Summary
المخدرات تستند إلى جسم قد أحدثت ثورة في علاج أمراض التهابات. بالإضافة إلى وجود تأثيرات مباشرة على أهداف محددة، يمكن تنشيط الأجسام المضادة الضامة لتصبح للالتهابات. هذا البروتوكول يصف بلعم الالتهابات كيف يمكن تفعيل المقررة في المختبر، باستخدام الماوس نخاع العظم الضامة، و الحية، استخدام الضامة البريتوني.
Abstract
الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية متجولة، الشروع في الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض، ويسهم في رد الشفاء والأنسجة. الضامة نفس القدر من الأهمية في إيقاف تشغيل الاستجابات التحريضية. وقد أظهرنا أن الضامة حفزت مع الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg) يمكن أن تنتج كميات كبيرة من سيتوكين المضادة للالتهابات، انترلوكين 10 (إيل-10)، وانخفاض مستويات السيتوكينات الموالية التحريضية ردا على lipopolysaccharides البكتيرية ( لبس). IVIg هو جسم الشاملين، المقام الأول Gs (IgGs)، الغلوبولين المناعي المجمعة من البلازما من 1,000 أكثر من المتبرعين بالدم. يتم استخدامه لتكملة الأجسام المضادة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة أو لقمع الاستجابات المناعية في المرضى الذين يعانون من الشروط الذاتية أو تحريضية. كما تبين Infliximab، جسم ألفا (TNFα) عوامل علاجية المضادة لورم نخر، لتفعيل الضامة لإنتاج إيل-10 في الاستجابة للمحفزات التحريضية. ويمكن اختبار IVIg والبيولوجي الأخرى المستندة إلى جسم لتحديد آثارها على تفعيل بلعم. وتصف هذه الورقة أساليب الاشتقاق والتحفيز والتقييم مورين نخاع العظم الضامة تفعيلها من خلال الأجسام المضادة في المختبر والضامة البريتوني مورين المنشط مع الأجسام المضادة في الجسم الحي. وأخيراً، نحن شرح استخدام النشاف الغربية لتحديد مساهمة خلية معينة إشارات الطرق المؤدية إلى نشاط بلعم المضادة للالتهابات. يمكن استخدام هذه البروتوكولات مع الفئران المعدلة وراثيا، لتحديد أثر protein(s) محددة على تفعيل بلعم المضادة للالتهابات. يمكن أيضا استخدام هذه التقنيات لتقييم ما إذا كان البيولوجي محددة قد تتصرف عن طريق تغيير الضامة إلى حالة تنشيط للالتهابات إيل-10-إنتاج يقلل من الاستجابات التحريضية فيفو. هذا تقديم معلومات عن دور التنشيط بلعم بفعالية من البيولوجي خلال نماذج المرض في الفئران، وتوفير نظرة ثاقبة إليه جديدة محتملة للعمل في الناس. على العكس من ذلك، هذا قد نحذر من استخدام البيولوجي القائم على جسم معين لعلاج الأمراض المعدية، ولا سيما إذا الضامة دوراً هاما في الدفاع المضيف ضد الإصابة بهذا.
Introduction
الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية، التي تلعب أدواراً متعددة في الاستجابة المناعية للعدوى أو الإصابة. الضامة المسؤولة عن بدء استجابة مناعية لأضرار الإصابة أو الأنسجة ووقف الاستجابة الالتهابية، وتعزيز استجابة الشفاء1. من الدول التنشيط أفضل درس بلعم ثلاثة أمثلة: 1) الضامة تعامل مع الانترفيرون غاما (IFNγ) والبكتيرية lipopolysaccharide (LPS)، عينت M (IFNγ + لبس)، التي تساهم في الاستجابة الالتهابية؛ 2) الضامة حفزت مع انترلوكين 4 (إيل-4)، M(IL-4)، التي ترتبط برد الشفاء؛ 3) الضامة حفزت مع مجمعات محصنة (IC) ولبس، م (IC + لبس)، التي لها القدرة على إيقاف الاستجابة الالتهابية2،3. M (IC + لبس) مميزة من الجرح M(IL-4) شفاء الضامة، ولا تعبر عن إنزيم أرجيناسي (الأرجنتين-1) أو FIZZ14. هو علامة أفضل لهذه الضامة للالتهابات على إنتاج سيتوكين5. الضامة أدواراً متعددة في الحفاظ على الصحة، ولكن أيضا المساهمة في أمراض التهابات وسرطان3. وبسبب هذا، يتم الضامة هدفا علاجية رئيسية لمعالجة مجموعة متنوعة من الأمراض. من المهم أن التحقيق آثار الأجسام المضادة على دولته التنشيط لتطوير العلاجات المستندة إلى بلعم للمرض.
هذه الورقة ينصب على استخدام نخاع العظام مورين المستمدة الضامة (بمدمس) والضامة البريتوني لاختبار تأثير المخدرات جسم على الاستجابات الالتهابية في المختبر و في فيفو. في الآونة الأخيرة، كانت هناك عدة دراسات تبين آثار الأجسام المضادة في بلعم التنشيط6،،من78. الضامة تفعيلها يشترك مع مجمعات محصنة، وهي الأجسام المضادة الرصاصية مع مستضد، ولبس، حافزا عادة تحريضية، تنتج مستويات عالية جداً سيتوكين المضادة للالتهابات، وايل-10، ومستويات منخفضة جداً من سيتوكين برو التحريضية، انترلوكين 12 (إيل-12)9. وباﻹضافة إلى ذلك، infliximab، جسم [مونوكلونل] ضد TNFα، وقد تبين أن العمل، في جزء منه، عن طريق حفز الضامة للالتهابات عن طريق جزء للتبلر (Fc) المنطقة7. وقد أبلغنا أن IVIg + لبس الحث على تفعيل بلعم المضادة للالتهابات مشابه إلى M (IC + لبس)، حيث شارك حفز الضامة تنتج كميات كبيرة من إيل-10، وكميات قليلة من وحدة فرعية سيتوكين برو التحريضية انترلوكين 12 أو (23 p40 IL-12/23p40)، انترلوكين-6 (إيل-6)، وتنف8. هو IVIg مخدرات تتألف من [بولكلونل] أجسام، أساسا مفتش، وقد تم تجميعها من الدم من المانحين 1,000 أكثر من10. فهو يستخدم لعلاج طائفة واسعة من الأمراض المناعية، مثل برفرية الصفيحات مجهول السبب واعتلال دملينتينغ المزمن، ولكن إليه العمل ليست مفهومة تماما11. ويمكن تقييم آثار المخدرات جسم يقوم على تفعيل بلعم باستخدام الأساليب الموضحة هنا.
ويمكن اختبار آثار البيولوجيات محددة على تفعيل بلعم في بمدمس والضامة البريتوني. ويسمح استخدام هذه المصادر بلعم تقييم الخلايا الأولية. الاختبارات الأولية للأجسام المضادة على استزراع الخلايا الأولية يتطلب أقل وقت واستثمار النقد من نماذج أخرى المرض تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. عن طريق حقن مخدرات في ماوس صحية في الجسم الحي، وعزل الخلايا وتحليلها السابقين فيفو، واحد تحديد إذا كان هناك ما يبرر دراسات لتقييم ما إذا كان العلاج مع البيولوجي يؤثر على تنشيط بلعم في نماذج المرض.
مع قليل من الدراسات اختبار أثر العلاجات البيولوجية على بلعم التنشيط في المختبر و في فيفو مباشرة، توفير تقنيات لدينا ميزة على تقنيات بديلة. التقنيات الحالية تنطوي على آثار المخدرات بيولوجي التجارب على الخلايا المختلطة السكان في المختبر، مثل تأثير infliximab في رد فعل اللمفاويات مختلطة (شيخوا) أو IVIg في الضامة البشرية في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى، حيث الأثر لا يمكن أن يعزى إلى7،12نوع خلية محددة. استخدام بمدمس والضامة البريتوني مفيد عبر استخدام خطوط الخلايا، مثل خلايا RAW264.7، التي لا تنتج سيتوكين برو التحريضية، إيل-12، استجابة للبس8،13. اختبار تأثير المخدرات جسم على بلعم الردود السابقين فيفو ومزايا لأن الردود سيتوكين يمكن أن تعزى مباشرة إلى الضامة، بدلاً من استنتاج ردود بلعم بقياس مستويات المصل سيتوكين14 . يمكن مشتقة بمدمس والضامة البريتوني ومعزولة من الفئران المعدلة وراثيا لتحديد الدور المحدد للبروتين في تفعيل بلعم المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، قد استخدمنا Il10 نقص(-/-) بمدمس لإثبات تعتمد جزئيا على إيل-108المستحثة IVIg الحد من إنتاج سيتوكين برو التحريضية. إليه المخدرات من العمل يمكن أن يحقق استخدام النشاف الغربية، حيث يمكن تحديد دور بروتينات محددة وأحداث إشارات. يمكن تنفيذ الكمية البلمرة المتسلسل (قبكر) على بمدمس أو الضامة البريتوني لإظهار أنماط تعبير الجينات التي تنتج عن تنشيط الأجسام المضادة. نماذج المرض في الفئران يمكن أن تقدم معلومات عن فعالية العلاجات البيولوجية القائمة على جسم في النماذج المحتملة لأمراض مثل التهاب الأمعاء المرض والتهاب المفاصل والسرطان15،16، 17-بيد ستوفر التقنيات الموضحة هنا معلومات عن إليه عمل هذه البيولوجيات قبل تحديد سواء كانوا حمل بلعم مضادة للالتهابات النشاط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كولومبيا البريطانية.
1-نخاع العظام بلعم الاشتقاق والتنشيط مع الأجسام المضادة
- تنفيذ القتل الرحيم استخدام الخنق2 CO.
- مكان الماوس في الدائرة التعريفي. Euthanize الماوس مع التخدير إيسوفلوراني 5%، عن 60-90 ثانية، حتى تصبح قادرة على الحركة والتنفس العميق والبطيء.
- إيقاف التخدير isoflurane وإدارة 6-8 لتر في الدقيقة من CO2 حتى الماوس توقف عن التنفس. ترك الماوس مع CO2 في لدقيقة أخرى على الأقل 5 التحقق من أنه لم يعد هناك نبض القلب أو التنفس. أداء اضطراب عنق الرحم التأكد من الوفاة.
ملاحظة: 8-12 أسابيع الفئران القديمة توفر أعلى عائد الضامة.
- رش أرجل الماوس مع الإيثانول 70%، ويعلقون عليها مع الذراعين والساقين ملقاة في موقف ضعيف على متن رغوة. مع المقص والملقط عقد الجلد، جعل قطع ضحلة (0.2 سم) لإزالة الجلد والفراء من على سطح الأرض لكل من الخلفيتين.
ملاحظة: تنفيذ هذا الإجراء وكل ثقافة الأنسجة التلاعب في غطاء عقيمة. - تقليم العضلات لجعل تيبياس وقصبة مرئية. إزالة تيبياس وقصبة، بقطع العظام والعضلات أسفل الورك وفوق الكاحل. تقليم قدر العضلات قدر الإمكان.
- رش العظام مع الإيثانول 70% وانتظر 1 دقيقة لكي تتبخر، ثم وضعها في طبق جيدا 6 من العظام المتوسطة دافق (Iscove لتعديل المتوسط في دولبيكو (إيمدم)، 10% مصل بقرى الجنين (FBS)).
- تقليم نهايات العظام عن طريق خفض 0.1 سم عظم الكاحل ورأس عظم الفخذ حيث أن يتعرض لها تجويف العظام. ضمان أن مرئياً النخاع ويمكن وضع قياس 26 إبرة في تجويف العظام.
- قطع العظام والعضلات لفصل تيبياس وقصبة من مفاصل الركبة. أدخل إبرة قياس 26 يعلق على حقنه 10 مل في التجويف. مسح نخاع العظام في أنبوب 50 مل مخروطية مع 5 مل العظام تدفق المتوسط. مسح تيبياس اثنين وقصبة اثنين من الماوس واحدة، في كل أنبوب 50 مل.
- "الماصة؛" صعودا وهبوطاً عدة مرات أو دوامة نخاع بسرعة بطيئة لتفريق لطف كتل. ينبغي تقسيم سلاسل من النخاع إلى البقع الصغيرة (أقل من 0.5 مم) من نخاع. ملء الأنبوب المخروطية إلى 50 مل مع عظم تدفق المتوسط. ماصة محتويات الأنبوبة المخروطية في ثقافة أنسجة2 75 سم تعامل قارورة، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 1.
ملاحظة: تصبح ناضجة الضامة، والخلايا الوسيطة ملتصقة قارورة والتخلص منها، بينما تبقى موروث المكونة للدم المطلوب في تعليق. - "الماصة؛" المتوسطة مع فروعه المكونة للدم في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي الأنبوب في ز 300 x في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 5 مل مستعمرة بلعم حفز عامل (مكسف) الثقافة المتوسطة (إيمدم، 10% FBS و 5 نانوغرام/مل مكسف البنسلين/ستربتوميسين U/mL 100 150 ميكرومتر مونوثيوجليسيرول (قهوة)).
- حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير18. إضافة المتوسطة ريسوسبيند الخلايا بتركيز 0.5 × 106 خلايا/مل، 1.5 × 107 خلايا/قارورة في 30 مل متوسطة، و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بلطف. "الماصة؛" 30 مل التعليق إلى 75 سم2 زراعة الأنسجة تعامل قارورة جديدة.
- في يوم 4 ويوم 7 بعد الثقافة الأولية في الخطوة 1، 9، تحقق من الخلايا ملتصقة وتشعبت قليلاً استخدام مجهر حقل مشرق تباين مرحلة مقلوب. تجاهل المتوسطة التي تحتوي على الخلايا غير ملتصقة. تغسل الخلايا مع إيمدم مرة واحدة وإضافة 30 مل من مكسف الثقافة المتوسطة.
- عندما تكون الخلايا الناضجة قبل يوم 10 (> 95% إيجابية ل F4/80 وماك-1)، تحقق مرة أخرى من الخلايا ملتصقة وقليلاً.
- لوحة خلايا للتحفيز وإزالة المتوسطة الثقافة من قارورة وإضافة 8 مل من إنزيم الخلية الحرة، على أساس يدتا الانفصال من المخزن المؤقت (جدول المواد). احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- تتخلص خلايا بلطف، مع كمية صغيرة من الضغط باستخدام مكشطة خلية عقيم. تحقق في المجهر الذي فصل الخلايا من سطح قارورة. خلايا ماصة فصلها في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. شطف قارورة 3 مرات مع 5 مل إيمدم وتجمع الحل شطف مع الخلايا التي تم حصادها. الطرد المركزي خلايا في 300 غرام x في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من مكسف المتوسطة الثقافة الواحدة 50 مل الأنبوبة المخروطية. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير18. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا/مل ولوحة ميكروليتر 100 تعليق خلية (1 × 105 خلايا/جيد) كل من ثقافة الأنسجة 96-جيدا معاملة، لوحة مسطحة القاع جيدا.
ملاحظة: العظام من الماوس واحد سوف تولد خلايا كافية للآبار 100. إذا رغبت في ذلك، يمكن مطلي 1 مل خلايا في صفيحة 6-جيدا (زراعة الأنسجة المعالجة، شقة السفلي). عدد أكبر من الخلايا (1 × 106 خلايا) قد تكون مفيدة لتحليل لطخة غربية. - مرة واحدة ملتصقة، حفز مكررة أو الآبار ثلاث نسخ كل منها 10 نانوغرام/مل من لبس في إيمدم، 30 ملغ/مل من IVIg، أو IVIg + لبس. يمكن أن يكون تيتراتيد جرعات من لبس أو IVIg تحسين الاستجابات. ترك الآبار مكررة أو ثلاث كعناصر تحكم أونستيمولاتيد. احتضان لهم ح 24 (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
ملاحظة: ينبغي أن تتقيد الخلايا مطلي إعادة زراعة الأنسجة الآبار ضمن ح 1. - جمع supernatants خلية من كل بئر في أنابيب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 الفردية وإزالة أي جسيمات بالغزل في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخلية طافية وتجنب الإخلال بيليه. مكان الخلية أوضح طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة.
ملاحظة: سوبيرناتانتس خلية يمكن جزيئي السيتوكينات، وايل-10، وفرعية سيتوكين، إيل-40 ف 12/23، بمقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) فورا، أو تخزينها في الأجل الطويل-80 درجة مئوية. اتبع أليسا البروتوكول من أدوات متوفرة تجارياً (جدول المواد). السيتوكينات الموالية التحريضية الأخرى يمكن أن تكون جزيئي، مثل إيل-6 وتنف، كما أنها تخفض أيضا بمعاملة المشارك مع IVIg + لبس التحفيز بالمقارنة مع التحفيز مع لبس وحدها. بعد التحفيز، ويمكن إعداد الخلايا ملتصقة لتقنيات مثل النشاف الغربية أو الكمية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (س-PCR) 19،20.
2-الطعن في الفئران في فيفو IVIg وحصاد الضامة البريتوني
- تزن كل الماوس.
ملاحظة: على سبيل المثال، ماوس ز 20، 500 ميليلتر من IVIg مطلوب.
ملاحظة: تنفيذ الإجراء في غطاء عقيمة.
ملاحظة: وضع الإبرة بعناية في الماوس حتى أن كنت لا حقن برنامج تلفزيوني في الأجهزة، ولكن بدلاً من ذلك، في الفضاء البريتوني.
ملاحظة: لكل 5 مل من السوائل التي تحقن، سيتم استرداد حوالي 3.75 مل.
ملاحظة: بعد حقن النهائي، قد يكون أسهل لاستخراج السوائل من الجانبين الأيمن والأيسر الآن من الماوس، حيث تراكمت السوائل. الأجهزة التي سوف يسبب تداخل أقل مع الإبرة في هذا الموضع.
ملاحظة: سيكون أكبر قليلاً من الخلايا الأخرى البريتوني الضامة. عائد نموذجي هو 5 × 105 -1 × 106 الضامة/الماوس استخدام ماوس البرية نوع C57BL/6.
اختياري: إذا كان عدد كبير من خلايا الدم الحمراء موجودة في الخلية بيليه، إجراء خطوة تحلل لإزالتها، باستخدام المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء 1 x وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: قد يكون من الضروري لتجمع ثلاث خلايا من الماوس واحد أو أكثر لتجربة إذا كان استخدام الآبار أو المنشطات المعايرة. على سبيل المثال، إذا كان الماوس واحدة 5 × 105 الضامة، سيلزم 500 ميكروليتر من المتوسطة والطلاء. يكون هناك ما يكفي من خلايا للآبار 5، أو 1 تجربة مكررة، مع جرعة واحدة من لبس.
ملاحظة: بعد تنشيط، يمكن إعداد الخلايا ملتصقة لتقنيات مثل لطخة غربية أو PCR.
3-الطعن في الفئران في فيفو مع IVIg + لبس وحصاد الضامة البريتوني
- تزن كل الماوس. حساب حجم IVIg (100 مغ/مل تركيز المخزون) اللازمة لتوفير جرعة نهائية من 2.5 غ/كغ من وزن الجسم. حساب مقدار لبس (تركيز 100 ميكروغرام/مل الأسهم في إيمدم) اللازمة لتوفير جرعة نهائي 0.2 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم.
ملاحظة: على سبيل المثال، ماوس ز 20، 500 ميليلتر من حل الأسهم IVIg و 40 ميكروليتر من حل 100 ميكروغرام/مل من لبس مطلوب. - رسم المبلغ المطلوب من IVIg ولبس في محقن معقم 1 مل مزودة 26 عقيمة قياس الإبرة. لمكافحة الفئران التي لن تتلقى IVIg، يستبدل بما يعادل حجم IVIg العقيمة PBS الأس الهيدروجيني 7.4.
- القفا الماوس مع جهة بالاستيلاء على الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة بالإبهام والسبابة وعقد ذيل والخلفيتين بأصابعك المتبقية. الميل الجسم نحو الأرض.
- مكان الإبرة بزاوية 30-40 درجة مئوية بالنسبة للبطن الماوس، في الربع العلوي الأيمن، مجسم مشطوف الحواف، وإدراج 1.5 سم. إدخال IVIg لبس، أو برنامج تلفزيوني + + لبس، إينترابيريتونيلي كما في الخطوة 2، 4.
- بعد ح 1، حصاد الضامة البريتوني قبل تنفيذ الخطوات 2.5 2.10.
- تدور الخلايا لأسفل في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة 1 مل سائل الغسل المستردة واستخدام لايل-10 وتحليلات إيل-12/23 ف 40 من أليسا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة أو تجميد في-80 درجة مئوية للتحليلات المقبلة.
ملاحظة: لضمان مقارنة دقيقة بين العلاجات لتحليل السائل سيتوكين الغسل، أداء فلوشس 5 مل تجويف البريتوني 4 مرات لوحدة تخزين نهائي من 15 مل. وسيتم استرداد السوائل ليست كلها من كل دافق. - كما هو الحال في الخطوة 2.11، ريسوسبيند والعد الضامة قابلة للحياة.
ملاحظة: سيكون أكبر قليلاً من الخلايا الأخرى البريتوني الضامة.
اختياري: إذا كان عدد كبير من خلايا الدم الحمراء موجودة في الخلية بيليه، إجراء خطوة تحلل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لإزالتها، كما هو الحال في الخطوة 2.11.
ملاحظة: قد يكون من اللازم إلى تجمع الخلايا من الماوس واحد أو أكثر لتجربة. على سبيل المثال، إذا كان الماوس واحدة 5 × 105 الضامة، سيلزم 500 ميكروليتر من المتوسطة والطلاء.
ملاحظة: عينات قد يكون استخدامها فورا أو المجمدة والمخزنة في-80 درجة مئوية لتحليل سيتوكين من أليسا.
ملاحظة: يمكن إعداد الخلايا لتقنيات مثل لطخة غربية أو بكر، كما هو الحال في الخطوات 1.16-1.17 و 2.14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن مثقف الضامة المستمدة نخاع العظام مورين من سلائف الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم تبين. تبين نخاع العظام المجمعة من قصبة و tibias واحدة بالماوس C57BL/6 عادة ما تسفر عن7 10 نخاع العظام المستمدة الضامة، يجعلها مصدرا مناسب من الضامة للتجارب. يمكن استخدام بمدمس لاختبار الأجسام المضادة على أساس الردود المخدرات عندما تحدت مع حافز تحريضية في المختبر. ويبين الشكل 1 أن IVIg العلامة التجارية، جامونيكس (GX)، + لبس يزيد من إنتاج سيتوكين المضادة للالتهابات، إيل-10، 7-fold مقارنة بلبس التحفيز وحدها (الشكل 1أ) وانخفاض الإنتاج من إيل-12/23 40 ف (الرقم 1 ب). كما يوضح الشكل 1 أن يختلف أداء مختلف IVIg الاستعدادات. على الرغم من الاستعدادات المختلفة الثلاثة من IVIg قادرة على تقليل إيل-12/23 ف 40 إلى حد كبير (الشكل 1ب)، أوكتاجام (OG) وجاماجارد السائل (GL)، لا تزيد إلى حد كبير إنتاج إيل-10 ردا على لبس (الشكل 1 A)-الجريدة الرسمية و GL قادرون على إنتاج إيل-12/23 ف 40 في الاستجابة للبس، ولكن إلى درجة أقل مما GX تقلل إلى حد كبير. وتبين هذه النتائج أن نخاع العظم يؤثر على جسم المستمدة التنشيط بلعم، وأن هناك اختلافات بين الأعمال التحضيرية المخدرات نفسها التي يمكن أن تتسبب في تغييرات في الردود.
يمكن استخدام بمدمس لاختبار آثار IVIg، آليا بواسطة النشاف الغربية. وقد زادت الضامة تفعيلها مع IC + لبس الفسفرة مؤنزم mitogen تنشيط البروتين (خريطة)، p38 و Erk1/2، التي تعتبر مسؤولة عن زيادة إنتاج إيل-1021. وتظهر النتائج في الشكل 2 وصمة عار غربية نموذجية للكشف عن خريطة كيناز التنشيط المطلوبة لإنتاج إيل-10 التي الضامة التي هي أونستيمولاتيد، أو قد حفزت مع لبس، IVIg، أو IVIg + لبس. IVIg التحفيز وحدها أو IVIg + لبس تحفيز المشاركين زيادة تفعيل مؤنزم خريطة، Erk1/2، مع الفسفرة السابقة ولمدة طويلة بالمقارنة بالنظر مع لبس وحدها. تنشيط p38 وقع في وقت سابق من الضامة حفز IVIg + لبس مقارنة بتلك التي حفزت مع لبس وحدها. وتظهر هذه النتائج أنه يمكن استخدام أساليب مثل النشاف الغربية، لإظهار الخلايا مما يشير إلى آثار المخدرات جسم على بمدمس. بالإضافة إلى إنتاج سيتوكين، يمكن استخدام خريطة كيناز التنشيط لإظهار حدوث التنشيط بلعم المضادة للالتهابات.
ناضجة، الأنسجة الضامة المقيم يمكن أيضا أن تكون معزولة من الفئران لتقييم الاستجابات إلى IVIg 5.0 × 105 -1.0 × 106 الضامة البريتوني يمكن أن تكون معزولة عن ماوس C57BL/6 صحية واحدة. في الشكل 3، الضامة البريتوني من الفئران حقن IVIg لا تزيد إلى حد كبير إنتاج إيل-10 وفي غياب من التحفيز في المختبر، بالمقارنة مع برنامج تلفزيوني حقن الفئران. عندما الضامة البريتوني من IVIg حقن الفئران حفزت مع لبس السابقين فيفو، فإنها تنتج 6-fold إيل-10 أكثر من الفئران حقن مع برنامج تلفزيوني. لا، ومع ذلك، تنتج كميات قابلة للكشف لايل-12/23 ف 40 عندما حفزت مع لبس السابقين فيفو. وتبين هذه النتائج أن آثار جسم يمكن اختبارها على الضامة بالحقن المخدرات في فيفو واستزراع الخلايا فيفو السابقين مع هذا الأسلوب.
ويمكن بلعم استجابات الأجسام المضادة والمحفزات التحريضية المقررة في فيفو. إنتاج سيتوكين يمكن تقييمها في سائل الغسل، وفي سوبيرناتانتس من السابقين فيفو وحفز الضامة البريتوني. ويبين الشكل 4 سيتوكين المضادة للالتهابات إيل-10 هو زيادة في سائل الغسل (الشكل 4أ)، والخلايا البريتوني (الشكل 4ب)، والضامة البريتوني (الشكل 4ج) عند الفئران وتحدي مع IVIg + لبس مقارنة ببرنامج تلفزيوني + لبس. إنتاج سيتوكين برو التحريضية فرعية، إيل-40 ف 12/23، انخفض انخفاضا كبيرا في الضامة البريتوني مثقف، ولكن ليس في سائل الغسل. يسمح هذا الأسلوب بدراسة تأثير دواء جسم مضاد على الاستجابات الالتهابية في الجسم الحي ، وكذلك السابقين فيفو.
الشكل 1 : الإنتاج استجابة لتحفيز التعاون مع مختلف الماركات IVIg ولبس بلعم إيل-10، وايل-12/23 40 ف. مكسف C57BL/6 نخاع العظام المستمدة الضامة كانت أما أونستيمولاتيد (ج)، أو تحفز بلبس (10 نانوغرام/مل)، IVIg (30 ملغ/مل)، أو IVIg + لبس. تم اختبار ثلاثة أنواع مختلفة من IVIg: جامونيكس (GX) والسائل جاماجارد (GL) أوكتاجام (الجريدة الرسمية). بلعم supernatants جمعها 24 ساعة بعد التحفيز، وتوضيحها بالطرد المركزي. وأجريت اليساس لايل-10 (ألف)، وايل-40 ف 12/23 (ب). البيانات هي الضامة من n = 3 تجارب مستقلة، مع الخلايا من الماوس الفردية 1 كل تجربة، مع اليساس جزيئي في مكررة. تكون البيانات يعني ± التنمية المستدامة. *ف < 0.05، * * ف < 0.001، * * *ف < 0.0001 للمقارنة بين التحفيز لبس و IVIg + لبس التحفيز المشارك. واستخدمت اتجاه تحليل التباين (ANOVA) مع بعد اختبار توكي للمقارنات المتعددة للتحليلات الإحصائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل لطخة غربية لخريطة كيناز التنشيط في تنشيط IVIg الضامة. مكسف مشتقة نخاع العظم الضامة كانت أونستيمولاتيد أو تحفز بلبس (10 نانوغرام/مل)، IVIg GX (30 ملغ/مل)، أو GX IVIg + لبس؛ ليساتيس خلية كله 0 أو 10 أو 40 أو 120 دقيقة (1.0 × 106 الضامة/لين) تعرضوا للصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) والغربية النشاف مع الأجسام المضادة والرمات محددة ل p38 وخارج الخلية ينظم إشارة كيناز (Erk1/2)، فضلا عن جليسيرالديهيدي 3-الفوسفات نازعة (جابده)، كعنصر تحكم تحميل. أظهرت النتائج ممثل n = 3 تجارب مستقلة، مع الخلايا من الماوس الفردية 1 كل تجربة.قياس كثافة pp38 ومستويات البروتين pErk1/2، تطبيع إلى جابده، بلغ متوسط من 3 التجارب المستقلة موضحة أدناه كل الفرقة. لقد تم تعديل هذا الرقم من كوزيكي وآخرون8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إنتاج إيل-10 التي الضامة من الفئران وتحدي مع IVIg في فيفو. وأعطيت الفئران C57BL/6 عمرها 8 الأسبوع PBS العقيمة (التحكم بالحقن) أو IVIg GX (2.5 g/كغ) إينترابيريتونيلي. بعد ح 1، قد euthanized الفئران وأجريت لافاجيس البريتوني. الضامة البريتوني كانت معزولة باستخدام التحديد الالتزام. الضامة كانت أما أونستيمولاتيد (ج)، أو تحفز بلبس (10 نانوغرام/مل). Supernatants خلية تم حصادها وتوضيح بعد 24 ساعة لايل-10 "الساس". البيانات هي من n = 5 الفئران الفردية كل مجموعة في 3 تجارب مستقلة، مع اليساس جزيئي في مكررة. تكون البيانات يعني ± التنمية المستدامة. * ف < 0.01 و NS = ليس كبيرا. أجريت التحليلات الإحصائية باستخدام ANOVA المزدوج مع posttest في صداق لمقارنات متعددة. لقد تم تعديل هذا الرقم من كوزيكي وآخرون8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : إنتاج إيل-10، وايل-12/23 ف 40 من الفئران وتحدي مع IVIg + لبس في فيفو. تم حقن الفئران C57BL/6 عمرها 8 الأسبوع إينترابيريتونيلي مع برنامج تلفزيوني + لبس (وزن الجسم 0.2 ميكروغرام/لتر)، أما كعنصر تحكم; أو IVIg GX (2.5 غ/كغ من وزن الجسم) + لبس (وزن الجسم 0.2 ميكروغرام/لتر). بعد ح 1، قد euthanized الفئران وأجريت لافاجيس البريتوني. (أ) سائل الغسل Clarified، (ب) توضيح supernatants مكيفة من الخلايا البريتوني أثناء خطوة انضمام بلعم ح 1، وأوضح (ج) ح 24 supernatants بلعم البريتوني (مφ) كانت جزيئي ل إيل-10، وايل-12/23 ف 40 من أليسا. البيانات هي وسائل ± SD ل n = 5 الفئران في التجارب المستقلة 3، مع الساس جزيئي في مكررة. ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001، و NS = ليس كبيرا. وقورنت الفئران حقن مع برنامج تلفزيوني + لبس للفئران حقن IVIg + لبس استخدام الاختبار t للطالب. لقد تم تعديل هذا الرقم من كوزيكي وآخرون8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بلعم التنشيط الدول دوراً هاما في كل الأنسجة التوازن والمرض22. يمكن أن يكون الضامة متميزة فضلا عن تداخل الولايات التنشيط، اعتماداً على الإشارات في بهم المكروية3. لديهم أدوار متميزة في جميع مراحل الاستجابة الالتهابية: الدفاع ضد العوامل الممرضة، والجرح برد الشفاء والأنسجة، ولها أيضا حالة تنشيط للالتهابات متميزة مهم لإيقاف الاستجابة الالتهابية2 . يتطلب التنشيط بلعم الالتهابات المنبهات الخارجية اثنين الضامة لإنتاج كميات عالية سيتوكين المضادة للالتهابات، وايل-10، وكميات قليلة من السيتوكينات الموالية التحريضية، مثل إيل-1223. تأتي إشارة واحدة من الأجسام المضادة التي تعمل من خلال مستقبلات Fc غاما، والإشارة الثانية حافز برو تحريضية، مثل لبس أو IFNγ24،25. المصل، ومجمعات محصنة والأجسام المضادة-TNFα، وقد تم العثور على جميع حمل دولة تنشيط الالتهابات إيل-10-برودوينج عالية في الضامة8،23،،من2526. سابقا قد نشرت مجموعتنا أن نخاع العظام مورين المستمدة الضامة والضامة البريتوني حفزت مع IVIg أيضا إنتاج كميات عالية من إيل-10 والقليل إلى لا برو التحريضية إيل-12/23 ف 40 ردا على لبس8. وقد وجدنا أيضا أن أخرى السيتوكينات الموالية التحريضية، تنف وايل-6 كما منحها IVIg في نخاع العظام المستمدة الضامة8. يمكن تطبيق الأساليب الموصوفة هنا على اختبار الاستجابات المخدرات جسم القائمة الأخرى في بمدمس الماوس والضامة البريتوني في المختبر و في فيفو.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في الاختبار القائم على جسم المداواة في نخاع العظام الماوس والضامة البريتوني. من المهم الحفاظ على العقم لكل بروتوكول. إذا كان الثقافات بلعم ملوثة بالكائنات الدقيقة من الهواء، والفراء، أو براز الفئران، الضامة سيستجيب لهذه المحفزات من إنتاج السيتوكينات الالتهابية للمحترفين. إجراء جميع التجارب في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء والرش الماوس متحررا مع الإيثانول، وضمان سلامتها للامعاء خلال الإحمرار البريتوني ضرورية. كما يجب أن تبقى في الجسم العقيمة وتخزينها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لا يمكن استخدامه إذا كانت ملوثة أو منتهية الصلاحية، أو عكر. تعكر سيقلل من فعالية الدواء، ويمكن أن يحدث إذا لم يتم تخزين في درجة حرارة مناسبة المخدرات أو تم تخزينها لفترة طويلة جداً. يمكن تخزين في 4 درجات مئوية IVIg وتستخدم فقط قبل أن يتم التوصل إلى تاريخ انتهاء الصلاحية، حيث يمكن أن تتأثر مستويات إنتاج إيل-10. وبدلاً من ذلك، شهدنا أن أنها يمكن أن تجمد في-20 درجة مئوية مع أي تأثير على الردود. الكثير مختلفة من IVIg تؤدي إلى نتائج تجريبية مماثلة، بينما يمكن أن تسبب أنواع مختلفة من التحضيرات IVIg العلامة التجارية، كما هو الحال في الشكل 1، استجابات مختلفة في الضامة. الضوابط الأساسية، مثل أونستيمولاتيد الخلايا، وخلايا حفز مع الأجسام المضادة وحدها، يجب أن تدرج في كل تجربة لاستبعاد تلوث الضامة أو المخدرات.
يمكن أن تكون تعديلات عدة على هذه البروتوكولات لتخصيص تجربة. في الدولة غير ملتهبة، ويمكن أن يكون من الصعب على عزل ما يكفي الضامة البريتوني لتجارب كبيرة. يمكن أثارت الضامة البريتوني عن طريق الحقن داخل من ثيوجليكولاتي (تيراغرام). يحدث استجابة مناعية، وبعد 4 أيام، يمكن الضامة البريتوني انتزع المقطوع27. قد يكون أقل نضجاً الضامة المعينين ولا تمثل الخلايا المقيم، كما أننا استخدمنا هنا، واعتبارات هامة. أيضا قد استوعب الضامة أثارت تيراغرام أجار من مرق تيراغرام، الذي قد يكون مضاعفات، لا سيما إذا كان القيام بتجارب على البلعمه27. يمكن أيضا أن تستخدم لإجراء التجارب على الفئران من مختلف الخلفيات الوراثية، C57BL/6 أو بالب/ج، وقد اختيرت لدراسة تأثير الأجسام المضادة على الردود بلعم التي ستقيم في نماذج الأمراض التي تتطلب خلفية وراثية محددة. وبالإضافة إلى ذلك، الفئران المعدلة وراثيا، مثل Il10--/-- الفئران، قد تستعمل لتقييم وظيفة محددة من البروتينات في إليه العمل للمخدرات، كما فعلنا في منطقتنا العمل8. أيضا يمكن استخدام المحفزات تحريضية مختلفة لتقييم تأثير الأجسام المضادة على تفعيل بلعم. IFNγ، وعدد الوفيات المضيفة المشتقة مثل مستقبلات (TLR) يضع (مثل حمض الهيالورونيك)، قد استخدمت لتنشيط إنتاج إيل-10 الضامة25،28. ثمة اعتبار هام هو جرعة الضد. وينبغي أن تيتراتيد الجرعة للحصول على الجرعة المثالية في الثقافة وفي التجارب على الحيوانات، كما أنها سوف تختلف بين الأجسام المضادة، فضلا عن الموردين. الجرعة المختارة كما ينبغي أن تعكس الجرعة التي تعطي للبشر، وسوف تختلف بين المخدرات. يتم إعطاء IVIg كعلاج المضادة للالتهابات في جرعات عالية (25-35 ملغ/مل أو 2 غ/كغ من وزن الجسم)، مما يعكس معاير الجرعات المستخدمة في هذه البروتوكولات29،30.
عيوب استخدام نخاع العظام والضامة البريتوني. على الرغم من أن تحسنا في خطوط الخلايا بلعم، بمدمس الماوس خلايا لا تزال مصطنع المشتقة من السلائف المكونة للدم. اختبار الاستجابات المناعية من الضامة في المختبر خطوة هامة لفهم استجابات الأجسام المضادة، ولكن تحتاج إلى تجارب في فيفو التي يتعين القيام بها، وكذلك. حقن المنشطات في فيفو متبوعاً باستزراع خلايا السابقين فيفو، يمكن أن توفر المزيد من المعلومات عن الدراسات المستقبلية للتحقيق في ما إذا كانت المخدرات تستند إلى جسم أيضا تفعيل الضامة للالتهابات في حالة مرض. لا يمكن استخلاص استنتاجات بشأن ما يحدث في الأشخاص الذين يتلقون البيولوجي القائم على جسم من هذه التجارب. وقد نشرت دراسات قليلة لتقييم آثار IVIg على البشرية الوحيدات المستمدة الضامة في المختبر. سجلت انخفاضا في أرقام لايل-6 إنتاج وحيدات البشرية في المختبر ، عندما IVIg هو حفز التعاون مع لبس مقارنة بالتحفيز مع لبس وحدها12. يقلل IVIg TNFα وخلايا إنتاج إيل-6 عندما حفزت مع بروكالسيتونين (PCT) في الإنسان THP-1 مونوسيتيك31.
البروتوكولات في هذه الورقة لها مزايا أكثر من الأساليب القائمة. نخاع العظام المستمدة الضامة والضامة البريتوني هي الخلايا الأولية، معزولة مباشرة من الفئران، بدلاً من يتم تخليد خطوط الخلايا.خطوط الخلية مثل بلعم الماوس، مثل الخلايا RAW264.7، لا تنتج سيتوكين برو التحريضية، إيل-12، استجابة للبس، وهو سيتوكين هامة التي ينظمها إيل-10 الذي يتم إنتاجه في الاستجابة إلى IVIg8،13. اختبار المخدرات في فيفو مع لبس تصاريح دراسة أثر المخدرات على البيئة البريتوني المحلية من خلال تحليل السائل الغسل وخلايا البريتوني، والضامة البريتوني على وجه التحديد،. هو قصير، والنموذج البسيط الذي يمكن أن توفر معلومات هامة تبرر النظر في الآثار غير محددة من الأجسام المضادة على تفعيل بلعم في نماذج حيوانية أطول وأكثر تكلفة من المرض. أنها ميزة على نماذج اندوتوكسيميا حيث مقياس تجريبي هو غالباً ما بقاء الماوس أو السيتوكينات في المصل14فقط. معدلات البقاء على قيد الحياة والسيتوكينات المصل قيمة تدابير الاستجابة المناعية، ولكن أنها لا تظهر بالمساهمة التي يمكن أن يكون الضامة على وجه التحديد. عزل واستزراع الضامة البريتوني من تجربة تحدي يظهر تأثير مباشرة وقابلة للقياس يمكن أن المداواة جسم على وظيفة بلعم.
هذه الأساليب والتطبيقات لاختبار وتصميم العلاجات البيولوجية. استخدام الأجسام المضادة كالمداواة زاد زيادة كبيرة في السنوات الأخيرة. ومع ذلك، هذه العلاجات قد آثار إضافية غير معروف على الضامة التي يمكن الاعتراف بالجزء Fc من الجسم وتغيير إنتاج سيتوكين. الأجسام المضادة-TNFα، infliximab، لقد ثبت للحث على إيل-10 وقمع انتشار الخلايا T من خلال الجزء Fc، والذي تم اقتراحه كواحدة من آليات العمل7،،من1526. استخدام النماذج الوراثية، يمكن أن تورط بروتينات معينة في إليه كيف تؤثر هذه الأدوية على تفعيل بلعم. يمكن تغيير فئات من الأجسام المضادة مفتش والاستعدادات للأجسام المضادة لتغيير كيفية تأثر الضامة البيولوجي. تشير البيانات المتوفرة لدينا إلى الإعداد و/أو تخزين المخدرات جسم نفس (IVIg) يمكن أن يؤثر على إثارة على تفعيل بلعم. يمكن استخدام الأساليب داخل هذه الورقة لتصميم العلاجات التي ليس لها هذه الآثار، والتي قد تكون حاسمة للحفاظ على إيممونوسورفيلانسي أثناء علاجات السرطان، حيث الضامة للالتهابات قد تشجع على تطور الورم. يمكن أيضا استخدام هذه التقنيات لتصميم وتقييم العقاقير التي لها هذه الآثار، إذا كان ذلك مستصوبا. على سبيل المثال، قد يكون من المفيد تقليل الاستجابات بلعم التحريضية وإنشاء الضامة للالتهابات إيل-10-المنتجة لتعزيز العلاج لأمراض التهاب الأمعاء أو التهاب المفاصل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
ل. ك. هو جائزة الدراسات العليا سنهم 4 سنوات الزمالة (4YF) جامعة كولومبيا البريطانية. L.M.S. هو المستفيد من "الرابطة الكندية" لأمراض الجهاز الهضمي/كرون والتهاب القولون كندا/جائزة استوفوا الجديد المحقق المرتب وهو أحد "علماء الطب الحيوي" "مؤسسة مايكل سميث" "الأبحاث الصحية". بتأييد هذا العمل "منحة المشروع" من "خدمات الدم الكندية"، بالتعاون مع "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (منح # CIHR2016-LS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
