Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering af antistof-baserede lægemidler virkninger på Murine knoglemarven og Peritoneal makrofag aktivering

Published: December 26, 2017 doi: 10.3791/56689

Summary

Antistof-baserede lægemidler har revolutioneret behandling af inflammatoriske sygdomme. Ud over at have direkte virkninger på specifikke mål, kan antistoffer aktivere makrofager at blive anti-inflammatorisk. Denne protokol beskriver hvordan anti-inflammatoriske makrofag aktivering kan være vurderet in vitro ved hjælp af musen knoglemarv makrofager og in vivo med peritoneal makrofager.

Abstract

Makrofager er fagocyterende medfødte immun celler, som indlede immunrespons til patogener og bidrage til healing og væv tilbagelevering. Makrofager er lige vigtige i at slukke inflammatoriske respons. Vi har vist at makrofager stimuleret med intravenøs immunglobulin (IVIg) kan producere store mængder af den anti-inflammatoriske cytokine, interleukin 10 (IL-10), og lave niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner som reaktion på bakteriel lipopolysaccharides ( LP'ER). IVIg er en polyvalent antistof, primært immunoglobulin Gs (IgGs), samlet fra plasma af mere end 1.000 bloddonorer. Det bruges til at supplere antistoffer hos patienter med immun mangler eller at undertrykke immun svar hos patienter med autoimmune eller inflammatoriske betingelser. Infliximab, en terapeutisk anti-tumor nekrose faktor alfa (TNFα) antistof, har også vist sig at aktivere makrofager at producere IL-10 svar på inflammatoriske stimuli. IVIg og andre antistof-baserede biologics kan blive testet for at bestemme deres virkninger på makrofag aktivering. Dette papir beskriver metoder til afledning, stimulation og vurdering af murine knoglemarv makrofager aktiveres af antistoffer i vitro og murine peritoneal makrofager aktiveret med antistoffer in vivo. Endelig vil demonstrere vi brugen af western blotting Bestem bidrag af specifikke celle signalering veje til anti-inflammatoriske makrofag aktivitet. Disse protokoller kan bruges med gensplejsede mus, for at fastlægge effekten af en bestemt de(n) på anti-inflammatorisk makrofag aktivering. Disse teknikker kan også bruges til at vurdere, om specifikke biologics kan fungere ved at ændre makrofager en IL-10-producerende anti-inflammatoriske aktivering tilstand, der reducerer inflammatoriske respons in vivo. Dette kan give oplysninger om rollen af makrofag aktivering i effekten af biologics under sygdomsmodeller i mus, og giver indblik i en potentiel ny virkningsmekanisme i mennesker. Omvendt kan det advarer mod brugen af specifikke antistof-baserede biologics til behandling af smitsomme sygdomme, især hvis makrofager spiller en vigtig rolle i vært forsvar mod denne infektion.

Introduction

Makrofager er medfødte immun celler, som spiller flere roller i immunresponset infektion eller skade. Makrofager er ansvarlig for at indlede en immunrespons på infektion eller væv skader, standse den inflammatoriske respons og fremme en healing svar1. Eksempler på de tre bedste studerede makrofag aktivering stater er: 1) makrofager behandlet med interferon gamma (IFNγ) og bakteriel LPS (LPS), udpeget M (IFNγ + LPS), som bidrager til det inflammatoriske respons; 2) makrofager stimuleret med interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), der er forbundet med den helbredende reaktion; 3) makrofager stimuleret med immunkomplekser (IC) og LP'ER, M (IC + LPS), som har evnen til at slukke det inflammatoriske respons2,3. M (IC + LPS) adskiller sig fra M(IL-4) sårheling makrofager og udtrykke ikke enzym arginase (Arg-1) eller FIZZ14. Den bedste markør for disse anti-inflammatoriske makrofager er deres cytokin produktion5. Makrofager har flere roller i at bevare sundhed, men også bidrage til inflammatoriske sygdomme og kræft3. På grund af dette er makrofager en vigtigste terapeutiske mål for behandling af en lang række sygdomme. Det er vigtigt at undersøge virkningerne af antistoffer på deres aktiveringstilstanden at udvikle makrofag-baserede behandlinger for sygdommen.

Dette papir fokuserer på brug af murine knoglemarv afledt makrofager (BMDMs) og peritoneal makrofager at teste effekten af antistof narkotika på inflammatoriske respons in vitro og i vivo. For nylig har der været flere undersøgelser, der viser konsekvenserne af antistoffer på makrofag aktivisering6,7,8. Makrofager Co aktiveret med immunkomplekser, der er antistoffer kompleksbundet med et antigen og LP'ER, en normalt inflammatoriske stimulus, producere meget høje niveauer af anti-inflammatorisk cytokin, IL-10 og meget lave niveauer af det pro-inflammatoriske cytokine, interleukin 12 (IL-12)9. Hertil kommer, infliximab, et monoklonalt antistof mod TNFα, har vist sig for at arbejde, dels ved at inducere anti-inflammatoriske makrofager gennem sin fragment crystallizable (Fc) region7. Vi har rapporteret, at IVIg + LPS fremkalde anti-inflammatoriske makrofag aktivering, der svarer til M (IC + LPS), hvori Co stimuleret makrofager producerer store mængder af IL-10 og lavt beløb af pro-inflammatoriske cytokine subunit Interleukin 12 eller 23 p40 ( Il-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) og TNF8. IVIg er et stof består af polyklonale antistoffer, primært IgG, som har været samlet fra mere end 1.000 donorer10blod. Det bruges til at behandle en bred vifte af immunologiske sygdomme, såsom idiopatisk thrombocytopenisk purpura og kronisk demyeliniserende polyneuropati, men dets virkningsmekanisme er ikke helt forstået11. Virkningerne af antistof baseret narkotika på makrofag aktivering kan vurderes ved hjælp af metoder, der beskrives heri.

Virkningerne af specifikke biologics på makrofag aktivering kan testes i BMDMs og peritoneal makrofager. Ved hjælp af disse makrofag kilder tillader vurdering af primærelementer. Indledende test af antistoffer på kulturperler primærelementer kræver mindre tid og monetær investering end andre tidskrævende og dyre sygdomsmodeller. Ved at indsprøjte et stof i en sund mus i vivo, og isolere cellerne og analysere dem ex vivo, kan man bestemme, hvis undersøgelser er berettiget til at vurdere, om behandling med biologiske lægemidler påvirker makrofag aktivering i sygdomsmodeller.

Med kun få undersøgelser teste effekten af biologiske behandlinger på makrofag aktivering in vitro og i vivo direkte, give vores teknikker en fordel over alternative teknikker. Aktuelle teknikker indebærer test biologiske lægemiddel virkninger på blandet celle populationer i vitro, såsom effekten af infliximab i en blandet lymfocyt reaktion (MLR) eller IVIg på menneskelige makrofager i perifert blod mononukleære celler, hvor effekten ikke kan tilskrives en bestemt celle type7,12. Ved hjælp af BMDMs og peritoneal makrofager er en fordel over ved hjælp af cellelinjer, såsom RAW264.7 celler, der ikke producerer den pro-inflammatoriske cytokine, IL-12, som svar på LPS8,13. Test effekt af en antistof-baserede stof på makrofag svar ex vivo har fordele, fordi cytokin svar kan henføres direkte til makrofager, snarere end udlede makrofag svar ved måling af serum cytokin niveauer14 . BMDMs og peritoneal makrofager kan være afledt og isoleret fra genmodificerede mus til at bestemme den specifikke rolle af et protein i anti-inflammatoriske makrofag aktivering. For eksempel har vi brugt Il10 mangelfuld(- / -) BMDMs at demonstrere at IVIg-induceret reduktion af pro-inflammatoriske cytokine produktion er delvist afhængig af IL-108. Et lægemiddel virkningsmekanisme kan undersøges ved hjælp af western blotting, hvor rollen specifikke proteiner og signalering begivenheder kan bestemmes. Kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR) kan udføres på BMDMs eller peritoneal makrofager at vise mønstre af genekspression, der skyldes antistof aktivering. Sygdomsmodeller i mus kan give oplysninger om den potentielle effekt af antistof-baserede biologiske behandlinger i modeller for sygdomme som inflammatoriske tarm sygdom, reumatoid arthritis, og kræft15,16, 17. men de teknikker, der er beskrevet her vil give oplysninger om virkningsmekanisme af disse biologiske lægemidler ved at bestemme, om de fremkalde anti-inflammatoriske makrofag aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of British Columbia.

1. knoglemarven makrofag afledning og aktivering med antistoffer

  1. Udføre eutanasi ved hjælp af CO2 kvælning.
    1. Sted musen i induktion kammer. Aflive mus med 5% isofluran anæstesi, 60-90 s, indtil immobile og vejrtrækning er dyb og langsom.
    2. Slukke for isofluran anæstesi og administrere 6-8 L/min. af CO2 , indtil musen har stoppet vejrtrækning. Forlade mus med CO2 på i mindst 5 min. Kontroller at der er ikke længere en puls eller åndedræt. Udføre en cervikal dislokation for at sikre død.
      Bemærk: 8-12 uger gamle mus giver det størst mulige udbytte af makrofager.
  2. Spray mus ben med 70% ethanol, og pin dem med arme og ben strakt ud i den liggende stilling over en skum bord. Med saks og pincet til at holde huden, gør en lavvandet cut (0,2 cm) til at fjerne hud og pels fra overfladen af hver af bagbenene.
    Bemærk: Udføre denne procedure og alle vævskultur manipulationer i en steril hætte.
  3. Trim muskel for at synliggøre forbenede og lårben. Fjern de forbenede og lårben, ved at skære knogler og muskler lige nedenfor hofteleddet og over anklerne. Trim så meget muskelmasse som muligt.
  4. Spray knogler med 70% ethanol og vente 1 min til at fordampe, og Placer dem i 6 godt plade af knoglen flush medium (Iscoves modificerede Dulbecco's medium (IMDM), 10% føtal bovint serum (FBS)).
  5. Trimme enderne af knoglerne ved at skære 0,1 cm af knogle off ankel og toppen af lårbenet, således at den knogle hulrum er udsat. Sikre, at marven er synlig og en 26 gauge kanyle kan placeres i knoglen hulrum.
  6. Skære knogler og muskler til at adskille de forbenede og lårben fra knæleddene. Indsæt en 26 gauge kanyle tilknyttes en 10 mL sprøjte ind i hulrummet. Skyl knoglemarven i en 50 mL konisk slange med 5 mL af knogle flush medium. Skylle to forbenede og to lårben, en mus, til hver 50 mL tube.
  7. Pipetteres op og ned flere gange eller vortex marv ved en langsom hastighed til forsigtigt spredes klumper. Strenge af marv skal brydes op i lille (mindre end 0,5 mm) pletter af marv. Fyld den koniske rør til 50 mL med knogle flush medium. Pipette indholdet af koniske rør ind i en 75 cm2 vævskultur behandlet kolbe, og der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 for 1 h.
    Bemærk: Modne makrofager og mesenchymale celler bliver vedhængende kolben og kasseres, mens de ønskede hæmatopoietisk stamfaderen forbliver i suspension.
  8. Der afpipetteres medium med hæmatopoietisk ophav i en 50 mL konisk slange. Der centrifugeres rør på 300 x g ved stuetemperatur i 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i 5 mL af makrofag koloni stimulerende faktor (MCSF) næringssubstratet (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penicillin/streptomycin og 150 μM monothioglycerol (MTG)).
  9. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer18. Tilføje medium resuspend celler til en koncentration på 0,5 x 106 celler/mL, 1.5 x 107 celler/kolbe i 30 mL medium, og tilsæt forsigtigt op og ned. Der afpipetteres 30 mL af suspension i en ny 75 cm2 vævskultur behandlet kolbe.
  10. På dag 4 og 7 efter indledende kultur i trin 1.9, Kontroller, at cellerne er tilhænger og lidt grenet ved hjælp af en omvendt fase kontrast lysfelt mikroskop. Kassere det medium, der indeholder ikke-tilhænger celler. Cellerne vaskes med IMDM én gang og der tilsættes 30 mL MCSF næringssubstratet.
  11. Når cellerne er modne af dag 10 (> 95% positive for F4/80 og Mac-1), kontrollere igen, at cellerne er tilhænger og lidt.
  12. Plade celler for stimulering, fjerne næringssubstratet fra kolben og tilføje 8 mL af enzymet gratis, EDTA-baserede celle dissociation buffer (Tabel af materialer). Inkuber celler i 5 min ved 37 ° C, 5% CO2.
  13. Skrabe celler forsigtigt, med en lille mængde af pres, ved hjælp af en steril celle skraber. Check i mikroskopet, at cellerne har løsrevet fra kolben overflade. Der afpipetteres dissocierede celler i en 50 mL konisk slange. Skyl kolben 3 gange med 5 mL af IMDM og pool renseopløsningen med de celler, der er høstet. Der centrifugeres celler på 300 x g ved stuetemperatur i 5 min.
  14. Resuspenderes celle i 3 mL af MCSF næringssubstratet per 50 mL konisk tube. Grev levedygtige celler ved hjælp af en hemocytometer18. Resuspend celler i en koncentration på 1 x 106 celler/mL og pladen 100 μL af cellesuspension (1 x 105 celler/brønd) pr. brønd af en 96-brønd vævskultur behandlet, flad bundplade.
    Bemærk: Knogler fra en mus vil generere nok celler for 100 brønde. Hvis det ønskes, kan være forgyldt 1 mL af celler i en 6-godt plade (vævskultur behandlede, flad bund). Et større antal celler (1 x 106 celler) kan være nyttig for vestlige skamplet analyser.
  15. Når klæbende, stimulere dobbelt eller tredobbelt brønde hver med 10 ng/mL af LP'ER i IMDM, 30 mg/mL af IVIg, eller IVIg + LPS. Doser af LP'ER eller IVIg kan titreres til at optimere svar. Forlade dobbelt eller tredobbelt brønde som unstimulated kontrol. Inkuber dem i 24 timer (37 ° C, 5% CO2).
    Bemærk: Re forgyldt celler skal overholde vævskultur brøndene i 1 h.
  16. Indsamle celle analysere fra hver brønd i individuelle 1,7 mL microcentrifuge rør og fjerne eventuelle partikler af spinning på 10.000 x g i 5 min.
  17. Fjern supernatanten celle og undgå at forstyrre pelleten. Placere cellen klarede supernatanten i en steril microcentrifuge tube.
    Bemærk: Celle analysere kan analyseres for cytokiner, IL-10 og cytokin subunit, IL-12 / 23p 40, af enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) straks, eller opbevares ved-80 ° C lang sigt. Følg ELISA protokol fra kommercielt tilgængeligt kit (Tabel af materialer). Andre pro-inflammatoriske cytokiner der kan analyseres som IL-6 og TNF, som de er også reduceret ved co behandling med IVIg + LPS stimulation i forhold til stimulation med LP'ER alene. Efter stimulation, kan vedhængende celler være forberedt på teknikker som western blotting eller kvantitative polymerase kæde reaktion (Q-PCR) 19,20.

2. udfordrende mus In Vivo med IVIg og høst Peritoneal makrofager

  1. Veje hver mus.
Beregne omfanget af IVIg (100 mg/mL stock koncentration) skulle give en sidste dosis på 2,5 g/kg kropsvægt for hvert mus.
Bemærk: For eksempel, for en 20 g mus, 500 µL af IVIg er nødvendig.
  • Trække den nødvendige mængde af IVIg til en steril 1 mL sprøjten udstyret med en steril 26 gauge kanyle. Control mus, der ikke modtager IVIg, administrere en ækvivalent dosis volumen af sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7,4 i stedet for IVIg.
  • Harmoniske mus med den ene hånd ved at snuppe skindet på bagsiden af halsen med tommel- og pegefinger og holder sin halen og bagbenene med dine resterende fingre. Vippe sin krop mod jorden.
  • Placer nålen i en 30-40° vinkel i forhold til musens maven, i den nederste højre kvadrant, facet op, og indsætte 1,5 cm af nålen. Injicere IVIg eller PBS intraperitoneal. Vent 1 h.
  • Aflive mus med 5% isofluran anæstesi efterfulgt af 6-8 L/min CO2 kvælning (Se trin 1.1.1 - 1.1.2), eller på grundlag af institutionens etiske retningslinjer.
  • PIN mus til en skum bord, med benene spredt ud. Spray delene med 70% ethanol.
    Bemærk: Udføre proceduren i en steril hætte.
  • Gøre et lavvandet snit i huden (0,2 cm) med saks langs midterlinjen af musen, for at undgå at skære bughulen. Træk musens mave med pincet, abdominal skindet, så foring af intakt peritoneal væggen er synlige.
  • Fyld en 5 mL sprøjte med 5 mL steril PBS (pH 7,4). Indsæt en 25 eller 27 gauge kanyle i toppen af hulrum fra enten venstre eller højre side ind mod midten af musen med facet af nålen op.
    Bemærk: Placer nålen omhyggeligt i musen så du ikke injicere PBS i organerne, men snarere ind i peritoneal rummet.
  • Skubbe væsken i bughulen. Trækker nålen ud af hulrummet og massage bughinden for 10 s for at løsne eventuelle celler. Indsætte nålen øverst i hulrummet og undgå organer. Indsamle og placere lavage væske inddrives i en 15 mL konisk slange på is.
    Bemærk: For hver 5 mL væske sprøjtes, ca 3,75 mL vil blive inddrevet.
  • Gentag injektion og recovery (trin 2,8-2,9) 3 flere gange (samlede Injektionsvolumen 20 ml) at inddrive 15 mL lavage væske i alt. Indsamle lavage fra hver musen ind i en separat 15 mL konisk rør.
    Bemærk: Efter den sidste injektion, kan det være nemmere at udtrække væske fra de langt højre og venstre sider af musen, hvor væske har akkumuleret. Organer vil medføre mindre interferens med nål på denne holdning.
  • Spin celler ned på 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Resuspend celler i 500 μL af plating medium (IMDM, 10% FBS, og 100 U/mL penicillin/streptomycin) pr. mus skyllet. Grev levedygtige makrofager ved hjælp af en hemocytometer18.
    Bemærk: Makrofager bliver lidt større end de andre peritoneal celler. Typisk udbytte er 5 x 105 - 1 x 106 makrofager/mus ved hjælp af en vildtype C57BL/6 mus.
    Valgfrit: Hvis et stort antal røde blodlegemer, findes i celle pellet, udføre en lysis trin for at fjerne dem, ved hjælp af 1 x røde blodlegemer lysisbuffer ifølge producentens anvisninger.
  • Resuspend celler i plating medium på 1 x 106 makrofager/mL og plade 100 μl pr. brønd i en 96-godt flad bund vævskultur behandlet plade.
    Bemærk: Det kan være nødvendigt at pool celler fra mere end én musen til et eksperiment hvis bruger eksemplarer brønde eller titrere stimulanser. For eksempel, hvis en mus havde 5 x 105 makrofager, ville 500 μL af plating medium være påkrævet. Der ville være nok celler for 5 brønde eller 1 eksperiment i to eksemplarer, med én LP'ER dosis.
  • Inkuber celler i 1 timer ved 37 ° C, 5% CO2 til at tillade makrofager at blive tilhænger. De vedhængende celler er de peritoneal makrofager. Fjern celle analysere og ikke-tilhænger celler. Skyl wells to gange med 200 μl IMDM (pre-hjertelig til 37 ° C), skal du vente 10 s og langsomt vippe pladen. Erstatte plating medium. Inkuber celler ved 37 ° C, 5% CO2 i 30 min før stimulation.
  • Stimulere makrofager med 10 ng/mL af LP'ER i IMDM, eller forlade unstimulated, som et kontrolelement. Der inkuberes i 24 timer, indsamle og præcisere celle analysere (Se trin 1,16-1,17) for IL-10 cytokin analyse af ELISA. Følg ELISA protokol fra kommercielt tilgængeligt kit (Tabel af materialer).
    Bemærk: Efter stimulation, vedhængende celler kan være forberedt på teknikker som vestlige skamplet eller PCR.
  • 3. udfordrende mus in Vivo med IVIg + LPS og høst Peritoneal makrofager

    1. Veje hver mus. Beregne omfanget af IVIg (100 mg/mL stock koncentration) skulle give en sidste dosis på 2,5 g/kg kropsvægt. Beregne mængden af LP'ER (100 μg/mL stock koncentration i IMDM) for at give en sidste dosis på 0,2 μg/g kropsvægt.
      Bemærk: For eksempel, for en 20 g mus, 500 µL af IVIg stamopløsning og 40 μL af 100 μg/mL opløsning af LP'ER er nødvendig.
    2. Trække den nødvendige mængde af IVIg og LP'ER i en steril 1 mL sprøjten udstyret med en steril 26 gauge kanyle. Control mus, der ikke modtager IVIg, erstatte et tilsvarende volumen af IVIg med steril PBS pH 7,4.
    3. Harmoniske mus med den ene hånd ved at snuppe skindet på bagsiden af halsen med tommel- og pegefinger og holder sin halen og bagbenene med dine resterende fingre. Vippe sin krop mod jorden.
    4. Placer nålen i en 30-40° vinkel i forhold til musens maven, i den nederste højre kvadrant, facet op, og indsætte 1,5 cm. injicere IVIg + LP'ER, eller PBS + LP'ER, intraperitoneal som i trin 2.4.
    5. Efter 1 time, skal du høste peritoneal makrofager ved at udføre trin 2,5-2.10.
    6. Spin celler ned på 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjerne 1 mL af gendannede lavage væske og bruge for IL-10, og IL-12 / 23p 40 analyser ved ELISA efter fabrikantens anvisninger eller fryse ved-80 ° C for fremtidige analyser.
      Bemærk: For at sikre nøjagtig sammenligning mellem behandlinger for lavage væske cytokin analyse, udføre 5 mL flushs af bughulen 4 gange for en endelige mængden af 15 mL. Ikke alle væske vil blive inddrevet fra hver flush.
    7. Som i trin 2.11, resuspend og tælle levedygtige makrofager.
      Bemærk: Makrofager bliver lidt større end de andre peritoneal celler.
    Typisk udbytte er 5 x 105 - 1 x 106 makrofager/mus ved hjælp af en vildtype C57BL/6 mus.
    Valgfrit: Hvis et stort antal røde blodlegemer, findes i celle pellet, udføre en lysis trin ifølge producentens anvisninger til at fjerne dem, som i trin 2.11.
  • Som i trin 2.12, genopslæmmes celler i plating medium.
    Bemærk: Det kan være nødvendigt at pool celler fra mere end én musen for et eksperiment. For eksempel, hvis en mus havde 5 x 105 makrofager, ville 500 μL af plating medium være påkrævet.
  • Som i 2.13, inkuberes celler i 1 timer ved 37 ° C 5% CO2 til at tillade makrofager at blive tilhænger.
  • Indsamle og præcisere konditioneret medium, som pr trin 1,14-1,15, fra alle peritoneal celler.
    Bemærk: Prøver kan anvendes straks eller frosset og opbevares ved-80 ° C for cytokin analyse af ELISA.
  • Udføre trin 2.11, men Inkuber celler i 24 timer unstimulated. Indsamle og præcisere celle analysere, som pr trin 1,16-1,17, cytokin analyse af ELISA.
    Bemærk: Celler kan være forberedt på teknikker som vestlige skamplet eller PCR, som i trin 1,16-1,17 og 2.14.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Murine knoglemarv afledt makrofager kan være kulturperler fra hæmatopoietisk celle forstadier i knoglemarven aspirates. Knoglemarven aspirates samles fra lårben og skinneben af en C57BL/6 mus typisk udbytte 107 knoglemarv afledt makrofager, hvilket gør dem en bekvem kilde til makrofager for eksperimenter. BMDMs kan bruges til at teste antistof baseret drug svar når udfordret med en inflammatorisk stimulus i vitro. Figur 1 viser at IVIg mærke, Gammunex (GX) + LPS øger produktionen af den anti-inflammatorisk cytokin IL-10, 7-fold i forhold til LP'ER stimulation alene (fig. 1A) og nedsætter produktionen af IL-12/23 p 40 (figur 1 B). Figur 1 viser også, at forskellige IVIg præparater udføre forskelligt. Selvom de tre forskellige præparater af IVIg er i stand til at mindske IL-12 / 23p 40 betydeligt (figur 1B), Octagam (OG) og Gammagard væske (GL), ikke væsentligt forøger IL-10 produktion i svar til LP'ER (figur 1 A). OG og GL er i stand til at reducere IL-12/23 p 40 produktion i svar til LP'ER, men i mindre grad end GX. Disse resultater viser, at antistof påvirker knoglemarven afledt makrofag aktivering, og at der er forskelle mellem forberedelserne af det samme stof, der kan forårsage ændringer i svar.

    BMDMs kan bruges til at teste de mekanistiske virkningerne af IVIg, af western blotting. Makrofager aktiveret hos IC + LPS steget fosforylering af mitogen aktiveret protein (kort) kinaser, p38 og Erk1/2, som er ansvarlige for øget IL-10 produktion21. Resultaterne i figur 2 viser en typisk vestlige skamplet at opdage kort kinase aktivering kræves til produktion af IL-10 af makrofager, der er unstimulated, eller har været stimuleret med LP'ER, IVIg, eller IVIg + LPS. IVIg stimulation alene eller IVIg + LPS Co stimulation øget aktivering af kort kinaser, Erk1/2, med tidligere og længerevarende fosforylering i forhold til den, set med LP'ER alene. Aktivering af p38 opstod tidligere i makrofager stimuleret med IVIg + LPS sammenlignet med dem, stimuleret med LP'ER alene. Disse resultater viser, at metoder, såsom western blotting, kan bruges til at vise celle signalering effekter af antistof narkotika på BMDMs. Ud over cytokin produktion, kan kort kinase aktivering bruges til at vise, at anti-inflammatoriske makrofag aktivering er opstået.

    Modne, væv bosiddende makrofager kan også være isoleret fra mus til at vurdere svar til IVIg 5,0 x 105 - 1,0 x 106 peritoneal makrofager kan isoleres fra en sund C57BL/6 mus. I figur 3øger peritoneal makrofager fra musene injiceret med IVIg ikke betydeligt IL-10 produktion i mangel af stimulation i vitro, i forhold til PBS injiceres mus. Når peritoneal makrofager fra IVIg injiceres mus er stimuleret med LP'ER ex vivo, de producerer 6-fold mere IL-10 end musene injiceret med PBS. De ikke, producerer men påviselige mængder af IL-12 / 23p 40 når stimuleret med LP'ER ex vivo. Disse resultater viser, at antistof effekter kan testes på makrofager ved at indsprøjte medicin i vivo og dyrkning af celler ex vivo med denne metode.

    Makrofag svar til antistoffer og inflammatoriske stimuli kan blive vurderet in vivo. Cytokin produktion kan vurderes i lavage væske, og i supernatanter fra ex vivo stimuleret peritoneal makrofager. Figur 4 viser de anti-inflammatorisk cytokin IL-10 er steget i lavage væske (figur 4A), peritoneal celler (fig. 4B) og peritoneal makrofager (fig. 4C) når mus bliver udfordret med IVIg + LPS i forhold til PBS + LPS. Produktion af pro-inflammatoriske cytokine subunit, IL-12 / 23p 40, er betydeligt reduceret i kulturperler peritoneal makrofager, men ikke i lavage væske. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af en antistof drug effekt på inflammatoriske respons i vivo samt ex vivo.

    Figure 1
    Figur 1 : Makrofag IL-10, og IL-12 / 23p 40 produktion i svaret på Co stimulation med forskellige mærker af IVIg og LP'ER. C57BL/6 MCSF knoglemarv afledt makrofager blev enten unstimulated (C), eller stimuleret med LP'ER (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), eller IVIg + LPS. Tre forskellige mærker af IVIg blev testet: Gammunex (GX), Gammagard væske (GL) og Octagam (OG). Makrofag analysere blev indsamlet 24 h efter stimulation og afklaret ved centrifugering. Ringprøver for IL-10 (A) og IL-12/23 p 40 (B) blev udført. Data er for makrofager fra n = 3 uafhængige forsøg med celler fra 1 individuelle mus pr. eksperiment med ringprøver analyseres i duplikat. Data er middel ± SD. *P < 0,05, ** P < 0,001, ***P < 0,0001 for sammenligning mellem LP'ER stimulation og IVIg + LPS Co stimulation. Envejs variansanalyse (ANOVA) med Tukeys post-test for flere sammenligninger blev anvendt til statistiske analyser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2 : Western blot analyse af kort kinase aktivering i IVIg-aktiveres makrofager. MCSF afledt knoglemarv makrofager blev unstimulated eller stimuleret med LP'ER (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), eller GX IVIg + LPS; for 0, 10, 40 eller 120 min. hele cellelysater (1,0 x 106 makrofager/lane) blev udsat for sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) og western blotting med phospho-specifikke antistoffer for p38 og ekstracellulære signal-regulerede kinase (Erk1/2), samt glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) indlæsning kontrol. Resultater vist er repræsentative for n = 3 uafhængige forsøg med celler fra 1 individuelle mus pr. eksperiment.Densitometri for pp38 og pErk1/2 protein niveauer, normaliseret til GAPDH, gennemsnit fra 3 uafhængige forsøg er vist under hvert bånd. Dette tal er blevet ændret fra Kozicky mfl8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3 : IL-10 produktion af makrofager fra mus udfordret med IVIg in vivo. 8 uger gamle C57BL/6 mus fik steril PBS (injektion kontrol) eller GX IVIg (2,5 g/kg) intraperitoneal. Efter 1 time, mus blev aflivet og peritoneal lavages blev udført. Peritoneal makrofager blev isoleret ved hjælp af overholdelse af udvalg. Makrofager blev enten unstimulated (C), eller stimuleret med LP'ER (10 ng/mL). Celle analysere blev høstet og afklaret efter 24 h for IL-10 ringprøver. Data er fra n = 5 individuelle mus pr. gruppe udføres i 3 uafhængige forsøg med ringprøver analyseres i duplikat. Data er middel ± SD. * P < 0,01 og NS = ikke betydelig. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en tovejs ANAVA med Sidak's posttest for flere sammenligninger. Dette tal er blevet ændret fra Kozicky mfl8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4 : IL-10, og IL-12 / 23p 40 produktion fra mus udfordret med IVIg + LPS i vivo. 8 uger gamle C57BL/6 mus blev injiceret intraperitoneal med enten PBS + LPS (0,2 µg/g kropsvægt), som en kontrol; eller GX IVIg (2,5 g/kg kropsvægt) + LPS (0,2 µg/g kropsvægt). Efter 1 time, mus blev aflivet og peritoneal lavages blev udført. (A) afklarede lavage væske, (B) præcisering konditioneret analysere fra peritoneal celler under en 1 h makrofag overholdelse af trin, og (C) afklaret 24 h peritoneal makrofag (Mφ) supernatanter blev analyseret IL-10, og IL-12 / 23p 40 ved ELISA. Data er middel ± SD for n = 5 mus i 3 uafhængige forsøg, med ringprøver analyseres i duplikat. P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 og NS = ikke betydelig. Musene injiceret med PBS + LPS sammenlignet med musene injiceret med IVIg + LPS ved hjælp af en Student t -test. Dette tal er blevet ændret fra Kozicky mfl8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Makrofag aktivering stater spiller en vigtig rolle i både væv homøostase og sygdom22. Makrofager kan have forskellige og overlappende aktivering stater, afhængigt af signaler i deres mikromiljø3. De har forskellige roller i alle faser af den inflammatoriske reaktion: forsvar mod patogener, sår healing og væv tilbagelevering og også har en særskilt anti-inflammatoriske aktiveringstilstanden, der er vigtige for at slukke det inflammatoriske respons2 . Anti-inflammatoriske makrofag aktivering kræver to eksterne stimuli for makrofager at producere store mængder af anti-inflammatorisk cytokin, IL-10 og lavt beløb af pro-inflammatoriske cytokiner som IL-1223. En signal kommer fra antistoffer handler gennem Fc gamma receptorer, og det andet signal er en pro-inflammatoriske stimulus, som LP'ER eller IFNγ24,25. Serum, immunkomplekser og anti-TNFα antistoffer, har alle vist sig for at fremkalde en høj IL-10-produing anti-inflammatoriske aktiveringstilstand i makrofager8,23,25,26. Vores gruppe har tidligere offentliggjort at murine knoglemarv afledt makrofager og peritoneal makrofager stimuleret med IVIg også producere store mængder af IL-10 og lidt at ingen pro-inflammatoriske IL-12 / 23p 40 svar på LPS8. Vi har også fundet, at andre pro-inflammatoriske cytokiner, TNF og IL-6 også er reduceret med IVIg i knoglemarven afledt makrofager8. De metoder, der beskrives her kan anvendes til at teste andre antistof baseret drug svar i mus BMDMs og peritoneal makrofager in vitro og i vivo.

    Der er mange kritiske trin i test baseret på antistoffer therapeutics på musen knoglemarven og peritoneal makrofager. Opretholde sterilitet er vigtigt for hver protokol. Hvis makrofag kulturer er forurenet med mikroorganismer fra luften, pels eller afføring af mus, vil makrofager reagere på disse stimuli ved at producere pro-inflammatoriske cytokiner. Udfører alle eksperimenter i et kabinet biosikkerhed, sprøjtning musen rigeligt med ethanol, og at sikre integriteten af tarmen under peritoneal flushes er afgørende. Antistoffet skal også holdes sterilt og opbevares ifølge fabrikantens anvisninger. Det kan ikke bruges, hvis det er forurenet, udløbet eller grumset. Turbiditet vil nedsætte virkningen af stoffet, og kan opstå, hvis stoffet ikke er gemt på den korrekte temperatur eller har været gemt for længe. IVIg kan opbevares ved 4 ° C og kun brugt før udløbsdatoen er nået, da niveauer af IL-10 produktion kan blive påvirket. Alternativt, vi har set, at det kan fryses ved-20 ° C med ingen effekt på svar. Forskellige masser af IVIg føre til lignende eksperimentelle resultater, forskellige typer af IVIg mærke præparater, som i figur 1, kan skabe forskellige reaktioner i makrofager. Æteriske styrer, som unstimulated celler, og celler stimuleret med antistof alene, skal indgå i hvert forsøg at udelukke kontaminering af makrofager eller stoffet.

    Disse protokoller kan foretages flere ændringer til at tilpasse et eksperiment. I den ikke-betændt tilstand, kan det være vanskeligt at isolere nok peritoneal makrofager for store eksperimenter. Peritoneal makrofager kan være fremkaldt af intraperitoneal injektion af thioglycollate (TG). En immunrespons opstår, og efter 4 dage, fremkaldte peritoneal makrofager kan være fældet27. De rekrutterede makrofager kan være mindre modne og repræsenterer ikke hjemmehørende celler, som vi har brugt her, som er vigtige overvejelser. TG-fremkaldte makrofager kan også har internaliseret agar fra TG bouillon, som kan være en komplikation, især hvis laver eksperimenter på fagocytose27. Mus fra forskellige genetiske baggrunde, C57BL/6 eller BALB/c, kan også bruges til eksperimenter og kan blive valgt til at undersøge virkningen af antistoffer på makrofag reaktioner, der vil blive vurderet i sygdomsmodeller kræver en specifik genetisk baggrund. Derudover kan genmodificerede mus, såsom Il10- / - mus, anvendes til at vurdere funktionen af specifikke proteiner i virkningsmekanisme af et lægemiddel, som vi har gjort i vores eget arbejde8. Forskellige inflammatoriske stimuli kan også bruges til at vurdere virkningen af antistoffer på makrofag aktivering. IFNγ, og værten afledt vejafgift som receptor (TLR) agonister (fx hyaluronsyre), har været brugt til at aktivere IL-10-producerende makrofager25,28. En vigtig overvejelse er dosis af antistoffet. Dosis bør titreres for at opnå den optimale dosis i kultur og i dyreforsøg, som det vil variere mellem antistoffer samt leverandører. Dosis valgt bør også afspejle den dosis gives til mennesker, og vil variere mellem narkotika. IVIg er givet som en anti-inflammatorisk terapi ved høje doser (25-35 mg/mL eller 2 g/kg kropsvægt), som afspejler de titreret doser anvendes i disse protokoller29,30.

    Brugen af knoglemarven og peritoneal makrofager har begrænsninger. Selv om en forbedring i forhold til makrofag cellelinjer, er mus BMDMs stadig kunstigt afledte celler fra hæmatopoietisk prækursorer. Test immun svar af makrofager i vitro er et vigtigt skridt til forståelse antistof svar, men i vivo forsøg skal udføres så godt. Indsprøjte stimuli i vivo efterfulgt af dyrkning af celler ex vivo, kan give mere information til fremtidige undersøgelser for at undersøge, om antistof-baserede lægemidler kan også aktivere anti-inflammatoriske makrofager i en sygdom. Kan ikke drages konklusioner om hvad der sker i personer, som modtager antistof-baserede biologics fra disse eksperimenter. Få undersøgelser er blevet offentliggjort for at vurdere virkningerne af IVIg på humane monocyt afledt makrofager in vitro. En reduktion i antallet af IL-6 producerer humane monocytter i vitro er blevet rapporteret, når IVIg stimuleres sammen med LPS i forhold til stimulation med LP'ER alene12. IVIg reducerer TNFα og IL-6 produktion når stimuleret med procalcitonin (PCT) i THP-1 menneskelige monocytic celler31.

    Protokoller i dette papir har fordele i forhold til eksisterende metoder. Knoglemarven afledt makrofager og peritoneal makrofager er primærelementer, isoleret direkte fra mus, snarere end at blive udødeliggjort cellelinjer.Musen makrofag-lignende cellelinjer, såsom RAW264.7 celler, ikke producerer den pro-inflammatoriske cytokine, IL-12, som svar på LP'ER, som er en vigtig cytokin, der er reguleret af IL-10, der er produceret i svar til IVIg8,13. Test af et lægemiddel i vivo med LP'ER tillader undersøgelse af effekten af stoffet på det lokale peritoneal miljø gennem analyse af lavage væske, peritoneal celler og specifikt, peritoneal makrofager. Det er en kortsigtet, enkel model, der kan give vigtige oplysninger for at retfærdiggøre undersøgelse af uspecifikke effekter af antistoffer på makrofag aktivering i længere og dyrere dyremodeller for sygdom. Det er en fordel over endotoxemia modeller hvor den eksperimentelle foranstaltning er ofte kun mus overlevelse eller cytokiner i serum14. Overlevelsesrater og serum cytokiner er værdifulde foranstaltninger af immunrespons, men de viser ikke bidrag at makrofager kan have specielt. Isolering og dyrkning af peritoneal makrofager fra en udfordring eksperiment viser en direkte og målbar virkning, at antistof therapeutics kan have på makrofag funktion.

    Disse metoder har programmer for afprøvning og designe biologiske behandlinger. Brugen af antistoffer som therapeutics er vokset dramatisk i de seneste år. Dog kan disse behandlinger har flere ukendte virkninger på makrofager, der kan genkende Fc del af antistoffet og ændre deres cytokin produktion. Anti-TNFα antistof, infliximab, har vist sig at fremkalde IL-10 og undertrykke T-celle spredning gennem sin Fc del, og der er blevet foreslået som en af sine mekanismer i aktion7,15,26. Brug af genetiske modeller, kan specifikke proteiner være impliceret i mekanismen af hvordan stofferne påvirker makrofag aktivering. Klasser af IgG antistoffer og præparater af antistoffer kan ændres til at ændre, hvordan makrofager påvirkes af biologiske lægemidler. Vores data viser, at forberedelse og/eller opbevaring af det samme stof, antistof (IVIg) kan have indflydelse på dens virkninger på makrofag aktivering. Metoder inden for dette papir kan bruges til at designe behandlingsformer, der ikke har disse virkninger, som kan være afgørende for at opretholde immunosurveillance under kræftbehandling, hvor anti-inflammatoriske makrofager kan fremme tumor progression. Disse teknikker kan også bruges til at udforme og evaluere narkotika, der har disse effekter, hvis ønskeligt. For eksempel kan det være gavnligt at reducere makrofag inflammatoriske respons og skabe anti-inflammatoriske IL-10-producerende makrofager for at forbedre behandling af inflammatoriske tarmsygdomme eller leddegigt.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

    Acknowledgments

    Larsen er modtageren af University of British Columbia 4-årige stipendium (4YF) graduate studentship award. L.M.S. er modtageren af en canadisk sammenslutning af gastroenterologi / Crohns og Colitis Canada / CIHR nye Investigator løn Award og er en biomedicinsk lærd af Michael Smith Foundation for sundhedsforskning. Dette arbejde blev støttet af en Project Grant fra canadiske blod tjenester, i samarbejde med den canadiske institutter for sundhedsforskning (yde # CIHR2016-LS).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) Life technologies 12440053
    Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 12483-020
    Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) Stemcell technologies 78059
    Penicillin-streptomycin Life technologies 15140148
    Monothioglycerol (MTG) Sigma 88640
    1X red blood cell lysis buffer eBioscience
    Cell dissociation buffer Life technologies 13150016 Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA
    Lipopolysaccharide (LPS) Sigma aldrich L 4516 From E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex) Grifols Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    IVIg (Gammagard liquid) Baxter Healthcare Corporation Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    IVIg (Octagam) Octapharma Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
    Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 Life technologies 10010023
    mouse IL-10 ELISA BD biosciences 555252
    mouse IL-12/23p40 ELISA BD biosciences 555165
    anti-Erk1/2 antibody Cell signalling technology 9101
    anti-pp38 antibody Cell signalling technology 9211
    anti-GAPDH antibody Fitzgerald industries 10R-G109A
    26 g needle BD biosciences 305110
    1 mL syringe BD biosciences 309659
    10 mL syringe BD biosciences 309604
    15 mL conical tube BD biosciences 352096
    50 mL conical tube BD biosciences 352070
    microcentrifuge tube (1.7 mL) Diamed SPE155-N
    75 cm2 tissue culture treated flask BD biosciences 353136
    Cell scraper BD biosciences 353085
    Forcepts VWR 82027-386 fine tip, dissecting 
    Scissors VWR 82027-582 Delicate, 4 1/2"
    Brightfield microscope Motic AE31 Inverted phase contrast
    Scale  Mettler  PE 3000

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

    Tags

    Immunologi spørgsmålet 130 makrofager knogle knoglemarv makrofager peritoneal makrofager antistof intravenøs immunglobulin biologics interleukin 10
    Vurdering af antistof-baserede lægemidler virkninger på Murine knoglemarven og Peritoneal makrofag aktivering
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Kozicky, L., Sly, L. M. AssessmentMore

    Kozicky, L., Sly, L. M. Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (130), e56689, doi:10.3791/56689 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter