Summary
एंटीबॉडी आधारित दवाओं भड़काऊ रोगों के उपचार के लिए क्रांति की है । विशिष्ट लक्ष्यों पर प्रत्यक्ष प्रभाव होने के अलावा, एंटीबॉडी विरोधी भड़काऊ बनने के लिए मैक्रोफेज सक्रिय कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण इन विट्रो में मूल्यांकन किया जा सकता है, माउस अस्थि मज्जा मैक्रोफेज का उपयोग कर, और vivo में, पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग कर ।
Abstract
मैक्रोफेज phagocytic जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं है, जो रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आरंभ करने और चिकित्सा और ऊतक reवेश्यावृत्ति के लिए योगदान कर रहे हैं । मैक्रोफेज भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को बंद करने में समान रूप से महत्वपूर्ण हैं । हमें पता चला है कि नसों में immunoglobulin (IVIg) के साथ उत्तेजित मैक्रोफेज विरोधी भड़काऊ cytokine की उच्च मात्रा का उत्पादन कर सकते हैं, interleukin 10 (IL-10), और बैक्टीरियल साइटोकिंस के जवाब में समर्थक भड़काऊ lipopolysaccharides के निम्न स्तर ( एलपीएस) । IVIg एक polyvalent एंटीबॉडी है, मुख्यतः immunoglobulin जी एस (IgGs), १,००० से अधिक रक्त दाताओं के प्लाज्मा से परित । यह प्रतिरक्षा की कमी के साथ रोगियों में एंटीबॉडी के पूरक या स्व-प्रतिरक्षित या भड़काऊ स्थितियों के साथ रोगियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबाने के लिए प्रयोग किया जाता है । Infliximab, एक चिकित्सीय विरोधी ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) एंटीबॉडी, भी मैक्रोफेज को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है IL-10 भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में उत्पादन । IVIg और अन्य एंटीबॉडी आधारित macrophage सक्रियण पर उनके प्रभाव का निर्धारण करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है । इस कागज व्युत्पत्ति, उत्तेजना के लिए तरीकों का वर्णन है, और murine अस्थि मज्जा का आकलन इन विट्रो में एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय मैक्रोफेज और murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज vivo मेंएंटीबॉडी के साथ सक्रिय है । अंत में, हम पश्चिमी सोख्ता के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए विशिष्ट कोशिका विरोधी भड़काऊ macrophage गतिविधि के लिए संकेत मार्ग का योगदान निर्धारित करते हैं । इन प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण पर एक विशिष्ट प्रोटीन (ओं) के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए । इन तकनीकों का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है कि क्या विशिष्ट मैक्रोफेज एक IL-10-उत्पादन विरोधी भड़काऊ सक्रियकरण राज्य है कि vivo मेंभड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम कर देता है बदलने के द्वारा कार्य कर सकते हैं । यह चूहों में रोग मॉडल के दौरान macrophage सक्रियण की प्रभावकारिता में सक्रियकरण की भूमिका के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, और लोगों में कार्रवाई की एक संभावित नए तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । इसके विपरीत, इस विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग के खिलाफ सावधानी मई आधारित है संक्रामक रोग के इलाज के लिए, विशेष रूप से अगर मैक्रोफेज कि संक्रमण के खिलाफ मेजबान रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ।
Introduction
मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जो संक्रमण या चोट करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में कई भूमिका निभा रहे हैं । मैक्रोफेज संक्रमण या ऊतक क्षति के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत के लिए जिंमेदार हैं, भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने, और हीलिंग प्रतिक्रिया1को बढ़ावा देने के । तीन बेहतरीन अध्ययन macrophage सक्रियण राज्यों के उदाहरण हैं: 1) मैक्रोफेज इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) और बैक्टीरियल lipopolysaccharide (एलपीएस), नामित एम (IFNγ + एलपीएस), जो भड़काऊ प्रतिक्रिया में योगदान के साथ इलाज; 2) मैक्रोफेज interleukin 4 के साथ उत्तेजित (il-4), एम (il-4), जो चिकित्सा प्रतिक्रिया के साथ जुड़े रहे हैं; 3) मैक्रोफेज प्रतिरक्षा परिसरों (आईसी) और एलपीएस, एम (आईसी + एलपीएस) है, जो बंद भड़काऊ प्रतिक्रिया2,3बारी करने की क्षमता है के साथ उत्तेजित । एम (आईसी + एलपीएस) एम (IL-4) घाव भरने मैक्रोफेज से अलग हैं, और एंजाइम arginase (Arg-1) या FIZZ14व्यक्त नहीं करते । इन विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज के लिए सबसे अच्छा मार्कर उनके cytokine उत्पादन है5। मैक्रोफेज स्वास्थ्य को बनाए रखने में कई भूमिकाएं हैं, लेकिन यह भी भड़काऊ रोगों और कैंसर के लिए योगदान3। इस वजह से, मैक्रोफेज रोगों की एक विस्तृत विविधता के उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य हैं । यह उनके सक्रियकरण राज्य पर एंटीबॉडी के प्रभाव की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है रोग के लिए macrophage आधारित उपचार विकसित करना ।
इस कागज का ध्यान murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) और पेरिटोनियल मैक्रोफेज के उपयोग पर है इन विट्रो में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं पर एंटीबॉडी दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए और vivo में। हाल ही में, वहां कई macrophage सक्रियकरण6,7,8पर एंटीबॉडी के प्रभाव दिखा अध्ययन किया गया है । मैक्रोफेज सह प्रतिरक्षा परिसरों के साथ सक्रिय है, जो एंटीबॉडी एक प्रतिजन के साथ जटिल कर रहे हैं, और एलपीएस, एक सामान्य रूप से भड़काऊ उत्तेजना, विरोधी भड़काऊ cytokine के बहुत उच्च स्तर का उत्पादन, आईएल-10, और समर्थक भड़काऊ cytokine के बहुत निम्न स्तर, interleukin 12 (IL-12)9. इसके अलावा, infliximab, TNFα के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, काम करने के लिए, भाग में पाया गया है, विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज के माध्यम से अपने टुकड़ा सघन (एफसी) क्षेत्र7के माध्यम से उत्प्रेरण । हमने बताया है कि IVIg + एलपीएस विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण कि एम के समान है (आईसी + एलपीएस), जिसमें सह उत्तेजित मैक्रोफेज की बड़ी मात्रा में उत्पादन के आईएल-10 और कम मात्रा में समर्थक भड़काऊ cytokine उपइकाई Interleukin 12 या 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (il-6), और TNF8। IVIg एक polyclonal एंटीबॉडी के शामिल दवा है, मुख्य रूप से आईजीजी, जो १,००० से अधिक दाताओं10के खून से परित किया गया है । यह इस तरह के अज्ञातहेतुक थ्रोम्बोसाइटोपेनिक purpura और जीर्ण demyelinating के रूप में प्रतिरक्षा रोगों, की एक विस्तृत विविधता का इलाज किया जाता है, लेकिन कार्रवाई के अपने तंत्र को पूरी तरह से समझ में नहीं है11. macrophage सक्रियण पर एंटीबॉडी आधारित दवाओं के प्रभाव यहां वर्णित तरीकों का उपयोग कर आकलन किया जा सकता है ।
macrophage सक्रियण पर विशिष्ट वितर्कों के प्रभावों का BMDMs और पेरिटोनियल मैक्रोफेज में परीक्षण किया जा सकता है. इन macrophage स्रोतों का उपयोग प्राथमिक कक्षों के मूल्यांकन को अनुमति देता है । संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक कोशिकाओं पर एंटीबॉडी के प्रारंभिक परीक्षण कम समय और अन्य समय लेने वाले और महंगे रोग मॉडल की तुलना में मौद्रिक निवेश की आवश्यकता है । vivo मेंएक स्वस्थ माउस में एक दवा इंजेक्शन द्वारा, और कोशिकाओं को अलग करने और उन्हें पूर्व vivoका विश्लेषण, एक अगर अध्ययन के साथ कि क्या उपचार का आकलन करने के लिए वारंट कर सकते हैं कि macrophage सक्रियण रोग मॉडल में प्रभावित करता है.
कुछ अध्ययनों के साथ इन विट्रो में macrophage सक्रियण पर जीवविज्ञान चिकित्सा के प्रभाव का परीक्षण और vivo में सीधे, हमारी तकनीक वैकल्पिक तकनीकों पर एक लाभ प्रदान करते हैं । मौजूदा तकनीकों में मिश्रित कोशिका आबादी पर जीवविज्ञान दवा प्रभाव का परीक्षण शामिल है इन विट्रोमें infliximab के प्रभाव के रूप में एक मिश्रित लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया (एमएलआर) या परिधीय रक्त मैक्रोफेज कोशिकाओं में मानव mononuclear पर IVIg, जहां प्रभाव किसी विशिष्ट कक्ष प्रकार को7,12के लिए एट्रिब्यूट नहीं किया जा सकता । BMDMs और पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग कर इस तरह के कच्चे 264.7 कोशिकाओं है, जो समर्थक भड़काऊ cytokine, IL-12, एलपीएस8,13के जवाब में उत्पादन नहीं है के रूप में सेल लाइनों, का उपयोग करने पर लाभप्रद है । macrophage प्रतिक्रियाओं पर एक एंटीबॉडी आधारित दवा के प्रभाव का परीक्षण पूर्व vivo लाभ है क्योंकि cytokine प्रतिक्रियाओं को सीधे मैक्रोफेज के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, बजाय macrophage प्रतिक्रियाओं को मापने से सीरम cytokine स्तर14 . BMDMs और पेरिटोनियल मैक्रोफेज और व्युत्पंन किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से अलग विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण में एक प्रोटीन की विशिष्ट भूमिका निर्धारित करने के लिए । उदाहरण के लिए, हम Il10 आपुर्ति(-/-) BMDMs का उपयोग किया है कि समर्थक भड़काऊ cytokine उत्पादन के IVIg प्रेरित कमी IL-108पर आंशिक रूप से निर्भर है प्रदर्शित करने के लिए । कार्रवाई की एक दवा तंत्र पश्चिमी सोख्ता, जहां विशिष्ट प्रोटीन और संकेतन घटनाओं की भूमिका निर्धारित किया जा सकता है का उपयोग कर जांच की जा सकती है । मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) BMDMs या पेरिटोनियल मैक्रोफेज पर किया जा सकता है जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न दिखाने के लिए कि एंटीबॉडी सक्रियण से परिणाम । चूहों में रोग मॉडल भड़काऊ आंत्र रोग, रुमेटी गठिया, और कैंसर की तरह रोगों के लिए मॉडलों में एंटीबॉडी आधारित जैविक उपचारों की संभावित प्रभावकारिता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं15,16, 17. हालांकि, यहां बताई गई तकनीकों से यह पता लगाने के लिए कि वे विरोधी भड़काऊ macrophage गतिविधि पैदा कर इन तर्कों की कार्रवाई के तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान करेगा ।
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Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. अस्थि मज्जा Macrophage व्युत्पत्ति और सक्रियकरण एंटीबॉडी के साथ
- सह2 asphyxiation का उपयोग कर इच्छामृत्यु प्रदर्शन ।
- प्रेरण कक्ष में माउस प्लेस । Euthanize माउस के साथ 5% isoflurane संज्ञाहरण, के लिए ६०-९० एस, जब तक मोबाइल और सांस लेने में गहरी और धीमी है ।
- बंद isoflurane संज्ञाहरण और प्रशासन 6-8 एल/ 2 की सह से जब तक माउस श्वास बंद कर दिया है । पर सह के साथ माउस छोड़ें2 के लिए कम एक और 5 मिनट । सत्यापित करें कि अब दिल की धड़कन या संवेदनाएं नहीं हैं । मृत्यु को सुनिश्चित करने के लिए ग्रीवा विस्थापन करें ।
नोट: 8-12 सप्ताह पुराने चूहों मैक्रोफेज की उच्चतम उपज प्रदान करते हैं ।
- ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे माउस पैर, और उंहें हथियार और पैरों के साथ पिन एक फोम बोर्ड पर लापरवाह स्थिति में बाहर फैला । कैंची और संदंश के साथ त्वचा को पकड़ने के लिए, एक उथले कटौती (०.२ सेमी) करने के लिए त्वचा और हिंद के प्रत्येक पैरों की सतह से फर को हटा दें ।
नोट: इस प्रक्रिया और एक बाँझ डाकू में सभी ऊतक संस्कृति जोड़तोड़ करते हैं । - tibias और femurs दृश्यमान बनाने के लिए मांसपेशी ट्रिम । tibias और femurs, हड्डी और मांसपेशियों को काटने के द्वारा सिर्फ कूल्हे के नीचे और टखनों के ऊपर से हटा दें । संभव के रूप में ज्यादा पेशी बंद ट्रिम कर दीजिए ।
- ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे हड्डियों और यह वाष्पित करने के लिए 1 मिनट रुको, तो उन्हें हड्डी फ्लश मध्यम (Iscove के संशोधित Dulbecco के माध्यम (IMDM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) के 6 अच्छी तरह से थाली में जगह है ।
- हड्डी गुहा के सामने है ताकि फीमर के टखने और ऊपर से हड्डी के ०.१ सेमी काटने से हड्डियों के सिरों ट्रिम कर दीजिए । सुनिश्चित करें कि मज्जा दिखाई दे रहा है और एक 26 गेज सुई हड्डी गुहा में रखा जा सकता है ।
- tibias और femurs को घुटने के जोड़ों से अलग करने के लिए हड्डियों और मांसपेशियों को काटें । एक 26 गेज सुई गुहा में एक 10 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी डालें । अस्थि मज्जा एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 5 मिलीलीटर की हड्डी फ्लश मध्यम के साथ फ्लश । फ्लश दो tibias और दो femurs, एक माउस से, प्रत्येक ५० मिलीलीटर ट्यूब में ।
- पिपेट ऊपर और नीचे कई बार या एक धीमी गति से मज्जा भंवर धीरे से झुरमुट फैलाने के लिए । मज्जा के तार छोटे (कम से ०.५ mm) मज्जा की flecks में टूट जाना चाहिए । शंकु ट्यूब को अस्थि फ्लश मीडियम के साथ ५० मिलीलीटर में भरें । पिपेट एक ७५ सेमी2 ऊतक संस्कृति में शंकु ट्यूब की सामग्री कुप्पी का इलाज किया, और ३७ ° c, 5% सह 1 एच के लिए2 पर मशीन ।
नोट: परिपक्व मैक्रोफेज और mesenchymal कोशिकाएं कुप्पी तक अनुयाई हो जाएंगी और छोड दी जाएंगी, जबकि वांछित टेम progenitors सस्पेंशन में रह जाएंगे । - पिपेट को ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में टेम progenitors के साथ मध्यमा । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और macrophage कॉलोनी के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड कारक (MCSF) संस्कृति मध्यम (IMDM, 10% FBS, 5 एनजी/एमएल MCSF, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन/streptomycin, और १५० माइक्रोन monothioglycerol (MTG)) ।
- hemocytometer18का उपयोग करके कक्ष गिनना । ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल, १.५ x 107 कोशिकाओं/मध्यम के 30 मिलीलीटर में कुप्पी, और धीरे ऊपर और नीचे पिपेट की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को फिर से स्थगित करने के लिए माध्यम जोड़ें । पिपेट एक नया ७५ सेमी2 ऊतक संस्कृति कुप्पी इलाज में निलंबन के 30 मिलीलीटर ।
- 4 दिन और 7 दिन पर १.९ चरण में प्रारंभिक संस्कृति के बाद, सत्यापित करें कि कोशिकाओं अनुयाई और थोड़ा एक औंधा चरण कंट्रास्ट उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर बंटी हैं । गैर-अनुयाई कक्षों वाले माध्यम को छोड़ें । IMDM एक बार के साथ कोशिकाओं को धोने और MCSF संस्कृति मध्यम के 30 मिलीलीटर जोड़ें ।
- जब कक्ष 10 दिन से परिपक्व हो (& #62; F4/80 और Mac-1 के लिए ९५% धनात्मक), पुन: सत्यापित करें कि कक्ष अनुयाई और थोड़ा हैं ।
- उत्तेजना के लिए कोशिकाओं को प्लेट करने के लिए, कुप्पी से संस्कृति माध्यम को हटाने और एंजाइम मुक्त, EDTA-आधारित सेल पृथक्करण बफर (सामग्री की तालिका) के 8 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c, 5% CO2पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को मशीन ।
- कोशिकाओं धीरे परिमार्जन, दबाव की एक छोटी राशि के साथ, एक बाँझ सेल खुरचनी का उपयोग कर. माइक्रोस्कोप कि कोशिकाओं कुप्पी सतह से अलग है में जांच करें । एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में असंबद्ध कोशिकाओं पिपेट । IMDM और पूल की 5 मिलीलीटर के साथ कुप्पी 3 बार कुल्ला कोशिकाओं है कि काटा गया के साथ समाधान कुल्ला । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
- ५० एमएल शंकु ट्यूब प्रति MCSF संस्कृति माध्यम के 3 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । एक hemocytometer18का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती । 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल और प्लेट के १०० μL सेल निलंबन (1 x 105 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति का इलाज किया, फ्लैट नीचे प्लेट की एक एकाग्रता पर पुनर्निलंबित ।
नोट: एक माउस से हड्डियों १०० कुओं के लिए पर्याप्त कोशिकाओं पैदा करेगा । यदि वांछित, कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर एक 6 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया जा सकता है (ऊतक संस्कृति का इलाज, फ्लैट नीचे) । कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या (1 x 106 कोशिकाओं) पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है । - एक बार अनुयाई, IMDM में एलपीएस के 10 एनजी/एमएल के साथ डुप्लिकेट या तपसिल कुओं प्रत्येक उत्तेजित, 30 मिलीग्राम/IVIg, या IVIg + एलपीएस । एलपीएस या IVIg की खुराक प्रतिक्रियाओं का अनुकूलन करने के लिए titrated जा सकता है । उत्तेजित नियंत्रण के रूप में डुप्लिकेट या तपसिल कुओं छोड़ दें । उन्हें 24 घंटे के लिए मशीन (३७ ° c, 5% CO2) ।
नोट: पुनः चढ़ाया कोशिकाओं 1 एच के भीतर ऊतक संस्कृति कुओं का पालन करना चाहिए । - प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्तिगत १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में से सेल supernatants लीजिए और 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर कताई द्वारा किसी भी कण बात को हटा दें ।
- सेल supernatant निकालें और गोली परेशान से बचने के । एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में स्पष्ट सेल supernatant प्लेस ।
नोट: सेल supernatants साइटोकिंस, आईएल-10, और cytokine उपइकाई, आईएल-12/23p40, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) तुरंत, या पर संग्रहित-८० ° c दीर्घकालिक के लिए परख की जा सकती है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिका) से एलिसा प्रोटोकॉल का पालन करें । अन्य समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस जैसे IL-6 और TNF के रूप में परख किया जा सकता है, के रूप में वे भी IVIg के साथ सह उपचार से कम कर रहे हैं + एलपीएस उत्तेजना के साथ उत्तेजना की तुलना में अकेले एलपीएस. उत्तेजना के बाद अनुयाई कोशिकाओं को पश्चिमी सोख्ता या मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यू-पीसीआर) 19,20जैसी तकनीकों के लिए तैयार किया जा सकता है ।
2. IVIg और हार्वेस्टिंग पेरिटोनियल मैक्रोफेज के साथ Vivo में चूहों को चुनौती
- प्रत्येक माउस तौलना ।
नोट: उदाहरण के लिए, एक 20 जी माउस के लिए, IVIg के ५०० µ एल की आवश्यकता है ।
नोट: एक बाँझ डाकू में प्रक्रिया करते हैं ।
नोट: सुई ध्यान से माउस में इतनी जगह है कि आप पंजाबियों अंगों में सुई नहीं है, बल्कि, पेरिटोनियल अंतरिक्ष में.
नोट: द्रव इंजेक्शन के हर 5 मिलीलीटर के लिए, लगभग ३.७५ मिलीलीटर बरामद किया जाएगा ।
नोट: अंतिम इंजेक्शन के बाद, यह आसान हो सकता है दूर छोड़ दिया और माउस के दाईं ओर से तरल पदार्थ निकालने के लिए, जहां द्रव संचित है । अंगों इस स्थिति में सुई के साथ कम हस्तक्षेप का कारण होगा ।
नोट: मैक्रोफेज अंय पेरिटोनियल कक्षों से थोड़ा बड़ा होगा । ठेठ उपज है 5 x 105 -1 x 106 मैक्रोफेज/माउस का उपयोग कर एक जंगली प्रकार C57BL/
वैकल्पिक: लाल रक्त कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में सेल गोली में मौजूद हैं, तो उन्हें हटाने के लिए एक lysis कदम प्रदर्शन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1x लाल रक्त कोशिका lysis बफर का उपयोग कर.
नोट: तपसिल वेल्स या titrating उत्तेजक का उपयोग करते समय यह एक प्रयोग के लिए एक से अधिक माउस से पूल कोशिकाओं के लिए आवश्यक हो सकता है । उदाहरण के लिए, यदि एक माउस 5 x 105 मैक्रोफेज, चढ़ाना मध्यम की ५०० μL की आवश्यकता होगी । 5 कुओं, या डुप्लिकेट में 1 प्रयोग, एक एलपीएस खुराक के साथ के लिए पर्याप्त कोशिकाओं होगा ।
नोट: उत्तेजना के बाद अनुयाई कोशिकाओं को वेस्टर्न ब्लाटर या पीसीआर जैसी तकनीकों के लिए तैयार किया जा सकता है ।
3. IVIg + एलपीएस और हार्वेस्टिंग पेरिटोनियल मैक्रोफेज के साथ Vivo में चुनौतीपूर्ण चूहों
- प्रत्येक माउस तौलना । IVIg की मात्रा की गणना (१०० मिलीग्राम/एमएल स्टॉक एकाग्रता) की जरूरत है एक अंतिम खुराक प्रदान करने के लिए २.५ g/kg शरीर के वजन । एलपीएस की मात्रा की गणना (१०० μg/एमएल शेयर एकाग्रता IMDM में) ०.२ μg/g शरीर के वजन की एक अंतिम खुराक प्रदान करने के लिए आवश्यक है ।
नोट: उदाहरण के लिए, एक 20 जी माउस के लिए, IVIg शेयर समाधान के ५०० µ एल और एलपीएस के एक १०० μg/एमएल समाधान के ४० μL की आवश्यकता है । - एक बाँझ 1 मिलीलीटर एक बाँझ 26 गेज सुई के साथ लगे सिरिंज में IVIg और एलपीएस की आवश्यक राशि ड्रा. नियंत्रण चूहों कि IVIg प्राप्त नहीं होगा के लिए, बाँझ पंजाबियों पीएच ७.४ के साथ IVIg के एक समकक्ष मात्रा की जगह.
- अपने अंगूठे और तर्जनी के साथ गर्दन के पीछे अपनी त्वचा हथियाने और अपनी शेष उंगलियों के साथ अपनी पूंछ और हिंद पैर पकड़े द्वारा एक हाथ से माउस कूड़ा । जमीन की ओर अपने शरीर झुकाव ।
- माउस के पेट के सापेक्ष एक 30-40 ° कोण पर सुई प्लेस, निचले सही वृत्त का चक्र में, ऊपर बेवल, और डालने १.५ सेमी. IVIg + एलपीएस, या पंजाबियों + एलपीएस, intraperitoneally के रूप में चरण २.४ में सुई ।
- एक के बाद, हार्वेस्ट पेरिटोनियल मैक्रोफेज कदम प्रदर्शन द्वारा २.५-२.१० ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन । बरामद लेवेज द्रव की 1 मिलीलीटर निकालें और एलिसा द्वारा आईएल-10 और आईएल-12/23p40 विश्लेषण के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार या पर फ्रीज-८० ° c भविष्य के विश्लेषण के लिए उपयोग करें ।
नोट: लेवेज द्रव cytokine विश्लेषण के लिए उपचार के बीच सटीक तुलना सुनिश्चित करने के लिए, पेरिटोनियल गुहा के 5 मिलीलीटर flushes 4 बार 15 मिलीलीटर के अंतिम खंड के लिए प्रदर्शन । नहीं सभी तरल पदार्थ प्रत्येक फ्लश से बरामद किया जाएगा । - चरण २.११ में के रूप में, पुनर्स्थगित और व्यवहार्य मैक्रोफेज गिनती ।
नोट: मैक्रोफेज अंय पेरिटोनियल कक्षों से थोड़ा बड़ा होगा ।
वैकल्पिक: लाल रक्त कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में सेल गोली में मौजूद हैं, तो उन्हें हटाने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक lysis कदम प्रदर्शन, चरण २.११ में के रूप में.
नोट: यह एक प्रयोग के लिए एक से अधिक माउस से पूल कक्षों के लिए आवश्यक हो सकता है । उदाहरण के लिए, यदि एक माउस 5 x 105 मैक्रोफेज, चढ़ाना मध्यम की ५०० μL की आवश्यकता होगी ।
नोट: नमूने तुरंत या जमे हुए इस्तेमाल किया जा सकता है और पर संग्रहित-८० ° c एलिसा द्वारा cytokine विश्लेषण के लिए ।
नोट: कोशिकाओं पश्चिमी दाग या पीसीआर, के रूप में १.१६-१.१७ और २.१४ चरणों में के रूप में तकनीकों के लिए तैयार किया जा सकता है ।
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Representative Results
Murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज अस्थि मज्जा tracheal में टेम सेल पुरोगामी से कल्चरित किया जा सकता है । अस्थि मज्जा tracheal परित से femurs और tibias एक C57BL/6 माउस आम तौर पर 107 अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज उपज, उंहें प्रयोगों के लिए मैक्रोफेज का एक सुविधाजनक स्रोत बना । BMDMs जब इन विट्रो मेंएक भड़काऊ उत्तेजना के साथ चुनौती दी एंटीबॉडी आधारित दवा प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 1 कि IVIg ब्रांड से पता चलता है, Gammunex (GX), + एलपीएस विरोधी भड़काऊ cytokine के उत्पादन बढ़ जाती है, il-10, 7 गुना एलपीएस उत्तेजना की तुलना में अकेले (चित्रा 1A) और कम हो जाती है IL-12/23p40 का उत्पादन (चित्रा 1 ख). आरेख 1 यह भी दर्शाता है कि विभिंन IVIg तैयारियां भिंन रूप से कार्य करती हैं । हालांकि IVIg की तीन अलग तैयारी il-12/23p40 काफी (चित्रा 1बी), Octagam (ओग) और Gammagard तरल (जीएल), काफी कम नहीं एलपीएस के जवाब में il-10 उत्पादन में वृद्धि करने में सक्षम है (चित्रा 1 a). ओग और GL करने के लिए काफी कम करने में सक्षम है IL-12/23p40 उत्पादन एलपीएस के जवाब में, लेकिन GX से एक कम डिग्री करने के लिए । ये परिणाम प्रदर्शित करता है कि एंटीबॉडी अस्थि मज्जा व्युत्पंन macrophage सक्रियण को प्रभावित करता है, और है कि एक ही दवा है कि प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन पैदा कर सकता है की तैयारी के बीच मतभेद हैं ।
BMDMs पश्चिमी सोख्ता द्वारा IVIg के यंत्रवत प्रभावों का परीक्षण किया जा सकता है । आईसी + एलपीएस के साथ सक्रिय मैक्रोफेज mitogen सक्रिय प्रोटीन (नक्शा) kinases, p38 और Erk1/2, जो वृद्धि हुई IL-10 उत्पादन के लिए जिंमेदार है की फास्फारिलीकरण वृद्धि हुई है21। चित्रा 2 में परिणाम एक ठेठ पश्चिमी दाग दिखाने के लिए नक्शे कळेनासे मैक्रोफेज कि उत्तेजित कर रहे है द्वारा IL-10 उत्पादन के लिए आवश्यक सक्रियकरण का पता लगाने, या एलपीएस, IVIg, या IVIg + एलपीएस के साथ उत्तेजित किया गया है । IVIg उत्तेजना अकेले या IVIg + एलपीएस सह उत्तेजना नक्शा kinases के सक्रियकरण में वृद्धि हुई, Erk1 के साथ पहले और लंबे समय तक फास्फारिलीकरण के साथ कि अकेले एलपीएस के साथ देखा की तुलना में । p38 के सक्रियकरण IVIg के साथ उत्तेजित मैक्रोफेज में पहले हुई + एलपीएस अकेले एलपीएस के साथ उत्तेजित लोगों की तुलना में । इन परिणामों से पता चलता है कि तरीकों, जैसे पश्चिमी सोख्ता, BMDMs पर एंटीबॉडी दवाओं के सेल संकेत प्रभाव दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । cytokine उत्पादन के अलावा, नक्शा कळेनासे सक्रियण कि विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण हुआ है दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
परिपक्व, ऊतक निवासी मैक्रोफेज भी चूहों से अलग किया जा सकता IVIg ५.० एक्स 10 के लिए प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए5 -१.० x 106 पेरिटोनियल मैक्रोफेज एक स्वस्थ C57BL/6 माउस से अलग किया जा सकता है । चित्रा 3में, IVIg के साथ इंजेक्शन चूहों से पेरिटोनियल मैक्रोफेज काफी विट्रो मेंउत्तेजना के अभाव में IL-10 उत्पादन में वृद्धि नहीं, पंजाबियों इंजेक्शन चूहों की तुलना में. जब IVIg इंजेक्शन चूहों से पेरिटोनियल मैक्रोफेज एलपीएस पूर्व vivoके साथ प्रेरित कर रहे हैं, वे उत्पादन 6 गुना अधिक आईएल-10 चूहों से पंजाबियों के साथ इंजेक्शन. वे नहीं है, तथापि, IL-12/23p40 जब एलपीएस पूर्व vivoके साथ उत्तेजित का पता लगाने की मात्रा का उत्पादन । ये परिणाम प्रदर्शित करता है कि एंटीबॉडी इफेक्ट इस विधि के साथ vivo और संवर्धन कोशिकाओं ex vivo में दवा इंजेक्शन द्वारा मैक्रोफेज पर परीक्षण किया जा सकता है ।
vivo मेंएंटीबॉडी और भड़काऊ उत्तेजनाओं को Macrophage प्रतिक्रियाओं का आकलन किया जा सकता है । Cytokine उत्पादन लेवेज द्रव में मूल्यांकन किया जा सकता है, और supernatants में से पूर्व vivo उत्तेजित पेरिटोनियल मैक्रोफेज. चित्रा 4 से पता चलता है विरोधी भड़काऊ cytokine IL-10 लेवेज द्रव में वृद्धि हुई है (चित्रा 4ए), पेरिटोनियल कोशिकाओं (चित्रा 4बी), और पेरिटोनियल मैक्रोफेज (चित्रा 4सी) जब चूहों पंजाब + एलपीएस की तुलना में IVIg + एलपीएस के साथ चुनौती दे रहे हैं. समर्थक भड़काऊ cytokine उपइकाई के उत्पादन, IL-12/23p40, काफी कम है कल्चरल पेरिटोनियल मैक्रोफेज में, लेकिन लेवेज द्रव में नहीं । इस विधि vivo में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं पर एक एंटीबॉडी दवा के प्रभाव के साथ ही पूर्व vivoपरीक्षा की अनुमति देता है ।
चित्र 1 : Macrophage il-10 और आईएल-12/23p40 उत्पादन के जवाब में IVIg और एलपीएस के विभिंन ब्रांडों के साथ सह उत्तेजना । C57BL/6 MCSF अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज या तो उत्तेजित थे (सी), या एलपीएस के साथ उत्तेजित (10 एनजी/एमएल), IVIg (30 मिलीग्राम/एमएल), या IVIg + एलपीएस । IVIg के तीन विभिंन ब्रांडों का परीक्षण किया गया: Gammunex (GX), Gammagard तरल (जीएल), और Octagam (ओग) । Macrophage supernatants उत्तेजना के बाद 24 एच एकत्र थे, और केंद्रापसारक द्वारा स्पष्ट किया । आईएल-10 (ए) और आईएल-12/23p40 (बी) के लिए एलिसा प्रदर्शन किया गया । डेटा n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों से मैक्रोफेज के लिए कर रहे हैं, प्रति प्रयोग 1 व्यक्ति माउस से कोशिकाओं के साथ, नकल में एलिसा परख के साथ । डेटा मतलब है ± एसडी । *प & #60; ०.०५, * * p & #60; ०.००१, * * *p & #60; ०.०००१ एलपीएस उत्तेजना और IVIg + एलपीएस सह उत्तेजना के बीच तुलना के लिए । एकाधिक तुलना के लिए Tukey के बाद परीक्षण के साथ प्रसरण (ANOVA) का एक-तरफा विश्लेषण सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए उपयोग किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : IVIg-आपन मैक्रोफेज में मानचित्र कळेनासे सक्रियण का पश्चिमी दाग विश्लेषण. MCSF व्युत्पंन अस्थि मज्जा मैक्रोफेज उत्तेजित या एलपीएस के साथ उत्तेजित थे (10 एनजी/एमएल), GX IVIg (30 मिलीग्राम/एमएल), या GX IVIg + एलपीएस; के लिए 0, 10, ४०, या १२० min. all cell lysates (१.० x 106 मैक्रोफेज/लेन) सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) और सोख्ता के लिए phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी p38 और extracellular के अधीन थे सिग्नल विनियमित कळेनासे (Erk1/2), के रूप में अच्छी तरह के रूप में glyceraldehyde 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH), एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में. दिखाए गए परिणाम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, प्रति प्रयोग 1 व्यक्ति माउस से कोशिकाओं के साथ.pp38 और pErk1 के लिए Densitometry/2 प्रोटीन स्तर, GAPDH को सामान्यीकृत, 3 स्वतंत्र प्रयोगों से औसत प्रत्येक बैंड के नीचे दिखाए जाते हैं । यह आंकड़ा Kozicky एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : vivo मेंIVIg के साथ चुनौती दी चूहों से मैक्रोफेज द्वारा आईएल-10 उत्पादन । 8 सप्ताहीय C57BL/6 चूहों बाँझ पंजाबियों (इंजेक्शन नियंत्रण) दिया गया था या GX IVIg (२.५ ग्राम/intraperitoneally. 1 ज के बाद चूहों को euthanized गया और पेरिटोनियल lavages का प्रदर्शन किया गया । पेरिटोनियल मैक्रोफेज पालन चयन का उपयोग कर अलग थे । मैक्रोफेज या तो उत्तेजित थे (सी), या एलपीएस के साथ उत्तेजित (10 एनजी/ सेल supernatants को काटा गया और आईएल-10 एलिसा के लिए 24 घंटे के बाद स्पष्ट किया गया । डेटा n = 5 व्यक्तिगत चूहों से कर रहे है 3 स्वतंत्र प्रयोगों में प्रदर्शन प्रति समूह, नकल में एलिसा परख के साथ । डेटा का अर्थ है ± एसडी. * P & #60; ०.०१ और NS = महत्वपूर्ण नहीं है । सांख्यिकीय विश्लेषण कई तुलना के लिए Sidak के posttest के साथ एक दो तरह ANOVA का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । यह आंकड़ा Kozicky एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : il-10 और आईएल-12/23p40 IVIg + एलपीएस के साथ चुनौती दी चूहों से उत्पादन vivo में। 8 सप्ताह पुराने C57BL/चूहों या तो पंजाबियों + एलपीएस (०.२ µ जी/जी शरीर के वजन) के साथ intraperitoneally इंजेक्शन थे, एक नियंत्रण के रूप में; या GX IVIg (२.५ ग्राम/किलो बॉडी वेट) + एलपीएस (०.२ µ g/जी बॉडी वेट). 1 ज के बाद चूहों को euthanized गया और पेरिटोनियल lavages का प्रदर्शन किया गया । (क) स्पष्ट लेवेज द्रव, (ख) 1 ज macrophage पालन चरण के दौरान पेरिटोनियल कोशिकाओं से स्पष्ट वातानुकूलित supernatants, और (ग) स्पष्ट 24 ज पेरिटोनियल macrophage (Mφ) supernatants के लिए परख रहे थे एलिसा द्वारा 23p40 आईएल-10 और आईएल-12/ डेटा का अर्थ है ± एसडी के लिए = 5 चूहों में 3 स्वतंत्र प्रयोगों, नकल में परख एलिसा के साथ । *p & #60; ०.०५, * *p & #60; ०.०१, * * *p & #60; ०.००१, और NS = महत्वपूर्ण नहीं. चूहों के साथ पंजाब के इंजेक्शन + एलपीएस चूहों IVIg + एक छात्र का टी परीक्षण का उपयोग एलपीएस के साथ इंजेक्शन की तुलना में थे. यह आंकड़ा Kozicky एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
Macrophage सक्रियण राज्य ऊतक homeostasis और रोग22दोनों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । मैक्रोफेज अलग हो सकता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अतिव्यापी सक्रियकरण राज्यों, उनके microenvironment3में cues पर निर्भर करता है । वे भड़काऊ प्रतिक्रिया के सभी चरणों में अलग भूमिका है: रोगजनकों के खिलाफ रक्षा, घाव भरने और ऊतक reवेसे, और भी एक अलग विरोधी भड़काऊ सक्रियकरण राज्य है कि भड़काऊ प्रतिक्रिया 2 बंद करने के लिए महत्वपूर्ण है . विरोधी भड़काऊ macrophage सक्रियण मैक्रोफेज के लिए दो बाहरी उत्तेजनाओं विरोधी भड़काऊ cytokine, आईएल-10 की उच्च मात्रा का उत्पादन करने के लिए की आवश्यकता है, और समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस की कम मात्रा, जैसे il-1223। एक संकेत से आता है एंटीबॉडी एफसी गामा रिसेप्टर्स के माध्यम से अभिनय, और दूसरा संकेत है एक समर्थक भड़काऊ उत्तेजना, जैसे एलपीएस या IFNγ24,25. सीरम, प्रतिरक्षा परिसरों, और विरोधी TNFα एंटीबॉडी, सभी मैक्रोफेज में एक उच्च IL-10-produing विरोधी भड़काऊ सक्रियण राज्य के प्रेरित करने के लिए पाया गया है,23,25,26। हमारे समूह पहले से प्रकाशित किया गया है कि murine अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज और पेरिटोनियल मैक्रोफेज के साथ उत्तेजित भी आईएल के उच्च मात्रा 10 और कोई समर्थक भड़काऊ il-12/IVIg के जवाब में 23p408का उत्पादन । हम यह भी पाया है कि अंय समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, TNF और IL-6 भी अस्थि मज्जा में IVIg द्वारा कम कर रहे है मैक्रोफेज8व्युत्पंन । यहां वर्णित विधियों में माउस BMDMs और पेरिटोनियल मैक्रोफेज में अंय एंटीबॉडी आधारित दवा प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है इन विट्रो और vivo में।
माउस अस्थि मज्जा और पेरिटोनियल मैक्रोफेज पर एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय परीक्षण में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । बाँझ को बनाए रखने के प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है. यदि macrophage संस्कृतियों हवा, फर, या चूहों के मल से सूक्ष्मजीवों के साथ प्रदूषित कर रहे हैं, मैक्रोफेज समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस उत्पादन द्वारा उन उत्तेजनाओं का जवाब होगा । एक सुरक्षा कैबिनेट में सभी प्रयोगों प्रदर्शन, इथेनॉल के साथ उदार माउस छिड़काव, और पेरिटोनियल flushes के दौरान आंत की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं । एंटीबॉडी भी बाँझ रखा जाना चाहिए और निर्माता के निर्देश के अनुसार संग्रहीत । यह उपयोग नहीं किया जा सकता यदि यह दूषित है, समय सीमा समाप्त, या पंकिल । मैलापन दवा की प्रभावशीलता में कमी होगी, और हो सकता है अगर दवा उचित तापमान पर संग्रहीत नहीं है या बहुत लंबे समय के लिए संग्रहीत किया गया है । IVIg 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और केवल समय समाप्त होने की तारीख से पहले इस्तेमाल किया है, IL-10 उत्पादन के स्तर को प्रभावित किया जा सकता है के बाद से । वैकल्पिक रूप से, हमने देखा है कि यह पर जमे हुए किया जा सकता है-20 ° c प्रतिक्रियाओं पर कोई प्रभाव नहीं के साथ. IVIg के विभिंन समान प्रयोगात्मक परिणामों के लिए सीसा, IVIg ब्रांड की तैयारी के विभिंन प्रकार, जबकि चित्रा 1में के रूप में, मैक्रोफेज में अलग प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है । ऐसे उत्तेजित कोशिकाओं के रूप में आवश्यक नियंत्रण, और एंटीबॉडी अकेले के साथ उत्तेजित कोशिकाओं, प्रत्येक प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए बाहर मैक्रोफेज या दवा के संदूषण शासन ।
किसी प्रयोग को अनुकूलित करने के लिए इन प्रोटोकॉल में कई संशोधन किए जा सकते हैं । गैर-सूजन राज्य में, बड़े प्रयोगों के लिए पर्याप्त पेरिटोनियल मैक्रोफेज को अलग करना कठिन हो सकता है । पेरिटोनियल मैक्रोफेज thioglycollate (टीजी) के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा बटोरा जा सकता है । एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है, और 4 दिनों के बाद, पेरिटोनियल मैक्रोफेज को27काटा जा सकता है । भर्ती मैक्रोफेज कम परिपक्व हो सकता है और निवासी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, जैसा कि हम यहां इस्तेमाल किया है, जो महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । टीजी-बटोरा मैक्रोफेज भी टीजी शोरबा, जो एक जटिलता हो सकता है, विशेष रूप से अगर phagocytosis पर प्रयोग कर रहे है से आंतरिक आगार हो सकता है27। विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, C57BL/6 या बालब/सी से चूहों, भी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और macrophage प्रतिक्रियाओं कि एक विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि की आवश्यकता होती है रोग मॉडल में मूल्यांकन किया जाएगा पर एंटीबॉडी के प्रभाव की जांच करने के लिए चुना जा सकता है । इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों, जैसे Il10-/ चूहों, एक दवा की कार्रवाई के तंत्र में विशिष्ट प्रोटीन के समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसा कि हम अपने खुद के काम में8किया है । अलग भड़काऊ उत्तेजनाओं भी macrophage सक्रियण पर एंटीबॉडी के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । IFNγ, और रिसेप्टर (TLR) एगोनिस्ट (जैसे hyaluronic एसिड) की तरह मेजबान व्युत्पंन टोल, IL 10 उत्पादन मैक्रोफेज25,28सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । एक महत्वपूर्ण विचार एंटीबॉडी की खुराक है । खुराक संस्कृति में और पशु प्रयोगों में इष्टतम खुराक प्राप्त करने के लिए titrated होना चाहिए, क्योंकि यह एंटीबॉडी के बीच के रूप में अच्छी तरह से आपूर्तिकर्ताओं के बीच अलग होगा. खुराक भी मनुष्यों को दी खुराक को प्रतिबिंबित करना चाहिए चुना, और दवाओं के बीच अलग होगा. IVIg उच्च खुराक पर एक विरोधी भड़काऊ चिकित्सा के रूप में दिया जाता है (25-35 मिलीग्राम/एमएल या 2 जी/किलोग्राम शरीर के वजन), जो इन प्रोटोकॉल में प्रयुक्त titrated खुराक को दर्शाताहै29, 30.
अस्थि मज्जा और पेरिटोनियल मैक्रोफेज के उपयोग की सीमाएं हैं । macrophage सेल लाइनों पर एक सुधार हालांकि, माउस BMDMs अभी भी कृत्रिम रूप से टेम पुरोगामी से व्युत्पंन कोशिकाओं रहे हैं । मैक्रोफेज इन विट्रो में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का परीक्षण एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, लेकिन vivo में प्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से प्रदर्शन करने की जरूरत है. vivo में संवर्धन कोशिकाओं पूर्व vivoद्वारा पीछा उत्तेजनाओं इंजेक्शन, भविष्य के अध्ययन के लिए और अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं कि क्या एंटीबॉडी आधारित दवाओं भी एक रोग राज्य में विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज सक्रिय कर सकते हैं की जाँच करने के लिए. एंटीबॉडी आधारित प्राप्त लोगों में क्या होता है पर निष्कर्ष इन प्रयोगों से नहीं खींचा जा सकता है. इन विट्रो मेंमानव monocyte व्युत्पंन मैक्रोफेज पर IVIg के प्रभाव का आकलन करने के लिए कुछ अध्ययनों को प्रकाशित किया गया है । IL-6 के इन विट्रो में मानव monocytes उत्पादन की संख्या में कमी की सूचना दी गई है, जब IVIg सह है एलपीएस के साथ उत्तेजित की तुलना में एलपीएस अकेले12के साथ उत्तेजना । IVIg THP-1 मानव monocytic कोशिकाओं में procalcitonin (पीसीटी) के साथ उत्तेजित जब TNFα और IL-6 उत्पादन को कम कर देता है31.
इस पेपर के भीतर प्रोटोकॉल मौजूदा तरीकों से अधिक लाभ है । अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज और पेरिटोनियल मैक्रोफेज प्राथमिक कोशिकाओं रहे हैं, सीधे चूहों से अलग, बजाय जा रहा है अमर सेल लाइनों ।माउस macrophage-जैसे कक्ष रेखाएं, इस तरह के रूप में कच्चे 264.7 कोशिकाओं, समर्थक भड़काऊ cytokine, il-12, एलपीएस है, जो एक महत्वपूर्ण cytokine है कि IVIg8,13के जवाब में उत्पादन किया जाता है कि il-10 द्वारा विनियमित है के जवाब में उत्पादन नहीं करते । vivo में एक दवा परीक्षण के साथ एलपीएस परमिट लेवेज द्रव, पेरिटोनियल कोशिकाओं के विश्लेषण के माध्यम से स्थानीय पेरिटोनियल पर्यावरण पर दवा के प्रभाव की परीक्षा, और विशेष रूप से, पेरिटोनियल मैक्रोफेज. यह एक अल्पकालिक, सरल मॉडल है कि महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए गैर की परीक्षा का औचित्य साबित कर सकते है macrophage सक्रियण पर अब और रोग के अधिक महंगा पशु मॉडल में एंटीबॉडी के विशिष्ट प्रभाव । यह endotoxemia मॉडल पर एक फायदा है, जहां प्रयोगात्मक उपाय अक्सर केवल माउस अस्तित्व या सीरम14में साइटोकिंस है । जीवित रहने की दर और सीरम साइटोकिंस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यवान उपाय कर रहे हैं, लेकिन वे योगदान है कि मैक्रोफेज विशेष रूप से हो सकता है नहीं दिखा । अलग और संवर्धन एक चुनौती प्रयोग से पेरिटोनियल मैक्रोफेज एक सीधा और मध्यम श्रेणी का प्रभाव है कि एंटीबॉडी चिकित्सकीय macrophage समारोह पर हो सकता है दिखाता है ।
इन विधियों के परीक्षण और जीवविज्ञान उपचारों के डिजाइन के लिए आवेदन किया है । चिकित्सकीय के रूप में एंटीबॉडी का उपयोग नाटकीय रूप से हाल के वर्षों में वृद्धि हुई है । हालांकि, इन उपचारों मैक्रोफेज कि एंटीबॉडी के एफसी भाग पहचान और उनके cytokine उत्पादन में परिवर्तन कर सकते है पर अतिरिक्त अज्ञात प्रभाव हो सकता है । विरोधी TNFα एंटीबॉडी, infliximab, IL-10 प्रेरित और अपने एफसी भाग के माध्यम से टी सेल प्रसार को दबाने के लिए दिखाया गया है, और है कि कार्रवाई के अपने तंत्र में से एक के रूप में प्रस्तावित किया गया है7,15,26। आनुवंशिक मॉडल का प्रयोग, विशिष्ट प्रोटीन कैसे इन दवाओं macrophage सक्रियण को प्रभावित कर रहे है के तंत्र में फंसाया जा सकता है । आईजीजी एंटीबॉडी की कक्षाएं और एंटीबॉडी की तैयारी को बदलने के लिए कैसे मैक्रोफेज से प्रभावित कर रहे है बदल सकते है तर्क । हमारे डेटा की तैयारी और/या एक ही एंटीबॉडी दवा (IVIg) के भंडारण को इंगित करता है macrophage सक्रियण पर इसके प्रभाव को प्रभावित कर सकते हैं । इस कागज के भीतर तरीकों को उपचार है कि इन प्रभावों, जो कैंसर के उपचार, जहां विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज ट्यूमर प्रगति को बढ़ावा देने के दौरान immunosurveillance बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है नहीं है डिजाइन किया जा सकता है । इन तकनीकों को भी डिजाइन और दवाओं है कि इन प्रभावों का मूल्यांकन करते हैं, यदि वांछनीय इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह macrophage भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम करने और विरोधी भड़काऊ IL-10 उत्पादन मैक्रोफेज भड़काऊ आंत्र रोगों या रुमेटी गठिया के लिए उपचार को बढ़ाने के लिए बनाने के लिए फायदेमंद हो सकता है ।
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Disclosures
लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.
Acknowledgments
लालकृष्ण ब्रिटेन के कोलंबिया विश्वविद्यालय के प्राप्तकर्ता 4 साल फैलोशिप (4YF) स्नातक छात्र पुरस्कार है । L.M.S. के एक कनाडा एसोसिएशन के प्राप्तकर्ता है गैस्ट्रोएंटरोलॉजी/Crohn ' s और कोलाइटिस कनाडा/CIHR नए अंवेषक वेतन पुरस्कार और स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन के एक बायोमेडिकल विद्वान है । यह काम कनाडा के रक्त सेवाओं से एक परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित था, कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान के संस्थानों के सहयोग से (अनुदान # CIHR2016-LS) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
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