Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e intracelular. Aqui, eu descrevo um protocolo para análise de transporte axonal e em c. eleganse in vivo de gravação.
Abstract
Transporte axonal e do transporte (IFT) são essenciais para a função e morfogênese axônio e cílios. Dineína e cinesina superfamília proteínas são motores moleculares que regulam anterógrada e retrógrada, transporte, respectivamente. Estes motores usam redes de microtúbulos como trilhos. Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo modelo poderoso para estudar o transporte axonal e IFT na vivo. Aqui, eu descrevo um protocolo para observar o transporte axonal e IFT na vida c. elegans. Carga transportada pode ser visualizada por marcação de proteínas de carga usando proteínas fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente (GFP). C. elegans é transparente e proteínas GFP-etiquetado carga podem ser expressa em células específicas sob promotores específicos de célula. Vermes vivos podem ser corrigidos por microbeads em gel de agarose 10% sem matar ou anestesiar os vermes. Nestas condições, movimentação de carga pode ser diretamente observada nos axônios e cílios de viver c. elegans sem dissecação. Esse método pode ser aplicado para a observação de qualquer molécula de carga em todas as células, modificando as proteínas alvo e/ou as células estão expressos em. As proteínas mais básicas tais como motores moleculares e proteínas do adaptador que estão envolvidas no transporte axonal e IFT são conservadas no c. elegans. Em comparação com outros organismos-modelo, os mutantes podem ser obtidos e mantidos mais facilmente em c. elegans. Combinar este método com vários mutantes de c. elegans pode esclarecer os mecanismos moleculares do transporte axonal e IFT.
Introduction
Imagem de célula viva é uma ferramenta essencial para a análise de transporte intracelular. Em biologia celular neuronal, análises de transporte axonal com imagens ao vivo da célula são essenciais para a compreensão de função e morfogênese neuronal1. Defeitos no transporte axonal fundamentam várias de doenças neurodegenerativas2. Proteínas de superfamília de cinesina e Dineína realizam transporte axonal anterogradely e retrogradely, respectivamente,1,2.
Cílios são outro compartimento celular em que a rede de microtúbulos e maquinaria de tráfico são altamente desenvolvidos3. Maquinaria de síntese de proteína não está localizada em cílios, o que significa que as proteínas ciliares devem ser transportadas do citoplasma para as pontas dos cílios. Específicos de cílios cinesina e Dineína, chamada cinesina-2 e citoplasmática Dineína-2, respectivamente, os componentes de cílios4, em um fenômeno chamado do transporte (IFT)5de transporte. Imparidade de IFT faz com que um espectro de doenças chamadas ciliopathies6. Assim, é necessária uma análise do mecanismo de IFT por imagens de células vivas para entender os mecanismos básicos de formação ciliar e patogênese.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e IFT7,8,9. Para observar o IFT, Chlamydomonas tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo5,6. Como Chlamydomonas é um organismo unicelular, a relação do IFT com envelhecimento, função neuronal e comportamento seria difícil de analisar. Além disso, não foram aplicadas técnicas genéticas essenciais tais como CRISPR/Cas9 a Chlamydomonas. Em organismos superiores do modelo, tais como ratos e Drosophila, ruptura do transporte axonal e IFT frequentemente causa fenótipos letais porque transporte axonal e IFT são essenciais para a homeostase dos animais 10e a morfogênese 11. No caso dos ratos, transfection e cultura de células é geralmente necessária para observar o transporte axonal e IFT, que requer muitas habilidades e extenso de tempo12,13. Além disso, um monte de contexto fisiológico importante pode ser perdido em culturas de células e linhas celulares. Porque o sistema nervoso não é essencial para a sobrevivência dos vermes, c. elegans mutantes em que o transporte axonal ou IFT são rompidos muitas vezes não são letais7,9,14. Transporte axonal e IFT podem ser diretamente observado na vivo sem dissecação porque c. elegans é transparente e, portanto, é fácil observar marcadores GFP-etiquetado.
Existem vários protocolos para imobilizar o c. elegans, como o uso de um dispositivo de microfluidic15, almofadas de agarose com anestesia16ou microbeads17. A inclusão da anestesia pode inibir os tráfico de eventos em neurônios15. Uma clara desvantagem do método microfluidic-dispositivo é que preparar um dispositivo microfluidic não é sempre fácil. Em vez disso, imobilização por almofadas de agarose e microbeads é uma maneira fácil e conveniente de realizar imagens de lapso de tempo em c. elegans. Aqui, eu descrevo este protocolo básico para imobilizar o c. elegans e visualizar o transporte axonal e IFT na vivo em c. elegans. Comparado a outros métodos, o método descrito aqui não requer equipamentos especiais e é muito mais barato e mais fácil de realizar.
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Protocol
1. preparação da amostra
- gerar um transgénico c. elegans estirpe de interesse usando metodologias transgénicos 18. Como alternativa, obter cepas apropriadas de centro de genética o Caenorhabditis (CGC). Para visualizar o transporte axonal de precursores da vesícula sináptica, use a linha transgênicos wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Para observar o IFT, obter a linha transgênicos mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Estas variedades são utilizadas neste protocolo.
Nota: Qualquer matriz extracromossômico, integração genômica ou mesmo GFP bater-em obras. Para reduzir os sinais de fundo, usar promotores específicos de célula, ao invés de promotores pan-neuronal.
Nota: Manutenção de vermes é descrita em outros protocolos de 20. Cepas foram mantidas nos relvados do alimentador Escherischia coli OP50 no crescimento de nematoides médio chapas (NGM) (agarose 1,7% (p/v), 50 mM de NaCl, 0,25% (p/v) de peptona, 1 mM CaCl 2, 5mg/mL colesterol, 25mm KH 2 PO 4, 1mm MgSO 4 pratos plásticos de 60 mm de diâmetro) a 20 ° C. - Crescem vermes a 20 ° C em placas NGM para qualquer estágio do ciclo de vida dos vermes.
Nota: Pode-se observar tanto o transporte axonal e o IFT em qualquer fase. L4 atrasado para o jovem adulto é um bom controlo positivo porque várias publicações têm usado estes estágios e eventos visualizado tráfico de 14 , 21 , 22 , 23.
2. Preparação de 10% Agarose
Nota: muitos fornecedores oferecem produtos similares, tais como pó de ágar-ágar, ágar e agarose. Use a electroforese da classe agarose (força do gel > 1200 g/cm 2). Pó de ágar barato não funcionam porque o gel resultante não é forte o suficiente para imobilizar vermes.
- Mix 0,4 g de agarose em 4 mL de água destilada (DW) de água em um tubo de vidro (1,5 x 10,5 cm). Coloque uma tampa do tubo de vidro para evitar a evaporação.
- Colocar o tubo de vidro em um bloco de calor de 95 ° C por 90 min. Além disso, preparar um outro tubo de vidro (1,5 cm x 10,5 cm) repleto de DW e mantê-lo em 95 ° C. colocar uma pipeta Pasteur na 95 ° C DW ( Figura 1 A). Será visto um monte de pequenas bolhas no tubo de agarose e a solução deve ser turva. Deixá-lo até que a solução torna-se claro. Em seguida, misture pipetando acima e para baixo até que a solução de agarose torna-se homogênea.
Nota: O micro-ondas não podem ser usadas para preparar a solução de agarose de 10% quando feita de DW e agarose. Pequenas bolhas causadas por microondas evitar derretimento de agarose. No entanto, solidificado 10% gel de agarose facilmente pode ser derretido novamente usando um microondas. Tubos de vidro contendo 10% de gel de agarose podem ser preparados antecipadamente e armazenados a 4 ° C durante pelo menos 6 meses. Se fazê-lo, derreter o estoque usando microondas quando necessário e começar a partir do passo 3 neste protocolo.
Nota: Agarose perde gradualmente a capacidade de solidificar-se incubada a 95 ° C por um longo tempo ou após repetidas de solidificação e fusão. Se isso acontecer, prepare-se nova 10% agarose.
3. Preparação de Agarose Pad
- usando a pipeta de Pasteur aquecida preparada no passo 2.2, colocar 2 gotas de agarose de 10% em um slide 76 x 22 mm.
- Rapidamente a tampa com um slide de 2 76 x 22 mm segundo antes da queda de agarose solidifica como mostrado na Figura 1 B e empurrar para baixo o segundo slide para achatar a solução de agarose. A espessura deve ser de 0,5-1 mm.
- Rapidamente lave a pipeta Pasteur por pipetagem 95 ° C DW acima e para baixo até que a solução de agarose é lavada para fora. Caso contrário, a pipeta vai ficar obstruída por gel de agarose. Deixar a pipeta de pé na 95 ° C DW.
- Espera por 1 min. A almofada de agarose forma e torna-se turva. Em seguida, deslize os slides separados pela mão ( Figura 1 C).
4. Montagem de vermes
Nota: mesmo pequenas quantidades de movimento worm impedem boa observação. Levamisole tradicionalmente tem sido utilizada para prevenir o movimento worm a almofada de agarose 24 , 25. No entanto, Levamisole inibe receptores neuronais em c. elegans e, portanto, pode afetar os eventos de tráfico em neurônios 15. Usar o poliestireno microbeads descrito aqui é uma boa alternativa 17.
- Sob um microscópio estéreo equipado com uma transiluminação espelho deslizável, transfer ~ 30 vermes transgênicos expressando os marcadores apropriados para um novo NGM placa sem bactérias usando um fio de platina escolher.
Nota: Escolher um fio de platina é feita de fio de platina e pipeta Pasteur (5 polegadas), e a ponta do fio de platina foi achatada. A preparação das picaretas fio de platina e manipulação de vermes com estes são descritos no Wormbook (http://www.wormbook.org). - Deixar o prato para 1 min. bactérias são removidas automaticamente das superfícies de vermes como os vermes se move em gel de agarose NGM sem bactérias.
- Colocar um 0,5-1,0 µ l queda de 2,6% 100 nm de diâmetro poliestireno microbeads em água sobre a placa de ágar-ágar ( Figura 1 D). Transferi 10-20 vermes da placa NGM livre de bactérias para o microbeads. Gota e espalhar os vermes usando o fio de platina escolher para evitar a sobreposição de verme corpos ( Figura 1 E).
- Uma lamela 22 x 40 mm 2 ( Figura 1-F). Empurre suavemente para remover as bolhas de ar, mas evitar o esmagamento de vermes. A amostra está agora pronta para tratamento de imagens.
Nota: Porque sem anestesia é administrada, vermes são fixados apenas pela força friccional gerada pelo bloco de ágar e poliestireno microbeads lamela 17. A presença de bactérias do alimentador e/ou demais solução fará com que a força de fricção mais fraco.
Nota: Tamanhos diferentes de lamelas (por exemplo, 22 x 22mm 2, 18 x 18 mm 2) de trabalho. No entanto, as lamelas de maiores podem evitar imersão água ou óleo a partir da lente objetiva vazando para amostras durante a observação.
5. Observação
Nota: parâmetros de imagem apropriados (poder do laser, ganho, binning, etc.) serão diferentes para cada sistema de microscópio e câmera. Aqui, um microscópio widefield equipado com um scanner confocal de disco giratório e uma câmera CCD digital é usado.
- Regule a temperatura da fase de 20 ° C, ou ajustar a temperatura ambiente de 20 ° C.
- Colocar o slide de amostra no palco microscópio. Use x 100 (abertura numérica = 1.3 ou superior) da lente objetiva.
- Olha para as áreas indicadas na Figura 2 (para wyIs251 e transporte axonal) ou Figura 2 B (para mnIs17 e IFT) como controles positivos . Outras áreas podem ser analisadas como bem 22.
- Conjunto de parâmetros (CCD ganho = 200, Binning = 1 ou 2, a potência do laser em 488 nm = 1.0-1.3 mW). Executar a gravação de lapso de tempo em 4 frames/s para até 1 min. salvar arquivos como mutli-TIFF formato.
Nota: Se a GFP sinais de desaparecer e é difícil continuar a observar GFP::RAB-3 ou OSM-6::GFP por 30 s, a potência do laser é muito forte. Nesse caso, reduza a potência do laser. Por outro lado, se nenhum movimento vesicular é registrado, a potência do laser é muito fraca. Nesse caso, aumentar a potência do laser. - Observar um worm diferente e repetir 5.3 e 5.4. As observações podem durar por até 20 min., mas cada verme deve ser registrada apenas uma vez para evitar os efeitos de pAcredita danos.
Nota: Worms foram observados pelo menos 20 min sem defeitos significativos de 27 , 7 , 28. Mais observação pode ser possível, mas refúgio ' t sido testado ainda. Um sinal claro da morte neuronal é a mudança da morfologia neuronal, tais como inchaço do axônio. Como sinais fracos do GFP podem ser vistos nos axônios e dendritos em wyIs251 e mnIs17, morfologia do axônio pode ser facilmente verificada olhando apenas axônios ou dendritos. Morfologia neuronal é mostrada na Figura 2. - Gerar arquivos de filme.
- Aberto o TIFF multi arquivo usando software de Fiji. Vá para arquivo > abrir selecione o arquivo TIFF multi salvou na etapa 5.4.
Nota: Fiji pode ser baixado em jttps://fiji.sc. Imagem J e plugins também pode ser usado para gerar kymographs. Se fazer isso, siga as instruções relevantes para o plugin escolhido... - clique a " seleção retangular " botão ( Figura 3 A, seta) e selecione a área de interesse pelo desenho de um retângulo com um mouse de computador (retângulo amarelo na Figura 3 A). Vá até Image > pilhas > ferramentas > fazer Substacks e selecione os números de fatia que estão incluídos no filme. Um substack é gerado.
- Ativar a janela de substack clicando e vá até Image > ajuste > brilho/contraste. Mostra-se uma janela para ajustar o brilho e contraste. Na janela, deslize a parte superior da barra (mínimo) para a direita para que o sinal de fundo desaparece e o segundo top bar (máximo) para a esquerda assim que o movimento vesículas e partículas podem ser vistas muito bem sobre o fundo.
- Vá até Image > pilhas > tempo Stamper. Como o filme é gravado em 4 frames/s na etapa 5.4, o intervalo de tempo é 0,25 s. Assim, digite " 0.25 " no intervalo.
- Gerar um arquivo de filme, selecionando salvar como > AVI do menu arquivo (filme 1 e 2).
Nota: Usando plugins apropriado, você pode salvar o arquivo como outros formatos tais como " mpeg4 " ou " mov " arquivos.
- Aberto o TIFF multi arquivo usando software de Fiji. Vá para arquivo > abrir selecione o arquivo TIFF multi salvou na etapa 5.4.
- Gerar kymographs.
- Abrir os arquivos originais do filme usando software de FIji novamente e repita os passos 5.6.2 e 5.6.3 para ajustar o brilho e o contraste.
- Clique " segmentado linha " ( Figura 3 B, seta). Usando um mouse, desenhe uma linha segmentada ao longo dos cílios ou axônio (linha amarela, na Figura 3 B).
- Ir para analisar > Multi Kymograph > Multi Kymograph ( Figura 3 C). Aparece a janela de largura de linha ( Figura 3-D). Tipo " 3 " na janela Linewidth e clique Okey ( Figura 3-D).
- Kymograph janela é criada. Salvar a imagem em formato TIFF ou JPEG.
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Representative Results
Transporte axonal em DA9 neurônio
Usando a linha de wyIs251 , o anterógrada e retrógrada transporte axonal de GFP::RAB-3 pode ser gravada simultaneamente no neurônio motor DA9. A velocidade média de anterógrada e retrógrada transporte no axônio do neurônio DA9 dorsal proximal é cerca de 1,8 e 2,6 μm/s, respectivamente22. O número de vesículas em movimento é sobre 0,03 e 0,018 por μm de axônio por s. Assim, para uma observação de s 30 10 μm de axônio DA9 usando uma lente de 100 x, que se pode encontrar cerca de 9 e 5 movendo vesículas no axônio (Figura 4 e 1 filme). Se nenhum movimento vesicular pode ser observado, é possível que a potência do laser é muito fraca. Além de corridas de longa distância, movimento curto alcance das piscinas de vesículas pode ser gravado (1 filme). Algumas vesículas param esses pools de vesículas, enquanto outros dissociam-há7,23. Esses parâmetros podem ser monitorados e utilizados para analisar os fenótipos mutantes.
IFT nos neurônios de cauda
Cílios são localizados à ponta de dendrites em c. elegans (Figura 2B). A tensão de mnIs17 expressa OSM-6 GFP-etiquetado, dentre o IFT subunidades29. OSM-6 é expresso em ambos cabeça e cauda de neurônios19. Enquanto muitos cílios cabeça são rotulados por mnIs17, cílios apenas dois são claramente observados em neurônio a cauda. Assim, observando esses cílios é mais fácil do que a cabeça cílios (Veja também discussão). OSM-6::GFP é difusa no citoplasma neuronal como a encontrada no dendrito, corpo celular e axônio. No entanto, em cílios, OSM-6::GFP concentrado para cílios e incorporada em mover partículas. O comprimento dos cílios PHA e PHB são cerca de 6,5 μm. Anterograde IFT é bifásico 8,9. A velocidade da anterógrada IFT é sobre 0,7 e 1,3 μm/s nos segmentos médios e distais dos cílios, respectivamente (Figura 5 e filme 2).
Figura 1 : Demonstração da preparação amostra. (A) DW quente, pipeta Pasteur e 10% de agarose no bloco do calor. (B e C) Preparação de agarose almofadas: uma almofada de agarose é formada entre slides (B). A corrediça superior é removida após um formas de almofada de agarose (C). (D) diagrama esquemático desenho mostrando como poliestireno do grânulo solução é colocar a almofada de agarose. (E) diagrama esquemático mostrando como vermes são colocados na solução de poliestireno do grânulo, usando um fio de platina de desenho escolher. (F) uma lamela (22 x 44 mm2) é colocada na plataforma de agarose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Área de imagem. (A) desenho esquemático do DA9 e VA12 neurônios e uma imagem representativa da wyIs251. Nos neurônios DA9, o axônio ventral, comissura e axônio proximal não tem maduras sinapses. Mas precursores da vesícula sináptica são transportados do corpo celular para sinapses através destas regiões axonal. A região que deve ser observada é mostrada por caixas. (B) desenho esquemático do PHA e PHB neurônios e seus cílios. A região que deve ser observada é mostrada por caixas. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Geração de filmes e kymographs usando software de Fiji. (A) clique no botão "Seleção retangular" (seta) e selecione a área que gostaria de focar desenhando um retângulo (caixa amarela) para gerar substacks. (B) clique no botão de linha segmentada (seta) e desenhe uma linha segmentada ao longo os cílios usando um rato (linha amarela). (C) selecione "Analisar", "Multi Kymograph" e "Multi Kymograph" para iniciar um plugin para gerar kymographs. (S) linewidth de entrada, clique em "Okey" e gerar kymographs (Figura 5 e Figura 7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Kymograph representante de transporte axonal de precursores da vesícula sináptica. GFP::Rab-3 movimento é observado na região proximal asynaptic do neurônio DA9 e o kymograph foi gerado com Multi Kymograph de Fiji. Barras horizontais e verticais representam comprimento e tempo, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Kymograph representante do IFT. OSM-6::GFP é observada em cílios PHA e PHB e este kymograph é gerado a partir do evento de tráfico em qualquer um deles. O kymograph foi gerado com Multi Kymograph de Fiji. Barras horizontais e verticais representam comprimento e tempo, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: filme representativo do transporte axonal de precursores da vesícula sináptica. GFP::Rab-3 movimento é observado na região proximal asynaptic do neurônio DA9. GFP::Rab-3 é incorporada precursores da vesícula sináptica e transportados. Tanto anterógrada e retrógrada transporte axonal são registrados. Algumas vesículas parem mas reiniciar novamente. O filme foi gravado em 4 frames/s e peças em 15 quadros/s. ScaLe bar = 5 μm. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Movie 2: filme representativo do IFT. OSM-6::GFP é observada em cílios PHA e PHB. OSM-6::GFP incorporado ao complexo do IFT e se move ao longo dos cílios. O filme foi gravado em 4 frames/s e joga no bar de escala 15 frames/s. = 5 μm. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Limitação no que diz respeito a métodos existentes
O método descrito aqui é otimizado para observar eventos rápidos como transporte axonal e IFT. Assim, a imobilização é mais priorizada de incubação mais longa. Enquanto nós fomos capazes de observar eventos de tráfico pelo menos 20 min sem perturbação significativa, esse método pode não ser sempre adequado para observar eventos lentos, exigindo mais observações, tais como alongamento do axônio e migração celular. Para mais observações, um precisa otimizar as condições, reduzindo a porcentagem da agarose (i.e., aumentando a água para evitar a secar e reduzindo a pressão que potencialmente causa danos). Como alternativa, o dispositivo microfluidic descrito acima15 ou a imobilização dos vermes usando anestesia e agarose almofadas pode ser mais adequado16 enquanto efeitos colaterais devem ser avaliados cuidadosamente.
Passos críticos dentro do protocolo
Para observação adequada, marcadores são críticos. Marcadores precisam ser incorporada de vesículas ou partículas e ser de brilho suficiente. Extracromossômico matrizes ou linhas integradas podem ser usadas. Para visualização do transporte axonal de precursores de vesícula sináptica nos neurônios DA9, a tensão de wyIs251 é útil7,23. jsIs821 tem sido usado para observar o transporte axonal nos neurônios mechanosensory alguns estudos26,27. Quando outros neurônios são analisados, proteínas de vesícula sináptica devem ser expressos em neurônios interessados usando promotores específicos de célula. Esses promotores devem ser fortes o suficiente. RAB-3 e SNB-1 são amplamente utilizados para rotular a vesícula sináptica precursores22,23,26. Para observar o IFT, os componentes do complexo o IFT devem ser rotulados. Como um controle positivo, a tensão de mnIs17 é uma boa escolha de29. Cílios emanando de 8 células (ASE, ASG, ASI, ASL, ASH, ASK, ADF e ADL) estão reunidos na cabeça (amphid), enquanto os cílios de 2 células (PHA e PHB) são empacotados na cauda (bicho-pau). Porque OSM-6::GFP é expressa em todos os neurônios ciliados no mnIs17, pode ser difícil analisar o IFT detalhadamente na cabeça cílios. No entanto, na região da cauda, apenas neurônios PHA e PHB são rotulados e IFT em cada célula pode ser facilmente resolvido. Outras proteínas do IFT etiquetadas por proteínas fluorescentes podem ser usadas para observar o IFT21,28. Se deseja analisar a cabeça neurônios, promotores de célula específica seria útil. Enquanto cabeça cílios têm morfologias variadas, eventos de transporte podem ser gravado29. Através do cruzamento de mutantes com estes marcadores, as funções de quaisquer genes no transporte axonal e IFT pode ser analisado na vivo. Os parâmetros que podem ser analisados foram descritos em trabalhos anteriores22,23,26,27. GFP é a escolha melhor e primária. mCherry e tdTomato também podem ser usado22, no entanto, mCherry é muito mais fraca do que as boas práticas agrícolas. tdTomato é um dímero em tandem e maior do que de proteínas fluorescentes monoméricas, que às vezes, afeta a dinâmica das proteínas de fusão30. Portanto, os resultados devem ser analisados e interpretados com cautela quando tdTomato é usado. mScarlet, uma brilhante proteína vermelha fluorescente monomérica que recentemente tem sido desenvolvida, é uma escolha alternativa31.
Enquanto girando a microscopia confocal de disco é amplamente utilizado para observar o transporte axonal e IFT7,21, o equipamento é caro e pode ser difíceis de acessar em alguns ambientes de pesquisa. No entanto, esses fenômenos também podem ser gravados e analisados em c. elegans usando microscópios fluorescentes padrão, se equipado com lentes de alta at, porque c. elegans é um pequeno e transparente animal e fácil observar.
Aplicação futura
Pelo método de imobilização semelhantes descritos aqui, IFT observou-se na resolução em vivo32única molécula. Além disso, foram desenvolvidos vários tipos de microscopia de super-resolução. Um pode aplicar diretamente os métodos descritos aqui para análise microscópica de super-resolução. Na minha experiência, o modo rápido de Airyscan33 funciona muito bem para analisar IFT. Teoricamente, um microscópio de super-resolução disco girando (SDSRM) seria uma boa escolha como bem34. Em conclusão, combinando bibliotecas mutantes e essas novas técnicas, o método descrito aqui deve ser útil para esclarecer os mecanismos moleculares do transporte axonal e IFT na vivo.
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Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
O autor agradece profundamente Dr. Asako Sugimoto (Universidade de Tohoku) para a discussão útil. wyIs251 foi um presente generoso do Dr. Kang Shen (Universidade de Stanford). mnIs17 foi fornecido pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Este trabalho foi apoiado por grant JSPS KAKENHI #17 H 05010 e #16 H 06536 e Daiichi Sankyo foundation, Fundação da ciência do cérebro e Fundação Naito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell's antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
