Summary
Médicaments à base d’anticorps ont révolutionné le traitement de maladies inflammatoires. En plus d’avoir des effets directs sur des cibles spécifiques, les anticorps peuvent activent les macrophages pour devenir anti-inflammatoires. Ce protocole décrit comment anti-inflammatoires macrophage activation peut être évaluée in vitro, à l’aide des macrophages de la moelle osseuse de souris et in vivo, à l’aide des macrophages péritonéaux.
Abstract
Les macrophages sont phagocytaires cellules immunitaires innées, initier des réponses immunitaires aux agents pathogènes et de contribuer à la restitution de guérison et de tissus. Les macrophages sont tout aussi importants en éteignant les réponses inflammatoires. Nous avons montré que les macrophages stimulés par des immunoglobulines intraveineuses (IgIV) peuvent produire des quantités élevées de la cytokine anti-inflammatoire, interleukine 10 (IL-10) et de faibles niveaux de cytokines pro-inflammatoires en réponse aux lipopolysaccharides bactériens) LPS). IVIg est qu'un anticorps polyvalent, principalement des immunoglobulines Gs (IgG), mis en commun par le plasma de plus de 1 000 donneurs de sang. Il est utilisé en complément des anticorps chez les patients atteints d’une déficience immunitaire ou pour supprimer les réponses immunitaires chez les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires. Infliximab, un anticorps thérapeutique anti-tumorale nécrose facteur alpha (TNFα) a aussi démontré qu’activent les macrophages pour produire l’IL-10 en réponse à des stimuli inflammatoires. IgIV et autres des produits biologiques à base d’anticorps peuvent être testés afin de déterminer leurs effets sur l’activation des macrophages. Cet article décrit des méthodes pour la dérivation, la stimulation et évaluation de la moelle épinière murine macrophages activés par l’anticorps in vitro et des macrophages péritonéaux murines activés avec anticorps in vivo. Enfin, nous montrent l’utilisation de western blot pour déterminer la contribution de cellule spécifique à l’activité des macrophages anti-inflammatoire des voies de signalisation. Ces protocoles peuvent être associés à des souris génétiquement modifiées, afin de déterminer l’effet d’une ou des protéines spécifiques sur l’activation des macrophages anti-inflammatoires. Ces techniques peuvent également servir à déterminer si les produits biologiques spécifiques peuvent agir en changeant les macrophages à un état d’activation anti-inflammatoires productrices de IL-10 qui réduit les réactions inflammatoires in vivo. Cela peut fournir des informations sur le rôle de l’activation de macrophages dans l’efficacité des produits biologiques au cours de modèles de maladies chez les souris et donnent un aperçu d’un nouveau mécanisme de potentiel d’action chez les personnes. À l’inverse, cela peut mettre en garde contre l’utilisationdes spécifiques produits biologiques à base d’anticorps pour traiter les maladies infectieuses, surtout si les macrophages jouent un rôle important dans la défense de l’hôte contre l’infection.
Introduction
Les macrophages sont des cellules immunitaires innées, qui jouent des rôles multiples dans la réponse immunitaire à l’infection ou de lésion. Les macrophages sont responsables d’initier une réponse immunitaire à l’infection ou un tissu de dommages, arrêt la réponse inflammatoire et favoriser la guérison de la réponse1. On peut citer les trois États d’activation mieux étudiés macrophage : 1) macrophages traités par l’interféron gamma (IFNγ) et bactérien lipopolysaccharide (LPS), désigné M (IFNγ + LPS), qui contribuent à la réponse inflammatoire ; 2) macrophages stimulés par l’interleukine 4 (IL-4), M(IL-4), qui sont associés à la réponse de guérison ; 3) macrophages stimulés par des complexes immuns (IC) et LPS, M (IC + LPS), qui ont la possibilité de désactiver la réponse inflammatoire2,3. M (IC + LPS) sont distinct des macrophages de cicatrisation M(IL-4) et n’expriment pas l’arginase enzyme (Arg-1) ou le FIZZ14. Le meilleur marqueur pour ces macrophages anti-inflammatoire est leur production de cytokine5. Macrophages ont plusieurs rôles dans le maintien de la santé, mais aussi contribuent à des maladies inflammatoires et cancer3. Pour cette raison, les macrophages sont une clé cible thérapeutique pour le traitement d’une grande variété de maladies. Il est important d’étudier les effets des anticorps sur leur état d’activation au point de traitements axés sur les macrophages pour maladie.
Le présent document porte sur l’utilisation des macrophages murins médullaire dérivé (BMDMs) et les macrophages péritonéaux pour tester l’effet des anticorps médicaments sur les réponses inflammatoires in vitro et in vivo. Récemment, il y a eu de nombreuses études montrant les effets d’anticorps le macrophage activation6,7,8. Macrophages activés conjointement avec des complexes immuns, qui sont des anticorps complexés avec un antigène et disques vinyles, un stimulus inflammatoire normalement, produisent des niveaux très élevés des cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et des niveaux très faibles de la cytokine pro-inflammatoire, interleukine 12 (IL-12)9. En outre, infliximab, un anticorps monoclonal contre le TNFα, a été trouvé au travail, en partie, en induisant des macrophages anti-inflammatoires par le biais de son fragment cristallisable (Fc) région7. Nous avons rapporté qu’IgIV + LPS induisent l’activation de macrophage anti-inflammatoire qui est similaire à M (IC + LPS), dans laquelle macrophages stimulés co produisent de grandes quantités d’IL-10 et de faibles quantités de la sous-unité de la cytokine pro-inflammatoire interleukine 12 ou 23 p40 ( IL-12/23p40), l’interleukine-6 (IL-6) et TNF8. IVIg est un médicament composé d’anticorps polyclonaux, principalement l’IgG, qui a été mis en commun du sang de plus de 1 000 donateurs10. Il est utilisé pour traiter une grande variété de maladies immunologiques, telles que le purpura thrombopénique idiopathique et polyradiculonévrite démyélinisante, mais son mécanisme d’action n’est pas totalement comprise11. Les effets des médicaments de l’anticorps basé sur l’activation des macrophages peuvent être évaluées à l’aide des méthodes décrites dans les présentes.
Les effets des produits biologiques spécifiques sur l’activation des macrophages peuvent être testés dans les BMDMs et les macrophages péritonéaux. À l’aide de ces sources de macrophage permet d’évaluer des cellules primaires. Les essais préliminaires d’anticorps sur des cellules en culture primaire nécessite moins de temps et un investissement monétaire que les autres modèles de maladie longue et coûteuse. En injectant un médicament dans une saine de souris in vivoet les cellules d’isolement et en les analysant ex vivo, on peut déterminer si les études sont garantis afin de déterminer si le traitement avec des produits biologiques influe sur l’activation des macrophages dans les modèles de maladies.
Avec peu d’études tester l’effet des thérapies biologiques sur le macrophage activation in vitro et in vivo directement, nos techniques apportent un avantage sur les autres techniques. Les techniques actuelles comportent des effets de médicament biologique test sur cellules mixtes populations in vitro, tels que l’effet de l’infliximab dans une réaction lymphocytaire mixte (MLR) ou IVIg sur des macrophages humains en cellules mononucléaires de sang périphérique, où l’effet ne peuvent être attribués à une cellule spécifique type7,12. L’utilisation de BMDMs et macrophages péritonéaux est avantageux à l’aide de lignées cellulaires, telles que les cellules RAW264.7, qui ne produisent pas de la cytokine pro-inflammatoire, IL-12, en réponse à LPS8,13. Tester l’effet d’un médicament à base d’anticorps sur le macrophage réponses ex vivo a avantages parce que les cytokines peuvent être attribués directement à des macrophages, plutôt que de déduire les réponses de macrophages en mesurant les concentrations sériques de cytokines14 . BMDMs et macrophages péritonéaux peuvent être dérivés et isolés des souris génétiquement modifiées afin de déterminer le rôle spécifique d’une protéine dans l’activation des macrophages anti-inflammatoires. Par exemple, nous avons utilisé Il10 déficients(- / -) BMDMs de démontrer qu’IgIV induite par la réduction de la production de cytokines pro-inflammatoires dépend partiellement de IL-10,8. Mécanisme d’un médicament d’action peut être étudiée à l’aide de western blot, où le rôle des protéines spécifiques et d’événements de signalisation peut être déterminé. PCR quantitative (qPCR) peut être effectuée sur les BMDMs ou les macrophages péritonéaux à montrent des profils d’expression génique qui résultent de l’activation de l’anticorps. Les modèles de maladies chez la souris peuvent fournir des informations sur l’efficacité potentielle des thérapies biologiques à base d’anticorps dans les modèles pour les maladies comme l’affection abdominale inflammatoire polyarthrite rhumatoïde, la maladie et le cancer15,16, 17. Toutefois, les techniques décrites ici vont renseignera sur le mécanisme d’action de ces produits biologiques en déterminant si elles induisent l’activité anti-inflammatoire macrophage.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de la Colombie-Britannique.
1. moelle osseuse Macrophage dérivation et Activation avec des anticorps
- Effectuer à l’aide de CO2 asphyxie l’euthanasie.
- Souris de place dans la chambre de l’induction. Euthanasier la souris avec l’anesthésie isoflurane 5 %, pour les 60-90 s, jusqu'à ce qu’immobile et respiration sont lente et profonde.
- Désactiver l’anesthésie isoflurane et administrer les 6-8 L/min de CO2 jusqu'à ce que la souris a cessé de respirer. Laisser souris avec CO2 pendant au moins encore pendant 5 min. vérifier qu’il n’est plus un rythme cardiaque ou la respiration. Effectuer une dislocation cervicale pour s’assurer de la mort.
NOTE : 8-12 semaines souris âgées offrent le rendement le plus élevé des macrophages.
- Pulvériser des pattes de souris avec l’éthanol à 70 % et les épingler avec bras et jambes allongés en décubitus dorsal sur un panneau de mousse. Avec les ciseaux et pinces pour tenir la peau, faites une coupe peu profonde (0,2 cm) pour enlever la peau et la fourrure de la surface de chacune des pattes.
Remarque : Effectuez cette procédure et toutes les manipulations de culture de tissus dans une hotte stérile. - Coupez le muscle pour rendre les tibias et fémurs visible. Supprimer les tibias et fémurs, en coupant les os et les muscles juste en dessous de l’articulation de la hanche et au-dessus des chevilles. Coupez autant musculaire que possible.
- OS de pulvérisation avec l’éthanol à 70 % et attendre 1 min pour qu’il puisse s’évaporer, puis placez-les dans une assiette bien 6 du milieu RAS OS (Iscove modifié de Dulbecco (IMDM), 10 % sérum fœtal (SVF)).
- Coupez les extrémités des os en coupant 0,1 cm d’os de la cheville et le haut du fémur afin que la cavité de l’OS est exposée. Veiller à ce que la moelle est visible et une aiguille de 26 calibre peut être placée dans la cavité osseuse.
- Couper les os et les muscles pour séparer les tibias et fémurs de l’articulation du genou. Insérer une aiguille de 26 calibre attachée à une seringue de 10 mL dans la cavité. Rincer la moelle osseuse dans un tube conique de 50 mL par 5 mL d’OS niveau moyen. Rincer les deux tibias et deux fémurs, d’une souris, dans chaque tube de 50 mL.
- Pipetter monter et descendre plusieurs fois ou vortex la moelle à une vitesse lente pour disperser doucement les touffes. Chaînes de moelle devraient être divisées en taches légères (moins de 0,5 mm) de la moelle osseuse. Remplir le tube conique à 50 mL avec une ossature moyenne fleur. Contenu de la pipette du tube conique dans une culture de tissu de2 cm 75 traités fiole et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 1 h.
NOTE : Mature macrophages et cellules mésenchymateuses deviendront adhérentes au ballon et être mis au rebut, tandis que les progéniteurs hématopoïétiques souhaités restent en suspension. - Pipetter, au milieu des progéniteurs hématopoïétiques dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger le tube à 300 x g à température ambiante pendant 5 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL de stimulant de milieu de culture de facteur (MCSF) des colonies de macrophages (IMDM, 10 % FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 150 μM Monothioglycerol (MTG)).
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre18. Ajouter le support pour remettre en suspension les cellules à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL, 1. 5 x 107 cellules/flacon de 30 mL de milieu et Pipeter monte et descend doucement. Pipetter 30 mL de la suspension dans un flacon de culture de tissus traité nouveaux 75 cm2 .
- Les jours 4 et 7 après culture initiale à l’étape 1.9, vérifiez que les cellules sont adhérentes et légèrement ramifiées à l’aide d’un microscope à champ lumineux contraste de phase inverse. Jeter le support contenant les cellules non adhérentes. Laver les cellules avec IMDM une fois et ajouter 30 mL de milieu de culture MCSF.
- Quand les cellules sont matures, 10e jour (> 95 % positive pour F4/80 et Mac-1), vérifiez à nouveau que les cellules sont adhérentes et légèrement.
- Plaque de cellules pour les stimulations, enlever le milieu de culture du flacon et ajoutez 8 mL de tampon de dissociation enzymatique cellulaire gratuit, basé sur EDTA (Table des matières). Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Grattez doucement, cellules avec une petite quantité de pression, à l’aide d’un grattoir de cellules stériles. Vérifier au microscope des cellules ont détaché de la surface du ballon. Pipetter cellules dissociées dans un tube conique de 50 mL. Rincer le ballon 3 fois avec 5 mL d’IMDM et piscine la solution de rinçage avec les cellules qui ont été récoltés. Centrifuger de cellules à 300 g à température ambiante pendant 5 min.
- Resuspendre le culot dans 3 mL de milieu de culture MCSF par tube conique de 50 mL. Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre18. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/mL et la plaque de 100 μl de suspension cellulaire (1 x 105 cellules/puits) / puits d’une culture de tissu de 96 puits traitée, plaque de fond plat.
NOTE : OS d’une souris vont générer suffisamment de cellules pour 100 puits. Si vous le souhaitez, 1 mL de cellules peuvent être plaqué dans une plaque de 6 puits (culture de tissus traités, plat en bas). Un plus grand nombre de cellules (1 x 106 cellules) peut être utile pour l’analyse par transfert western. - Une fois adhérent, stimuler les puits en doubles ou en triple chaque 10 ng/ml de LPS chez IMDM, 30 mg/mL d’IgIV, ou IgIV + LPS. Doses de LPS ou IVIg peuvent être titrés afin d’optimiser l’intervention. Laissez les puits en doubles ou en triple comme témoins non stimulés. Les incuber pendant 24 h (37 ° C, 5 % de CO2).
NOTE : Re-plaqués cellules devraient adhérer aux puits de culture de tissus moins de 1 h. - Recueillir les surnageants de cellule de chaque puits dans des tubes de microcentrifuge individuels 1,7 mL et enlever les particules en tournant à 10 000 x g pendant 5 min.
- Supprimer la cellule surnageante et éviter de déranger le culot. Placez la cellule clarifiée surnageant dans un tube de microcentrifuge stérile.
Remarque : Surnageants de cellule peuvent être essayés pour les cytokines IL-10 et sous-unité cytokine IL-12 / 23p 40, par dosage immunoenzymatique (ELISA) immédiatement, ou conservés à-80 ° C à long terme. Suivre le protocole de ELISA Kit disponible dans le commerce (Table des matières). Autres cytokines pro-inflammatoires peuvent être dosés, tels que l’IL-6 et TNF, car ils sont également réduits par cotraitement avec IVIg + stimulation du LPS par rapport à la stimulation avec le LPS seuls. Après la stimulation, les cellules adhérentes peuvent être préparés pour des techniques telles que le western blot ou polymérase quantitative PCR (Q-PCR) 19,20.
2. contester souris In Vivo avec IVIg et récolte des Macrophages péritonéaux
- Peser chaque souris.
Remarque : par exemple, pour une souris de 20 g, 500 µL d’IgIV est requise.
Remarque : Effectuez la procédure sous une hotte stérile.
Remarque : Placez délicatement l’aiguille chez la souris afin que vous n’injectez pas de PBS dans les organes, mais plutôt dans l’espace péritonéal.
Remarque : Pour chaque 5 mL de liquide injecté, environ 3,75 mL seront récupéré.
Remarque : Après la dernière injection, il peut être plus facile à extraire le liquide sur les côtés loin gauche et droite de la souris, où le liquide s’est accumulée. Les organes entraîne moins d’interférences avec l’aiguille à cette position.
Remarque : Les macrophages sera légèrement plus grands que les autres cellules péritonéales. Rendement typique est de 5 x 105 - 1 x 106 macrophages/souris à l’aide d’une souris C57BL/6 de type sauvage.
Facultatif : Si un grand nombre de globules rouges est présent dans le culot cellulaire, exécuter une étape de lyse pour les supprimer, en utilisant le tampon de lyse des globules rouges 1 x conformément aux instructions du fabricant.
Remarque : Il peut être nécessaire au pool de cellules de la souris pour une expérience si vous utilisez plus d’un triple puits ou titration stimulants. Par exemple, si une souris avait 5 x 105 macrophages, 500 μL d’électrodéposition moyen serait nécessaire. Il y aurait suffisamment de cellules pour 5 puits ou 1 expérience en double exemplaire, avec une seule dose de LPS.
NOTE : Après stimulation, les cellules adhérentes peuvent être préparés pour des techniques telles que la tache occidentale ou PCR.
3. attaque la souris in Vivo les IgIV + LPS et récolte des Macrophages péritonéaux
- Peser chaque souris. Calculer le volume d’IgIV (concentration de stock de 100 mg/mL) nécessaire pour fournir une dernière dose de 2,5 g/kg de poids corporel. Calculer le montant de LPS (concentration stock 100 μg/mL en IMDM) nécessaire pour fournir une dernière dose de 0,2 μg/g de poids de corps.
Remarque : par exemple, pour une souris de 20 g, 500 µL de solution mère de l’IGIV et 40 μL d’une solution de 100 μg/mL de LPS sont requises. - Dessiner la quantité requise d’IgIV et LPS dans une seringue stérile 1 mL muni d’un 26 stérile aiguille de calibre. Pour les souris témoins qui ne recevront pas d’IgIV, remplacez un volume équivalent d’IgIV par PBS stérile pH 7,4.
- Scruff la souris d’une main en saisissant sa peau à l’arrière du cou avec votre pouce et votre index et en tenant sa queue et les pattes avec les doigts restants. Incliner son corps vers le sol.
- Place de l’aiguille à un angle de 30-40° par rapport au ventre de la souris, dans le quadrant inférieur droit, biseau vers le haut et insérez de 1,5 cm. injecter l’IVIg LPS, ou PBS + LPS, par voie intrapéritonéale comme à l’étape 2.4.
- Après 1h, récolter des macrophages péritonéaux en procédant comme 2.5-2.10.
- Faire tourner les cellules vers le bas à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Prélever 1 mL de liquide de lavage récupéré et utiliser pour l’IL-10 et d’IL-12 / 23p 40 analyses par ELISA conformément aux instructions du fabricant ou congeler à-80 ° C pour les analyses futures.
Remarque : Pour assurer une comparaison exacte entre les traitements pour l’analyse de cytokine liquide de lavage, effectuez 5 mL flushs de la cavité péritonéale 4 fois pour un volume final de 15 mL. Pas tous les fluides seront récupérés auprès de chaque chasse d’eau. - Comme à l’étape 2.11, resuspendre et compter les macrophages viables.
Remarque : Les macrophages sera légèrement plus grands que les autres cellules péritonéales.
Facultatif : Si un grand nombre de globules rouges est présent dans le culot cellulaire, exécuter une étape de lyse conformément aux instructions du fabricant pour les supprimer, comme au point 2.11.
Remarque : Il peut être nécessaire aux cellules de la piscine depuis plus d’une souris pour une expérience. Par exemple, si une souris avait 5 x 105 macrophages, 500 μL d’électrodéposition moyen serait nécessaire.
NOTE : Les échantillons peuvent être utilisés immédiatement ou congelés et conservés à-80 ° C pour l’analyse de cytokine par ELISA.
Remarque : Les cellules peuvent être préparés pour techniques telles que la tache occidentale ou PCR, comme dans les étapes 1.16-1.17 et 2.14.
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Representative Results
Macrophages dérivé de moelle osseuse murine peuvent être cultivées à partir de précurseurs de cellules hématopoïétiques dans la ponction de moelle osseuse. Ponction de moelle osseuse regroupées à partir de fémurs et tibias de souris C57BL/6 en général donne 10 macrophages de la moelle osseuse provenant de7 , rendant une source commode de macrophages pour les expériences. BMDMs peuvent être utilisés pour tester la base drogue d’anticorps lorsque confrontés à un stimulus inflammatoire in vitro. La figure 1 illustre cette marque d’IgIV, Gammunex (GX), + LPS augmente la production de la cytokine anti-inflammatoire, IL-10, 7 fois par rapport à elle seule une stimulation LPS (Figure 1A) et diminue la production d’IL-12/23 p 40 (Figure 1 B). Figure 1 montre aussi que les différentes préparations d’IgIV comportent différemment. Même si les trois différentes préparations d’IgIV sont capables de diminuer IL-12 / 23p 40 significativement (Figure 1B), Octagam (OG) et Gammagard liquide (GL), n’augmentent pas significativement la production d’IL-10 en réponse à LPS (Figure 1 A). OG et GL sont capables de réduire considérablement la production d’IL-12/23 p 40 en réponse à LPS, mais à un degré moindre que GX. Ces résultats démontrent que les anticorps affecte la moelle osseuse dérivées activation des macrophages, et qu’il y a des différences entre les préparations du même médicament qui peut entraîner des modifications dans les réponses.
BMDMs peuvent être utilisés pour tester les effets mécaniques des IGIV, western blot. Macrophages activés par IC + LPS ont augmenté la phosphorylation des protéines (carte) kinases mitogène activé, p38 et Erk1/2, qui sont responsables d’une augmentation de la production de IL-1021. Dans la Figure 2 , les résultats montrent une tache occidentale typique pour détecter l’activation de la kinase carte nécessaire à la production d’IL-10 par les macrophages qui sont non stimulées, ou ont été stimulées par LPS, IVIg, ou IgIV + LPS. IgIV stimulation seule ou IgIV + LPS Co-stimulation a augmenté l’activation des MAP kinases Erk1/2, avec phosphorylation antérieure et prolongée par rapport à ceux observés avec LPS seuls. Activation de p38 est survenu plus tôt dans les macrophages stimulés par des IgIV + LPS comparées à celles stimulées avec LPS seuls. Ces résultats montrent que les méthodes, telles que western blot, peuvent être utilisées pour montrer les effets d’anticorps médicaments sur BMDMs de signalisation cellulaire. En plus de la production de cytokines, activation de la kinase carte peut servir à montrer que l’activation de macrophage anti-inflammatoire a eu lieu.
Mature, les résidents macrophages tissulaires peuvent également être isolés des souris pour évaluer les réponses d’IgIV 5.0 x 105 - 1,0 x 106 macrophages péritonéaux peuvent être isolés des souris C57BL/6 en bonne santé. Dans la Figure 3, macrophages péritonéaux de souris injectées avec IVIg n’augmentent pas significativement la production IL-10 en l’absence de stimulation in vitro, par rapport à des souris de PBS injecté. Lorsqu’elle est injectée de macrophages péritonéaux de l’IGIV souris sont stimulées par LPS ex vivo, ils produisent 6 fois IL-10 de plus que les souris injectées avec du PBS. Ils ne produisent pas, cependant, des quantités décelables de IL-12 / 23p 40 quand ils sont stimulés avec LPS ex vivo. Ces résultats démontrent que les effets de l’anticorps peuvent être analysés sur les macrophages en injectant le médicament in vivo et en cultivant des cellules ex vivo avec cette méthode.
Macrophage réponses aux anticorps et stimuli inflammatoires peuvent être mises en recouvrement in vivo. La production de cytokines peut être évaluée dans le liquide de lavage et dans les surnageants de ex vivo stimulée par les macrophages péritonéaux. La figure 4 montre la cytokine anti-inflammatoire IL-10 est augmentée dans le liquide de lavage (Figure 4A), les cellules péritonéales (Figure 4B) et les macrophages péritonéaux (Figure 4C) quelle souris sont mis au défi avec IVIg + LPS comparées à PBS + LPS. Production de la sous-unité de la cytokine pro-inflammatoire, IL-12 / 23p 40, est considérablement réduite dans les macrophages péritonéaux cultivés, mais pas dans le liquide de lavage. Cette méthode permet l’examen de l’impact de la drogue de l’anticorps sur les réactions inflammatoires in vivo et ex vivo.
Figure 1 : Production de macrophages IL-10 et d’IL-12 / 23p 40 en réponse à une stimulation Co avec différentes marques d’IgIV et LPS. Les macrophages de la moelle osseuse provenant de MCSF C57BL/6 ont été soit non stimulée (C), ou stimulées par LPS (10 ng/mL), immunoglobuline intraveineuse (30 mg/mL), ou IgIV + LPS. Trois marques différentes d’IgIV ont été testés : Gammunex (GX), Gammagard liquide (GL) et Octagam (OG). Les surnageants de macrophages ont été recueillies 24h après la stimulation et clarifiés par centrifugation. ELISA pour l’IL-10 (A) et d’IL-12/23 p 40 (B) ont été effectuées. Données sont des macrophages de n = 3 expériences indépendantes, avec des cellules de 1 souris individuelle par expérience, avec des tests ELISA dosés en doublet. Les données sont moyen ± SD. *P < 0,05, ** P < 0,001, ***P < 0,0001 pour la comparaison entre la stimulation de LPS et IgIV + Co-stimulation LPS. Analyse de variance (ANOVA) avec après le test de Tukey à comparaisons multiples ont été utilisées pour des analyses statistiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse par Western blot de l’activation de la carte kinase dans les macrophages activés par IgIV. MCSF dérivées de la moelle osseuse macrophages étaient non stimulées ou stimulées par LPS (10 ng/mL), IVIg GX (30 mg/mL), ou GX IgIV + LPS ; pour 0, 10, 40 ou 120 min. lysats de cellules entières (1,0 x 106 macrophages/lane) ont été soumis à sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel d’électrophorèse (SDS-PAGE) et western blot avec anticorps phospho-spécifiques pour p38 et extracellulaire kinase signal-réglée (Erk1/2), en plus de glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), comme un contrôle de chargement. Résultats présentés sont représentatifs de n = 3 expériences indépendantes, avec des cellules de 1 souris individuelle par expérience.La densitométrie pour pp38 et des niveaux de protéine pErk1/2, normalisée à GAPDH, en moyenne de 3 expériences indépendantes apparaissent au-dessous de chaque bande. Ce chiffre a été modifié par Kozicky et al.8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Production d’IL-10 par les macrophages de souris soumises à IgIV in vivo. souris C57BL/6 8 semaines ont reçu par voie intrapéritonéale PBS stérile (contrôle de l’injection) ou GX IgIV (2,5 g/kg). Après 1 h, les souris ont été euthanasiés et on a effectué des lavages péritonéaux. Macrophages péritonéaux ont été isolés à l’aide de la sélection de l’adhésion. Les macrophages ont été soit non stimulée (C), ou stimulées par LPS (10 ng/mL). Surnageants de cellules ont été récoltées et clarifiés après 24 h d’IL-10 tests ELISA. Données sont de n = 5 souris individuels par groupe dans 3 expériences indépendantes, avec Elisa dosés en doublet. Les données sont moyen ± SD. * P < 0,01 et NS = non significatif. Des analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’un Two-Way ANOVA avec post-test de Sidak pour les comparaisons multiples. Ce chiffre a été modifié par Kozicky et al.8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Production de IL-10 et d’IL-12 / 23p 40 de souris soumises à IgIV + LPS in vivo. des souris C57BL/6 8 semaines ont été par injection intrapéritonéale soit PBS + LPS (0,2 µg/g de poids de corps), sous forme de contrôle ; ou GX IgIV (2,5 g/kg de poids corporel) + LPS (0,2 µg/g de poids corporel). Après 1 h, les souris ont été euthanasiés et on a effectué des lavages péritonéaux. (A) clarifié le liquide de lavage, (B) clarifier conditionnés surnageants de cellules péritonéales au cours d’une étape de l’adhésion de macrophage 1 h, et (C) précisé 24h surnageants de macrophages péritonéaux (Mφ) ont été testés pour IL-10 et IL-12 / 23p 40 par ELISA. Les données sont moyen ± SD pour n = 5 souris en 3 expériences indépendantes, avec Elisa dosés en doublet. P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et NS = non significatif. Souris injectées avec PBS + LPS ont été comparées aux souris injectées avec IVIg + LPS à l’aide d’un test de Student t . Ce chiffre a été modifié par Kozicky et al.8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
États d’activation de macrophages jouent un rôle important dans les deux tissus l’homéostasie et maladie22. Les macrophages peuvent avoir distinctes ainsi que la superposition des États d’activation, selon repères dans leur microenvironnement3. Ils ont des rôles distincts dans toutes les étapes de la réponse inflammatoire : la défense contre les agents pathogènes, restitution de tissus et de guérison de blessure et ont aussi un état d’activation anti-inflammatoires distincts qu’il est important d’éteindre la réponse inflammatoire2 . Anti-inflammatoires macrophage activation requiert deux stimuli externes pour les macrophages produire des montants des cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et de faibles quantités de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-12,23. Un seul signal provient des anticorps agissant par l’intermédiaire des récepteurs Fc gamma, et le deuxième signal est un stimulus pro-inflammatoires, telles que les LPS ou IFNγ24,25. Sérum, complexes immuns et des anticorps anti-TNFα, ont été jugées à induire un état d’activation anti-inflammatoire IL-10-son haut en macrophages8,23,25,26. Notre groupe a déjà publié que murin de moelle osseuse provenant des macrophages et des macrophages péritonéaux stimulées avec IVIg produisent également des quantités élevées de IL-10 et peu à aucune pro-inflammatoires IL-12 / 23p 40 en réponse à LPS8. Nous avons aussi trouvé que les autres cytokines pro-inflammatoires, TNF et IL-6 sont également réduits par IgIV dans la moelle osseuse provenant de macrophages8. Les méthodes décrites ici peuvent être appliquées pour tester les autres anticorps de drogue basé dans la souris BMDMs et macrophages péritonéaux in vitro et in vivo.
Il y a beaucoup d’étapes essentielles dans l’essai thérapeutique fondée sur les anticorps sur moelle osseuse de souris et de macrophages péritonéaux. Maintenir la stérilité est essentiel pour chaque protocole. Si les cultures de macrophages sont contaminés par des micro-organismes de l’atmosphère, fourrure ou des excréments de souris, les macrophages répondra à ces stimuli par la production de cytokines pro-inflammatoires. Effectuer toutes les expériences dans une armoire de biosécurité, pulvérisant la souris abondamment avec de l’éthanol et veiller sur l’intégrité de l’intestin au cours de purges péritonéales sont essentielles. L’anticorps doivent également demeurer stérile et stockées selon les instructions du fabricant. Il ne peut pas être utilisé s’il est contaminé, expiré ou trouble. La turbidité diminue l’efficacité du médicament et peut se produire si le médicament n’est pas stocké à la température appropriée ou a été stocké pendant trop longtemps. IVIg peut être conservée à 4 ° C et seulement utilisé avant la date d’expiration est atteint, puisque les niveaux de production d’IL-10 peuvent être affectés. Par ailleurs, nous avons vu qu’il peut être congelé à-20 ° C sans effet sur les réponses. Différents lots d’IgIV conduisent à des résultats expérimentaux similaires, alors que différents types de préparations d’IgIV marque, comme dans la Figure 1, peuvent provoquer des réactions différentes chez les macrophages. Essentielles les contrôles, tels que non stimulés cellules et cellules stimulées par l’anticorps seul, doivent figurer dans chaque expérience pour écarter la possibilité de la contamination des macrophages ou la drogue.
Plusieurs modifications sont possibles à ces protocoles pour personnaliser une expérience. Dans l’état non enflammée, il peut être difficile d’isoler suffisamment macrophages péritonéaux de grandes expériences. Macrophages péritonéaux peuvent être provoquées par une injection intrapéritonéale de thioglycolate (TG). Se produit une réponse immunitaire, et après 4 jours, les macrophages péritonéaux stimulés peuvent être récolté27. Les macrophages recrutés peuvent être moins matures et ne représentent pas des cellules résidentes, comme nous avons utilisé ici, qui sont des considérations importantes. TG-a suscité des macrophages peuvent aussi ont intériorisé agar du bouillon TG, qui peut être une complication, en particulier si faire des expériences sur la phagocytose27. Souris de différentes origines génétiques, C57BL/6 ou BALB/c, peuvent également être utilisés pour des expériences et peuvent être choisis pour examiner l’incidence des anticorps sur les réponses de macrophage qui seront évalués dans les modèles de maladies nécessitant un bagage génétique spécifique. En outre, des souris génétiquement modifiées, comme les souris- / - de Il10, peuvent servir à évaluer la fonction des protéines spécifiques dans le mécanisme d’action d’un médicament, comme nous l’avons fait dans notre propre travail8. Différents stimuli inflammatoires permet également d’évaluer l’incidence des anticorps sur l’activation des macrophages. Pro-inflammatoire et hôte dérivé frais comme agonistes des récepteurs (TLR) (par exemple l’acide hyaluronique), ont été utilisés pour activer IL 10-productrices de macrophages,25,,28. Une considération importante est la dose de l’anticorps. La dose devrait être réglée pour obtenir la dose optimale en culture et en expérimentation animale, tel qu’il sera différent entre anticorps ainsi qu’aux fournisseurs. La dose choisie devrait également refléter la dose administrée à l’homme et sera différente entre les médicaments. IVIg est administré par un traitement anti-inflammatoire à fortes doses (25-35 mg/mL ou 2 g/kg de poids corporel), qui reflète les doses titrées utilisées dans ces protocoles29,30.
L’utilisation de la moelle osseuse et de macrophages péritonéaux ont des limites. Même si une amélioration par rapport à des lignées de cellules macrophages, BMDMs de souris sont encore artificiellement dérivées de cellules précurseurs hématopoïétiques. Essais de réponses immunitaires des macrophages in vitro est une étape importante pour la production d’anticorps compréhension, mais in vivo des expériences doivent être effectuées aussi bien. Par voie intraveineuse des stimuli en vivo suivie en cultivant des cellules ex vivo, peut fournir plus d’informations pour de futures études étudier si médicaments à base d’anticorps peuvent également être activé macrophages anti-inflammatoires dans un état de maladie. Conclusions sur ce qui se produit chez les personnes recevant des produits biologiques à base d’anticorps ne peuvent être tirées de ces expériences. Peu d’études ont été publiées pour évaluer les effets des IgIV sur monocyte humain dérivé macrophages in vitro. Une réduction du nombre d’IL-6 produisant des monocytes humains in vitro ont été rapportés, quand IVIg est stimulé conjointement avec le LPS par rapport à une stimulation par le LPS seul12. IgIV réduit le TNFα et production d’IL-6 quand ils sont stimulés avec la procalcitonine (PCT) en THP-1 homme monocytaire cellules31.
Les protocoles au sein de ce document ont des avantages par rapport aux méthodes existantes. La moelle osseuse provenant des macrophages et macrophages péritonéaux sont les cellules primaires, isolés directement à partir de souris, plutôt que d’être immortalisés lignées cellulaires.Des lignées de cellules de macrophage-comme des souris, telles que les cellules RAW264.7, ne produisent pas de la cytokine pro-inflammatoire, IL-12, en réponse à LPS, qui est une cytokine importante qui est réglementée par l’IL-10 qui est produite en réponse à IgIV8,13. Tester un médicament in vivo avec le LPS permet l’examen de l’effet du médicament sur l’environnement local péritonéale par l’intermédiaire de l’analyse du liquide de lavage, cellules péritonéales et plus précisément, les macrophages péritonéaux. C’est un court terme, le modèle simple qui peut fournir des informations importantes pour justifier l’examen des effets non spécifique d’anticorps lors de l’activation des macrophages dans les modèles animaux de la maladie plus longues et plus coûteuses. Il a un avantage par rapport aux modèles endotoxémie où la mesure expérimentale est souvent seulement la survie de souris ou de cytokines dans le sérum,14. Taux de survie et les concentrations sériques de cytokines sont des mesures utiles de la réponse immunitaire, mais ils ne montrent pas la contribution que les macrophages peuvent avoir spécifiquement. Isoler et à cultiver les macrophages péritonéaux d’une expérience de challenge montrent un effet direct et mesurable que thérapeutique anticorps peut avoir sur la fonction des macrophages.
Ces méthodes présentent des demandes d’essais et de concevoir des thérapies biologiques. L’utilisation d’anticorps comme agents thérapeutiques a considérablement augmenté ces dernières années. Cependant, ces thérapies peuvent avoir des effets supplémentaires inconnus sur les macrophages qui peuvent de reconnaître la portion Fc de l’anticorps et de modifier leur production de cytokines. L’anticorps anti-TNFα, infliximab, s’est avéré d’induire l’IL-10 et supprimer la prolifération des cellules T par le biais de sa portion Fc, et qui a été proposé comme l’un de ses mécanismes d’action de15,7,26. À l’aide de modèles génétiques, des protéines spécifiques peuvent être impliqués dans le mécanisme de comment ces médicaments affectent activation macrophage. Classes d’anticorps IgG et préparations d’anticorps peuvent être modifiées pour changer comment les macrophages sont affectées par des produits biologiques. Nos données indiquent la préparation et/ou de stockage du même médicament anticorps (IgIV) peut influer sur ses effets sur l’activation des macrophages. Les méthodes dans cet article permet de concevoir des thérapies qui n’ont pas ces effets, qui peuvent être essentielles pour maintenir l’immunosurveillance lors de thérapies contre le cancer, où les macrophages anti-inflammatoires pourraient favoriser la progression tumorale. Ces techniques pourraient également servir à concevoir et évaluer des médicaments qui n’ont pas ces effets, si désirable. Par exemple, il pourrait être bénéfique pour diminuer les réponses inflammatoires de macrophages et de créer des anti-inflammatoires macrophages productrices de IL-10, afin d’améliorer le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin ou la polyarthrite rhumatoïde.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
L.K. est le lauréat de l’Université de la Colombie-Britannique 4 ans (4YF) bourse d’études supérieures bourse. L.M.S. bénéficie d’une Association canadienne de gastro-entérologie / maladie de Crohn et la colite Canada / nouveau salaire de chercheur des IRSC Award et est un chercheur biomédical de la Michael Smith Foundation for Health Research. Ce travail a été soutenu par une subvention de projet de la société canadienne du sang, en collaboration avec les instituts de recherche en santé (# CIHR2016-LS de subventions).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
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