura sul ghiaccio. Rimuovere e scartare i media. Lavare le cellule di primo aggiungendo 2 mL DPBS al lato dei piatti per non disturbare la cella di strato e manualmente i piatti della roccia avanti e indietro parecchie volte.
- Rimuovere e scartare il DPBS e aggiungere le cellule 100 µ l di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl a pH 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl etere, 1 mM EGTA (glicole etilenico-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico), 1 mM sodio ortovanadato, 50 mM fluoruro di sodio, β-glicerofosfato di 10mm, pirofosfato di sodio di 5 mM, 0,1 µ g/mL microcistina-LR, saccarosio 270mm, inibitore della proteasi cocktail).
- Inclinare le piastre sul ghiaccio e raschiare le celle utilizzando un raschietto di cella per raccogliere quanto più lysate possibile delle cellule. Raccogliere i lisati mediante una micropipetta in provette da 1,5 mL (pre-refrigerate sul ghiaccio).
Attenzione: Microcistina-LR può essere fatale se ingerito o a contatto con la pelle.
- Lasciare le provette in ghiaccio per 10 min per lisi completa. Chiarire i lisati mediante centrifugazione (20.000 × g, 10 min a 4 ° C) e trasferire i surnatanti in nuove provette da 1,5 mL pre-refrigerate sul ghiaccio.
- Misurare la concentrazione di proteina (µ g / µ l) dei lisati sgomberati da analisi di Bradford.
- Preparare l'albumina di siero bovino (BSA) gli standard (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1 mg/mL) diluendo la soluzione di riserva con acqua distillata. Diluire i lisati di cella cancellata da 20 volte con acqua distillata.
- Mettere 5 µ l/pozzetto degli standard di BSA, blank (acqua distillata) e ogni cella diluito lisato in una piastra a 96 pozzetti in triplice copia.
- Aggiungere 150 µ l/pozzetto del reagente di analisi di Bradford utilizzando 12 canali micropipetta e lasciate la piastra riposare a temperatura ambiente per 5 min.
- Misurare l'assorbanza a 595 nm su un lettore di piastre e confrontare con gli standard di BSA.
- Preparare 100 µ l di campioni per SDS-PAGE. La concentrazione di proteine dei campioni è di 1 µ g / µ l per iperespresso HA-Rab10 e 2 µ g / µ l per Rab10 endogena.
- Utilizzando le concentrazioni quantificate dal passaggio 1.11.4, calcolare il volume (µ l) dei lisati cellulari equivalenti a 100 µ g (iperespresso HA-Rab10) o di 200 µ g (endogeno Rab10) dividendo la quantità di proteine (100 µ g o 200 µ g) della concentrazione nella proteina di lisati (µ µ g/l).
- Aggiungere 25 µ l di tampone di Laemmli 4 × SDS-PAGE (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% (p/v) SDS, 40% (v/v) glicerolo, blu di bromofenolo 0.02% (p/v), 4% (v/v) β-mercaptoetanolo) in nuove provette da 1,5 mL conservate a temperatura ambiente.
- Aggiungere il volume calcolato della cella lisati a ciascuna provetta e mescolano nel Vortex per 5 s a temperatura ambiente.
- Portare il volume totale a 100 µ l con il buffer di lisi e mescolare nel Vortex per 5 s a temperatura ambiente.
- Supplemento con 10mm MnCl2 per placare l'agente chelante. Aggiungere 1 µ l di 500mm MnCl2. Mix nel Vortex per 5 s a temperatura ambiente.
Nota: Campioni contenenti MnCl2 potrebbero non essere adatti per normale SDS-PAGE.
2. colata gel per tag P SDS-PAGE
Nota: Gel dovrebbe essere effettuate nello stesso giorno in esecuzione i gel. Gel può essere fatta in condizioni di luce ambientali.
- Preparare soluzione stock di acrilammide 5mm tag P sciogliendo prima il 10 mg di polvere/solido tag P acrilammide completamente con 100 µ l di metanolo e quindi portare a 3,3 mL aggiungendo acqua distillata doppia.
Nota: L'acrilammide tag P è sensibile alla luce. La soluzione preparata deve essere conservata al buio a 4 ° C fino all'utilizzo. - Pulito semplice e dentellate piastre spruzzando etanolo al 70% e asciugare con un tovagliolo di carta. Montare le piastre di gel. Le dimensioni delle lastre di gel utilizzate nel presente protocollo particolare sono 80 o 100 mm di lunghezza di 100 mm di larghezza. Distanziali di silicio pulito sono messo tra pianura e dentellate tavole e le tavole assemblate vengono fissate con clip legante.
Nota: Può essere utilizzato qualsiasi tipo di lastre di gel che funzionano per ordinaria SDS-PAGE. - Mettere un pettine da utilizzare (pettine di plastica 17-ben) in lastre di gel di assemblati e mark la piastra di gel la posizione del fondo dei pozzetti con un pennarello indelebile.
- Preparare 10 mL di miscela di gel di acrilamide 10% (10% (p/v) di acrilammide (acrylamide:bis-acrilammide = 29: 1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (p/v) SDS) in una provetta da 15 mL.
Nota: La concentrazione ottimale di acrilamide può variare a seconda dei reagenti utilizzati. Tetrametiletilendiammina (TEMED) e ammonio persolfato (APS) non deve essere aggiunte a questo punto. - Aggiungere 100 µ l di acrilammide tag P 5 mM e 10 µ l di 1 M MnCl2 soluzioni alle concentrazioni finali di 50 µM e 100 µM, rispettivamente.
Nota: Le concentrazioni ottimale di acrilammide tag P e MnCl2 potrebbero anche variare a seconda dei reagenti utilizzati. - Aggiungere 15 µ l di TEMED per la miscela di gel ad una concentrazione finale di 0,15% (v/v) e poi 50 µ l di 10% (p/v) APS ad una concentrazione finale di 0,05% (p/v). Miscelare accuratamente agitando delicatamente il tubo per 5 s e versare nelle piastre assemblate immediatamente fino ad un'altezza di 2 mm sotto la posizione contrassegnata al punto 2.3.
- Delicatamente strato 2-propanolo sulla soluzione di gel per appiattire la parte superiore del gel di separazione.
- Lasciate i gel a riposare per 30 min a temperatura ambiente. Non è necessario proteggere il gel dalla luce.
Nota: Potrebbe richiedere più tempo per gel impostare sotto temperatura ambiente fredda. La miscela di gel di degassamento prima aggiunta di TEMED e APS consente di accelerare questo passaggio. Per questo scopo, la miscela di gel può essere preparata in una beuta da 100-200 mL connesso a un'aspirazione. Degassare la soluzione per 10 min. - Rimuovere gli strati 2-propanolo assorbendo con un tovagliolo di carta.
- Lavare lo spazio superiore dei gel, riempiendo lo spazio con acqua distillata da una bottiglia di lavaggio e gettare l'acqua versando fuori nel bacino. Ripetere 3 volte di lavaggio.
- Rimuovere l'acqua residua rimasta nello spazio superiore dei gel assorbendo con un tovagliolo di carta.
- Preparare 3 mL di miscela di gel di acrilamide 4% (4% (p/v) di acrilammide (r: crylamide:bis-acrilammide = 29: 1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% (p/v) SDS) in una provetta da 15 mL.
Nota: Non aggiungere tag P acrilammide o MnCl2 soluzione per la miscela di gel di impilamento. - Aggiungere 7,5 µ l di TEMED e 24 µ l di 10% (p/v) APS alle concentrazioni finali di 0,25% (v/v) e 0,08% (p/v), rispettivamente. Miscelare bene agitando delicatamente il tubo per 5 s e versare il composto sulla superficie del gel di separazione. Immediatamente mettere pettini appropriati (pettini in plastica 17-pozzo che ospitare fino a 25 µ l di campioni, ad esempio).
- Lasciate i gel a riposare per 30 min a temperatura ambiente. Non è necessario proteggere il gel dalla luce. Dopo il gel di impilamento impostato, è possibile eseguirli senza ulteriore deposito.
3. SDS-PAGE e Immunoblotting
- Rimuovere i pettini dai gel. Quindi rimuovere i distanziali di silicio e quindi clip dai gel.
- Mettere il gel colato in serbatoi di gel e fissare il gel al serbatoio di bloccaggio con la clip di legante.
- Versare il buffer in esecuzione (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% (p/v) SDS) nella parte inferiore e superiore dei gel. Pulito pozzi di svuotamento del buffer in esecuzione utilizzando una siringa da 5 mL e un ago 21G per rimuovere pezzi di gel.
- Rimuovere le bolle d'aria dallo spazio inferiore dei gel utilizzando un ago piegato collegato a una siringa. Per rendere un ago piegato, piegare manualmente un ago 21G al centro l'ago in modo che l'angolo tra la punta e la base dell'ago diventa 30-45 °.
- Rotazione verso il basso precipitati causati dall'aggiunta di MnCl2 a 20.000 × g per 1 min a temperatura ambiente per ottenere campioni chiari.
- Caricare 10 µ g proteine per la rilevazione la fosforilazione di Rab10 iperespresso e 30 µ g proteine per Rab10 endogena.
Nota: È fondamentale per caricare un volume uguale di campioni in tutti i pozzetti. Corsie vuote devono essere caricate con tampone di 1 × Laemmli SDS-PAGE. Se i campioni contengono MnCl2, aggiungere la stessa concentrazione di MnCl2 i campioni fittizi. - Il bene caricato con un marcatore di peso molecolare (MWM) dovrebbe anche essere completato con tampone di Laemmli 1 × SDS-PAGE: il volume dei campioni caricati è lo stesso in tutti i pozzetti.
Nota: Ancora una volta, se i campioni contengono MnCl2, aggiungere la stessa concentrazione di MnCl2 per la MWM. In alternativa, può essere utilizzato un MWM privo di EDTA. - Eseguire gel a 50 V per l'accatastamento (circa 30 min) fino a quando la parte anteriore della tintura attraversa il gel di separazione.
- Dopo i campioni impilare, cambiare la tensione a 120 V per la separazione, fino a quando la parte anteriore della tintura raggiunge il fondo del gel (circa 50 e 80 min per 80 e 100 mm di lunghezza gel, rispettivamente).
Nota: Il modello di migrazione della MWM dovrebbe essere diversa da quella normale gel di SDS-PAGE. Esso non deve essere utilizzato per stimare il peso molecolare delle proteine su gel di SDS-PAGE tag P ma può essere utilizzato per verificare la riproducibilità dei gel P-tag. Per dettagli, fare riferimento alla discussione . - Lavare il gel per rimuovere MnCl2 dai gel.
- Versare il trasferimento buffer (48 mM Tris, 39 mM glicina, 20% (v/v) metanolo) contenente 10 mM EDTA e lo 0,05% (p/v) SDS in un contenitore (ad esempio, grandi barche di pesatura).
Nota: Utilizzare buffer fresco per ogni lavaggio.
- Collocare un filtro di carta (10 x 7 cm) su un tampone di spugna per il trasferimento. Collocare il gel su carta da filtro. Assicurarsi che non vi siano senza bolle d'aria tra la carta da filtro e il gel.
- Mettere una membrana (10 x 7 cm) sul gel e assicurarsi che non siano senza bolle d'aria tra la membrana e il gel.
- Mettere un altro filtro di carta (10 x 7 cm) sulla membrana e, ancora una volta, assicurarsi di bolle d'aria tra la membrana e la carta da filtro.
- Mettere un altro tampone di spugna su carta da filtro. Mettere la pila di documenti/filtro a membrana in una cassetta per il trasferimento.
- Mettere la cassetta in un serbatoio di trasferimento, assicurandosi che la membrana si trova tra il gel e l'anodo positivamente caricato.
- Collegare il serbatoio alla rete di alimentazione e collocare il serbatoio in una scatola di schiuma di stirolo riempita con acqua ghiacciata. Avviare il trasferimento a 100 V per 180 min.
Nota: Trasferimento prolungato è necessaria poiché il trasferimento delle proteine dal gel di SDS-PAGE tag P non sono efficienti come quello dai normali gel di SDS-PAGE. Raffreddamento efficiente è essenziale per evitare la fusione gel durante il trasferimento.
- Rimuovere le membrane dai gel con pinzette e immergere le membrane in una soluzione di Ponceau S (0,1% (p/v) Ponceau S, acido acetico al 5% (v/v)) per macchiare le proteine trasferite su membrane in un contenitore di plastica. Il volume della soluzione dovrebbe essere sufficiente a coprire una membrana.
- Incubare le membrane per 1 min a temperatura ambiente da dondolo manualmente.
Nota: Una scala delle bande dovrebbe diventare visibile in ogni corsia. - Ritirare la membrana dalla soluzione di macchiatura con pinzette e vedere se la scala delle bande ha modello uniforme e intensità in ogni corsia dove i campioni sono stati caricati.
- Dopo aver controllato la colorazione, è necessario rimuovere la soluzione colorante e aggiungere tampone TBST (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurato). Il volume del buffer deve essere sufficiente a coprire una membrana.
Nota: La soluzione di Ponceau S possa essere raccolta e riutilizzati più volte. - Roccia, le membrane in TBST su un agitatore oscillante (~ 60 giri/min) a temperatura ambiente finché non rimangono senza bande visibili sulle membrane.
- Ripetere la fase di lavaggio con TBST fresco per 5 min.
Nota: Tempo di esposizione potrebbe variare a seconda della soluzione di ECL e il sistema usato per rilevazione di chemiluminescenza.
- Accendere un imager dotato di una fotocamera di charge coupled device (CCD) e un computer collegato al dispositivo di imaging. Avviare il software di controllo per il dispositivo di imaging. Attendere che la temperatura della telecamera CCD ha raggiunto-25 ° C.
- Mettere 1 mL della soluzione di ECL per una membrana in un involucro di plastica si sono diffuse su una panchina.
- Mettere un membrana gel-side-up sulla soluzione ECL e quindi rapidamente capovolgerla modo che entrambi i lati della membrana sono rivestiti con la soluzione.
- Prendere la membrana e scolarla lasciando un lato del tocco membrana un tovagliolo di carta per 5 s.
- Reinserire la membrana tra pellicole trasparenti (ad es., carta chiaro tasche).
Nota: Involucro di plastica non è raccomandato per avvolgere le membrane. Le pellicole trasparenti utilizzate per avvolgere la membrana devono essere piano il più possibile senza rughe visibili per evitare fondo irregolare. - Posizionare la membrana su un vassoio nero. Inserire il vassoio nella stampante e chiudere la porta.
- Fare clic sul pulsante "Focusing" nella finestra del software di controllo. Controllare che la membrana sia posizionata correttamente. Fare clic sul pulsante "Return".
- Selezionare "Precisione" per "Tipo di esposizione". Selezionare "Manuale" per "Tempo di esposizione" e impostare il tempo di esposizione di 1 s.
- Selezionare "Alto" per "Sensibilità/risoluzione". "Aggiungi immagine di digitalizzazione" lasciare deselezionata. Fare clic sul pulsante "Start" per prendere un'immagine.
- Salvare l'immagine che apparsa sul display nel computer come file TIFF.
- Ripetere immagini che con il tempo di esposizione da 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s e fino a 180 s. Quando prende l'ultima immagine, controllare "Aggiungi immagine di digitalizzazione" così l'immagine digitale, non la chemiluminescenza, della membrana può essere assunto contemporaneamente.
- Selezionare l'immagine migliore con la più ampia gamma dinamica e senza eventuali pixel saturante (mostrato in rosso) nelle bande di interesse.
Nota: Le pellicole di raggi x convenzionali possono essere utilizzati anche per rilevamento19.
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Representative Results
Sistema di sovraespressione: Fosforilazione di HA-Rab10 da 3 × bandiera-LRRK2 in HEK293 celle:
Cellule HEK293 transfected con 0,266 µ g di HA-Rab10 wild-type e 1,066 µ g di 3 × bandiera-LRRK2 (wild-type, chinasi-inattivo mutante (K1906M), o FPD mutanti). Fosforilazione di Rab10 è stata esaminata da tag P. SDS-PAGE seguita da immunoblotting utilizzando un anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g di proteine sono stati eseguiti su un gel al 10% (80 x 100 x 1 mm) contenente 50 µM tag P acrilammide e 100 µM MnCl2. Il tempo di esposizione per il gel P-tag (pannello superiore) era di 10 s utilizzando una soluzione standard di ECL. Co-sovraespressione di LRRK2 con Rab10 causato spostamento della fascia sul gel P-tag (contrassegnati con un cerchio aperto nel pannello superiore; confrontare corsie 2 e 4). Al contrario, co-espressione con un mutante della chinasi-inattivo LRRK2 (K1906M) Impossibile modificare la mobilità di Rab10 (confrontare le corsie 4 e 5), che indica che lo spostamento di banda è a causa di attività della chinasi di LRRK2. Lo spostamento della fascia è stato aumentato da tutte le mutazioni di FPD (confrontare corsie 4 e 6-13) in accordo con la relazione precedente15.
Sistema endogeno: Fosforilazione di Rab10 di LRRK2 in cellule coltivate:
Cellule dei fibroblasti embrionali di topo 3T3-Swiss albino sono state trattate con o senza un inibitore (GSK2578215A) di LRRK220 ad una concentrazione finale di 1 µM per 1 h (Figura 3A). Cellule polmonari umane A549 di carcinoma sono state trattate con o senza un altro LRRK2 inibitore (MLi-2)21 ad una concentrazione finale di 10 nM per 1 h (Figura 3B). Endogeno Rab10 fosforilazione di LRRK2 endogeno è stata esaminata da tag P. SDS-PAGE seguita da immunoblotting con un anticorpo anti-Rab10. 30 µ g di proteine sono stati eseguiti su un gel di 10% (100 x 100 x 1 mm per le cellule 3T3-Swiss albino) e 80 mm per cellule A549 contenente 50 µM tag P acrilammide e 100 µM MnCl2. L'esposizione per il gel P-tag (pannello superiore) in Figura 3A e 3B figura erano 3 min e 90 s, rispettivamente. Lo spostamento di banda corrispondente a fosforilato Rab10 endogeno è stato osservato sul gel P-tag (contrassegnati con un cerchio aperto nel pannello superiore; confronta corsie 1-2 e 3-4) che è sparito dopo il trattamento delle cellule con GSK2578215A o MLi-2. L'efficacia degli inibitori LRRK2 è stato convalidato dall'immunoblotting usando l'anticorpo di LRRK2 anti-pSer935 (il terzo pannello dalla parte inferiore), che è una lettura ben consolidata di LRRK2 inibizione in cellule22.
Figura 1. Rappresentazione schematica di SDS-PAGE tag P. Quando una miscela di fosforilato (cerchi rossi) e non-fosforilate (cerchi blu) proteine (ad es., Rab10) scorre attraverso un gel dove l'acrilammide tag P è co-polimerizzata, la mobilità delle proteine fosforilate soli ritarda a causa del forte interazione di proteine fosforilate con le molecole di P-tag (rotto le frecce). Poiché Rab10 è fosforilato da LRRK2 ad un singolo residuo Thr73, Rab10 viene eseguito come due bande: la banda superiore rappresenta Rab10 fosforilato e la banda inferiore rappresenta Rab10 non fosforilate. Quando le cellule sono trattate con inibitori di LRRK2, dovrebbe scomparire la banda superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Risultato rappresentativo del blot P-tag: sistema di sovraespressione. Il pannello superiore mostra la macchia di tag P usando un anti-anticorpo, dove Rab10 fosforilate e non-fosforilate sono contrassegnati con HA aprire (○) e chiuso cerchi (●), rispettivamente. I pannelli mostrati sotto la macchia di tag P sono immunoblots su normale gel di SDS-PAGE utilizzando un anti-HA, anti-FLAG, anti-α-tubulina e gli anticorpi anti-GAPDH. La macchia HA e bandiera della macchia sono indicati per assicurare la sovraespressione di HA-Rab10 e 3xFLAG-LRRK2, rispettivamente. Il α-tubulina e GAPDH macchie sono mostrate per garantire il caricamento uguale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultato rappresentativo del blot P-tag: sistema endogeno. Due linee cellulari, vale a dire cellule 3T3-Swiss albino (A) e cellule A549 (B), sono stati utilizzati. In entrambe le figure, i pannelli superiori Visualizza che il tag P macchie usando un anticorpo anti-Rab10, dove Rab10 endogeno fosforilate e non-fosforilate sono contrassegnati con aperto (○) e chiuso cerchi (●), rispettivamente. I pannelli mostrati sotto le macchie di tag P sono immunoblots su normale gel di SDS-PAGE utilizzando un anti-Rab10, anti-pSer935 LRRK2, anti-LRRK2 e gli anticorpi anti-α-tubulina. Il Rab10 e LRRK2 sono mostrati per garantire l'espressione simile di endogeno Rab10 e LRRK2 tra i campioni, rispettivamente. La macchia di LRRK2 pSer935 sono indicati per garantire quel GSK2578215A (A) e MLi-2 (B) ha funzionato come previsto. La macchia di α-tubulina sono mostrati per garantire il caricamento uguale. Le immagini delle macchie tag P sovrapposte con il marcatore di peso molecolare sono mostrate in Figura S4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1. Sequenze di DNA del plasmide. Le sequenze di DNA del plasmide codifica HA-Rab10/pcDNA5 FRT a e quella di 3 × × bandiera-LRRK2/p3 bandiera-CMV-10. Tutti i plasmidi usati in questo protocollo sono disponibili da parte degli autori su richiesta. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Figura S2. Un esempio di ottimizzazione di SDS-PAGE tag P. Lo stesso set di campioni come quello utilizzato in Figura 3A è stato utilizzato per ottimizzare il tag P SDS-PAGE. Quattro diverse condizioni sono state testate come mostrato nella figura. Le bande corrispondenti a Rab10 fosforilate e non-fosforilate sono evidenziate con rettangoli di linea continue e tratteggiate, rispettivamente.Basato su questo esperimento, la condizione con 10% di acrilammide, 50 µM tag P acrilammide e 100 µM MnCl2 ha dato la migliore separazione delle due bande, entrambi individuazione nel mezzo il gel. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Figura S3. Confronto tra il pattern di migrazione di un marcatore di peso molecolare. Il marcatore di peso molecolare (MWM) è stato eseguito su un normale gel di SDS-PAGE (pannello di sinistra) o su un gel di SDS-PAGE tag P (pannello centrale), e i gel sono stati macchiati dalla macchiatura Coomassie. Il pannello di destro Mostra un immunoblot dei campioni utilizzati in Figura 2 (via 4 e 5) sullo stesso gel SDS-PAGE tag P come il pannello centrale per mostrare le posizioni di Rab10 fosforilate e non-fosforilate. La punta della freccia sul lato destro del immunoblot indica la posizione di uno di MWM sul gel SDS-PAGE tag P. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Figura S4. La posizione di un marcatore di peso molecolare sui gel di SDS-PAGE tag P. Immagini digitalizzate delle membrane utilizzate per Figura 3A e 3B di figura sono mostrati come (A) e(B), rispettivamente. I immunoblots illustrato nella Figura 3 sono sovrapposti per visualizzare la relativa posizione del marcatore di peso molecolare (MWM). La MWM non hanno trasferito bene le membrane ma il marcatore (punta di freccia) in Figura S3 è stato leggermente ma costantemente osservato. La posizione della MWM è segnata con linee tratteggiate. Si noti che corsie irrilevante per le figure tra la MWM e le corsie di interesse sono barrate. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Qui, descriviamo un metodo facile e robusto di rilevazione Rab10 fosforilazione di LRRK2 a livelli endogeni basata sulla metodologia P-tag. Poiché l'anticorpo attualmente disponibile contro fosforilato Rab10 funziona solo con proteine overexpressed15, il presente metodo utilizzando tag P SDS-PAGE è l'unico modo per valutare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione. Inoltre, il presente metodo consente la stima della stechiometria di Rab10 fosforilazione nelle cellule. Perché la metodologia P-tag è genericamente applicabile a fosfoproteine, il presente protocollo può essere un "prototipo" per stabilire metodi simili per altri fosfo-proteine.
Passaggi critici nel protocollo sono colata gel e preparazione dei campioni. L'acrilammide tag P è un reagente relativamente foto-labile e la capacità di ritardare la mobilità elettroforetica delle proteine fosforilate a volte viene persa dopo la lunga conservazione a 4 ° C. I ricercatori dovrebbero prendere ogni cura per evitare di esporre i tag P acrilammide alla luce. Inoltre, la molecola di tag P ha bisogno formare un complesso con ioni2 + Mn per catturare i fosfati. Così, i campioni non devono contenere agenti chelanti come l'EDTA, che sono componenti usuali di tamponi di campione di SDS-PAGE disponibili sul mercato. Si consiglia di utilizzare il buffer del campione di Laemmli classica per preparare campioni per tag P SDS-PAGE.
Un altro punto critico è accuratamente ottimizzare le concentrazioni di acrilamide, tag P acrilammide e MnCl2 nella miscela di gel di separazione (Figura S2). Le distanze di migrazione delle bande fosforilate e non-fosforilate variano a seconda dei reagenti utilizzati (sacco, purezza, ecc.), e l'ottimizzazione delle concentrazioni corretta testando diverse concentrazioni differenti in combinazione è obbligatoria (ad esempio, tag P acrilamide (25, 50, 75 µM), MnCl2 (1:2 o 1:3 rapporto molare all'acrilammide P-tag) e acrilammide (7.5, 10, 12,5%)). Le bande fosforilate e non-fosforilate dovrebbero apparire nel mezzo i gel e ben separano gli uni dagli altri. Per processo di ottimizzazione, si consiglia di utilizzare iperespresso Rab10 perché la band spostata è facilmente rilevabile. Gli autori possono fornire campioni di controllo per questo protocollo.
Uno della più grande confusione che possa causare questo protocollo sarà a causa della differenza dei modelli di migrazione della MWM tra regolari e gel di SDS-PAGE tag P. Come illustrato nella Figura S3, i modelli di migrazione di MWM su regolare e gel di SDS-PAGE tag P (entrambi 10%) sono notevolmente differenti e non si può utilizzare la MWM per stimare il peso molecolare delle proteine su gel di SDS-PAGE tag P. Tuttavia, il gel di SDS-PAGE tag P, uno del MWM spicca migrando verso il centro del gel (punta di freccia in Figura S3), che è costantemente osservato tra gel (Vedi Figura S4). Questo MWM migra sempre tra le bande di Rab10 fosforilate e non-fosforilate. Di conseguenza, questo indicatore è utile non solo per garantire che il tag P SDS-PAGE funziona prima del trasferimento, ma anche come un punto di riferimento per avere un'idea approssimativa di dove saranno visibili le bande di Rab10 fosforilate e non-fosforilate.
Per la rilevazione delle bande sui immunoblots, abbiamo usato un imager equipaggiato con una camera CCD raffreddata (Vedi Tabella materiali) così come una radiografia convenzionale pellicola di sviluppo del sistema e trovato che entrambi i sistemi funzionano bene. Per il rilevamento dei livelli endogeni di Rab10 fosforilazione in cellule coltivate, è necessario utilizzare linee cellulari che hanno livelli di alta espressione di LRRK2 endogeni, come fibroblasti embrionali del mouse (primario coltivate o immortalato cella linee ( 3T3-Swiss albino, ecc.)) e cellule A549 di derivate da carcinoma del polmone umano. Per il rilevamento dei livelli endogeni di fosforilazione di Rab10 nei tessuti del mouse, si consiglia di utilizzare del polmone16.
La quantificazione di Rab10 fosforilazione non è di là del consueto immunoblotting. Se la stechiometria dei Rab10 fosforilazione è molto bassa (come mostrato nella Figura 3), l'intensità della banda non fosforilate (contrassegnato con un cerchio chiuso) tende ad essere molto di sopra del livello di saturazione, rendendo la precisa determinazione della stechiometria Impossibile. Tuttavia, stima qualitativa è ancora possibile in ogni caso, che non è ottenibile senza utilizzare il presente metodo. Poiché la rilevazione della fosforilazione di Rab10 endogeni richiede l'esposizione prolungata, tende ad esserci alcune bande non specifici che appaiono al P-Tag macchia anche se l'anticorpo anti-Rab10 utilizzata nel presente protocollo dà immunoblots abbastanza pulita per uso normale . Per distinguere proteine fosforilate da bande non specifici, è fondamentale utilizzare un controllo inibitore-trattamento, in cui bande fosforilati, ma bande non aspecifici, dovrebbero scomparire. LRRK2 fosforila Tab8 oltre Rab1015, e abbiamo correttamente applicato il presente protocollo a Rab8A pure (dati non mostrati). Il presente protocollo potenzialmente utilizzabile per esaminare la fosforilazione di eventuali proteine, anche se potrebbero esserci difficoltà tecniche se la proteina è grande (> 100 kDa) o moltiplicare fosforilati. Perché Rab10 è una piccola proteina (25 kDa) e singolarmente fosforilato a Thr73 da LRRK2, il risultato del tag P SDS-PAGE è semplice dove è osservata soltanto una fascia spostata.
Nel prossimo futuro, sarà fondamentale per stabilire il metodo per rilevare quantitativamente l'attività della chinasi di LRRK2 in campioni paziente in un modo ad alta velocità per valutare l'alterazione dell'attività della chinasi di LRRK2 nei pazienti del Palladio anche valutare l'effetto delle droghe su LRRK2 negli studi clinici. Dal sangue periferico umano cellule mononucleari (PBMCs) esprimono livelli relativamente alti di endogeno LRRK223, PBMCs o ulteriormente isolato le cellule del sangue sarà vale la pena provare per endogena Rab10 fosforilazione. Il presente metodo sarà non solo essere utile per studiare la biologia di base del LRRK2 via di segnalazione, ma anche un aiuto nell'ottenere un base di prova per decidere quale campione in campioni paziente sia per essere analizzati in tali studi su larga scala.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Si ringrazia il Dr. Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo, Giappone) per gentilmente fornire i plasmidi codifica 3xFLAG-LRRK2 WT e mutanti. Ringraziamo anche il Dr. Dario Alessi (Università di Dundee, UK) per fornire gentilmente MLi-2 ed il plasmide che codifica HA-Rab10. Questo lavoro è stato supportato dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI Grant numero JP17K08265 (G.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
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