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Immunology and Infection

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

Published: December 26, 2017 doi: 10.3791/56689

Summary

Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.

Abstract

I macrofagi sono fagocitiche cellule dell'immunità innata, che avviare le risposte immunitarie ai patogeni e contribuiscono alla restituzione di tessuto e di guarigione. I macrofagi sono ugualmente importanti nella disattivazione le risposte infiammatorie. Abbiamo dimostrato che i macrofagi stimolati con l'immunoglobulina endovenosa (IVIg) possono produrre le quantità elevate della citochina antinfiammatoria, interleuchina 10 (IL-10) e bassi livelli di citochine pro-infiammatorie in risposta a lipopolisaccaridi batterici ( LPS). IVIg è che un anticorpo polivalente, principalmente immunoglobulina Gs (IgG), riuniti dal plasma di donatori di sangue più di 1.000. Serve a integrare gli anticorpi nei pazienti con deficienze immunitarie o sopprimere le risposte immunitarie in pazienti con condizioni autoimmuni o infiammatorie. Infliximab, un anticorpo di terapeutico anti-tumore necrosi fattore alfa (TNFα), ha anche dimostrato di attivare i macrofagi a produrre IL-10 in risposta a stimoli infiammatori. IVIg e altri biologici basati su anticorpi possono essere testati per determinare i loro effetti sull'attivazione del macrofago. Questo articolo descrive metodi per la derivazione, la stimolazione e la valutazione del midollo osseo murino macrofagi attivati da anticorpi in vitro e macrofagi peritoneali murini attivati con anticorpi in vivo. Infine, dimostriamo l'utilizzo di western blotting per determinare il contributo di specifici percorsi di attività antinfiammatoria del macrofago di segnalazione delle cellule. Questi protocolli possono essere utilizzati con topi geneticamente modificati, per determinare l'effetto di una specifica proteina su attivazione macrofagica anti-infiammatori. Queste tecniche è utilizzabile anche per valutare se biologics specifico può agire modificando i macrofagi a uno stato di attivazione anti-infiammatori producono IL-10 che riduce le risposte infiammatorie in vivo. Questo può fornire informazioni sul ruolo dell'attivazione macrofagica nell'efficacia dei farmaci biologici durante modelli di malattia in topi e forniscono approfondimenti un potenziale nuovo meccanismo di azione nelle persone. Al contrario, questo può ammoniscono contro l'uso dei farmaci biologici basati su anticorpi specifici per il trattamento di malattie infettive, soprattutto se i macrofagi svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro l'infezione.

Introduction

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata, che svolgono i ruoli multipli nella risposta immunitaria alle infezioni o lesioni. I macrofagi sono responsabili dell'avvio di una risposta immunitaria a danno di tessuto o di infezione, fermare la risposta infiammatoria e promuovere la guarigione di risposta1. Esempi dei tre stati di attivazione meglio studiati macrofago sono: 1) macrofagi trattati con interferone gamma (IFNγ) e lipopolisaccaride batterico (LPS), designato M (IFNγ + LPS), che contribuiscono alla risposta infiammatoria. 2) macrofagi stimolati con l'interleuchina 4 (IL-4), M(IL-4), che sono associati con la risposta di guarigione; 3) macrofagi stimolati con immunocomplessi (IC) e LPS, M (IC + LPS), che hanno la capacità di spegnere la risposta infiammatoria2,3. M (IC + LPS) sono distinti dai macrofagi di cicatrizzazione M(IL-4) e non esprimono l'arginasi enzima (Arg-1) o FIZZ14. Il miglior marcatore per questi macrofagi infiammatori è loro cytokine produzione5. I macrofagi hanno ruoli multipli nel mantenimento della salute, ma anche contribuiranno a malattie infiammatorie e cancro3. Per questo motivo, i macrofagi sono un fondamentale obiettivo terapeutico per il trattamento di un'ampia varietà di malattie. È importante studiare gli effetti degli anticorpi sul loro stato di attivazione di sviluppare trattamenti basati su macrofago per malattia.

Il focus di questa carta è sull'uso dei macrofagi del midollo osseo murino derivato (BMDMs) e macrofagi peritoneali di testare l'effetto di droghe dell'anticorpo su risposte infiammatorie in vitro e in vivo. Recentemente, ci sono stati più studi che mostrano gli effetti degli anticorpi il macrofago attivazione6,7,8. Macrofagi co-attivati con complessi immuni, che sono anticorpi complessati con un antigene e LPS, uno stimolo infiammatorio normalmente, producono livelli molto elevati della citochina antinfiammatoria IL-10 e livelli molto bassi di citochina pro-infiammatoria, interleuchina 12 (IL-12)9. Inoltre, infliximab, un anticorpo monoclonale contro il TNFα, è stato trovato a lavorare, in parte, inducendo antinfiammatori macrofagi attraverso suo frammento cristallizzabile (Fc) regione7. Abbiamo segnalato che IVIg + LPS inducono l'attivazione del macrofago antinfiammatori che è simile a M (IC + LPS), in cui co-stimolato i macrofagi producono grandi quantità di IL-10 e basse quantità della subunità citochina pro-infiammatoria Interleukin 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) e TNF8. IVIg è un farmaco composto da anticorpi policlonali, principalmente IgG, che è stata riunita dal sangue di più di 1.000 donatori10. Esso è usato per trattare una vasta gamma di malattie immunologiche, come purpura thrombocytopenic idiopatico e polineuropatia demielinizzante cronica, ma il suo meccanismo d'azione non è completamente capito11. Gli effetti delle droghe dell'anticorpo basato sull'attivazione del macrofago possono essere valutati utilizzando i metodi descritti nel presente documento.

Gli effetti dei farmaci biologici specifici sull'attivazione del macrofago possono essere testati in BMDMs e macrofagi peritoneali. Utilizzando queste fonti del macrofago consente la valutazione di cellule primarie. Test preliminari di anticorpi su cellule in coltura primaria richiede meno tempo e investimento monetario rispetto ad altri modelli di malattia che richiede tempo e costoso. Iniettare una droga in un topo sano in vivoe isolando le cellule e analizzarli ex vivo, si può determinare se gli studi sono autorizzati per valutare se il trattamento con farmaci biologici colpisce l'attivazione del macrofago in modelli di malattia.

Con pochi studi test direttamente l'effetto delle terapie biologiche sul macrofago attivazione in vitro e in vivo , le nostre tecniche forniscono un vantaggio rispetto a tecniche alternative. Le attuali tecniche comportano test effetti di farmaci biologici su cellule miste popolazioni in vitro, ad esempio l'effetto di infliximab in una reazione linfocitaria mista (MLR) o IVIg su macrofagi umani in cellule mononucleari di sangue periferico, dove l'effetto non può essere attribuita a una cella specifica tipo7,12. Utilizzando BMDMs e macrofagi peritoneali è vantaggioso rispetto all'utilizzo di linee cellulari, quali le cellule RAW 264.7, che non producono le citochine pro-infiammatorie, IL-12, in risposta a LPS8,13. Verificare l'effetto di un farmaco a base di anticorpi sul macrofago risposte ex vivo ha vantaggi perché risposte di citochina possono essere attribuite direttamente ai macrofagi, piuttosto che la deduzione di risposte del macrofago misurando i livelli di citochina del siero14 . BMDMs e macrofagi peritoneali possono essere derivati e isolati da topi geneticamente modificati per determinare il ruolo specifico di una proteina in attivazione macrofagica anti-infiammatori. Ad esempio, abbiamo utilizzato Il10 carente(- / -) BMDMs per dimostrare che IVIg-indotta di riduzione della produzione di citochine pro-infiammatorie dipende parzialmente dal-108. Meccanismo di azione di un farmaco può essere studiato usando macchiarsi occidentale, dove può essere determinato il ruolo delle proteine specifiche e segnalazione eventi. Reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) può essere eseguita su BMDMs o macrofagi peritoneali di mostrare pattern di espressione genica che derivano dall'attivazione dell'anticorpo. Modelli di malattia in topi possono fornire informazioni sull'efficacia potenziale di anticorpo-ha basato le terapie biologiche nei modelli per le malattie infiammatorie intestinali malattia, artrite reumatoide ed il cancro15,16, 17. Tuttavia, le tecniche qui descritte forniranno informazioni sul meccanismo di azione di questi farmaci biologici determinando se essi inducono l'attività antinfiammatoria del macrofago.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of British Columbia.

1. del midollo osseo del macrofago derivazione e attivazione con anticorpi

  1. Eseguire l'eutanasia usando CO2 asfissia.
    1. Del mouse posto nella camera di induzione. Eutanasia, mouse con 5% isoflurane anestesia, per 60-90 s, fino a quando l'immobile e la respirazione è profondo e lento.
    2. Spegnere l'anestesia isoflurano e amministrare di CO2 del 6-8 L/min fino a quando il mouse ha smesso di respirare. Lasciare mouse con CO2 per almeno altri 5 min verifica che non c'è più un battito cardiaco o la respirazione. Eseguire una dislocazione cervicale per assicurare la morte.
      Nota: 8-12 settimane vecchi topi forniscono il più alto rendimento dei macrofagi.
  2. Spray gambe del mouse con etanolo al 70% e bloccarli con braccia e gambe distese nella posizione supina sopra un bordo della gomma piuma. Con forbici e pinze per tenere la pelle, fate un taglio superficiale (0,2 cm) per rimuovere la pelle e del pelo dalla superficie di ciascuna delle zampe posteriori.
    Nota: Eseguire questa procedura e tutte le manipolazioni di cultura del tessuto in una cappa sterile.
  3. Tagliare il muscolo per rendere visibile delle tibie e femori. Rimuovere le tibie e femori, tagliando l'osso e i muscoli appena sotto l'articolazione dell'anca e sopra le caviglie. Tagliare come muscolo molto possibile.
  4. Spruzzare le ossa con etanolo al 70% e attendere 1 minuto per farlo evaporare, poi metterli in ben 6 piastra di medie a livello osseo (Iscove modificato medio di Dulbecco (IMDM), 10% siero bovino fetale (FBS)).
  5. Tagliare le estremità delle ossa di taglio 0,1 cm dell'osso fuori della caviglia e la parte superiore del femore in modo che la cavità dell'osso è esposto. Assicurarsi che il midollo è visibile e un ago di 26 calibro può essere posizionato nella cavità dell'osso.
  6. Tagliare le ossa e i muscoli per separare le tibie e femori da articolazioni del ginocchio. Inserire un ago di 26 calibro collegato a una siringa da 10 mL nella cavità. Sciacquare il midollo osseo in una provetta conica da 50 mL con 5 mL di osso a filo medio. Lavare due tibie e due femori, da un mouse, in ogni provetta da 50 mL.
  7. Pipettare su e giù parecchie volte o vortice il midollo a bassa velocità per disperdere delicatamente ciuffi. Stringhe del midollo devono essere suddiviso in macchie di piccolo (meno di 0,5 mm) del midollo. Riempire la provetta conica a 50 mL con l'osso a filo medio. Pipetta contenuto della provetta conica in una cultura di tessuto2 75 cm trattati boccetta e incubazione a 37 ° C, 5% CO2 per 1 h.
    Nota: Macrofagi maturi e cellule mesenchimali diventerà aderente al pallone ed essere scartato, mentre i progenitori ematopoietici desiderati rimangano in sospensione.
  8. Dispensare il mezzo con progenitori ematopoietici in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare la provetta a 300 x g e a temperatura ambiente per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura (MCSF) fattore di stimolazione della Colonia del macrofago (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 150 μM monothioglycerol (MTG)).
  9. Contare le celle utilizzando un emocitometro18. Aggiungere il terreno per risospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL, 1,5 x 107 cellule/boccetta in 30 mL di terreno e pipettare su e giù delicatamente. Pipettare 30 mL di sospensione in un matraccio da nuova coltura di tessuti trattato2 di 75 cm.
  10. Il giorno 4 e 7 ° giorno dopo la coltura iniziale nel passaggio 1,9, verificare che le cellule siano aderenti e leggermente ramificata utilizzando un microscopio a campo chiaro contrasto fase invertita. Scartare il supporto che contiene le cellule non-aderenti. Lavare le cellule con IMDM una volta e aggiungere 30 mL di terreno di coltura MCSF.
  11. Quando le cellule sono mature di giorno 10 (> 95% positivo per F4/80 e Mac-1), verificare di nuovo che le cellule sono aderenti e leggermente.
  12. Piastra di cellule per stimolazioni, rimuovere il terreno di coltura dalla beuta e aggiungere 8 mL di tampone di enzima libero, basato su EDTA cella dissociazione (Tabella materiali). Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C, 5% CO2.
  13. Raschiare delicatamente, cellule con una piccola quantità di pressione, con una spatola sterile cella. Check-nel microscopio che cellule staccato dalla superficie del pallone. Pipettare cellule dissociate in una provetta conica da 50 mL. Risciacquare il matraccio 3 volte con 5 mL di IMDM e piscina la soluzione di risciacquo con le cellule che sono state raccolte. Centrifugare le cellule a 300 x g a temperatura ambiente per 5 min.
  14. Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di coltura MCSF a tubo conico da 50 mL. Conteggio di cellule vitali utilizzando un emocitometro18. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL e piastra 100 µ l di sospensione cellulare (1 x 105 cellule/pozzetto) per pozzetto di una cultura di tessuto 96 pozzetti trattata, piatto fondo piatto.
    Nota: Le ossa da un mouse genererà abbastanza cellule per 100 pozzi. Se lo si desidera, 1 mL di cellule può essere placcato in una piastra a 6 pozzetti (coltura di tessuti trattati, fondo piatto). Un numero maggiore di cellule (1 x 106 cellule) può essere utile per analisi western blot.
  15. Una volta che è aderente, stimolare duplicato o triplicato pozzetti ciascuna con 10 ng/mL di LPS in IMDM, 30 mg/mL di IVIg, o IVIg + LPS. Dosi di LPS o IVIg possono essere titolate per ottimizzare le risposte. Lasciare i pozzetti duplicati o triplice copia come controlli non stimolati. Li Incubare per 24 h (37 ° C, 5% CO2).
    Nota: Ri-placcate cellule dovrebbero aderire pozzi di coltura del tessuto all'interno di 1 h.
  16. Raccogliere i surnatanti delle cellule da ciascun pozzetto in microcentrifuga individuali 1,7 mL e rimuovere particelle estranee di filatura a 10.000 x g per 5 min.
  17. Rimuovere il surnatante delle cellule ed evitare di disturbare il pellet. Mettere la cella chiarificata surnatante in una provetta da microcentrifuga sterile.
    Nota: I surnatanti delle cellule possono essere analizzati per citochine, IL-10 e subunità di citochina, IL-12 / 23p 40, dall'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) immediatamente, o conservati a-80 ° C a lungo termine. Seguire il protocollo di ELISA da kit disponibile in commercio (Tabella materiali). Altre citochine pro-infiammatorie può essere analizzato, come IL-6 e TNF, come sono anche ridotti dal co-trattamento con IVIg + stimolazione dei LPS rispetto alla stimolazione con LPS da solo. Dopo stimolazione, cellule aderenti possono essere preparate per tecniche quali macchiarsi occidentale o quantitativa della polimerasi reazione a catena (Q-PCR) 19,20.

2. impegnativo topi In Vivo con IVIg e macrofagi peritoneali di raccolta

  1. Pesare ogni mouse.
Calcolare il volume di IVIg (concentrazione stock di 100 mg/mL) necessari per fornire una dose finale di 2,5 g/kg peso corporeo per ogni mouse.
Nota: ad esempio, per un mouse 20g, 500 µ l di IVIg è richiesto.
  • Disegnare la quantità necessaria di IVIg in una siringa sterile da 1 mL dotata di una sterile 26 ago del manometro. Per topi di controllo che non riceverà IVIg, somministrare un volume equivalente di dose di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS), pH 7,4 invece di IVIg.
  • Collottola il mouse con una mano afferrando la sua pelle sul retro del collo con il pollice e il dito indice e che tiene la coda e le zampe posteriori con le restanti dita. Inclinare il suo corpo verso il suolo.
  • Posizionare l'ago a un angolo di 30-40° rispetto addome del mouse, nel quadrante inferiore destro, in rilievo fino e inserire 1,5 cm dell'ago. Iniettare l'IVIg o PBS intraperitonealmente. Aspettare 1 ora.
  • Eutanasia di topi con l'anestesia di isoflurano 5% seguita da 6-8 L/min CO2 asfissia (vedere i passaggi 1.1.1 - 1.1.2), o secondo orientamenti etici dell'istituzione.
  • Pin il mouse a un bordo della gomma piuma, con le membra sparse. Spruzzare le parti con etanolo al 70%.
    Nota: Eseguire la procedura in una cappa sterile.
  • Fate un taglio superficiale della pelle (0,2 cm) con le forbici lungo la linea mediana del mouse, per evitare di tagliare la cavità peritoneale. Tirare la pelle addominale fuori pancia del mouse usando il forcipe, affinché il rivestimento della parete peritoneale intatto è visibile.
  • Riempire una siringa da 5 mL con 5 mL di PBS sterile (pH 7.4). Inserire un 25 o 27 ago nella parte superiore della cavità da sinistra o da destra verso il centro del mouse con la smussatura dell'ago del manometro fino.
    Nota: Inserire l'ago con attenzione nel topo affinché non si inietti PBS negli organi, ma piuttosto, nello spazio peritoneale.
  • Spingere il fluido nella cavità peritoneale. Estrarre l'ago dalla cavità e massaggiare il peritoneo per 10 s per rimuovere tutte le cellule. Inserire l'ago nella parte superiore della cavità ed evitare gli organi. Raccogliere e mettere il liquido di lavaggio recuperato in una provetta conica da 15 mL sul ghiaccio.
    Nota: Per ogni 5 mL di fluido iniettato, saranno recuperati circa 3,75 mL.
  • Ripetere l'iniezione e recupero (passaggi 2,8-2,9) 3 più volte (volume di iniezione totale di 20 mL), per recuperare 15 mL di liquido di lavaggio in totale. Raccogliere il lavaggio da ogni mouse in una provetta conica separato da 15 mL.
    Nota: Dopo l'ultima iniezione, potrebbe essere più facile estrarre il liquido dal lato lontano destro e sinistro del mouse, dove ha accumulato fluido. Gli organi causerà meno interferenze con l'ago in questa posizione.
  • Selezione di celle verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in 500 μL di placcatura medio (IMDM, 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina) per topo svuotata. Conta Vitali macrofagi utilizzando un emocitometro18.
    Nota: I macrofagi sarà leggermente più grandi rispetto alle altre cellule peritoneali. Rendimento tipico è 5x105 - 1 x 106 . macrofagi/mouse utilizzando un mouse C57BL/6 di tipo selvaggio.
    Opzionale: Se un gran numero di globuli rossi è presente nel pellet cellulare, eseguire un passaggio di lisi per rimuoverli, utilizzando il buffer di lisi del globulo rosso di 1x secondo le istruzioni del produttore.
  • Risospendere le cellule in mezzo a 1 x 106 macrofagi/mL di placcatura e 100 μL per pozzetto in una piastra di coltura di tessuti trattato 96 pozzetti piatto inferiore della lastra.
    Nota: Potrebbe essere necessario al pool di cellule da più di un mouse per un esperimento se utilizza in triplice copia pozzi o titolazione stimolanti. Ad esempio, se un mouse ha avuto 5 x 105 macrofagi, 500 μL di placcatura medio sarebbe necessaria. Non ci sarebbe abbastanza cellule per 5 pozzi, o 1 esperimento in duplice copia, con una dose di LPS.
  • Incubare le cellule per 1 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire i macrofagi diventare aderente. Le cellule aderenti sono macrofagi peritoneali. Rimuovere i surnatanti delle cellule e cellule non aderenti. Lavare i pozzetti due volte con 200 μL IMDM (pre-riscaldato a 37 ° C), attendere 10 s e lentamente inclinare il piatto. Sostituire il mezzo di placcatura. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 per 30 min prima della stimolazione.
  • Stimolare i macrofagi con 10 ng/mL di LPS in IMDM, o lasciare non stimolate, come un controllo. Incubare per 24 h, raccogliere e chiarire i surnatanti delle cellule (vedere i passaggi 1.16-1.17) per analisi di citochina IL-10 da ELISA. Seguire il protocollo di ELISA da kit disponibile in commercio (Tabella materiali).
    Nota: Dopo stimolazione, cellule aderenti possono essere preparate per tecniche come il western blot o PCR.
  • 3. impegnativo topi in Vivo con IVIg + LPS e macrofagi peritoneali di raccolta

    1. Pesare ogni mouse. Calcolare il volume di IVIg (concentrazione stock di 100 mg/mL) necessari per fornire una dose finale di 2,5 g/kg peso corporeo. Calcolare la quantità di LPS (concentrazione stock 100 μg/mL in IMDM) necessaria per fornire una dose finale di 0,2 μg/g di peso di corpo.
      Nota: ad esempio, per un mouse 20g, 500 µ l di soluzione madre di IVIg e 40 µ l di una soluzione di 100 μg/mL di LPS è richiesti.
    2. Disegnare la quantità necessaria di IVIg e LPS in una siringa sterile da 1 mL con una sterile 26 ago del manometro. Per topi di controllo che non riceverà IVIg, è possibile sostituire un volume equivalente di IVIg con PBS sterile a pH 7,4.
    3. Collottola il mouse con una mano afferrando la sua pelle sul retro del collo con il pollice e il dito indice e che tiene la coda e le zampe posteriori con le restanti dita. Inclinare il suo corpo verso il suolo.
    4. Posto l'ago a un angolo di 30-40° rispetto addome del mouse, nel quadrante inferiore destro, smussato e inserire 1,5 cm. iniettare le IVIg + LPS, o PBS + LPS, intraperitonealmente as in passaggio 2.4.
    5. Dopo 1h, raccogliere macrofagi peritoneali attenendosi alla procedura 2.5-2.10.
    6. Selezione di celle verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere 1 mL di fluido di lavaggio recuperati e utilizzare per IL-10 e IL-12 / 23p 40 analisi di ELISA secondo le istruzioni del produttore o congelare a-80 ° C per le analisi future.
      Nota: Per garantire il confronto puntuale tra i trattamenti per l'analisi di citochina fluido di lavaggio, eseguire Internetlittlereno 5ml della cavità peritoneale 4 volte per un volume finale di 15 mL. Non tutto il liquido sarà recuperato da ogni filo.
    7. Come descritto al punto 2.11, risospendere e contare i macrofagi praticabili.
      Nota: I macrofagi sarà leggermente più grandi rispetto alle altre cellule peritoneali.
    Rendimento tipico è 5x105 - 1 x 106 . macrofagi/mouse utilizzando un mouse C57BL/6 di tipo selvaggio.
    Opzionale: Se un gran numero di globuli rossi è presente nel pellet cellulare, eseguire un passaggio di lisi secondo le istruzioni del produttore per rimuoverli, come descritto al punto 2.11.
  • Come descritto al punto 2.12, risospendere le cellule in medium di placcatura.
    Nota: Potrebbe essere necessario alle cellule di piscina da più di un mouse per un esperimento. Ad esempio, se un mouse ha avuto 5 x 105 macrofagi, 500 μL di placcatura medio sarebbe necessaria.
  • Come in 2.13, incubare le cellule per 1 h a 37 ° C 5% CO2 per consentire i macrofagi diventare aderente.
  • Raccogliere e chiarire il medium condizionato, secondo passi 1.14-1.15, da tutte le cellule peritoneali.
    Nota: I campioni possono essere utilizzati immediatamente o congelati e conservati a-80 ° C per l'analisi di cytokine Elisa.
  • Eseguire il passaggio 2.11, ma Incubare le cellule per 24 h non stimolate. Raccogliere e chiarire i surnatanti delle cellule, secondo passi 1.16-1.17, per l'analisi di cytokine Elisa.
    Nota: Le cellule possono essere preparate per tecniche come il western blot o PCR, come in passaggi 1.16-1.17 e 2.14.
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    Representative Results

    Macrofagi derivato del midollo osseo murino possono essere coltivati da precursori di cellule ematopoietiche nel midollo osseo aspira. Il midollo osseo aspira pool da femori e tibie di un topo C57BL/6 in genere resa 107 derivata midollare macrofagi, che li rende una fonte conveniente dei macrofagi per esperimenti. BMDMs può essere utilizzato per verificare le risposte di droga dell'anticorpo basato quando sfidato con uno stimolo infiammatorio in vitro. La figura 1 Mostra quel marchio di IVIg, Gammunex (GX), + LPS aumenta la produzione della citochina antinfiammatoria, IL-10, 7 volte rispetto alla stimolazione dei LPS da solo (Figura 1A) e diminuisce la produzione di IL-12/23 p 40 (Figura 1 B). Figura 1 dimostra anche che diverse preparazioni di IVIg eseguano in modo diverso. Anche se le tre diverse preparazioni di IVIg sono in grado di diminuire IL-12 / 23p 40 significativamente (Figura 1B), Octagam (OG) e Gammagard liquido (GL), non aumentare significativamente la produzione di IL-10 in risposta ai LPS (Figura 1 A). OG e GL sono in grado di ridurre significativamente la produzione di IL-12/23 p 40 in risposta ai LPS, ma in misura minore rispetto a GX. Questi risultati dimostrano che l'anticorpo colpisce midollo osseo derivato attivazione macrofagica, e che ci sono differenze tra le preparazioni del farmaco stesso che può causare cambiamenti nelle risposte.

    BMDMs può essere utilizzato per testare gli effetti meccanicistici di IVIg, mediante western blotting. Macrofagi attivati con IC + LPS hanno aumentato la fosforilazione delle chinasi della proteina (mappa) attivate mitogene, p38 ed Erk1/2, che sono responsabili per la produzione di IL-10 aumentata21. Risultati nella Figura 2 mostrano una tipica macchia occidentale per rilevare l'attivazione di chinasi mappa necessaria per la produzione di IL-10 dai macrofagi che sono non stimolate, o sono stati stimolati con LPS, IVIg, o IVIg + LPS. IVIg stimolazione da solo o IVIg + LPS co-stimolazione aumentata attivazione delle MAP chinasi, Erk1/2, con fosforilazione precedente e prolungata rispetto a quello osservato con LPS da solo. Attivazione di p38 si è presentata precedentemente in macrofagi stimolati con IVIg + LPS rispetto a quelle stimolate con LPS da solo. Questi risultati indicano che metodi come macchiarsi occidentale, utilizzabile per mostrare gli effetti delle droghe dell'anticorpo su BMDMs di segnalazione delle cellule. Oltre alla produzione di citochine, l'attivazione della chinasi della mappa può essere utilizzato per mostrare che si è verificato l'attivazione del macrofago anti-infiammatori.

    Maturo, macrofagi residenti del tessuto possono anche essere isolati dai topi per valutare le risposte di IVIg 5,0 x 105 - 1.0 x 106 macrofagi peritoneali possono essere isolati da un sano del mouse C57BL/6. Nella Figura 3, macrofagi peritoneali dai topi iniettati con IVIg non aumentano significativamente produzione di IL-10 in assenza di stimolazione in vitro, rispetto ai topi di PBS iniettato. Quando i macrofagi peritoneali da IVIg iniettato i topi sono stimolati con LPS ex vivo, che producono IL-10 6 volte di più rispetto ai topi iniettati con PBS. Non, tuttavia, producono quantità rilevabili di IL-12 / 23p 40 quando stimolati con LPS ex vivo. Questi risultati dimostrano che gli effetti dell'anticorpo possono essere testati sui macrofagi iniettando il farmaco in vivo e la coltura di cellule ex vivo con questo metodo.

    Macrofago risposte agli anticorpi e stimoli infiammatori possono essere valutati in vivo. La produzione di citochina può essere valutata nel fluido di lavaggio e in surnatanti di ex vivo ha stimolato i macrofagi peritoneali. La figura 4 Mostra la citochina antinfiammatoria IL-10 è aumentata nel fluido di lavaggio (Figura 4A), cellule peritoneali (Figura 4B) e macrofagi peritoneali (Figura 4C) quando topi sono sfidati con IVIg + LPS rispetto a PBS + LPS. Produzione della citochina pro-infiammatoria subunità, IL-12 / 23p 40, è ridotto significativamente in macrofagi peritoneali coltivati, ma non nel liquido di lavaggio. Questo metodo consente l'esame dell'impatto di un farmaco anticorpo su risposte infiammatorie in vivo come pure ex vivo.

    Figure 1
    Figura 1 : Produzione del macrofago IL-10 e IL-12 / 23p 40 in risposta alla co-stimolazione con diverse marche di IVIg e LPS. I macrofagi di derivazione midollare MCSF C57BL/6 erano entrambi non stimolate (C), o stimolate con LPS (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), o IVIg + LPS. Sono stati testati tre diverse marche di IVIg: Gammunex (GX), liquido Gammagard (GL) e Octagam (OG). I surnatanti macrofago sono stati raccolti 24 h dopo stimolazione e chiarificati mediante centrifugazione. Elisa per IL-10 (A) e IL-12/23 p 40 (B) sono state eseguite. I dati sono per i macrofagi da n = 3 esperimenti indipendenti, con celle da singoli 1 mouse ogni esperimento, con Elisa saggiati in duplicato. Dati sono mezzi ± SD. *P < 0.05, * * P < 0.001, * * *P < 0,0001 per confronto tra stimolazione dei LPS e IVIg + co-stimolazione dei LPS. Unidirezionale analisi della varianza (ANOVA) con post-test di Tukey per i confronti multipli sono stati utilizzati per analisi statistiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 2
    Figura 2 : Analisi di Western blot di attivazione della chinasi mappa in macrofagi attivati IVIg. MCSF derivato del midollo osseo macrofagi erano non stimolate o stimolate con i LPS (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), o IVIg GX + LPS; per 0, 10, 40 o 120 min lisati di cellule intere (1.0 x 106 macrofagi/lane) sono stati sottoposti a sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) e western blotting con anticorpi fosfo-specifici per p38 ed extracellulare chinasi segnale-regolata (Erk1/2), come pure gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), come un controllo di carico. Risultati mostrati sono rappresentativi di n = 3 esperimenti indipendenti, con celle da singoli 1 mouse ogni esperimento.Densitometria per pp38 e livelli della proteina pErk1/2, normalizzata di GAPDH, in media da 3 esperimenti indipendenti sono indicati sotto ciascuna banda. Questa figura è stata modificata da Cisar et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 3
    Figura 3 : Produzione di IL-10 dai macrofagi dai topi sfidati con IVIg vivo in. 8-settimana-vecchi topi C57BL/6 sono stati dati PBS sterile (controllo dell'iniezione) o GX IVIg (2,5 g/kg) per via intraperitoneale. Dopo 1 h, topi sono stati eutanasizzati e lavaggi peritoneali sono stati effettuati. Macrofagi peritoneali sono stati isolati mediante selezione di aderenza. I macrofagi sono stati entrambi non stimolate (C), o stimolate con LPS (10 ng/mL). I surnatanti delle cellule sono state raccolte e chiariti dopo 24 h per IL-10 ELISAs. I dati sono da n = 5 topi individuali per ogni gruppo eseguito in 3 esperimenti indipendenti, con Elisa saggiati in duplicato. Dati sono mezzi ± SD. * P < 0,01 e NS = non significativo. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un ANOVA a due vie con posttest di Sidak per i confronti multipli. Questa figura è stata modificata da Cisar et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 4
    Figura 4 : Produzione di IL-10 e IL-12 / 23p 40 da topi sfidati con IVIg + LPS in vivo. 8-settimana-vecchi topi C57BL/6 sono stati iniettati intraperitonealmente con sia PBS + LPS (peso corporeo di 0,2 µ g/g), come un controllo; o GX IVIg (2,5 g/kg di peso corporeo) + LPS (peso corporeo di 0,2 µ g/g). Dopo 1 h, topi sono stati eutanasizzati e lavaggi peritoneali sono stati effettuati. (A) chiarito dal fluido di lavaggio, (B) chiarito surnatanti condizionati da cellule peritoneali durante un passo di aderenza del macrofago di 1h, e (C) chiarito 24h surnatanti peritoneale del macrofago (Mφ) sono stati analizzati per IL-10 e IL-12 / 23p 40 da ELISA. Dati sono mezzi ± SD per n = 5 topi in 3 esperimenti indipendenti, con Elisa saggiati in duplicato. P < 0.05, * *P < 0,01, * * *P < 0,001 e NS = non significativo. Topi iniettati con PBS + LPS sono stati confrontati ai topi iniettati con IVIg + LPS con il test t di uno studente. Questa figura è stata modificata da Cisar et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Gli Stati di attivazione del macrofago svolgono un ruolo importante in entrambi di omeostasi e malattia del tessuto22. Macrofagi possono avere distinti così come sovrapposizione di Stati di attivazione, a seconda delle stecche in loro microambiente3. Hanno ruoli distinti in tutte le fasi della risposta infiammatoria: difesa contro gli agenti patogeni, ferita restituzione di tessuto e di guarigione, e hanno anche uno stato di attivazione antinfiammatori distinti che è importante per lo spegnimento della risposta infiammatoria2 . L'attivazione del macrofago antinfiammatori richiede due stimoli esterni per i macrofagi a produrre le quantità elevate della citochina antinfiammatoria IL-10 e basse quantità di citochine pro-infiammatorie, quali IL-1223. Un segnale proviene da anticorpi che agiscono attraverso i recettori Fc gamma, e il secondo segnale è uno stimolo pro-infiammatorie, come LPS o IFNγ24,25. Siero, gli immunocomplessi e anticorpi anti-TNF, sono stati trovati per indurre uno stato di attivazione antinfiammatoria IL-10-produing alto in macrofagi8,23,25,26. Il nostro gruppo ha precedentemente pubblicato che del midollo osseo murino derivate macrofagi e macrofagi peritoneali stimolate con IVIg inoltre producono elevate quantità di IL-10 e poco a nessun pro-infiammatorie IL-12 / 23p 40 in risposta a LPS8. Abbiamo anche trovato che altre citochine pro-infiammatorie, TNF e IL-6 sono anche ridotti di IVIg in derivazione midollare macrofagi8. I metodi descritti qui possono essere applicati per testare altre risposte anticorpali basato di droga in mouse BMDMs e macrofagi peritoneali in vitro e in vivo.

    Ci sono molti passaggi critici in fase di test basati su anticorpi terapeutica il midollo osseo di topo e macrofagi peritoneali. Mantenere la sterilità è importante per ogni protocollo. Se culture del macrofago sono contaminate con microrganismi provenienti dall'aria, pelliccia o feci dei topi, i macrofagi risponderà a tali stimoli con la produzione di citochine pro-infiammatorie. Esecuzione di tutti gli esperimenti in una cappa di biosicurezza, il mouse di spruzzatura liberalmente con etanolo e garantendo l'integrità dell'intestino durante peritoneale vampate sono essenziali. L'anticorpo deve anche rimanere sterili e conservati secondo le istruzioni del fabbricante. Non può essere utilizzato se è contaminata, scaduti o torbidi. Torbidità diminuirà l'efficacia del farmaco e può verificarsi se il farmaco non viene memorizzato alla temperatura adeguata o per troppo tempo è stato memorizzato. IVIg può essere conservato a 4 ° C e solo utilizzato prima della data di scadenza è raggiunto, poiché i livelli di produzione di IL-10 possono essere influenzati. In alternativa, abbiamo visto che può essere congelato a-20 ° C con nessun effetto sulle risposte. Diversi lotti di IVIg conducono a risultati sperimentali simili, mentre diversi tipi di preparazioni di marca di IVIg, come illustrato nella Figura 1, possono causare reazioni diverse nei macrofagi. I controlli essenziali, come stimolate le cellule e le cellule stimolate con anticorpo da solo, devono essere incluso in ogni esperimento per escludere la contaminazione dei macrofagi o della droga.

    Parecchie modifiche possono essere fatto a questi protocolli per personalizzare un esperimento. Nello stato non infiammata, può essere difficile isolare abbastanza macrofagi peritoneali per grandi esperimenti. Macrofagi peritoneali possono essere suscitati tramite l'iniezione intraperitoneale di tioglicolato (TG). Si verifica una risposta immunitaria, e dopo 4 giorni, hanno suscitato i macrofagi peritoneali possono essere raccolto27. I macrofagi reclutati possono essere meno maturi e non rappresentano le cellule residenti, come abbiamo usato qui, che sono considerazioni importanti. TG-suscitata macrofagi potrebbero anche hanno interiorizzato agar dal brodo TG, che può essere una complicazione, particolarmente se facendo esperimenti sulla fagocitosi27. Topi da diversi background genetici, C57BL/6 o BALB/c, possono anche essere utilizzati per esperimenti e possono essere scelti per esaminare l'impatto degli anticorpi sulle risposte del macrofago che saranno valutati in modelli di malattie che richiedono uno specifico background genetico. Inoltre, topi geneticamente modificati, come Il10- / - mouse, possono essere usati per valutare la funzione delle proteine specifiche nel meccanismo di azione di un farmaco, come abbiamo fatto nel nostro lavoro8. Diversi stimoli infiammatori è utilizzabile anche per valutare l'impatto degli anticorpi su attivazione macrofagica. IFNγ e host derivato toll-like receptor (TLR) agonisti (ad es. acido ialuronico), sono stati utilizzati per attivare la produzione di IL-10 macrofagi25,28. Una considerazione importante è la dose dell'anticorpo. La dose dovrebbe essere titolata per ottenere la dose ottimale nella cultura e negli esperimenti sugli animali, come sarà diverso tra anticorpi, come pure i fornitori. La dose scelta dovrebbe anche riflettere la dose somministrata agli esseri umani e varierà tra farmaci. IVIg è dato come una terapia antinfiammatoria ad alte dosi (25-35 mg/mL o 2 g/kg peso corporeo), che riflette la titolata dosi utilizzate in questi protocolli29,30.

    L'uso del midollo osseo e macrofagi peritoneali hanno limitazioni. Anche se un miglioramento rispetto le linee cellulari del macrofago, BMDMs del mouse sono cellule ancora artificialmente derivate dai precursori ematopoietici. Test risposte immunitarie dei macrofagi in vitro è un passo importante per le risposte dell'anticorpo di comprensione, ma in vivo gli esperimenti devono essere eseguite come bene. Iniezione di stimoli in vivo seguita da coltura cellule ex vivo, può fornire ulteriori informazioni per gli studi futuri di indagare se farmaci a base di anticorpi possono anche attivare i macrofagi antinfiammatori in uno stato di malattia. Non è possibile trarre conclusioni su ciò che si verifica in persone che ricevono farmaci biologici basati su anticorpi da questi esperimenti. Pochi studi sono stati pubblicati per valutare gli effetti di IVIg su monocito umano derivato macrofagi in vitro. Una riduzione del numero di IL-6 produce monociti umani in vitro sono stati segnalati, quando IVIg è co-stimolati con LPS rispetto alla stimolazione con LPS da solo12. IVIg riduce TNFα e produzione di IL-6 quando stimolati con procalcitonina (PCT) in essere umano THP-1 monocytic cellule31.

    I protocolli all'interno di questa carta hanno vantaggi rispetto ai metodi esistenti. Midollo osseo derivato macrofagi e macrofagi peritoneali sono cellule primarie, isolate direttamente dai topi, piuttosto che essere immortalato linee cellulari.Linee macrofago-come mouse, quali cellule RAW 264.7, non producono le citochine pro-infiammatorie, IL-12, in risposta ai LPS, che è un'importante citochina che è regolata da l'IL-10 che viene prodotta in risposta a IVIg8,13. Una droga test in vivo con LPS permette l'esame dell'effetto del farmaco sull'ambiente peritoneale locale attraverso l'analisi del fluido di lavaggio, cellule peritoneali e in particolare, i macrofagi peritoneali. È un a breve termine, il modello semplice che può fornire informazioni importanti per giustificare l'esame degli effetti non specifici di anticorpi su attivazione macrofagica in più lunghi e più costosi modelli animali della malattia. Ha un vantaggio rispetto ai modelli di endotossiemia dove la misura sperimentale è spesso solo mouse sopravvivenza o citochine in siero14. I tassi di sopravvivenza e citochine del siero sono misure importanti della risposta immunitaria, ma non mostrano il contributo che i macrofagi possono avere in particolare. Isolamento e coltura di macrofagi peritoneali da un esperimento di sfida Mostra un effetto diretto e misurabile che terapeutica dell'anticorpo possa avere sulla funzione del macrofago.

    Questi metodi hanno applicazioni per test e la progettazione di terapie biologiche. L'uso di anticorpi come terapeutica è aumentato drammaticamente negli ultimi anni. Tuttavia, queste terapie possono avere ulteriori effetti sconosciuti sui macrofagi che possono riconoscere la porzione Fc dell'anticorpo e cambiare la loro produzione di citochina. L'anticorpo anti-TNF, infliximab, è stato indicato per indurre IL-10 e sopprimere la proliferazione delle cellule T attraverso la porzione Fc, e che è stato proposto come uno dei suoi meccanismi di azione7,15,26. Utilizzando modelli genetici, proteine specifiche possono essere implicate nel meccanismo di come questi farmaci influenzano l'attivazione del macrofago. Classi di anticorpi IgG e preparazioni a base di anticorpi possono essere modificate per modificare come macrofagi sono colpiti da biologics. I nostri dati indicano la preparazione e/o deposito del farmaco stesso anticorpo (IVIg) possa avere un impatto relativo effetti sull'attivazione del macrofago. I metodi all'interno di questa carta è utilizzabile per progettare le terapie che non hanno questi effetti, che possono essere fondamentali per mantenere immunosorveglianza durante terapie del cancro, dove i macrofagi infiammatori potrebbero promuovere la progressione del tumore. Queste tecniche potrebbero essere utilizzate anche per progettare e valutare i farmaci che hanno questi effetti, se opportuno. Ad esempio, potrebbe essere utile per ridurre le risposte infiammatorie dei macrofagi e creare i macrofagi producono IL-10 anti-infiammatori per migliorare il trattamento per le malattie infiammatorie intestinali o artrite reumatoide.

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    Disclosures

    Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

    Acknowledgments

    La rosa è il destinatario del premio borsa di studio laureato 4-anno fellowship (4YF) University of British Columbia. L.M.S è il destinatario di un'associazione canadese di Gastroenterologia / di Crohn e colite Canada / CIHR nuovo investigatore stipendio premio ed è uno studioso biomedica della Fondazione Michael Smith per ricerca di salute. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto dal Canadian Blood Services, in collaborazione con la canadese istituti di ricerca sanitaria (concessione n # CIHR2016-LS).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) Life technologies 12440053
    Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 12483-020
    Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) Stemcell technologies 78059
    Penicillin-streptomycin Life technologies 15140148
    Monothioglycerol (MTG) Sigma 88640
    1X red blood cell lysis buffer eBioscience
    Cell dissociation buffer Life technologies 13150016 Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA
    Lipopolysaccharide (LPS) Sigma aldrich L 4516 From E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex) Grifols Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    IVIg (Gammagard liquid) Baxter Healthcare Corporation Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    IVIg (Octagam) Octapharma Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 Life technologies 10010023
    mouse IL-10 ELISA BD biosciences 555252
    mouse IL-12/23p40 ELISA BD biosciences 555165
    anti-Erk1/2 antibody Cell signalling technology 9101
    anti-pp38 antibody Cell signalling technology 9211
    anti-GAPDH antibody Fitzgerald industries 10R-G109A
    26 g needle BD biosciences 305110
    1 mL syringe BD biosciences 309659
    10 mL syringe BD biosciences 309604
    15 mL conical tube BD biosciences 352096
    50 mL conical tube BD biosciences 352070
    microcentrifuge tube (1.7 mL) Diamed SPE155-N
    75 cm2 tissue culture treated flask BD biosciences 353136
    Cell scraper BD biosciences 353085
    Forcepts VWR 82027-386 fine tip, dissecting 
    Scissors VWR 82027-582 Delicate, 4 1/2"
    Brightfield microscope Motic AE31 Inverted phase contrast
    Scale  Mettler  PE 3000

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    References

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    Kozicky, L., Sly, L. M. Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (130), e56689, doi:10.3791/56689 (2017).

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