Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Immobilisering av Caenorhabditis elegans å analysere intracellulær Transport i nerveceller

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56690

Summary

Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en god modell å studere axonal og intracellulær. Her beskrive jeg en protokoll for in vivo -opptak og analyse av axonal og intraflagellar transport i C. elegans.

Abstract

Axonal transport og intraflagellar transport (IFT) er avgjørende for axon og flimmerhårene morphogenesis og funksjon. Kinesin overfamilie proteiner og dynein er molekylære motorer som regulerer anterograd og retrograd transport, henholdsvis. Disse motorene bruker microtubule nettverk som skinner. Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en effektiv modell organisme axonal transport og IFT i vivo. Her jeg beskrive en protokoll for å observere axonal transport og IFT i levende C. elegans. Transportert Last kan visualiseres ved å merke Last proteiner bruke fluorescerende proteiner som grønne fluorescerende protein (GFP). C. elegans er gjennomsiktig og GFP-merket Last proteiner kan uttrykkes i bestemte celler under cellen-spesifikke arrangører. Levende ormer kan fikses ved microbeads på 10% agarose gel uten å drepe eller anesthetizing ormer. Under disse forholdene, Last bevegelse direkte observert i axons og flimmerhårene levende C. elegans uten disseksjon. Denne metoden kan brukes til observasjon av noen Last molekyl i celler ved å endre målet proteiner og/eller cellene de uttrykkes i. Mest grunnleggende proteiner som molekylær motorer og adapter proteiner som er involvert i axonal transport og IFT er bevart i C. elegans. Sammenlignet med andre modellen organismer, kan mutanter oppnådd og opprettholdt lettere i C. elegans. Kombinere denne metoden med ulike C. elegans mutanter kan avklare molekylære mekanismer axonal transport og IFT.

Introduction

Levende celle bildebehandling er et viktig verktøy for å analysere intracellulær transport. I neuronal cell biology er analyser av axonal transport med levende celle imaging avgjørende for å forstå neuronal funksjon og morphogenesis1. Feil i axonal transport ligger flere nevrodegenerative lidelser2. Kinesin overfamilie proteiner og dynein bære axonal transport anterogradely og retrogradely, henholdsvis1,2.

Cilia er en annen mobilnettet avlukke der microtubule nettverks- og menneskehandel maskiner er høyt utviklet3. Protein syntese maskiner er ikke lokalisert i flimmerhårene, som betyr at ciliary proteiner må transporteres fra cytoplasma til flimmerhårene tips. Flimmerhårene-spesifikke kinesin og dynein, kalt kinesin-2 og cytoplasmatiske dynein-2, henholdsvis, transport komponentene i flimmerhårene4, i et fenomen som kalles intraflagellar transport (IFT)5. Nedskrivning av IFT fører et spektrum av sykdommer kalt ciliopathies6. Dermed er analyse av IFT mekanismen av levende celle tenkelig nødvendig å forstå grunnleggende mekanismer av ciliary formasjon og patogenesen.

Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en god modell axonal transport og IFT7,8,9. For å observere IFT, har Chlamydomonas vært mye brukt som en modell organisme5,6. Chlamydomonas er en encellet organisme, ville forholdet mellom IFT med aldring, neuronal funksjon og oppførsel være vanskelig å analysere. I tillegg er viktig genetisk teknikker som CRISPR/Cas9 ikke brukt på Chlamydomonas. I høyere modell organismer, som mus og Drosophila, forårsaker forstyrrelse av axonal transport og IFT ofte dødelig fenotyper fordi axonal transport og IFT er avgjørende for morphogenesis og homeostase av dyr 10, 11. Når det gjelder mus, er cellekultur og hva vanligvis nødvendig å observere axonal transport og IFT, som krever mange ferdigheter og omfattende tid12,13. I tillegg kan en rekke viktige fysiologiske sammenheng gå tapt i kulturperler celler og linjer. Fordi nervesystemet ikke er avgjørende for overlevelsen av ormer, C. elegans mutanter der axonal transport og IFT avbrutt er ofte ikke dødelige7,9,14. Axonal transport og IFT kan være direkte observert i vivo uten disseksjon fordi C. elegans er gjennomsiktig, og det er derfor lett å observere GFP-merket markører.

Det er flere protokoller til nakkens C. elegans, som med en microfluidic enhet15, agarose pads med anestesi16eller microbeads17. Inkludering av anestesi kan hemme menneskehandel hendelsene i neurons15. En klar ulempe av metoden microfluidic-enhet er at forberede en microfluidic enhet ikke er alltid lett. I stedet er immobilisering av agarose pads og microbeads en praktisk og enkel måte å utføre tid forfalle bildebehandling i C. elegans. Her jeg beskrive denne grunnleggende protokollen nakkens C. elegans og visualisere axonal transport IFT og i vivo C. elegans. Sammenlignet med de andre metodene, metoden beskrevet her krever ikke spesialutstyr og er mye billigere og enklere å utføre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sample forberedelse

  1. Generer en transgene C. elegans stamme av interesse ved hjelp av transgene metoder 18. Eventuelt få riktig stammer fra Caenorhabditis genetikk Center (CGC). For å visualisere axonal transport av synaptic vesicle forløpere, bruke transgene linje wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Å observere IFT, få transgene linje mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Disse stammer brukes i denne protokollen.
    Merk: Enten extrachromosomal matrise, genomisk integrasjon eller selv GFP bank i works. For å redusere bakgrunnen signaler, bruk cellen-spesifikke arrangører, i stedet for pan-nevrale arrangører.
    Merk: Vedlikehold av ormer beskrives andre protokoller 20. Påkjenningen ble opprettholdt på plenene ved Escherischia coli OP50 mater på Rundormer vekst medium (NGM) plater (1,7% (w/v) agarose, 50 mM NaCl, 0,25% (w/v) pepton 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL kolesterol, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 60 mm diameter plast retter) på 20 ° C.
  2. Voksen ormer ved 20 ° C på NGM plater til helst livssyklus av ormene.
    Merk: Kan man observere både axonal transport og IFT når som helst. Sen L4 til unge voksne er en god positive kontroll fordi flere publikasjoner har brukt disse stadier og visualisert menneskehandel hendelser 14 , 21 , 22 , 23.

2. Utarbeidelse av 10% Agarose

Merk: mange tilby tilsvarende produkter som agar, agar pulver og agarose. Bruker geleelektroforese klasse agarose (gel styrke > 1200 g/cm 2). Billige agar pulver ikke fungerer fordi resulterende gel ikke er sterk nok til å nakkens ormer.

  1. Mix 0,4 g agarose i 4 mL destillert vann (DW) i et glassrør (1,5 cm x 10.5 cm). Legg lokk på glassrør å unngå fordampning.
  2. Sette glassrør på 95 ° C varme blokk i 90 min. I tillegg forbereder en annen glassrør (1,5 cm x 10.5 cm) fylt med DW og holde det på 95 ° C. sette en Pasteur Pipetter i 95 ° C DW ( figur 1 A). Mange små bobler vises i agarose røret og løsningen skal være grumset. Overlate til løsningen blir klart. Så, blande av pipettering opp og ned til den agarose løsningen blir homogen.
    Merk: Mikrobølgeovn kan ikke brukes til å klargjøre 10% agarose løsning når laget av DW og agarose. Små bobler forårsaket av mikrobølger hindre agarose smelter. Imidlertid kan befestet 10% agarose gel lett være smeltet igjen med en mikrobølgeovn. Glass-rør som inneholder 10% agarose gel kan være forberedt på forhånd og lagret på 4 ° C i minst 6 måneder. Hvis dermed smelte lager bruker mikrobølgeovn ved behov og starte fra trinn 3 i denne protokollen.
    Merk: Agarose mister evnen til å stivne hvis ruges 95 ° c i lang tid eller etter gjentatte herding og smelter. Hvis dette skjer, klargjør nye 10% agarose.

3. Utarbeidelse av Agarose Pad

  1. bruker de varmet Pasteur Pipetter i trinn 2.2, plasserer 2 dråper av 10% agarose på et 76 x 22 mm-lysbilde.
  2. Raskt dekket med en andre 76 x 22 mm 2 lysbildet før agarose stivner som vist i figur 1 B, og skyv ned på det andre lysbildet å flate agarose løsningen. Tykkelsen skal 0,5-1 mm.
  3. Raskt tømme Pasteur pipette av pipettering 95 ° C DW opp og ned til den agarose løsningen er vasket ut. Ellers vil Pipetter blir tilstoppet av agarose gel. La den pipette står i 95 ° C DW.
  4. Vente 1 min. Agarose pad former og blir skyet. Skyv deretter lysbildene fra hverandre for hånd ( figur 1 C).

4. Montering av

Merk: selv små mengder ormen bevegelse hindre god observasjon. Levamisole er tradisjonelt brukt til å forhindre at ormen bevegelse på agarose pad 24 ,- 25. Men Levamisole hemmer neuronal reseptorer i C. elegans, og derfor kan påvirke menneskehandel hendelser i neurons 15. Bruke polystyren microbeads beskrevet hereis en god alternativ 17.

  1. Under en stereo mikroskop utstyrt med en slidable speil transillumination, overføre ~ 30 transgene ormer uttrykke de passende indikatorene som en ny NGM plate uten bakterier bruker en platina wire plukke.
    Merk: En platina wire plukke er laget av platina wire og Pasteur Pipetter (5 tommer), og spissen av platina ledningen var flat. Utarbeidelse av platina wire plukker og håndtering av ormer med disse er beskrevet i Wormbook (http://www.wormbook.org).
  2. La platen i 1 bakterier blir automatisk fjernet fra overflater av ormer som ormer flytte på NGM agarose gel uten bakterier.
  3. Sette en 0,5-1.0 µL dråpe 2,6% 100 nm diameter polystyren microbeads i vann på agar pad ( figur 1 D). Overfør 10-20 ormer fra bakterier-free NGM platen til microbeads. Slipp og spre ormer bruke platinum wire velge for å unngå de overlappende av ormen organer ( figur 1 E).
  4. Bruke en 22 x 40 mm 2 dekkglassvæske ( figur 1 F). Skyv forsiktig å fjerne luftbobler, men unngå knusende ormer. Prøven er nå klart til avbilding.
    Merk: Fordi ingen anestesi blir administrert, worms er løst bare av det friksjons kraften generert av agar pad, polystyren microbeads og dekkglassvæske 17. Tilstedeværelsen av materen bakterier og/eller mye løsning vil gjøre friksjons styrken svakere.
    Merk: Forskjellige størrelser av coverslips (f.eks, 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) fungerer. Større coverslips kan imidlertid hindre nedsenking vann eller olje fra linsen lekker i prøvene under observasjon.

5. Observasjon

Merk: aktuelle tenkelig parametere (laser makt, gevinst, binning, etc.) vil være forskjellig for hver mikroskop og kameraet. Her widefield mikroskop utstyrt med et spinning disk AC confocal skanner og en digital CCD kameraet brukes.

  1. Satt temperaturkontroll av scenen til 20 ° C, eller justere romtemperaturen til 20 ° C.
  2. Sette eksempel lysbildet på mikroskopet scenen. Bruke 100 x (numerisk blenderåpning = 1.3 eller bedre) linsen.
  3. Ser for områdene angitt i figur 2 A (for wyIs251 og axonal transport) eller figur 2 B (for mnIs17 og IFT) som positive kontroller . Andre områder kan analyseres som godt 22.
  4. Sett parametere (CCD gevinst = 200, Binning = 1 eller 2, laser makt på 488 nm = 1.0-1.3 mW). Utføre tid lapse innspillingen på 4 rammer/s for opptil 1 min. lagre filer som mutli-TIFF-formatet.
    Merk: Hvis GFP signaler forsvinner og det er vanskelig å fortsette å observere GFP::RAB-3 eller OSM-6::GFP for 30 s, laser makt er for sterk. I så fall redusere laser makt. Omvendt, hvis ingen vesicula bevegelse registreres, laser makt er for svakt. I så fall øke laser makt.
  5. Observere en annen orm og gjenta 5.3 og 5.4. Observasjonene kan vare i opptil 20 min, men hver orm skal registreres bare én gang for å unngå virkningene av photo skade.
    Merk: Ormer er observert i minst 20 min uten betydelige feil 7 , 27 , 28. Lengre observasjon kan være mulig, men havn ' t vært testet ennå. Et klart tegn på neuronal død er endring av neuronal morfologi som neurite hevelse. Svake GFP signaler kan sees i axons og dendrites både wyIs251 og mnIs17, kan neurite morfologi enkelt kontrolleres ved å bare se på axons eller dendrites. Neuronal morfologi er vist i figur 2.
  6. Generere filmfiler.
    1. Åpne flere TIFF-filen ved hjelp av Fiji programvare. Gå til fil > åpne Velg flere TIFF-filen lagret i trinn 5.4.
      Merk: Fiji kan lastes ned på jttps://fiji.sc. Bildet J og plugins kan også brukes til å generere kymographs. Hvis dermed følge veiledningen for valgte plugin.
    2. Klikk på " Rektangulært utvalg " knappen ( Figur 3, pil) og velger området av interesse ved å tegne et rektangel med en mus (gul rektangel i Figur 3 A). Gå til Image > stabler > verktøy > Substacks og Velg sektor numrene som er inkludert i filmen. En substack genereres.
    3. Aktivere vinduet substack ved å klikke og gå til Image > Juster > lysstyrke/kontrast. Et vindu for å justere lysstyrken og kontrasten vises. I vinduet Skyv toppen bar (Minimum) til høyre slik at bakgrunnen signalet forsvinner og andre topp bar (maksimum) til venstre så det bevegelige blemmer og partikler kan sees ganske godt over bakgrunnen.
    4. Gå til Image > stabler > tid Stamper. Som filmen er registrert på 4 rammer/s i trinn 5.4, tidsintervallet er 0,25 s. Dermed skriver " 0,25 " i intervallet.
    5. Genererer en filmfil ved å velge Lagre som > AVI fil-menyen (film 1 og 2).
      Merk: Ved å bruke riktig plugins, kan du lagre filen som andre formater som " mpeg4 " eller " mov " filer.
  7. Genererer kymographs.
    1. Åpne de originale filmfilene bruke FIji programvare på nytt og gjenta 5.6.3 justere lysstyrken og kontrasten og 5.6.2.
    2. Klikk " segmentert linje " ( Figur 3 B, pil). Bruke en mus, tegne en segmentert linje langs flimmerhårene eller axon (gul linje, i Figur 3 B).
    3. Gå til analysere > Multi Kymograph > Multi Kymograph ( Figur 3 C). Bredde vinduet vises ( Figur 3 D). Type " 3 " i Linewidth-vinduet og klikk på OK ( Figur 3 D).
    4. Kymograph vindu opprettes. Lagre bildet i TIFF- eller JPEG-format.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Axonal transport i DA9 Nevron
Ved å bruke wyIs251 :, både anterograd og retrograd axonal transport av GFP::RAB-3 kan være samtidig registrert i DA9 motor neuron. Gjennomsnittlig hastighet for anterograd og retrograd transport i proksimale dorsal axon av DA9 Nevron er ca 1,8 og 2,6 μm/s, henholdsvis22. Antall bevegelige blemmer handler om 0,03 og 0.018 per μm av axon per s. Dermed for en 30 s observasjon av 10 μm på DA9 axon bruker en 100 x linsen, kan man finne omtrent 9 og 5 flytte blemmer i axon (Figur 4 og film 1). Hvis ingen vesicula bevegelse kan observeres, er det mulig at laser makt er svak. I tillegg til lang rekkevidde går, kort rekkevidde bevegelse av vesicle bassenger kan være registrert (film 1). Noen blemmer stopp på disse vesicle bassenger, mens andre dissociate fra det7,23. Disse parametrene kan overvåkes og brukes til å analysere mutant fenotyper.

IFT i halen nerveceller
Cilia er lokalisert til spissen av dendrites i C. elegans (figur 2B). MnIs17 belastning uttrykker GFP-merket OSM-6, en av de IFT underenheter29. OSM-6 uttrykkes i både hodet og halen neurons19. Mens mange hodet flimmerhårene er merket med mnIs17, er bare to flimmerhårene tydelig observert i halen Nevron. Dermed observere disse flimmerhårene er enklere enn hodet flimmerhårene (se diskusjon). OSM-6::GFP er diffus i neuronal cytoplasma som man finner i axon, celle kroppen og dendrite. Men i flimmerhårene, er OSM-6::GFP konsentrert til flimmerhårene og innlemmet i flytte partikler. Lengden på PHA og PHB flimmerhårene er ca 6,5 μm. Anterograde IFT er bifasisk 8,9. Hastigheten på anterograd IFT handler om 0,7 og 1,3 μm/s i midten og distale segmenter av flimmerhårene, henholdsvis (figur 5 og Movie 2).

Figure 1
Figur 1 : Demonstrasjon av eksempel utarbeidelsen. (A) Hot DW, Pasteur Pipetter og 10% agarose på varme blokk. (B og C) Utarbeidelse av agarose pads: en agarose pad er dannet mellom lysbilder (B). Øvre lysbildet er fjernet etter en agarose pad former (C). (D) skjematisk tegning viser hvordan polystyren perle løsning er satt på agarose puten. (E) skjematisk tegning viser hvordan ormer er satt i den polystyren perle løsningen ved hjelp av en platina wire plukke. (F) A dekkglassvæske (22 x 44 mm2) er satt på agarose puten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Imaging området. (A) skjematisk tegning av DA9 og VA12 neurons og et representativt bilde av wyIs251. I DA9 neurons har ikke det ventrale axon, commissure og proksimale axon modne synapser. Men synaptic vesicle prekursorer er transportert fra celle kroppen til synapser via disse axonal regioner. Regionen som skal observeres vises boksene. (B) skjematisk tegning av PHA og PHB neurons og deres flimmerhårene. Regionen som skal observeres vises boksene. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Generasjon og kymographs Fiji programmvre. (A) klikk på "Rektangulært utvalg"-knappen (pil), og velg en ønsker å fokusere på ved å tegne et rektangel (gul boks) for å generere substacks. (B) klikk segmentert linje (pil) og trekke en segmentert linje langs flimmerhårene bruke mus (gul linje). (C) Velg "Analysere", "Multi Kymograph" og "Multi Kymograph" starte en plugin for å generere kymographs. (S) Input linewidth, klikk "OK" og generere kymographs (figur 5 og figur 7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representative kymograph axonal transport av synaptic vesicle prekursorer. GFP::RAB-3 bevegelse er observert på den proksimale asynaptic regionen DA9 Nevron og kymograph ble generert med Multi Kymograph av Fiji. Vannrette og loddrette linjene representerer lengden og tid, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Representative kymograph av IFT. OSM-6::GFP er observert i PHA og PHB flimmerhårene og denne kymograph genereres fra hendelsen menneskehandel i ett av dem. Kymograph ble generert med Multi Kymograph av Fiji. Vannrette og loddrette linjene representerer lengden og tid, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: representant film av axonal transport av synaptic vesicle prekursorer. GFP::RAB-3 bevegelse er observert på den proksimale asynaptic regionen DA9 Nevron. GFP::RAB-3 er innlemmet i synaptic vesicle prekursorer og transportert. Både anterograd og retrograd axonal transport registreres. Noen blemmer stoppe men starte igjen. Filmen ble innspilt i 4 rammene/s og spiller på 15 rammer/s. ScaLe bar = 5 μm. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 2
Movie 2: representant film av IFT. OSM-6::GFP er observert i PHA og PHB flimmerhårene. OSM-6::GFP er innlemmet i IFT komplekse og beveger seg langs flimmerhårene. Filmen ble innspilt i 4 rammene/s og spiller på 15 rammer/s. skala bar = 5 μm. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Begrensninger med hensyn til eksisterende metoder
Metoden beskrevet her er optimalisert for å observere raske hendelser som axonal transport og IFT. Dermed er immobilisering mer prioritert enn lenger inkubasjon. Mens vi har kunnet observere menneskehandel hendelser for minst 20 min uten betydelige forstyrrelsene, kanskje denne metoden passer ikke alltid å observere langsom hendelser som krever lengre observasjoner, som axon forlengelse og celle migrasjon. For lengre observasjoner, man trenger å optimalisere betingelsene ved å redusere prosentandelen av agarose (dvs., øke vannet å unngå tørker opp og redusere presset som potensielt forårsaker skade). Eventuelt kan microfluidic enheten beskrevet over15 eller immobilisering av agarose pads og anestesi være mer egnet16 mens bivirkninger bør vurderes nøye.

Avgjørende skritt i protokollen
For tilstrekkelig observasjon er markører kritiske. Indikatorer må innarbeides i blemmer eller partikler og være av tilstrekkelig lysstyrke. Extrachromosomal matriser eller integrert linjer kan brukes. For visualisering av axonal transport av synaptic vesicle forløpere i DA9 nerveceller er wyIs251 belastningen nyttig7,23. jsIs821 har blitt brukt til å observere axonal transport i mechanosensory nerveceller i noen studier26,27. Når andre neurons er analysert, bør synaptic vesicle proteiner uttrykkes i interessert neurons bruker celle bestemt arrangører. Disse arrangører bør være sterk nok. RAB-3 og SNB-1 er mye brukt til å merke synaptic vesicle forløpere22,23,26. For å observere IFT, skal komponentene i IFT komplekse være merket. Som en positiv er mnIs17 belastningen et godt valg29. Flimmerhårene fra 8 celler (ASE, ASG, ASI, ASL, aske, ASK, automatisk dokumentmater og ADL) er samlet sammen i hodet (amphid) mens flimmerhårene fra 2 celler (PHA og PHB) er samlet i halen (phasmid). Fordi OSM-6::GFP uttrykkes i alle tungeformet neurons i mnIs17, kan det være vanskelig å analysere IFT i detalj i hodet flimmerhårene. Men i regionen hale, bare PHA og PHB neurons er merket og IFT i hver celle kan enkelt løses. Andre IFT proteiner merket med fluorescerende proteiner kan brukes til å observere IFT21,28. Hvis man ønsker å analysere hodet nerveceller, ville celle-spesifikke arrangører være nyttig. Mens hodet flimmerhårene har varierende morphologies, kan transport hendelsene være registrert29. Krysset mutanter med disse markørene, kan funksjonene til noen gener i axonal transport og IFT være analysert i vivo. Parameterne som kan analyseres har blitt beskrevet i tidligere arbeid22,23,26,27. GFP er det beste og primære valget. mCherry og tdTomato kan også være brukt22, men mCherry er mye dimmer enn GFP. tdTomato er en tandem dimer og større enn monomerisk fluorescerende proteiner, som noen ganger påvirker dynamikken i fusion proteiner30. Derfor resultatene skal analyseres og tolket forsiktig når tdTomato brukes. mScarlet, en lys monomerisk rød fluorescerende protein som nylig har blitt utviklet, er en alternativ valg31.

Mens spinning disk AC confocal mikroskopi er mye brukt til å observere axonal transport og IFT7,21, utstyret er dyrt og kan være vanskelig å få tilgang i noen forskningsmiljøer. Men kan disse fenomenene også registrert og analysert i C. elegans bruker standard fluorescerende mikroskoper, hvis utstyrt med høy NA linser, fordi C. elegans er en liten og gjennomsiktig dyr og lett å observere.

Fremtidig anvendelse
Av lignende immobilisering metoden beskrevet her, ble IFT observert i ett molekyl oppløsning i vivo32. Dessuten er flere typer Super-oppløsning mikroskopi utviklet. En kan direkte bruke metodene som er beskrevet her til super-oppløsning mikroskopisk analyse. I min erfaring, Airyscan33 rask modus fungerer godt analysere IFT. Teoretisk sett, spinner disken super-oppløsning mikroskop (SDSRM) ville være et godt valg som vel34. I konklusjonen, ved å kombinere mutant biblioteker og disse nye teknikkene, metoden beskrevet bør her være nyttig for å avklare molekylære mekanismer axonal transport og IFT i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatteren Takk dypt Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) for hennes nyttig diskusjon. wyIs251 var en sjenerøs gave fra Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 ble gitt av CGC, som finansieres av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 og #16 H 06536 og Daiichi Sankyo foundation, hjernen vitenskap Foundation og Naito Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slideglass (76  x 26 mm) Matsunami S1111
Coverglass (22  x 40 mm) Matsunami C024401
Agarose Wako 318-01195
Polystylene microbeads 0.1 micron Polysciences #00876
Heat block TAITEC 0063288-000 CTU-mini
Microscope Olympus IX-71 widefield microscope
Spinning disk Scanner Yokogawa CSU-X1 spinning disc confocal scanner 
Digital CCD camera Hamamatsu Photonics C10600-10B ORCA-R2 degital CCD camera
Objective lens (x100, NA1.4) Olympus UPLSAPO 100XO
Pasteur pipette (5 inch) IWAKI IK-PAS-5P
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) IWAKI 9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251 Laboratory of Kang Shen N/A
OTL11: mnIs17 Ref. 27, 29 N/A SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times
Stereo microscope Carl Zeiss 435064-9000-000 STEMI 508 
Mirror transillumination unit Carl Zeiss 435425-9010-000
platinum wire (0.2 mm) Nilaco Corporation m78483501
60 mm plastic dish Falcon #351007
Fiji N/A N/A https://fiji.sc/
nematode growth medium (NGM)   1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  2. Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
  3. Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
  4. Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
  5. Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
  6. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell's antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
  7. Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
  8. Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
  9. Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
  10. Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
  11. Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
  12. Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
  13. Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
  14. Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
  15. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
  16. Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
  17. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
  18. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  19. Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
  20. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  21. Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
  22. Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
  23. Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
  24. Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
  25. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
  26. Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
  27. Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
  28. Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
  29. Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
  30. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  31. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
  32. Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
  33. Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
  34. Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 128 Axonal transport Intraflagellar transport Caenorhabditis elegans mikroskopi Nevron flimmerhårene
Immobilisering av <em>Caenorhabditis elegans</em> å analysere intracellulær Transport i nerveceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niwa, S. Immobilization ofMore

Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons. J. Vis. Exp. (128), e56690, doi:10.3791/56690 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter