Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56688
Automatic Translation
1, 1,2
1Laboratory of Brain and Neurological Disorders, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Laboratory of Neuropathology and Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

Studien beskriver en enkel metode for å oppdage endogene av Rab10 fosforylering av leucine-rik gjenta kinase 2.

Abstract

Mutasjoner i leucine-rik gjenta kinase 2 (LRRK2) har vist seg å være knyttet til familiær Parkinsons sykdom (FPD). Siden unormal aktivering av kinase aktiviteten til LRRK2 har vært innblandet i patogenesen av PD, er det viktig å etablere en metode for å vurdere fysiologiske nivåer av kinase aktiviteten til LRRK2. Nyere studier viser at LRRK2 phosphorylates av Rab GTPase familien, inkludert Rab10, under fysiologiske forhold. Selv om fosforylering av endogene Rab10 av LRRK2 i kulturperler celler ble oppdaget av massespektrometri, har det vært vanskelig å oppdage det ved immunoblotting på grunn av dårlig følsomheten av tilgjengelige fosforylering-spesifikke antistoffer for Rab10. Her beskriver vi en enkel metode for å oppdage endogene av Rab10 fosforylering av LRRK2 basert på immunoblotting bruker natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) kombinert med en fosfat-bindende kode (P-koden), som er N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -NN',N'- tris (pyridin-2-yl-metyl) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Nåværende protokollen ikke bare gir et eksempel av metodikken bruker P-koden, men kan også vurdere hvordan mutasjoner som hemmer behandling/administrasjon eller andre faktorer endre nedstrøms signalene for LRRK2 i celler og vev .

Introduction

PD er en av de vanligste nevrodegenerative sykdommene, hovedsakelig påvirker dopaminergic nerveceller i mellomhjernen, som resulterer i dysfunksjon av motor systemer i eldre mennesker1. Mens de fleste pasientene utvikle PD på sporadiske måte, er det familier arve sykdommen. Mutasjoner i flere gener er funnet å være knyttet til FPD2. En av forårsaker genene for FPD er LRRK2, der åtte eks. missense mutasjoner (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S og I2020T) koblet til en nesten kun arvet FPD kalt PARK8 har så langt vært rapportert3,4,5. Flere genomet hele association studier (GWAS) av sporadiske PD pasienter har også identifisert genomisk variantene LRRK2 locus som en risikofaktor for PD, antyder at abnormitet i funksjonen for LRRK2 er en vanlig årsak til neurodegeneration både sporadisk og PARK8 FPD6,7,8.

LRRK2 er et stort protein (2,527 aminosyrer) som består av et leucine-rik gjenta domene, en GTP bindende Ras av komplekse proteiner (ROC) domene, en C-terminalen ROC (COR) domene, et serine/threonin protein kinase domene og WD40 gjenta domene9. Åtte FPD mutasjoner finner i disse funksjonelle domener; N1437H og R1441C/G/H/S i ROC domenet, Y1699C i COR domenet, G2019S og I2020T i kinase domenet. Siden G2019S mutasjon, som finnes mest mutasjon i PD pasienter10,11,12, øker kinase aktiviteten til LRRK2 av 2-3 ganger i vitro13, det er en teori om at unormal økningen i fosforylering av LRRK2 substrate(s) er giftig for neurons. Imidlertid har det vært umulig å studere om fosforylering av fysiologisk relevante LRRK2 underlag endres i familiær/sporadiske PD pasienter på grunn av manglende metoder evaluerer den i avledede pasientprøvene.

Protein fosforylering oppdages vanligvis av immunoblotting eller enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) bruker antistoffer spesifikt gjenkjenne phosphorylated staten proteiner eller masse spectrometric analyse. Men den tidligere strategien noen ganger kan ikke brukes på grunn av vanskelighetene med å skape fosforylering-spesifikke antistoffer. Metabolsk merking av celler med radioaktive fosfat er et alternativ å undersøke fysiologiske nivåer av fosforylering når fosforylering-spesifikke antistoffer ikke er lett tilgjengelig. Men det krever en stor mengde radioaktivt materiale og derfor innebærer noen spesialisert utstyr for radioprotection14. Masse spectrometric analyse er mer følsom sammenlignet med metodene talipes og populært analysere protein fosforylering. Imidlertid prøve forberedelsene er tidkrevende, og dyre instrumenter kreves for analysen.

Et delsett av Rab GTPase familien inkludert Rab10 og Rab8 ble nylig rapportert som direkte fysiologiske substrater for LRRK2 basert på resultatet av en storstilt phosphoproteomic analyse15. Vi så demonstrerte at Rab10 fosforylering ble økt med FPD mutasjoner i mus embryonale fibroblaster og lungene til knockin mus16. I denne rapporten, valgte vi å ansette en natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side)-basert metode der en P-tag molekylet er co polymerized i SDS side gels (P-tag SDS-side) for å oppdage endogene av Rab10 fosforylering, fordi en svært følsom antistoffer spesifikke for fosforylert Rab10 var fremdeles mangler. Vi kunne oppdage fosforylering av endogene Rab8 på grunn av dårlig selektivitet av tilgjengelige antistoffer for totalt Rab8. Vi har derfor besluttet å fokusere på Rab10 fosforylering. LRRK2 phosphorylates Rab10 på Thr73 å finne på midten av høyt konservert "bytte II" regionen. Høy bevaring av webområdene fosforylering blant Rab proteinene kan være en av grunnene til hvorfor phosphospecific antistoffer gjenkjenne forskjellige Rab proteiner er vanskelig å gjøre.

Fosforylering av Rab8A av LRRK2 hemmer binding av Rabin8, en guanine nukleotid utveksling faktor (GEF) som aktiverer Rab8A ved å utveksle bundet BNP med GTP15. Fosforylering Rab10 og Rab8A av LRRK2 hemmer også binding av BNP-dissosiasjon hemmere (GDIs), som er avgjørende for aktivering av Rab proteiner ved å trekke ut BNP-bundet Rab proteiner membraner15. Kollektivt, er den hypotese at fosforylering Rab proteiner av LRRK2 hindrer dem fra aktivisering selv om den presise molekylære mekanisme og fysiologiske konsekvensene av fosforylering fortsatt uklare.

P-tag SDS-side ble oppfunnet av Kinoshita et al. i 2006: I denne metoden akrylamid var covalently kombinert med P-tag, et molekyl fange fosfater med høy affinitet, som copolymerized i SDS side gels17. Fordi P-tag molekylene i en SDS side gel sinke selektivt electrophoretic mobilitet fosforylert proteiner, P-tag SDS-side kan skille fosforylert proteiner fra ikke-fosforylert seg (figur 1). Hvis den protein-av-begrave er fosforylert på flere rester, vil en stige band tilsvarer ulikt fosforylert skjemaer bli observert. Ved Rab10 ser vi bare ett skiftet band, som angir at Rab10 er fosforylert bare på Thr73. Den store fordelen med P-tag SDS-side over immunoblotting med fosforylering-spesifikke antistoffer er at fosforylert Rab10 kan oppdaget av immunoblotting med ikke-fosforylering-spesifikke antistoffer (i.e.erkjennelsen totalt Rab10) etter overføres på membraner, som er generelt mer spesifikke følsom og tilgjengelig fra kommersielle/faglige kilder. En annen fordel med å bruke P-tag SDS-side er at man kan få omtrentlig estimering av støkiometri av fosforylering, som er umulig ved immunoblotting med fosforylering-spesifikke antistoffer eller metabolske merking av celler med radioaktivt fosfater.

Bortsett fra bruk av rimelig P-tag akrylamid og noen mindre endringer knyttet til det, følger nåværende metoden for påvisning av Rab10 fosforylering av LRRK2 generelle protokollen immunoblotting.Derfor bør det være enkel og lett kjørbare i noen laboratorier der immunoblotting er en vanlig praksis, med noen typer prøver inkludert renset proteiner, cellen lysates og vev homogenates.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sample forberedelse til P-tag SDS-siden

  1. Fjerne og forkaste media fra 10 cm retter der celler er dyrket ved hjelp av et inntaks vaske celler med 5 mL Dulbecco fosfat-bufret saltvann (DPBS) ved første legger DPBS til side av retter å unngå å forstyrre celle laget og manuelt rock retter tilbake og tilbake flere ganger.
  2. Fjerne og forkaste DPBS bruker en sugekraft og legge 2 mL 0,25% (w/v) trypsin fortynnet i DPBS, og forsiktig rock retter å dekke celle laget. Retter inn en CO2 inkubator (37 ° C, fuktet luft, 5% CO2) i 5 min.
  3. Etter pipettering opp og ned med en engangs pipette for å bryte opp frittstående celler, samle celle suspensjon i en 15 mL tube og måle celle tetthet med en hematocytometer under et mikroskop18.
  4. Fortynne cellene til 2,5 × 105 celler/mL med Dulbeccos endret Eagle medium (DMEM) med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Tilsett 2 mL (5 × 105 celler) av fortynnet celle suspensjon hver brønn av 6-og plater.
  5. Vokse cellene over natten i en CO2 inkubator (37 ° C, fuktet luft, 5% CO2).
  6. Hva i HEK293 celler
    Merk: Hvis fosforylering av endogene Rab10 undersøkes, gå videre til trinn 1.7. Plasmider brukes i denne protokollen kan fås fra forfatterne på forespørsel. Se Tabellen for materiale for kort informasjon og Figur S1 for deres DNA-sekvenser.
    1. Aliquot 200 µL av DMEM inn i 1,5 mL rør.
    2. Legge til begge 0.266 µg (siste konsentrasjon av 1,33 µg/mL) av en plasmider koding HA-Rab10 og 1.066 µg (siste konsentrasjon av 5.33 µg/mL) av en plasmider koding 3 × flagg-LRRK2 fra 500 µg/mL plasmider aksjer hver tube. Deretter legger 4 µL av 1 mg/mL løsningen av polyethyleneimine (oppløst i 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0) og bland umiddelbart løsningen ved vortexing for 5 s.
    3. La rør stå ved romtemperatur i 10 min og legge innholdet i en tube dropwise til en godt med brønnene. Forsiktig og manuelt rock kultur platene frem og tilbake flere ganger for å la transfection blandingen diffus jevnt gjennom brønnen.
  7. La cellene vokse for en 24-36 h i en CO2 inkubator (37 ° C, fuktet luft, 5% CO2).
  8. Hvis fosforylering av endogene Rab10 undersøkes, behandle celler med og uten LRRK2 hemmere 1t før lysing celler.
    1. Klargjør lager løsninger av LRRK2 hemmere ved oppløsning hemmere i dimethyl sulfoxide (DMSO) på 10 mM. Vi anbefaler å bruke MLi-2 og GSK2578215A, som er svært bestemt og potent LRRK2 hemmere. Lager lager løsninger på-80 ° C.
    2. Forberede arbeider bestander av hemmere fortynne lager løsninger med DMSO: For MLi-2, forberede 10 µM og 30 µM endogene og overexpressed LRRK2, henholdsvis. For GSK2578215A, forberede 1 mM og 3 mM endogene og overexpressed LRRK2, henholdsvis.
    3. Legg 2 µL av de arbeider av MLi-2 eller GSK2578215A til midten av en godt med brønnene og forsiktig rock platen manuelt frem og tilbake flere ganger for å la hemmere diffus jevnt gjennom brønnen.
    4. Legge 2 µL av DMSO til et annet godt som en negativ kontroll på en lignende måte til inhibitor i trinn 1.8.3.
    5. Sett platene til inkubatoren og kultur cellene 1t.
  9. Lyse cellene.
    1. Lagt kultur platene på is. Fjerne og slette media. Vask cellene ved første legge 2 mL DPBS ved siden av retter å unngå å forstyrre cellen lag og manuelt rock rettene frem og tilbake flere ganger.
    2. Fjerne forkaste DPBS og legge til celler 100 µL av lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl Eter, 1 mM EGTA (etylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N, N N', N'-tetraacetic syre), 1 mM natrium orthovanadate, 50 mM Natrium Fluor, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM natrium pyrophosphate, 0.1 µg/mL microcystin-LR, 270 mM sukrose, protease hemmer cocktail).
    3. Tilt platene på is og skrape celler ved hjelp av en celle skraper for å samle så mye celle lysate som mulig. Samle lysates ved hjelp av brønnene i 1,5 mL rør (pre kjølt på is).
      Forsiktig: Microcystin-LR kan være dødelig hvis svelget eller hudkontakt.
  10. La rør stå på is 10 min for komplett lysis. Avklare den cellen lysates med sentrifugering (20.000 × g, 10 minutter til 4 ° C) og overføre supernatants til nye 1,5 mL rør pre kjølt på is.
  11. Måle protein konsentrasjon (µg/µL) av de ryddet lysates ved Bradford analysen.
    1. Forberede bovin serum albumin (BSA) standarder (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1 mg/mL) fortynne lager løsningen med destillert vann. Fortynne ryddet celle lysates av 20-fold med destillert vann.
    2. Sett 5 µL/vel av BSA standarder, tom (destillert vann) og hver utvannet celle lysate i en 96-brønns plate i tre eksemplarer.
    3. Legg 150 µL/vel i Bradford analysen reagensen med 12-kanals brønnene og la platen står ved romtemperatur for 5 min.
    4. Måle absorbans ved 595 nm på en plate leseren og sammenligne BSA standarder.
  12. Forberede 100 µL av prøver SDS-side. Protein konsentrasjonen av prøvene er 1 µg/µL for overexpressed HA-Rab10 og 2 µg/µL for endogene Rab10.
    1. Bruker kvantifisert konsentrasjonen fra trinn 1.11.4, beregne volumet (µL) av cellen lysates tilsvarende 100 µg (overexpressed HA-Rab10) eller 200 µg (endogene Rab10) ved at protein beløpet (100 µg eller 200 µg) ved at protein lysates (μ g/µL).
    2. Legg til 25 µL 4 × Laemmli SDS side eksempel bufferen (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% (w/v) SDS, 40% (v/v) glyserol, 0.02% (w/v) bromophenol blå, 4% (v/v) β-mercaptoethanol) i nye 1,5 mL rør holdt ved romtemperatur.
    3. Legge til beregnede volumet av cellen lysates hver rør og bland ved vortexing for 5 s ved romtemperatur.
    4. Bringe det totale volumet til 100 µL lyseringsbuffer og blanding av vortexing for 5 s ved romtemperatur.
  13. Supplere med 10 mM MnCl2 å slukke chelaterande agent. Legg 1 µL av 500 mM MnCl2. Blanding av vortexing for 5 s ved romtemperatur.
    Merk: Utvalg som inneholder MnCl2 passer kanskje ikke for normal SDS-side.
Dette trinnet er nødvendig på grunn av tilstedeværelsen av chelaterande agent (som ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), EGTA, etc.) i lyseringsbuffer. Ellers Mn2 + ioner koblet til P-tag akrylamid vil bli atskilt av chelaterande agenter, og P-tag SDS-side vil ikke fungere skikkelig.
  • Koke alle prøver ved 100 ° C i 5 min og lagre prøvene under 20 ° C før bruk. Kokte prøvene kan lagres opp til minst 6 måneder.

    • 2. casting Gels for P-tag SDS-side

    Merk: Gels bør gjøres på samme dag som kjører geléer. Gels kan gjøres under lysforholdene i rommet.

    1. Klargjør 5 mM P-tag akrylamid lagerløsning ved første oppløsende 10 mg av pulver/solid P-tag akrylamid helt med 100 µL av metanol, og koble deretter til 3,3 mL ved å legge til dobbel destillert vann.
      Merk: P-tag akrylamid er lysfølsom. Løsningen skal lagres i mørket på 4 ° C før bruk.
    2. Ren både vanlig og hakk plater av sprøyting 70% etanol og tørke med et papirhåndkle. Samle gel plater. Gel platene brukes i denne bestemte protokollen er 80 eller 100 mm lange 100 mm bred. Ren silisium avstandsstykker settes mellom ren og hakk og de sammensatte platene er festet med bindemiddel klipp.
      Merk: Alle typer gel plater som fungerer for vanlige SDS-siden kan brukes.
    3. Sette en kam som skal brukes (17-vel plast kombi) i sammensatte gel plater og merke på gel platen posisjonen til bunnen av brønnene med en permanent penn.
    4. Forberede 10 mL av 10% akrylamid gel blanding (10% (w/v) akrylamid (acrylamide:bis-akrylamid = 29:1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (w/v) SDS) i en 15 mL tube.
      Merk: Den optimal konsentrasjonen av akrylamid kan variere avhengig av reagensene brukes. Tetramethylethylenediamine (TEMED) og ammonium persulfate (APS) bør ikke legges på dette punktet.
    5. Legg 100 µL av 5 mM P-tag akrylamid og 10 µL av 1 M MnCl2 løsninger på siste konsentrasjoner av 50 µM og 100 µM, henholdsvis.
      Merk: De optimale konsentrasjonene av P-tag akrylamid og MnCl2 kan også variere avhengig av reagensene brukes.
    6. Legge til 15 µL av TEMED til gel blanding i en siste konsentrasjon av 0,15% (v/v) og deretter 50 µL av 10% (w/v) APS på en siste konsentrasjon på 0,05% (w/v). Bland godt ved forsiktig virvler røret for 5 s og hell i de sammensatte platene umiddelbart til en høyde som er 2 mm under plasseringen markert i trinn 2.3.
    7. Forsiktig layer 2-propanol på gel løsningen å flate toppen av skille gels.
    8. La geléer står for 30 min ved romtemperatur. Det er ikke nødvendig for å beskytte geléer fra lys.
      Merk: Det kan ta lengre tid for gels sette under kalde romtemperatur. Avgassing gel blandingen før du legger til TEMED og APS hjelper akselerere dette trinnet. For dette formålet, kan gel blandingen tilberedes i en 100-200 mL Erlenmeyer kolbe koblet til en sugekraft. Degas løsningen for 10 min.
    9. Fjerne lag 2-propanol ved å absorbere med et papirhåndkle.
    10. Vask toppen løpet av geléer ved å fylle plassen opp med destillert vann fra en og forkaste vannet ved å helle av i bassenget. Gjenta vaske 3 ganger.
    11. Fjern gjenværende vann i det øverste området geléer ved å absorbere med et papirhåndkle.
    12. Forberede 3 mL 4% akrylamid gel blanding (4% (w/v) akrylamid (a: crylamide:bis-akrylamid = 29:1), 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 0,1% (w/v) SDS) i en 15 mL tube.
      Merk: Ikke Legg P-tag akrylamid eller MnCl2 løsning til stabling gel blanding.
    13. Legg 7,5 µL av TEMED og 24 µL av 10% (w/v) APS på siste konsentrasjoner av 0,25% (v/v) og 0,08% (w/v), henholdsvis. Bland godt ved forsiktig virvler røret for 5 s og Hell blandingen over separasjon gel. Umiddelbart satt riktig kammer (17-vel Plastspiraler som romme opptil 25 µL av prøver, for eksempel).
    14. La geléer står for 30 min ved romtemperatur. Det er ikke nødvendig for å beskytte geléer fra lys. Når stabling geléer angitt, kjøre dem uten ytterligere lagring.

    3. SDS-side og Immunoblotting

    1. Fjern kammene fra geléer. Deretter fjerne silisium spacere og deretter klipp fra geléer.
    2. Støpt geléer inn gel stridsvogner, og løs gel til tanken ved clamping med bindemiddel klipp.
    3. Hell kjører bufferen (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (w/v) SDS) på bunnen og toppen av geléer. Ren brønner ved flushing kjører bufferen med en 5 mL sprøyte og en 21G nål fjerne gel stykker.
    4. Fjerne luftbobler fra bunnen plass gelé bruker en bøyd nål knyttet til en sprøyte. For å gjøre en bøyd nål, bøy manuelt en 21G nålen i midten nålen slik at vinkelen mellom toppen og bunnen av nålen blir 30-45 °.
    5. Nedspinning precipitates forårsaket av tillegg av MnCl2 på 20.000 × g for 1 min ved romtemperatur å få klare eksempler.
    6. Laste inn 10 µg proteiner for å oppdage fosforylering overexpressed Rab10 og 30 µg proteiner for endogene Rab10.
      Merk: Det er viktig å laste like volum av prøver i alle brønnene. Tom baner skal lastes med 1 × Laemmli SDS side eksempel buffer. Hvis eksemplene inneholder MnCl2, Legg samme konsentrasjonen av MnCl2 til dummy prøvene.
    7. Den godt lastet med merketråd molekylvekt (ÅRENE) bør også suppleres med 1 × Laemmli SDS side eksempel buffer slik volumet av prøver lastet er det samme i alle brønnene.
      Merk: Igjen, hvis prøvene inneholder MnCl2, legge til samme konsentrasjonen av MnCl2 i ÅRENE. Alternativt kan en EDTA-fri ÅRENE brukes.
    8. Kjøre gels på 50 V for stabling (ca 30 min) til fargestoff foran krysser i separasjon gel.
    9. Etter at prøvene stabler, endre spenningen til 120 V for separasjon til fargestoff foran når bunnen av geléer (ca 50 og 80 min for 80 og 100 mm lange geleer, henholdsvis).
      Merk: Migrasjon mønster av ÅRENE er forventet å være forskjellig fra på normal SDS side gels. Det bør ikke brukes til å beregne molekylvekt av proteiner på P-tag SDS-side gels, men kan brukes for å kontrollere reproduserbarhet P-tag gelé. Se diskusjon for detaljer.
    10. Vask geléer for å fjerne MnCl2 fra geléer.
      1. Hell overføring buffer (48 mM Tris, 39 mM Glycine, 20% (v/v) metanol) inneholder 10 mM EDTA og 0,05% (w/v) SDS i en beholder (f.eks, store veier båter).
    Volumet av bufferen bør være tilstrekkelig til å dekke en gel.
  • Fjerne separasjon geléer fra gel plater og sette en gel i en beholder. Kast stabling gel.
  • La geléer på en rocking shaker (~ 60 rpm) i 10 min ved romtemperatur.
  • Gjenta trinnene vask totalt 3 ganger.
    Merk: Bruk ferske buffer for hver vask.
  • Vask geléer gang for 10 min med overføring bufferen som inneholder 0,05% (w/v) SDS fjerne EDTA. Volumet av bufferen bør være tilstrekkelig til å dekke en gel.
  • Electro-overføring til nitrocellulose eller polyvinylidene difluoride (PVDF) membraner med våte tanker.
    1. Plassere et filter papir (10 x 7 cm) på en svamp pad for overføring. Plass gel på filter papir. Kontroller at det er ingen luftbobler mellom filter papir og gel.
    2. Sett en membran (10 x 7 cm) på gel og kontroller at det er ingen luftbobler mellom gel og membranen.
    3. Sette et annet filter papir (10 x 7 cm) på membranen, og sørg for at det er ingen luftbobler mellom membranen og filter papir.
    4. Sette en annen svamp pad på filter papir. Sette papirbunken membran/filter i en kassett for overføring.
    5. Sett kassetten i en overføring tank, at membranen er gel og positivt ladede anoden.
    6. Koble tanken til en strømforsyning og sette tanken i en styren skum boks fylt med iskaldt vann. Start overføring på 100 V i 180 min.
      Merk: Langvarig overføring er nødvendig siden overføring av proteiner fra P-tag SDS-side gels ikke er så effektiv som fra vanlige SDS side gels. Effektiv kjøling er viktig å unngå smelter gels under overføring.
  • Når overføringen
    1. Fjerne membraner fra geléer ved hjelp av pinsett og suge membraner i en Ponceau S løsning (0,1% (w/v) Ponceau S, 5% (v/v) eddiksyre) stain overførte proteiner på membraner i en plastbeholder. Volumet av løsningen bør være tilstrekkelig til å dekke en membran.
    2. Inkuber membraner for 1 min ved romtemperatur av rocking manuelt.
      Merk: En stige band bør bli synlig i hver fil.
    3. Hente membranen av flekker løsningen med pinsett og se om stigen band har ensartet mønster og intensiteten i hver lane der prøvene er lastet.
    4. Etter å sjekke den flekker, fjerne flekker løsningen og legge TBST buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate). Volumet av bufferen bør være tilstrekkelig til å dekke en membran.
      Merk: Den Ponceau S-løsningen kan samles og brukes flere ganger på nytt.
    5. Rock membraner i TBST på en rocking shaker (~ 60 rpm) ved romtemperatur gjenstår ingen synlige bånd på membraner.
    6. Gjenta trinnet vask med fersk TBST i 5 minutter.
  • Fjerne og slette TBST. Blokkere ved å legge til 5% (w/v) skummet melk oppløst i TBST og rocking på en shaker (~ 60 rpm) 1t ved romtemperatur. Volumet av blokkering løsningen bør være tilstrekkelig til å dekke en membran.
  • Klargjør primære antistoff løsninger ved å fortynne primære antistoffer (anti-Rab10 antistoffer for endogene Rab10) og anti-HA antistoffer for overexpressed HA-Rab10 i 10 mL per membran av blokkering løsningen (se Tabell for materiale for konsentrasjoner).
  • Fjerne og forkaste blokkerer løsningen og Legg primære antistoffer. Inkuber membraner på en rocking shaker (~ 60 rpm) natten på 4 ° C.
  • Fjern primær antistoff løsningen og legge TBST å vaske membraner. Volumet av bufferen bør være tilstrekkelig til å dekke en membran.
  • Inkuber membraner i 5 min på en rocking shaker (~ 60 rpm) i romtemperatur. Gjenta vask (trinn 3.16) totalt 3 ganger bruker ferske TBST hver gang.
  • Klargjør sekundære antistoff løsninger ved utvannende sekundære antistoff merket med pepperrotperoksidase (HRP) i 10 mL per membran av blokkering løsningen. Bruke anti-kanin IgG antistoff merket med HRP for membranene sonde med anti-Rab10 antistoffer og anti-musen IgG antistoff merket med HRP for de analysert med anti-HA antistoff (se Tabell for materiale for konsentrasjon).
  • Fjerne og kaste TBST etter tredje vask og legg den sekundære antistoff-løsningen. Inkuber membraner på en rocking shaker (~ 60 rpm) 1t ved romtemperatur.
  • Vask membraner i TBST for 10 min. Gjenta vask trinn totalt 3 ganger, ligner på trinn 3.17.
  • Utvikle membranene bruke forbedret chemiluminescence (ECL).
    Merk: Eksponeringstid kan variere avhengig av ECL løsningen og systemet brukes til å søke etter chemiluminescence.
    1. Aktivere en imager utstyrt med en kostnad - sammen enhet (CCD) kamera og en datamaskin koblet til imager. Starte opp Kontrollprogramvaren imager. Vent til temperaturen på CCD kameraet har nådd-25 ° C.
    2. Sett 1 mL ECL løsningen en membran på en plastfolie spredt på en benk.
    3. Sett en membran gel-side-fordel på ECL løsningen og deretter raskt snu den over slik at begge sider av membranen er belagt med løsningen.
    4. Hente membranen og renne den ved å la en side av membran touch et papirhåndkle 5 s.
    5. Sette membranen mellom klart filmer (f.eks, gjennomsiktig lommer).
      Merk: Plastfolie anbefales ikke for innpakning membraner. Klart filmene brukes for innpakning membranen må være så flat som mulig uten synlige rynker å unngå ujevn bakgrunn.
    6. Plassere membranen på en svart skuffen. Sett skuffen i imager og lukke døren.
    7. Klikk "Fokus" vinduet i Kontrollprogramvaren. Kontroller at membranen er riktig plassert. Klikk "Tilbake"-knappen.
    8. Velg "Presisjon" for "Eksponering Type". Velg "Manuell" for "Eksponeringstid" og angi eksponeringstid 1 s.
    9. Velg "Høy" for "Følsomhet/løsning". La "Legge digitalisering bilde" ukontrollert. Klikk "Start" for å ta et bilde.
    10. Lagre bildet som vises på skjermen i datamaskinen som en TIFF-fil.
    11. Gjenta bilder med eksponeringstiden fra 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s og opptil 180 s. Når du tar det siste bildet, sjekk "Legg digitalisering Image" så det digitale bildet, ikke chemiluminescence, av membranen kan tas samtidig.
    12. Velg det beste bildet med største dynamikkområdet og uten noen mette piksler (vises i rødt) i bandene rundt.
      Merk: Konvensjonelle X-ray filmer kan også brukes for gjenkjenning19.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Overuttrykte System: Fosforylering av HA-Rab10 av 3 × flagg-LRRK2 i HEK293 celler:

    HEK293 celler var transfekterte med 0.266 µg av HA-Rab10 vill-type og 1.066 µg av 3 × flagg-LRRK2 (vill-type, kinase inaktive mutant (K1906M) eller FPD mutanter). Rab10 fosforylering ble undersøkt av P-tag SDS siden etterfulgt av immunoblotting hjelp av anti-HA antistoff (figur 2). 10 µg proteiner ble kjørt på en 10% gel (80 x 100 x 1 mm) som inneholder 50 µM P-tag akrylamid og 100 µM MnCl2. Eksponeringstid for P-tag gel (toppanelet) var 10 s med en standard ECL løsning. Co-overuttrykte LRRK2 med Rab10 forårsaket bandet Skift på P-koden gel (merket med en åpen sirkel i toppanelet, sammenligne baner 2 og 4). Derimot co uttrykk med en kinase inaktive mutant (K1906M) LRRK2 kan ikke endre mobilitet av Rab10 (sammenligne baner 4 og 5), som angir at bandet skiftet skyldes LRRK2 kinase aktivitet. Bandet skiftet ble økt med alle FPD mutasjoner (sammenligne baner 4 og 6-13) med de forrige rapport15.

    Endogene System: Fosforylering av Rab10 av LRRK2 i kulturperler celler:

    Mus 3T3-Swiss albino embryonale fibroblast celler ble behandlet med eller uten en LRRK2 hemmer (GSK2578215A)20 på en siste konsentrasjon på 1 µM 1t (figur 3A). Menneskelige lunge karsinom A549 celler ble behandlet med eller uten en LRRK2 hemmer (MLi-2)21 i en siste konsentrasjon av 10 nM 1t (figur 3B). Endogene Rab10 fosforylering av endogene LRRK2 ble undersøkt av P-tag SDS siden etterfulgt av immunoblotting med et anti-Rab10 antistoff. 30 µg proteiner ble kjørt på en 10% gel (100 x 100 x 1 mm for 3T3-Swiss albino celler) og 80 mm for A549 celler som inneholder 50 µM P-tag akrylamid og 100 µM MnCl2. Eksponering for P-tag gel (topp panel) i figur 3A og 3B figur var 3 minutter og 90 s, henholdsvis. Bandet skiftet tilsvarer fosforylert endogene Rab10 ble observert på P-koden gel (merket med en åpen sirkel i toppanelet; sammenligne baner 1-2 og 3-4) som forsvant etter behandling av celler med GSK2578215A eller MLi-2. Effekten av LRRK2-hemmere ble godkjent av immunoblotting med anti-pSer935 LRRK2 antistoffer (tredje panelet fra bunnen), som er en veletablert avlesning av LRRK2 hemming i celler22.

    Figure 1
    Figur 1. Skjematisk fremstilling av P-tag SDS – side. Når en blanding av fosforylert (røde sirkler) og ikke-fosforylert (blå sirkler) proteiner (f.eksRab10) går gjennom en gel der P-tag akrylamid er co polymerized, forsinker mobiliteten til bare fosforylert proteiner på grunn av den sterke samspill fosforylert proteiner med P-tag molekyler (brukket piler). Siden Rab10 er fosforylert av LRRK2 på en enkelt rester Thr73, Rab10 kjører som to band: topp bandet representerer fosforylert Rab10 og bunnen bandet representerer ikke-fosforylert Rab10. Når cellene behandles med LRRK2 hemmere, skal topp bandet forsvinne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2. Representant resultatet av P-tag blot: overuttrykte systemet. Toppanelet viser P-tag blot bruke en anti-HA antistoff, der fosforylert og ikke-fosforylert Rab10 er merket med åpne (○) og lukket (●) sirkler, henholdsvis. Panelene nedenfor P-tag blot er immunoblots på normal SDS side gels med en anti-HA, anti-flagg, anti-α-tubulin og anti-GAPDH antistoffer. HA blot og flagg blot vises for å sikre at overuttrykte HA-Rab10 og 3xFLAG-LRRK2, henholdsvis. Α-tubulin og GAPDH blots vises for å sikre lik lasting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3. Representant resultatet av P-tag blot: endogene systemet. To cellelinjer, nemlig (A) 3T3-Swiss albino cellene og (B) A549, ble brukt. I både tall viser topp-panelene P-koden blotter bruker et anti-Rab10 antistoff, der fosforylert og ikke-fosforylert endogene Rab10 er merket med åpen (○) og lukket (●) sirkler, henholdsvis. Panelene nedenfor P-tag blots er immunoblots på normal SDS side gels med en anti-Rab10, anti-pSer935 LRRK2, anti-LRRK2 og anti-α-tubulin antistoffer. Rab10 og LRRK2 vises for å sikre lignende uttrykk for endogene Rab10 og LRRK2 mellom utvalgene, henholdsvis. PSer935 LRRK2 blot vises for å sikre at GSK2578215A (A) og MLi-2 (B) fungerte som forventet. Α-tubulin blot vises for å sikre lik lasting. Bilder av P-tag blots lagt med molekylvekt markøren vises i Figur S4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur S1. DNA-sekvenser av plasmider. DNA-sekvenser av plasmider koding HA-Rab10/pcDNA5 FRT til og med 3 × flagg-LRRK2/p3 × flagg-CMV-10. Alle plasmider brukes i denne protokollen er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Figur S2. Et eksempel på optimalisering av P-tag SDS side. Det samme settet av prøver som brukes i figur 3A ble brukt for å optimalisere P-tag SDS-siden. Fire ulike forhold ble testet som vist i figuren. Feltene tilsvarer fosforylert og ikke-fosforylert Rab10 er markert med solid og stiplede linjen rektangler, henholdsvis.Basert på dette eksperimentet, ga tilstanden med 10% akrylamid, 50 µM P-tag akrylamid og 100 µM MnCl2 best separasjon av de to bandene, både å finne i gel. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Figur S3. Sammenligning av migrasjon mønster av merketråd molekylvekt. Molekylvekt markøren (ÅRENE) ble kjørt på en vanlig SDS side gel (venstre panel) eller på en P-tag SDS-side gel (midten panel) og geléer var farget av Coomassie flekker. Panelet til høyre viser en immunoblot av prøvene i figur 2 (lane 4 og 5) på samme P-tag SDS-side gel som midtre panelet til å vise plasseringen av fosforylert og ikke-fosforylert Rab10. Pilspissen på høyre side av immunoblot indikerer plasseringen av en av ÅRENE på P-tag SDS-side gel. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Figur S4. Plasseringen av en molekylvekt markør på P-tag SDS-side gels. Digitaliserte bilder av membraner figur 3A og 3B figur vises som (A) og(B), henholdsvis. Immunoblots vises i Figur 3 er lagt for å vise den relative plasseringen av molekylvekt markøren (ÅRENE). I ÅRENE overføre ikke godt til membraner men markøren (pilspiss) i Figur S3 var svakt men konsekvent observert. Plasseringen av ÅRENE er markert med prikkede linjer. Merk at baner irrelevant for tallene mellom ÅRENE og baner rundt er gjennomstreket. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her beskriver vi en lettvinte og robust metode for å oppdage Rab10 fosforylering av LRRK2 på endogene basert på metodologi som P-kode. Fordi tilgjengelig antistoffer mot fosforylert Rab10 fungerer bare med overexpressed proteiner15, er nåværende metoden bruker P-tag SDS-side den eneste måten å vurdere endogene av Rab10 fosforylering. Videre gjør metoden finnes estimering av støkiometri av Rab10 fosforylering i celler. P-tag metodikken er generelt gjelder phospho-proteiner, kan den nåværende protokollen være en "prototype" for å etablere lignende metoder for andre phospho-proteiner.

    Avgjørende skritt i protokollen er avstøpning gels og forberedelse av prøver. P-tag akrylamid er en relativt Foto-labilt reagens og muligheten til å retard electrophoretic mobilitet fosforylert proteiner er tapt etter langtidslagring på 4 ° C. Forskere bør ta vare å unngå å utsette P-tag akrylamid lys. Videre trenger P-tag molekylet danner et kompleks med Mn2 + ioner å fange fosfater. Derfor bør prøver ikke inneholde chelaterande agenter som EDTA, som er vanlig kommersielt tilgjengelig SDS side eksempel buffere. Vi anbefaler å bruke den klassiske Laemmli eksempel buffer forberede eksempler P-tag SDS-side.

    En annen kritisk punkt er å optimalisere grundig konsentrasjonen av akrylamid, P-tag akrylamid og MnCl2 i separasjon gel blandingen (Figur S2). Migrasjon avstanden fosforylert og ikke-fosforylert vil variere avhengig av reagensene brukes (mye, renhet, etc.) og optimalisering av riktig konsentrasjonen ved å teste flere ulike konsentrasjoner i kombinasjon er Obligatorisk (f.eks, P-tag akrylamid (25, 50, 75 µM), MnCl2 (1:2 eller 1:3 molar forholdet til P-tag akrylamid), og akrylamid (7.5, 10, 12,5%)). Fosforylert og ikke-fosforylert bandene skal vises i geléer og atskilt godt fra hverandre. For optimaliseringsprosessen anbefales det å bruke overexpressed Rab10 fordi skiftet bandet er lett synlig. Forfatterne gir kontroll prøver for denne protokollen.

    En av de største forvirringen som kan føre til denne protokollen skyldes forskjellen av migrasjon av ÅRENE mellom vanlig og P-tag SDS-side gels. Man kan ikke bruke ÅRENE for beregne molekylvekt av proteiner på P-tag SDS-side gels som vist i Figur S3, migrasjon av ÅRENE på regelmessig og P-tag SDS-side gels (både 10%) er svært forskjellig. Men på P-tag SDS-side geleer står en av ÅRENE ved overføring til midten av gel (pilspissen i Figur S3), som er konsekvent observert blant gels (se Figur S4). Denne ÅRENE overfører alltid mellom bånd fosforylert og ikke-fosforylert Rab10. Derfor er denne indikatoren nyttig ikke bare for å sikre at P-tag SDS-side fungerer før, men også som et landemerke for å ha en grov følelse av hvor bånd fosforylert og ikke-fosforylert Rab10 vises.

    Deteksjon av band på immunoblots, har vi brukt en imager utstyrt med en vannkjølt CCD kamera (se Tabell for materiale) også som en konvensjonell X-ray film utvikling systemet, og funnet at systemene fungerer godt. For deteksjon av endogene Rab10 fosforylering i kulturperler celler er det nødvendig å bruke cellelinjer som har høy uttrykk nivåer av endogen LRRK2, for eksempel mus embryonale fibroblaster (enten primær kultivert eller udødeliggjort cellen linjer ( 3T3-Swiss albino, etc.)) og menneskelige lunge karsinom-avledet A549 celler. Deteksjon av endogene av Rab10 fosforylering i musen vev anbefales det å bruke lunge16.

    Kvantifisering av Rab10 fosforylering er ikke utover det vanlige immunoblotting. Hvis støkiometri av Rab10 fosforylering er svært lav (som vist på Figur 3), intensiteten av ikke-fosforylert band (merket med en lukket sirkel) tendens til å være langt over fargemetning, gjør nøyaktig bestemmelse av støkiometri umulig. Likevel er kvalitativ vurdering fortsatt mulig uansett hvilke er ikke oppnåelig uten å bruke metoden finnes. Siden oppdagelsen av fosforylering av endogene Rab10 krever langvarig eksponering, pleier det å være noen uspesifikke band på P-koden blot selv om anti-Rab10 antistoffer i denne protokollen gir ganske ren immunoblots for normal bruk . For å skille fosforylert proteiner fra uspesifikke band, er det viktig å bruke en inhibitor-behandling-kontroll der fosforylert band, men ikke uspesifikke band, skal forsvinne. LRRK2 phosphorylates Rab8 foruten Rab1015, og vi har aktivert stede protokollen for Rab8A samt (data ikke vist). Nåværende protokollen kan potensielt brukes å undersøke fosforylering av eventuelle proteiner, selv om det kan være tekniske problemer hvis protein er stort (> 100 kDa) eller Multipliser fosforylert. Fordi Rab10 er et lite protein (25 kDa) og enkeltvis fosforylert på Thr73 av LRRK2, er resultatet av P-tag SDS-side enkelt der bare ett skiftet band er observert.

    I nær fremtid, vil det være viktig å etablere metoden for å oppdage kvantitativt kinase aktiviteten til LRRK2 i pasient-avledede prøver på en høy gjennomstrømming måte å vurdere endring av kinase aktiviteten til LRRK2 i PD pasienter så vel som å vurdere effekten av legemidler på LRRK2 i kliniske forsøk. Siden menneskelige perifert blod mononukleære celler (PBMCs) express relativt høye nivåer av endogen LRRK223, PBMCs eller videre isolert blod celler vil være verdt testing av endogene Rab10 fosforylering. Metoden finnes vil ikke bare være nyttig i undersøker den grunnleggende biologien av LRRK2 signalveien, men også hjelpe i å få en grunnleggende proof-of-concept avgjør hvilke prøven i pasient-avledede prøver er å bli analysert i slike store studier.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Vi takker Dr. Takeshi Iwatsubo (Universitetet i Tokyo, Japan) for vennlig å gi plasmider koding 3xFLAG-LRRK2 WT og mutanter. Vi takker også Dr. Dario Alessi (University Dundee, UK) for vennlig å gi MLi-2 og plasmider koding HA-Rab10. Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) KAKENHI Grant nummer JP17K08265 (G.I.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) homemade 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving
    Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-34
    Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water Wako 196-02835
    Potassium chloride Wako 163-03545
    Potassium Dihydrogen Phosphate Wako 169-04245
    2.5% Trypsin (10X) Sigma-Aldrich T4549 Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution
    Dulbecco's modified Eagle medium
    (DMEM)    		 Wako 044-29765
    Fetal bovine serum BioWest S1560 Heat-inactivated at 56 °C for 30 min
    Penicillin-Streptomycin (100X) Wako 168-23191
    HEPES Wako 342-01375
    Sodium hydroxide Wako 198-13765
    Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) PolySciences, Inc. 24765-1 Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH
    Dimethyl sulfoxide Wako 045-28335
    Tris STAR RSP-THA500G
    Hydrochloric acid Wako 080-01066
    Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether Wako 160-24751 Equivalent to Triton X-100
    Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) Wako 346-01312
    Sodium orthovanadate(V) Wako 198-09752
    Sodium fluoride Kanto Chemical 37174-20
    β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate Nacalai Tesque 17103-82
    Sodium pyrophosphate decahydrate Kokusan Chemical 2113899
    Microcystin-LR Wako 136-12241
    Sucrose Wako 196-00015
    Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis
    Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
    Sodium dodecyl sulfate Nacalai Tesque 31607-65
    Glycerol Wako 075-00616
    Bromophenol blue Wako 021-02911
    β-mercaptoethanol Kanto Chemical 25099-00
    Ethanol Wako 056-06967
    Methanol Wako 136-01837
    Phosphate-binding tag acrylamide Wako AAL-107 P-tag acrylamide
    40% (w/v) acrylamide solution Nacalai Tesque 06119-45 Acrylamide:Bis = 29:1
    Tetramethylethylenediamine (TEMED) Nacalai Tesque 33401-72
    Ammonium persulfate (APS) Wako 016-08021 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water
    2-propanol Wako 166-04831
    Manganese chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M3634
    Precision Plus Protein Prestained Standard Bio-Rad 1610374, 1610373, 1610377 Molecular weight marker used in the protocol
    WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III Wako 230-02461
    Glycine Nacalai Tesque 17109-64
    Amersham Protran NC 0.45 GE Healthcare 10600007 Nitrocellulose membrane
    Durapore Membrane Filter EMD Millipore GVHP00010 PVDF membrane
    Filter Papers No.1 Advantec 00013600
    Ponceau S Nacalai Tesque 28322-72
    Acetic acid Wako 017-00251
    Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 polyoxyethylenesorbitan monolaurate
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Wako 345-01865
    Skim milk powder Difco Laboratories 232100
    Immunostar Wako 291-55203 ECL solution (Normal sensitivity)
    Immunostar LD Wako 290-69904 ECL solution (High sensitivity)
    CBB staining solution homemade 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water
    CBB R-250 Wako 031-17922
    CBB destaining solution homemade 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water
    Name Company Catalog Number Comments
    Antibodies
    anti-HA antibody Sigma-Aldrich 11583816001 Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting.
    anti-Rab10 antibody Cell Signaling Technology #8127 Used at 1:1000 for immunoblotting.
    Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.
    anti-pSer935 antibody Abcam ab133450 Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
    anti-LRRK2 antibody Abcam ab133518 Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
    anti-α-tubulin antibody Sigma-Aldrich T9026 Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
    anti-GAPDH antibody Santa-Cruz sc-32233 Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting.
    Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 515-035-003 Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
    Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-035-003 Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
    Name Company Catalog Number Comments
    Inhibitors
    GSK2578215A MedChem Express HY-13237 Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
    MLi-2 Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
    Name Company Catalog Number Comments
    Plasmids
    Rab10/pcDNA5 FRT TO HA Provided by Dr Dario Alessi
    (University of Dundee)    		 This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.
    LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.
    LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.
    LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipments
    CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacketed
    Auto Pipette Drummond Pipet-Aid PA-400
    Micropipette P10 Nichiryo 00-NPX2-10 0.5–10 μL
    Micropipette P200 Nichiryo 00-NPX2-200 20–200 μL
    Micropipette P1000 Nichiryo 00-NPX2-1000 100–1000 μL
    Tips for micropipette P10 STAR RST-481LCRST Sterile
    Tips for micropipette P200 FUKAEKASEI 1201-705YS Sterile
    Tips for micropipette P1000 STAR RST-4810BRST Sterile
    5 mL disporsable pipette Greiner 606180 Sterile
    10 mL disporsable pipette Greiner 607180 Sterile
    25 mL disporsable pipette Falcon 357535 Sterile
    Hematocytometer Sunlead Glass A126 Improved Neubeuer
    Microscope Olympus CKX53
    10 cm dishes Falcon 353003 For tissue culture
    6-well plates AGC Techno Glass 3810-006 For tissue culture
    Vortex mixer Scientific Industries Vortex-Genie 2
    Cell scrapers Sumitomo Bakelite MS-93100
    1.5 mL tubes STAR RSV-MTT1.5
    15 mL tubes AGC Techno Glass 2323-015
    50 mL tubes AGC Techno Glass 2343-050
    Centrifuges TOMY MX-307
    96-well plates Greiner 655061 Not for tissue culture
    Plate reader Molecular Devices SpectraMax M2e
    SDS–PAGE tanks Nihon Eido NA-1010
    Transfer tanks Nihon Eido NA-1510B
    Gel plates (notched) Nihon Eido NA-1000-1
    Gel plates (plain) Nihon Eido NA-1000-2
    Silicon spacers Nihon Eido NA-1000-16
    17-well combs Nihon Eido Custom made
    Binder clips Nihon Eido NA-1000-15
    5 mL syringe Terumo SS-05SZ
    21G Terumo NN-2138R
    Power Station 1000 VC ATTO AE-8450 Power supply for SDS–PAGE and transfer
    Large weighing boats Ina Optika AS-DL
    Plastic containers AS ONE PS CASE No.4 10 x 80 x 50 mm
    Rocking shaker Titech NR-10
    Styrene foam box generic The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).
    ImageQuant LAS-4000 GE Healthcare An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
    2. Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
    3. Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
    4. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
    5. Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
    6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
    7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
    8. Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
    9. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
    10. Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
    11. Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
    12. Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
    13. West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
    14. Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
    15. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
    16. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
    17. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
    18. Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
    19. Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
    20. Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
    21. Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
    22. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
    23. Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).

    Tags

    Biokjemi problemet 130 Parkinsons sykdom leucine-rik gjenta kinase 2 Rab10 fosforylering Phos-tag SDS-side immunoblotting
    Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ito, G., Tomita, T. Rab10… More

    Ito, G., Tomita, T. Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag. J. Vis. Exp. (130), e56688, doi:10.3791/56688 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter