Summary
Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.
Abstract
Los macrófagos son las células inmunes innatas fagocíticas, que inician la respuesta inmune a patógenos y contribuyan a la restitución del tejido y cicatrización. Los macrófagos son igualmente importantes en la desactivación de las respuestas inflamatorias. Hemos demostrado que los macrófagos estimulados con inmunoglobulina intravenosa (IgIV) pueden producir altas cantidades de la citocina antiinflamatoria, interleucina 10 (IL-10) y bajos niveles de citoquinas proinflamatorias en respuesta a los lipopolisacáridos bacterianos ( LPS). IVIg es que un anticuerpo polivalente, principalmente inmunoglobulina Gs (IgGs), agrupados desde el plasma de más de 1.000 donantes de sangre. Se utiliza para complementar los anticuerpos en pacientes con inmunodeficiencias o para suprimir la respuesta inmune en pacientes con enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Infliximab, un factor terapéutico antifactor de necrosis tumoral alfa (TNFα) anticuerpo, también se ha demostrado para activar a los macrófagos a producir IL-10 en respuesta a estímulos inflamatorios. Inmunoglobulina intravenosa y otros productos biológicos basados en anticuerpos pueden analizarse para determinar sus efectos sobre la activación de los macrófagos. Este artículo describe métodos para la derivación, la estimulación y la evaluación de los macrófagos de médula ósea murina activados por los anticuerpos en vitro y macrófagos peritoneales murinos activados con anticuerpos in vivo. Por último, se demuestra el uso de western blot para determinar la contribución de la señalización de caminos hacia la actividad de los macrófagos antiinflamatorios específicos de la célula. Estos protocolos se pueden utilizar con ratones genéticamente modificados, para determinar el efecto de una proteína específica sobre la activación de macrófagos antiinflamatorio. Estas técnicas pueden usarse para evaluar si determinados productos biológicos pueden actuar cambiando los macrófagos a un estado de activación antiinflamatorio de producción de IL-10 que reduce las respuestas inflamatorias en vivo. Esto puede proporcionar información sobre el papel de la activación de los macrófagos en la eficacia de productos biológicos en modelos de la enfermedad en ratones y proporcionar la penetración en un nuevo mecanismo de potenciales de acción en las personas. Por el contrario, esto puede precaución contra el uso de productos biológicos basados en anticuerpos específicos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente si los macrófagos juegan un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por esa.
Introduction
Los macrófagos son las células inmunes innatas, que desempeñan múltiples roles en la respuesta inmune a infección o lesión. Los macrófagos son responsables de iniciar una respuesta inmunitaria a la infección o tejido, deteniendo la respuesta inflamatoria y promover la curación de respuesta1. Ejemplos de los tres Estados de activación del macrófago mejor estudiados son: 1) los macrófagos tratados con interferón gamma (IFNγ) y bacteriano lipopolysaccharide (LPS), señalado M (IFNγ + LPS), que contribuyen a la respuesta inflamatoria; 2) macrófagos estimulados con interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), que se asocian con la respuesta de curación; 3) macrófagos estimulados con complejos inmunes (CI) y LPS, M (IC + LPS), que tienen la capacidad para apagar la respuesta inflamatoria2,3. M (IC + LPS) son distinto de los macrófagos de la cicatrización M(IL-4) y no expresan la arginasa (Arg-1) de la enzima o FIZZ14. El mejor marcador para estos macrófagos antiinflamatorios es la producción del cytokine del5. Los macrófagos tienen múltiples funciones en el mantenimiento de la salud, pero también contribuyan a enfermedades inflamatorias y cáncer3. Por esta razón, los macrófagos son una diana terapéutica clave para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades. Es importante investigar los efectos de los anticuerpos sobre su estado de activación para desarrollar tratamientos a base de macrófagos para la enfermedad.
El enfoque de este artículo es sobre el uso de macrófagos murinos la médula ósea derivado (BMDMs) y los macrófagos peritoneales para probar el efecto de fármacos de anticuerpos en las respuestas inflamatorias in vitro e in vivo. Recientemente, ha habido varios estudios que demuestran los efectos de anticuerpos macrófago activación6,7,8. Macrófagos activados conjuntamente con complejos inmunes, que son anticuerpos complejados con un antígeno y LPS, un estímulo inflamatorio normalmente, producen niveles muy altos de la citocina antiinflamatoria IL-10 y niveles muy bajos de la citocina proinflamatoria, Interleucina 12 (IL-12)9. Además, infliximab, un anticuerpo monoclonal contra el TNFα, se ha encontrado para trabajar, en parte, mediante la inducción de macrófagos antiinflamatorios a través de su fragmento cristalizable (Fc) región7. Nos han informado que la IgIV + LPS inducen activación de macrófagos antiinflamatorio similar a M (IC + LPS), en donde co estimulados macrófagos producen grandes cantidades de IL-10 y cantidades bajas de la subunidad de citoquinas pro-inflamatorias interleuquina 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleucina 6 (IL-6) y TNF8. Inmunoglobulina intravenosa es un fármaco compuesto de anticuerpos policlonales, principalmente IgG, que ha sido de la sangre de los donantes más de 1.00010. Se utiliza para tratar una amplia variedad de Enfermedades inmunológicas, como la púrpura trombocitopénica idiopática y la polineuropatía desmielinizante crónica, pero su mecanismo de acción no es completamente entendida11. Los efectos de drogas de anticuerpos basados en la activación de los macrófagos pueden ser evaluados mediante los métodos descritos en este documento.
Los efectos de productos biológicos específicos en la activación de los macrófagos se pueden probar en BMDMs y en los macrófagos peritoneales. Utilizando estas fuentes de macrófagos permite la evaluación de células primarias. Pruebas preliminares de anticuerpos en cultivos de células primarias requiere menos tiempo y la inversión monetaria que otros modelos de enfermedad desperdiciador de tiempo y costoso. Por inyectar un medicamento en un ratón sano en vivoy aislar las células y análisis ex vivo, uno puede determinar si los estudios están garantizados para evaluar si el tratamiento con productos biológicos afecta la activación de los macrófagos en modelos de la enfermedad.
Con pocos estudios el efecto de las terapias biológicas en la activación de macrófagos in vitro e in vivo la prueba directamente, nuestras técnicas proporcionan una ventaja sobre técnicas alternativas. Las técnicas actuales implican efectos de droga biológica prueba de mezclado de la célula poblaciones en vitro, por ejemplo el efecto de infliximab en una reacción linfocitaria mixta (MLR) o inmunoglobulina intravenosa en macrófagos humanos en células mononucleares de sangre periférica, donde el efecto no se puede atribuir a una célula específica tipo7,12. Uso de BMDMs y macrófagos peritoneales es ventajoso sobre el uso de líneas celulares, tales como 264.7 células, que no producen las citoquinas pro inflamatorias, IL-12, en respuesta a LPS8,13. Prueba el efecto de una droga basada en anticuerpos en macrófago respuestas ex vivo tiene ventajas porque las respuestas del cytokine pueden atribuirse directamente a los macrófagos, en lugar de inferir las respuestas de los macrófagos mediante la medición de niveles del cytokine del suero14 . BMDMs y macrófagos peritoneales pueden ser derivados y aislados de ratones modificados genéticamente para determinar el papel específico de una proteína de activación de los macrófagos antiinflamatorio. Por ejemplo, hemos utilizado Il10 deficiente(- / -) BMDMs para demostrar que la reducción inducida por la inmunoglobulina intravenosa de la producción de citoquinas pro-inflamatorias es parcialmente dependiente de IL-108. Mecanismo de un medicamento de acción puede ser investigado utilizando el borrar occidental, donde el papel de proteínas específicas y eventos de señalización puede ser determinado. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) puede realizarse en BMDMs o los macrófagos peritoneales muestran patrones de expresión génica que resultan de la activación de anticuerpos. Modelos de la enfermedad en ratones pueden proporcionar información sobre la potencial eficacia de las terapias biológicas basados en anticuerpos en modelos para enfermedades como la inflamatoria intestinal enfermedad de, artritis reumatoide y cáncer15,16, 17. sin embargo, las técnicas descritas aquí proporcionará información sobre el mecanismo de acción de estos productos biológicos determinando si inducen la actividad de los macrófagos antiinflamatorio.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de British Columbia.
1. médula ósea macrófagos derivación y activación con anticuerpos
- Realizar la eutanasia usando CO2 asfixia.
- Ratón de lugar en cámara de inducción. Eutanasia a ratón con anestesia isoflurano de 5%, para 60-90 s, hasta que inmóviles y la respiración profunda y lenta.
- Apague la anestesia isoflurano y administrar 6-8 L/min de CO2 hasta que el ratón ha dejado de respirar. Dejar ratón con CO2 al menos otros 5 minutos Verifique que ya no es un latido cardíaco o respiración. Realizar una dislocación cervical para asegurar la muerte.
Nota: 8-12 semanas viejos ratones proporcionan el mayor rendimiento de los macrófagos.
- Spray patas de ratón con etanol al 70% y el pin con brazos y piernas estiradas en la posición supina sobre un tablero de la espuma. Con tijeras y pinzas para sujetar la piel, hacer un corte poco profundo (0,2 cm) para quitar la piel y el pelaje de la superficie de cada una de las patas traseras.
Nota: Realice este procedimiento y todas las manipulaciones de cultivo de tejidos en una campana estéril. - Recorte muscular para visibilizar tibias y fémures. Quite la tibia y el fémur, cortando el hueso y los músculos debajo de la articulación de la cadera y por encima de los tobillos. Recorte tanto músculo como sea posible.
- Pulverizar los huesos con etanol al 70% y espere 1 minuto para que se evapore, luego colocarlos en placa 6 bien de medio al ras del hueso (Iscove modificado medio de Dulbecco (IMDM), 10% suero bovino fetal (FBS)).
- Recorte los extremos de los huesos mediante la reducción de 0,1 cm de hueso del tobillo y parte superior del fémur por lo que se expone la cavidad ósea. Asegúrese de que la médula es visible y se puede colocar una aguja de 26 calibre en la cavidad del hueso.
- Cortar los huesos y músculos para separar la tibias y fémures de los empalmes de rodilla. Inserte una aguja 26 calibre unida a una jeringa de 10 mL en la cavidad. Enjuague la médula ósea en un tubo cónico de 50 mL con 5 mL de medio al ras del hueso. Ras dos tibias y dos fémures, desde un ratón, en cada tubo de 50 mL.
- Pipetear arriba y abajo varias veces o vórtice la médula a una velocidad lenta para dispersar a grupos suavemente. Cadenas de médula deben dividirse en manchas pequeñas (menos de 0,5 mm) de médula ósea. Llene el tubo cónico de 50 mL con medio al ras del hueso. Contenido de la pipeta del tubo cónico en un cultivo de tejidos2 75 cm tratado frasco e incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 1 h.
Nota: Los macrófagos maduros y las células mesenquimales se convertirá en adherentes al matraz y descartarse, mientras que los progenitores hematopoyéticos deseados permanecerán en suspensión. - Pipetear el soporte con progenitores hematopoyéticos en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 min., descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL de medio de cultivo factor (MCSF) el estimular de Colonia de macrófagos (IMDM, 10% FBS, MCSF de 5 ng/mL, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 150 μM Monothioglycerol (MTG)).
- Contar las células usando un hemocitómetro18. Añadir medio para resuspender las células a una concentración de 0,5 x 106 células/mL, 1,5 x 107 células/frasco de 30 mL de medio y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo. Pipeta de 30 mL de la suspensión a un matraz de cultivo de tejidos tratado nueva de 75 cm2 .
- El día 4 y día 7 después de la primera cultura en el paso 1.9, comprobar que las células son adherentes y ligeramente ramificado usando un microscopio de campo brillante de contraste de fase invertida. Descartar el medio que contiene las células no adherentes. Lavar las células con IMDM una vez y añadir 30 mL de medio de cultivo MCSF.
- Cuando las células son maduras por día 10 (> 95% positivo para F4/80 y Mac-1), compruebe otra vez que las células son adherentes y ligeramente.
- Células por estímulos de la placa, retirar el medio de cultivo del frasco y añadir 8 mL de buffer de enzima libre, basada en EDTA células disociación (Tabla de materiales). Incube las células durante 5 min a 37 ° C, 5% CO2.
- Raspar las células suavemente, con una pequeña cantidad de presión, usando un raspador celular estéril. Comprobar en el microscopio que las células han separado de la superficie del frasco. Pipetear las células disociadas en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el matraz 3 veces con 5 mL de IMDM y la solución de enjuague con las células que se cosecharon de la piscina. Centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Resuspender el precipitado de células en 3 mL de medio de cultivo MCSF por el tubo cónico de 50 mL. Contar las células viables usando un hemocitómetro18. Resuspender las células a una concentración de 1 x 106 células/mL y la placa de 100 μL de suspensión celular (1 x 105 células/pocillo) por pozo de una cultura de tejido de 96 pocillos tratada, placa de fondo plano.
Nota: Los huesos de un ratón va a generar suficientes células para pozos de 100. Si lo desea, 1 mL de células puede ser plateado en una placa de 6 pozos (cultivo de tejidos tratados, plano abajo). Un mayor número de células (1 x 106 células) puede ser útil para los análisis de western blot. - Una vez adheridas, estimular el duplicado o triplicado pozos cada uno con 10 ng/mL de LPS en IMDM, 30 mg/mL de inmunoglobulina intravenosa, o IgIV + LPS. Dosis de LPS o IgIV pueden titularse para optimizar las respuestas. Deje duplicados o triplicados pozos controles sin estimular. Incúbelos durante 24 h (37 ° C, 5% CO2).
Nota: Las células re-plateadas deben adherirse a pocillos de cultivo de tejidos en 1 h. - Recoger sobrenadante de células de cada pozo en tubos de microcentrífuga de 1,7 mL individual y quitar cualquier materia particulada por giro a 10.000 x g durante 5 minutos.
- Retire el sobrenadante de la célula y evitar perturbar el sedimento. Lugar la célula clarificada sobrenadante en un tubo de microcentrífuga estéril.
Nota: Sobrenadantes celulares pueden ensayarse para citoquinas IL-10 y subunidad de la citoquina IL-12 / 23p 40, por el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) inmediatamente, o almacenados a-80 ° C a largo plazo. Seguir protocolo de ELISA kit disponible comercialmente (Tabla de materiales). Otras citoquinas proinflamatorias pueden ensayarse, tales como IL-6 y TNF, como también son reducidas por co tratamiento con IgIV + estimulación LPS en comparación con la estimulación con LPS solo. Después de la estimulación, las células adherentes se pueden preparar para técnicas como western blot o polimerasa cuantitativa (Q-PCR) reacción en cadena 19,20.
2. un reto ratones In Vivo con la IgIV y la cosecha de los macrófagos peritoneales
- Peso de cada ratón.
Nota: por ejemplo, para un ratón de 20 g, 500 μl de inmunoglobulina intravenosa se requiere.
Nota: Realice el procedimiento en una campana estéril.
Nota: Coloque la aguja cuidadosamente en el ratón para que no inyecte PBS en los órganos, sino más bien, en el espacio peritoneal.
Nota: Por cada 5 mL de líquido inyectado, aproximadamente 3,75 mL serán recuperado.
Nota: Después de la inyección final, puede ser más fácil extraer el líquido de los lados lejos izquierdos y derecho del ratón, donde se ha acumulado líquido. Los órganos causan menos interferencia con la aguja en esta posición.
Nota: Los macrófagos será ligeramente más grandes que las otras células peritoneales. Rendimiento típico es de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/ratón utilizando un ratón C57BL/6 de tipo salvaje.
Opcional: Si hay un gran número de glóbulos rojos en el sedimento celulares, realizar un paso de lisis para eliminarlos, utilizando el tampón de lisis de glóbulos rojos 1 x según las instrucciones del fabricante.
Nota: Puede ser necesario piscina células de más de un ratón para un experimento si utiliza triplicadas pozos o valoración de estimulantes. Por ejemplo, si un ratón tiene 5 x 105 macrófagos, 500 μL de medio de galjanoplastia sería necesario. Habría suficientes células para 5 pozos o 1 experimento por duplicado, con una dosis de LPS.
Nota: Después de la estimulación, las células adherentes se pueden preparar para técnicas como el western blot o PCR.
3. un reto ratones in Vivo con IgIV + LPS y cosecha de los macrófagos peritoneales
- Peso de cada ratón. Calcular el volumen de la IgIV (concentración stock de 100 mg/mL) necesaria para proporcionar una dosis final de 2,5 g/kg de peso corporal. Calcular la cantidad de LPS (concentración stock de 100 μg/mL de IMDM) necesaria para proporcionar una dosis final de 0.2 μg/g de peso corporal.
Nota: por ejemplo, para un ratón de 20 g, 500 μl de solución stock de IVIg y 40 μL de una solución 100 μg/mL de LPS se requiere. - Extraer la cantidad necesaria de IVIg y LPS en una jeringa estéril de 1 mL con una estéril 26 Medidor de aguja. Para los ratones de control que no va a recibir IgIV, reemplazar un volumen equivalente de la IgIV con pH de PBS estéril 7.4.
- Pescuezo del ratón con una mano agarrando la piel en la nuca con el pulgar y el dedo índice y sostiene su cola y patas traseras con los dedos restantes. Incline su cuerpo hacia el suelo.
- Coloque la aguja en un ángulo de 30-40° en relación con el abdomen del ratón, en el cuadrante inferior derecho, bisel e introduzca 1,5 cm. inyectar la IVIg LPS, o PBS + LPS, por vía intraperitoneal como en el paso 2.4.
- Después de 1h, cosecha de macrófagos peritoneales mediante pasos 2.5-2.10.
- Las células de la vuelta abajo a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Retirar 1 mL del líquido de lavado recuperado y utilice para IL-10 y IL-12 / 23p 40 análisis por ELISA según instrucciones del fabricante o congelar a-80 ° C para los análisis futuros.
Nota: Para asegurar la comparación precisa entre los tratamientos para el análisis de citoquinas líquido de lavado, realice flushs 5 mL de la cavidad peritoneal 4 veces para un volumen final de 15 mL. No todo el líquido será recuperado de cada descarga. - Como en el paso 2.11, suspender y contar los macrófagos viables.
Nota: Los macrófagos será ligeramente más grandes que las otras células peritoneales.
Opcional: Si hay un gran número de glóbulos rojos en el sedimento celulares, realizar un paso de lisis siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminarlos, como en el paso 2.11.
Nota: Puede ser necesario a las células de la piscina de más de un ratón para un experimento. Por ejemplo, si un ratón tiene 5 x 105 macrófagos, 500 μL de medio de galjanoplastia sería necesario.
Nota: Las muestras se pueden usar inmediatamente o congeladas y almacenadas a-80 ° C para el análisis del cytokine por ELISA.
Nota: Las células se pueden preparar para técnicas como el western blot o PCR, como en pasos 1.16 1.17 y 2.14.
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Representative Results
Macrófagos de derivados de médula ósea murina pueden cultivarse a partir de precursores de células hematopoyéticas en aspirados de médula ósea. Aspirados de médula ósea agrupados de fémures y tibias de un ratón C57BL/6 por lo general rinden 107 médula ósea derivado de macrófagos, haciéndolos una fuente conveniente de los macrófagos para experimentos. BMDMs pueden ser utilizados para probar las respuestas del medicamento anticuerpo basado en cuando con un estímulo inflamatorio en vitro. La figura 1 muestra la marca de IgIV, Gammunex (GX) + LPS incrementa la producción de la citocina antiinflamatoria IL-10, 7-fold en comparación con solamente la estimulación LPS (figura 1A) y disminuye la producción de IL-12/23 p 40 (figura 1 B). Figura 1 también muestra que diferentes preparaciones de IVIg realizan diferentemente. Aunque los tres diferentes preparados de IgIV son capaces de disminuir la IL-12 / 23p 40 significativamente (figura 1B), Octagam (OG) y Gammagard líquido (GL), no aumentó significativamente la producción de IL-10 en respuesta a LPS (figura 1 A). OG y GL son capaces de reducir significativamente la producción de IL-12/23 p 40 en respuesta a LPS, pero en menor grado que el GX. Estos resultados demuestran que anticuerpos afecta la médula ósea derivados de activación de los macrófagos, y que existen diferencias entre los preparados del mismo fármaco que puede causar cambios en las respuestas.
BMDMs puede utilizarse para probar los efectos mecanicistas de la IgIV, por borrar occidental. Macrófagos activados con IC + LPS han aumentado la fosforilación de las quinasas de mitógeno activada proteína (mapa), p38 y Erk1/2, que son responsables de la mayor producción de IL-1021. Resultados en la figura 2 muestran un típico inmunoblot para detectar la activación de la cinasa del mapa requerida para la producción de IL-10 por los macrófagos sin estimular o que han sido estimulados con LPS, inmunoglobulina intravenosa, o IgIV + LPS. IgIV estimulación sola o la IgIV + LPS estimulación Co mayor activación de las MAP quinasas Erk1/2, con fosforilación anterior y prolongada en comparación con el que con solo LPS. Activación de la p38 ocurrió anteriormente en macrófagos estimulados con IgIV + LPS comparados con aquellos estimulados con LPS solo. Estos resultados muestran que los métodos, como el western blot, se pueden usar para mostrar efectos de los fármacos de anticuerpos en BMDMs de señalización de la célula. Además de producción de citoquinas, activación de la cinasa de mapa se puede usar para mostrar que se ha producido la activación de los macrófagos antiinflamatorio.
Maduros, macrófagos residentes también pueden ser aislados de los ratones para evaluar respuestas a IgIV 5.0 x 105 - 1.0 x 106 macrófagos peritoneales puede ser aislado de un ratón C57BL/6 saludable. En la figura 3, los macrófagos peritoneales de los ratones inyectados con IgIV no aumentar producción de IL-10 en ausencia de estimulación en vitro, en comparación con PBS inyectó ratones. Cuando los macrófagos peritoneales de IVIg inyección ratones son estimulados con LPS ex vivo, producen IL-10 más 6-fold que los ratones inyectados con PBS. Sin embargo, no producen cantidades detectables de IL-12 / 23p 40 al ser estimulados con LPS ex vivo. Estos resultados demuestran que los efectos de anticuerpos pueden ser probados en macrófagos por inyectar la droga en vivo y cultivo de células ex vivo con este método.
Respuestas del macrófago a estímulos inflamatorios y anticuerpos pueden ser tasada en vivo. Producción de citoquinas puede evaluarse en líquido de lavado y en sobrenadantes de ex vivo estimula los macrófagos peritoneales. La figura 4 muestra la citocina antiinflamatoria IL-10 se incrementa en macrófagos peritoneales (figura 4C), líquido de lavado (figura 4A) y células peritoneales (figura 4B) cuando ratones se enfrentan con IgIV + LPS comparados con PBS + LPS. Producción de la subunidad de citoquinas pro inflamatorias, IL-12 / 23p 40, se reduce significativamente en los macrófagos peritoneales cultivados, pero no en líquido de lavado. Este método permite el examen de impacto de un medicamento de anticuerpo en las respuestas inflamatorias en vivo como ex vivo.
Figura 1 : Producción de macrófagos IL-10 e IL-12 / 23p 40 en respuesta a la estimulación con diferentes marcas de IVIg y LPS. Los macrófagos de la médula ósea derivado MCSF C57BL/6 fueron ambos sin estimular (C), o estimulados con LPS (10 ng/mL), inmunoglobulina intravenosa (30 mg/mL), o IgIV + LPS. Se analizaron tres diferentes marcas de IVIg: Octagam (OG), Gammunex (GX) y líquido de Gammagard (GL). Sobrenadantes de macrófagos fueron recogidos 24 h después de la estimulación y clarificados por centrifugación. Se realizaron ELISAs para IL-10 (A) e IL-12/23 p 40 (B). Datos son para macrófagos de n = 3 experimentos independientes, con células de 1 ratón individual por experimento, con ELISA se analizaron por duplicado. Los datos son medio ± SD. *P < 0.05, ** P < 0.001, ***P < 0.0001 para la comparación entre LPS estimulación e IgIV + estimulación Co LPS. Análisis unidireccional de varianza (ANOVA) con post-test de Tukey para comparaciones múltiples fueron utilizados para análisis estadísticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Mancha blanca /negra occidental análisis de activación de la cinasa del mapa en macrófagos activados de IVIg. MCSF derivadas de la médula los macrófagos eran estimulados con LPS o sin estimular (10 ng/mL), GX inmunoglobulina intravenosa (30 mg/mL), o IgIV GX + LPS; para 0, 10, 40 o 120 min lysates de la célula entera (1.0 x 106 macrófagos/carril) fueron objeto de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) y western blot con anticuerpos fosfo-específicos de p38 y extracelular quinasa regulada por señal (Erk1/2), así como el gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), como un control de carga. Resultados mostrados son representativos de n = 3 experimentos independientes, con células de 1 ratón individual por experimento.Densitometría para pp38 y proteína pErk1/2 niveles, normalizada a GAPDH, un promedio de 3 experimentos independientes se muestran a continuación de cada banda. Esta figura ha sido modificada desde Kozicky et al8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Producción de IL-10 por los macrófagos de ratones desafiados con IVIg en vivo. ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad recibieron PBS estéril (control de inyección) o inmunoglobulina intravenosa GX (2,5 g/kg) por vía intraperitoneal. Después de 1 h, ratones fueron sacrificados y se realizaron lavados peritoneales. Macrófagos peritoneales fueron aislados mediante selección de adherencia. Los macrófagos fueron ambos sin estimular (C), o estimulados con LPS (10 ng/mL). Sobrenadantes de células fueron cosechadas y aclarados después de 24 h para ELISAs de IL-10. Los datos son de n = 5 ratones individuales por grupo realizado en 3 experimentos independientes, con ELISA se analizaron por duplicado. Los datos son medio ± SD. * P < 0,01 y NS = no significativo. Análisis estadísticos se realizaron utilizando un ANOVA de dos vías con postest de Sidak para las comparaciones múltiples. Esta figura ha sido modificada desde Kozicky et al8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Producción de IL-10 e IL-12 / 23p 40 de ratones desafiados con IgIV + LPS en vivo. ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad se inyectan por vía intraperitoneal o PBS + LPS (peso corporal de 0,2 μg/g), como control; o GX IVIg (2,5 g/kg de peso corporal) + LPS (peso corporal de 0,2 μg/g). Después de 1 h, ratones fueron sacrificados y se realizaron lavados peritoneales. (A) aclaro del líquido de lavado, (B) aclara acondicionados sobrenadantes de células peritoneales durante un paso de adherencia de macrófagos 1 h, y (C) clarifica 24 h sobrenadantes de macrófagos peritoneales (Mφ) fueron analizadas para IL-10 e IL-12 / 23p 40 por ELISA. Los datos son medio ± SD para n = 5 ratones de 3 experimentos independientes, con ELISA se analizaron por duplicado. P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 y NS = no significativo. Ratones inyectados con PBS + LPS se compararon con ratones inyectados con IgIV + LPS mediante la prueba t de Student. Esta figura ha sido modificada desde Kozicky et al8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Estados de activación del macrófago juegan un papel importante en tanto tejido homeostasis y enfermedad22. Los macrófagos pueden tener distintas así como superposición de Estados de activación, dependiendo de señales en su microentorno3. Ellos tienen diferentes roles en todas las etapas de la respuesta inflamatoria: defensa contra agentes patógenos, restitución del tejido y cicatrización de la herida, y también tienen un estado de activación antiinflamatorio distinto que es importante para la desactivación de la respuesta inflamatoria2 . Activación de macrófagos antiinflamatorio requiere dos estímulos externos para los macrófagos producir altas cantidades de la citocina antiinflamatoria IL-10 y bajas cantidades de citoquinas proinflamatorias, como IL-1223. Una señal viene de anticuerpos a través de receptores de Fc gamma, y la segunda señal es un estímulo pro-inflamatorias, como LPS o IFNγ24,25. Suero, complejos inmunes y los anticuerpos anti-TNFα, se han encontrado para inducir un estado de activación antiinflamatorias IL-10-produing alta en macrófagos8,23,25,26. Nuestro grupo ha publicado previamente que macrófagos derivados de médula ósea murina y macrófagos peritoneales estimulados con IVIg también producen altas cantidades de IL-10 y poco a ninguna pro-inflamatorias IL-12 / 23p 40 en respuesta a LPS8. También hemos encontrado que otras citoquinas proinflamatorias, TNF e IL-6 también son reducidas por la IgIV en los macrófagos de la médula ósea derivado8. Los métodos aquí descritos pueden aplicarse para probar otras respuestas de drogas basado en anticuerpos de ratón BMDMs y macrófagos peritoneales in vitro e in vivo.
Hay muchos pasos críticos en la prueba terapéutica basados en anticuerpos en médula ósea de ratón y los macrófagos peritoneales. Mantenimiento de la esterilidad es importante para cada protocolo. Si las culturas macrófagos están contaminadas con microorganismos del aire, piel o las heces de los ratones, los macrófagos responderá a esos estímulos por producción de citoquinas proinflamatorias. Realizar todos los experimentos en un gabinete de bioseguridad, rociando el ratón liberalmente con etanol y asegurar la integridad del intestino durante los lavados peritoneales son esenciales. El anticuerpo debe mantenerse estéril y conservarse según las instrucciones del fabricante. No puede utilizarse si está contaminada, caducado o turbio. Turbidez disminuye la eficacia de la droga y puede ocurrir si la droga no se almacena a la temperatura adecuada o se ha almacenado durante demasiado tiempo. IVIg puede ser almacenado a 4 ° C y utilizado antes de la fecha de caducidad, ya que pueden afectar los niveles de producción de IL-10. Por otra parte, hemos visto que puede ser congelado a-20 ° C con ningún efecto sobre las respuestas. Distintos lotes de IgIV conducen a similares resultados experimentales, considerando diferentes tipos de preparaciones de la marca de IgIV, como en la figura 1, pueden provocar diferentes respuestas en macrófagos. Controles esenciales, tales como sin estimular las células y las células estimuladas con anticuerpos sola, deben incluirse en cada experimento para descartar la contaminación de los macrófagos o la droga.
Varias modificaciones se pueden hacer en estos protocolos para personalizar un experimento. En el estado no inflamado, puede ser difícil aislar suficiente los macrófagos peritoneales de grandes experimentos. Macrófagos peritoneales pueden ser provocados por inyección intraperitoneal de tioglicolato (TG). Se produce una respuesta inmunitaria, y después de 4 días, sacados de los macrófagos peritoneales pueden ser cosechado27. Los macrófagos reclutados pueden ser menos maduros y no representan las células residentes, ya hemos utilizado aquí, que son consideraciones importantes. TG-sacada de los macrófagos también han internalizado agar del caldo de la TG, que puede ser una complicación, sobre todo si haciendo experimentos en fagocitosis27. Ratones de diferentes orígenes genéticos, C57BL/6 y BALB/c, también pueden ser utilizados para experimentos y pueden ser elegidos para examinar el impacto de los anticuerpos en las respuestas del macrófago que se evaluaron en modelos de enfermedades que requieran un fondo genético específico. Además, los ratones modificados genéticamente, como Il10- / - ratones, pueden utilizarse para evaluar la función de proteínas específicas en el mecanismo de acción de un fármaco, como lo hemos hecho en nuestro propio trabajo8. Diversos estímulos inflamatorios pueden utilizarse también para evaluar el impacto de los anticuerpos en la activación de los macrófagos. IFNγ y anfitrión derivado de peaje como agonistas del receptor (TLR) (p. ej. ácido hialurónico), se han utilizado para activar la producción de IL-10 macrófagos25,28. Una consideración importante es la dosis del anticuerpo. La dosis debe titularse para obtener la dosis óptima en la cultura y en experimentos con animales, se diferencia entre anticuerpos así como de proveedores. La dosis elegida debe también reflejar la dosis en seres humanos y diferirán entre fármacos. IVIg se administra como una terapia antiinflamatoria a dosis altas (25-35 mg/mL o 2 g/kg de peso corporal), que refleja las dosis tituladas utilizados en estos protocolos29,30.
El uso de médula ósea y de los macrófagos peritoneales tienen limitaciones. Aunque una mejora sobre líneas celulares de macrófagos, ratón BMDMs son células todavía artificial derivadas de precursores hematopoyéticos. Pruebas de respuestas inmunes de los macrófagos en vitro es un paso importante para las respuestas del anticuerpo comprensión, pero en vivo experimentos deben realizarse así. Inyección de estímulos en vivo seguido por cultivo de células ex vivo, puede proporcionar más información para futuros estudios investigar si medicamentos basados en anticuerpos también pueden activar macrófagos antiinflamatorios en un estado de enfermedad. Estos experimentos no pueden extraer conclusiones sobre lo que ocurre en personas que reciben productos biológicos basados en anticuerpos. Pocos estudios han sido publicados para evaluar los efectos de la IgIV sobre humana monocitos derivados de macrófagos in vitro. Una reducción del número de monocitos humanos en vitro de IL-6 han sido reportados, cuando IVIg Co es estimulada con LPS en comparación a la estimulación con LPS solo12. IgIV reduce TNFα y producción de IL-6 al ser estimulados con procalcitonin (PCT) en humanos THP-1 monocytic células31.
Los protocolos dentro de este trabajo tienen ventajas sobre los métodos existentes. Macrófagos derivados de médula ósea y los macrófagos peritoneales son células primarias, aisladas de ratones, en lugar de ser inmortalizado en líneas celulares.Líneas del macrófago como célula de ratón, como 264.7 células, no producen la citocina proinflamatoria IL-12, en respuesta a LPS, que es una importante citocina que es regulada por la IL-10 que se produce en respuesta a IgIV8,13. Pruebas de una droga en vivo con LPS permite examinar el efecto de la droga en el entorno local peritoneal a través del análisis del líquido del lavado, las células peritoneales y específicamente, de los macrófagos peritoneales. Es un a corto plazo, el modelo simple que puede proporcionar información importante para justificar el examen de los efectos no específicos de anticuerpos en la activación de los macrófagos en los modelos animales más largos y más costosos de la enfermedad. Tiene una ventaja sobre modelos de endotoxemia donde la medida experimental a menudo es sólo la supervivencia del ratón o citocinas en suero14. Las tasas de supervivencia y suero citoquinas son valiosas medidas de la respuesta inmune, pero no muestran la contribución que los macrófagos pueden tener específicamente. Aislamiento y cultivo de macrófagos peritoneales de un experimento de desafío muestran un efecto directo y medible que terapias de anticuerpos pueden tener sobre la función del macrófago.
Estos métodos tienen aplicaciones para probar y diseñar las terapias biológicas. El uso de anticuerpos como terapéutica ha aumentado dramáticamente en los últimos años. Sin embargo, estas terapias pueden tener otros efectos desconocidos en los macrófagos que pueden cambiar su producción de citoquinas y reconocen la porción Fc del anticuerpo. El anticuerpo anti-TNFα, infliximab, se ha demostrado para inducir la IL-10 y suprimir la proliferación de células T a través de su porción Fc, y que se ha propuesto como uno de sus mecanismos de acción7,15,26. Utilizando modelos genéticos, proteínas específicas pueden estar implicadas en el mecanismo de cómo estos fármacos afectan a activación de los macrófagos. Clases de anticuerpos IgG y preparaciones de anticuerpos se pueden cambiar para alterar cómo macrófagos están afectados por productos biológicos. Nuestros datos indican la preparación o almacenamiento del mismo fármaco anticuerpo (inmunoglobulina intravenosa) puede afectar a sus efectos sobre la activación de los macrófagos. Los métodos en este artículo pueden utilizarse para diseñar terapias que no tienen estos efectos, que pueden ser críticos para mantener el ataque durante los tratamientos contra el cáncer, donde los macrófagos antiinflamatorios podrían promover la progresión tumoral. Estas técnicas podrían utilizarse también para diseñar y evaluar los medicamentos que tienen estos efectos, si deseable. Por ejemplo, podría ser beneficioso reducir las respuestas inflamatorias del macrófago y crear macrófagos IL-10 produce antiinflamatorios para mejorar el tratamiento para la enfermedad inflamatoria intestinal o la artritis reumatoide.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
L.K. es el recipiente de la concesión de beca posgrado beca de 4 años (4YF) Universidad de British Columbia. L.M.S. es el destinatario de una Asociación canadiense de Gastroenterología / de Crohn y de Colitis de Canadá / Premio CIHR nuevo salario del investigador y es un erudito Biomédica de la Fundación de Michael Smith para la investigación en salud. Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto de Canadian Blood Services, en colaboración con los institutos de salud de investigación de Canadá (concesión # CIHR2016-LS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
