Summary
Этот протокол описывает тепла шок индуцированного белка выражение (система pDHsp/V5-его/sf9 клеток), который может использоваться для выражения инородные белки или оценке анти apoptotic деятельность потенциальных иностранных белков и их усеченного аминокислот кислоты в клетках насекомых.
Abstract
Переходных ген выражение системы является одним из наиболее важных технологий для выполнения функционального анализа белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Эта система была разработана для Экспресс чужеродные гены под контролем промотора baculoviral в переходных выражение плазмид. Кроме того эта система может применяться для функционального анализа бакуловирусы сам или инородные белки. Наиболее широко и коммерчески доступных временных ген выражение системы является разработана на основе незамедлительного начала гена (IE) промоутер Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Однако наблюдается низкий уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых. Таким образом выражение системы переходных ген был построен для улучшения выражения протеина. В этой системе были построены рекомбинантных плазмид содержат последовательности целевых объектов под контролем промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Этот протокол представляет применение этого тепла на основе шок pDHsp/V5-его (V5 epitope с 6 гистидина) /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы; Эта система доступна не только для экспрессии генов, но и для оценки активности анти apoptotic кандидата белков в клетках насекомых. Кроме того эта система либо transfected с одной рекомбинантных плазмид или совместно transfected два потенциально функционально антагонистических рекомбинантных плазмид в клетках насекомых. Протокол демонстрирует эффективность этой системы и обеспечивает практический случай этой техники.
Introduction
Две системах выражения протеина широко использовались для производства белков: системах выражения протеина прокариот (кишечная палочка ген выражение системы) и эукариоты системах выражения протеина. Один из популярных эукариоты системе выражения протеина является бакуловирусы выражение вектор системы (BEVS)1. Baculoviruses впервые были использованы как во всем мире биоконтролирующих агентов сельскохозяйственных и лесных вредителей. В последние несколько десятилетий как биотехнологические инструменты для векторов выражения протеина также были разработаны baculoviruses. Геномы baculoviruses состоят из круговой двуцепочечной ДНК и запечатанная nucleocapsids2. На сегодняшний день, более чем семьдесят бакуловирусы изолятов были виртуализированного3. На основании временной Каскад выражения гена baculoviral в клетки хозяина насекомых, транскрипции гена могут быть разделены на четыре временных каскады, включая немедленное ранний, задержка начале, конце и очень поздно гены4.
BEVSs были определены таким образом, что очень поздно генным стимуляторам (то есть, многогранник или p10 промоутер) были использованы для привода целевых генов, в то время как рекомбинантной бакуловирусы была порождена гомологичная рекомбинация. Выражение иностранных белков в клетках насекомых, рекомбинантных бакуловирусы похож на млекопитающих белков в столб-поступательные изменения (подходит для производства гликопротеин). Таким образом бакуловирусы был широко используется5,6,7. Однако одно ограничение является наличие различных путей N-гликозилирования насекомых клетки7.
Таким образом была разработана новая система бакуловирусы выражение, выражение системы переходных гена. Эта система выражает чужеродные гены под диск baculoviral немедленного начале промоутеров (ie-1 промоутер) в клетках насекомых. С помощью этой системы, целевого белка может быть сразу же выражена под контролем промотора ie-1 во время изменения N-гликозилирования путь в клетках насекомых, что приводит к лучшей олигосахариды, связанный с N7. Кроме того baculoviral немедленно ранняя гены транскрибируются РНК полимеразой II клетки-хозяина и не требуют какой-либо вирусной фактор для активации4. Таким образом иностранные белков может быть выражено в клетках насекомых в течение короткого времени. На сегодняшний день, переходные системы выражения гена является одним из наиболее важных технологий для выполнения функциональных анализов белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Система может применяться для анализа функции бакуловирусы или инородные белки. Один из коммерчески доступных временных ген выражение систем основана на промоутеров немедленного начала гена (IE) Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 и OpIE1 промоутеров).
Однако ниже уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых еще была проблема, когда система выражение на основе промоутер переходных гена OpIE была используется8,9,10. Таким образом другой переходных ген выражение системы была построена на основе промоутер дрозофилы тепловой шок белка 70 (БТШ70) ген8,9. Промоутер hsp70 работает более эффективно, чем промоутер baculoviral IE когда индуцированных теплового шока на насекомых клетки10. В этой системе были высказаны генов-мишеней под диск промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Чужеродные гены можно легко клонировать в плазмиду выражение переходных генов клонирования методами на основе ПЦР. Кроме того контроль сроков для экспрессии генов может осуществляться тепловой шок индукция.
В настоящем докладе, мы следовать подходу и выразить три различных усечений гена baculoviral (Ингибитор апоптоза 3, iap3 от Lymantria xylina MNPV) с помощью системы выражения на основе шок переходных белка тепла и Далее примените эти выраженной белки на анти apoptotic анализ деятельности. Эта система может либо Экспресс инородные белки быстро или применяться для оценки деятельности анти apoptotic белка в клетках sf9, а также может применяться для других анализов активность белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Культура клеток насекомых
- Подготовка 50 мл среды культуры клеток. Чтобы сделать это, добавьте 500 мкл антибиотиков (амфотерицин B = 0,25 мкг/мл, пенициллин = 100 единицы/мл, стрептомицина = 100 мкг/мл) и 5 мл сыворотки тепла инактивированная плода говядину в среде культуры клеток сыворотки бесплатно (без FBS или антибиотики).
Примечание: Тепла плода бычьим сывороточным при 65 ° C за 30 минут на водяной бане перед использованием. - Сохранить Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: совок), sf9 насекомых клеток. Отсоединить ОК. 80% клеток от 25 см2 клетки культуры колбу, встряхивая колбу и проверить под световой микроскопии. Затем передать новый флакон культуры клеток2 25 см 50% суспензию клеток и позволяют клеткам прикрепить 15 мин при комнатной температуре. Заменить средство с 5 мл свежего клеток питательной среды и расти в инкубаторе на 28 ° C. Клетки проход каждые 2 до 3 дней в зависимости от роста клеток.
- Подготовка 50 мл среды культуры клеток. Чтобы сделать это, добавьте 500 мкл антибиотиков (амфотерицин B = 0,25 мкг/мл, пенициллин = 100 единицы/мл, стрептомицина = 100 мкг/мл) и 5 мл сыворотки тепла инактивированная плода говядину в среде культуры клеток сыворотки бесплатно (без FBS или антибиотики).
- Подготовка плазмиды для transfection клетки
- Вставьте фрагменты ДНК целевого объекта (например, непарный xylina гена iap3 в MNPV (LyxyMNPV) и его удаление конструкций) в pDHsp/V5-его на основе ПЦР клонирования метод11. Проверьте роста колоний превращается в колонии PCR с помощью ПЦР Мастер микс (2 X) и pDhsp-F2/Op-IE2R грунтовка набор. Подтвердите плазмида последовательности службой коммерческих последовательности.
Примечание: В таблице 1 перечислены Праймеры для ПЦР и соответствующей конструкции. - Культура единого виртуализированного колонии бактерий, которые содержат вышеупомянутые плазмида конструкций (шаг 1.2) в 200 мл LB средних содержащие выбранные антибиотики (50 мкг/мл), соответственно.
- Извлечь плазмид из искусственного E. coli с помощью Midi плазмида комплекта согласно инструкции производителя12.
- Вставьте фрагменты ДНК целевого объекта (например, непарный xylina гена iap3 в MNPV (LyxyMNPV) и его удаление конструкций) в pDHsp/V5-его на основе ПЦР клонирования метод11. Проверьте роста колоний превращается в колонии PCR с помощью ПЦР Мастер микс (2 X) и pDhsp-F2/Op-IE2R грунтовка набор. Подтвердите плазмида последовательности службой коммерческих последовательности.
- Подготовка среднего покрытие путем смешивания 1,5 мл среды культуры клеток и 8,5 мл сыворотки свободных клеток питательной среды.
- Подготовить актиномицин Д (АСРТ) клеток питательной среды, добавив 1.5 мкл АСРТ акций (1 мг/мл) в 10 мл среды культуры клеток (конечная концентрация = 150 нг/мл). Хранить при 4 ° C.
2. Переходные белков
- Заполнение ячеек
- Урожай sf9 клетки, встряхивая колбу культуры, свергнуть осенью суспензии клеток с 50 мл трубки и передать Горяева 10 мкл на P10 пипетки. Подсчет клеток под микроскопом света.
- Пластина 3 × 105 sf9 клеток в каждой скважине в 24-ну пластине 15 мин при комнатной температуре. Замените носитель 0,5 мл обшивка среднего.
- Трансфекция плазмиды
- Разбавить клеток трансфекции реагента: развести 8 мкл Реагента transfection клетки в 100 мкл сыворотки свободных клеток питательной среды и микс от vortexing для 1 s.
- Добавить 2 мкг плазмидной ДНК (pDHsp70-Ac-P35/V5-его pDHsp70-лы-IAP3/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его) в 100 мкл сыворотки свободных клеток питательной среды и микс, vortexing для 1 s (Рисунок 2).
- Объединить разреженных плазмида ДНК и разбавленных клеток трансфекции реагента (210 мкл) и смесь vortexing для 1 s. инкубировать 30 мин при комнатной температуре.
- Мкл 210 ДНК трансфекции реагент смеси каплям на клетки, P1000 пипетки. Инкубируйте на 28 ° C за 5 ч.
- Замените средство покрытия 0,5 мл среды культуры клеток с помощью пипетки P1000. Печать 24-ну пластины с лентой и инкубировать клетки на 28 ° C на 16 h.
- Тепловой шок transfected клеток: Положите пластину в ванну воды 42 ° C (плавающие на поверхности воды). Тепло в течение 30 мин и вернуть инкубатор 28 ° C 24-ну пластины.
- Определение выражения протеина
- После 1 час или 5 h теплового шока Вымойте клетки с 0,5 мл 1 x PBS буфера кратко три раза.
Примечание: Развести 10 x буфер PBS 1 x PBS буфера путем добавления 1 мл буфера PBS 10 x 9 мл стерилизованное ddH2O - Лизируйте клетки с 40 мкл 1 x SDS загрузки краситель, закупорить вверх и вниз.
Примечание: Разбавляют 4 x SDS загрузки краситель, смешивая 30 мкл 1 x PBS буфера и 10 мкл 4 x буфер образца SDS. - Тепла образцы протеина в 98 ° C в течение 10 мин в блоке тепла, уменьшается на 1 мин и положить на льду для западной помарки assay.
- Западной помарке пробирного
Следуйте процедуре иммуноблоттинга пробирного эслами и Лухан-13. Запуск Гели SDS-PAGE14: один гель, подвергается Кумасси синий окрашивание (контроль погрузки для проверки, что количество образцов белка, загруженной в каждый хорошо равно в сумме) и другие подвергаются Западной пятно пробирного, согласно эслами и Лухан13 . - Обнаружить V5-тегами синтез белков с кролик антитела анти V5 (5 мг/мл) (1: 5000 разрежения в TBST буфер для рабочей концентрации 1 мкг/мл) и коз анти кролик IgG хрен пероксидазы (ПХ) конъюгата (0,8 мг/мл) (1: 10000 разрежения в TBST буфер для рабочей концентрация 0,08 мкг/мл).
Примечание: Отрегулируйте процент полиакриламида до 17,5% когда низкомолекулярных белков быть < 17 кДа.
- После 1 час или 5 h теплового шока Вымойте клетки с 0,5 мл 1 x PBS буфера кратко три раза.
3. анти apoptotic деятельности пробирного
- Джин индуцированной клеток апоптоз: повторите вышеупомянутые процедуры от 2.1 до 2.3. Совместное transfect 1 мкг pDHsp/D-rpr/флаг-его плазмидной ДНК (содержащий апоптоз индуктором ген) с 1 мкг плазмидной ДНК [pDHsp70/V5-его вектор (отрицательный контроль), pDHsp70-Ac-P35/V5-его (положительный контроль), pDHsp70-лы-IAP3/V5-его, pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его, соответственно.]. В 5 ч после термообработки шок проведения пробирного жизнеспособности клеток (рис. 2).
- Апоптоз клеток химико индуцированной: повторите вышеупомянутые процедуры от 2.1 до 2.3. В шаге 2.1.2 пластина 1 x 10-6 sf9 клеток в каждой скважине в пластине 6-хорошо. Transfect 4 мкг плазмидной ДНК [pDHsp70/V5-его вектор (отрицательный контроль), pDHsp70-Ac-P35/V5-его (положительный контроль), pDHsp70-лы-IAP3/V5-его, pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его, соответственно.]. В 5 ч после теплового шока лечить sf9 клетки с 2 мл АСРТ клеток питательной среды для 16 h и проведения пробирного жизнеспособности клеток (рис. 2).
Примечание: Минимальный объем для покрытия одной скважиной 6-ну плиты-1 мл. - Выполните выше анти apoptotic деятельности пробирного экспериментов, включая 3.1 и 3.2 в triplicates.
4. клетки жизнеспособности пробирного
- Промойте обработанные клетки, добавив 1 мл 1 x PBS буфера 1 мин 3 раза. Ресуспензируйте клетки, закупорить 1 мл 1 x PBS буфер, содержащий 0,04% Трипановый синий и пятен на 3 мин при комнатной температуре. Перенесите суспензию клеток в 1,5 мл микропробирок.
Примечание: Разбавьте раствор 0,4% Трипановый синий, смешивая 9 мл раствора 1 x PBS буфер и 1 мл 0,4% Трипановый синий. - Передача 10 мкл Трипановый синий окрашенных клеток подвеска Горяева с пипеткой P10 и подсчет жизнеспособных нетронутым клеток под микроскопом света.
- Статистический анализ
- Рассчитать записанные данные и представить в качестве средства ± с.д. для всех счетчиков.
- Анализировать данные с помощью студента двустороннее t тест, с помощью Microsoft Excel. Определить статистически значимые данные как P-значение < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полная длина и другие два усечения (Бир и кольцо домены) Ly-IAP3 из LyxyMNPV были оверэкспрессировали в sf9 клетках, основанный на теплового шока на основе pDHsp/V5-его /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы. PDHsp/V5-его содержится дрозофилы тепловой шок белка промоутер, который управляет экспрессии генов вниз по течению при температуре 42 ° C состояния с помощью сотовой транскрипционный анализ факторов и перевода системы (рис. 1)8 ,9,11. Весь технологический блок-схема показана на рисунке 2. После 1 час или 5 h теплового шока клетки были лизированы с буфером образца протеина и подвергается пробирного западную помарку для подтверждения выражения протеина. Результаты показали, что полнометражных протеинов, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-Бир и Ly-IAP3-кольца, могут быть обнаружены в transfected клеток в 1 ч или 5 h после теплового шока. Кроме того накопление белка были найдены в 5 ч после теплового шока (рис. 3). Таким образом согласно данным, функциональных assay протеина была исполнена на момент времени выражение максимальная белка (5 ч после теплового шока).
Джин индуцированной клеток апоптоза и апоптоз клеток химико индуцированной могут быть адаптированы к этой системе для оценки деятельности анти apoptotic (рис. 2). Для apoptosis клетки генов induced две конструкции (апоптоз индуктор и целевых генов плазмида конструкции) были совместно transfected в sf9 клетки и затем тепла потрясен выполняет экспрессии генов. Кроме того анти apoptotic белка Ac-P35 (положительный контроль) и апоптоз индуктором протеина (D-RPR) были также выражены с помощью этой системы переходных выражение теплового шока.
После теплового шока оба генов начал быть выражена и переведены на белки. По сравнению с D/вектор RPR, положительный контроль (Ac-P35/D-RPR) показали высокой анти apoptotic активность, который достиг до 80% от ставки жизнеспособности. От жизнеспособности клеток результаты других конструкций исследователи могли бы сравнить анти apoptotic деятельность друг друга или позитивного управления (рис. 4A). Для химико индуцированной клеток апоптоза только одна конструкция была transfected в sf9 клетки. После 5 часов после теплового шока химических веществ (АСРТ) были добавлены, и жизнеспособность клеток была измерена после 16 h (рис. 2). По сравнению с теми из позитивного управления (AC-P35) или отрицательным (вектор), каждой конструкции показали различные эффекты на анти apoptotic активность (Рисунок 4B).
Рисунок 1: Схема и нуклеотидной последовательности ly-iap3 относительной плазмидные конструкции основанные на pDHsp/V5-его вектор. Начала кодон (ГПТ) показан жирным шрифтом. Подчеркивание указывает энзима ограничения вырубки (ХиндIII в красный цвет; BamHI в синий цвет); последовательность в зеленый цвет указывает на Dhsp70 промоутер региона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема теплового шока индуцированного белка выражение (система pDHsp/V5-его/sf9 клеток). Апоптоз Джин индуцированной клетки и клетки, химико индуцированного апоптоза лечения были указаны для первого шага (сопредседатель трансфекции с apoptosis индуктором гена плазмида) или позже после теплового шока (химико индуцированного апоптоза), соответственно, для анти апоптоз assay. Измененный рисунок и легенда воспроизводится с разрешения Springer11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: гиперэкспрессия AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-Бир и Ly-IAP3-кольца с помощью теплового шока индуцированного белка выражение (система pDHsp/V5-его/sf9 клеток). На 1 час или 5 h пост теплового шока lysates клетки были собраны и подвергается иммуноблоттинга пробирного и SDS/страница. (A) Западная помарка пробирного с α-V5 антитела и (B) SDS/страница витражи с Кумасси синим загрузки элемента управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Жизнеспособности assays для D-rpr или актиномицин Д индуцированного апоптоза. (A) sf9 клетки были transfected с pDHsp70/V5-его вектор (вектор только) и совместно transfected pDHsp70/drpr/флаг-его, с pDHsp70/V5-его вектор, pDHsp70/Ac-P35/V5-его, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-его, pDHsp70/Ly-IAP3-Бир/V5-его, pDHsp70 / Ly-IAP3-кольца/V5-его, соответственно. Статистически значимые различия между вектором и P35 и вектора и Ly-IAP3 (т-тест; P < 0,05). (B) sf9, которые были transfected клеток с либо pDHsp70/V5-его вектор или pDHsp70/Ac-P35/V5-его, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-его, pDHsp70/Ly-IAP3-Бир/V5-его, pDHsp70/Ly-IAP3-кольца/V5-его, соответственно, 5 ч после теплового шока был добавлен АСРТ и позже, 16 h жизнеспособность клеток была измерена. Разница между вектором и P35 является статистически значимым (t-теста; P < 0,05). Измененный рисунок и легенда воспроизводится с разрешения Springer11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Последовательности |
| pDHsp-IAP3-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´ |
| pDHsp-IAP3-BamHI-R | CGGATGTAGGAACACCTTGAGGATCC5´-GC-3´ |
| iap3-Бир-BamHI-r | CGGCAGATCGCCGCCGCGGAGGATCC5´-CG-3´ |
| iap3-кольцо-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´ |
| pDhsp70-F2 | 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´ |
| ОП IE2R | 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´ |
Таблица 1: грунтовка наборы, используемые для клонирования метода на основе ПЦР. * Подчеркнутые пар оснований ДНК указал энзима ограничения сайтов. В списке изменение грунтовка воспроизводится с разрешения Springer11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Концепция системы тепла на основе шок клеток pDHsp/V5-его/sf9 был впервые описан Клем et al. 19948. Сравнение baculoviral гена промоутер (IE1) и дрозофилы hsp70 показали, что что hsp70 имели более высокую эффективность в клетках комаров10. Кроме того из-за тепловой шок индукция, сроки экспрессии белков может контролироваться точно после термообработки шок. Затем эта система была применена для протеина функциональные анализы креветок и nucleopolyhedrovirus (NPV) ИАП белки9,11. В этом протоколе, были использованы в общей сложности 6 плазмидные конструкции: три (pDHsp/V5-его pDHsp/Ac-p35/V5-его и pDHsp/D-rpr/флаг-его), были предоставлены на Цзянь-Horng леи9и три других конструкций (pDHsp-iap3/V5-его, pDHsp-iap3-Бир/V5-его, и pDHsp-iap3-кольца/V5-его) были построены Най и др., 201611. Кажется, что этот промоутер в насекомое клетки работает более эффективно, чем baculoviral генным стимуляторам. Однако во время манипуляции настоящего Протокола, есть несколько моментов, которые должны быть рассмотрены. Прежде чем плазмида трансфекции Проверка вставки последовательность ДНК имеет важное значение для экспрессии генов; Таким образом она должна сливается с V5 epitope сформировать V5-тегами синтез белка в конце последовательности целевого объекта. Кроме того различные сплавливания Теги (например, флаг epitope) также может быть разработана на основе pDHsp вектора для assay протеина привязки в пробирке . Эта процедура продления будет способствовать дальнейшее расследование белок белковых взаимодействий9. Таким образом коммерческие V5 Поликлональные антитела могут использоваться для обнаружения белков. Трансфекция соотношение в различных клетках насекомых должны быть протестированы перед эксперимент. Более низкие показатели transfection может привести к необнаруживаемых экспрессии белков; Таким образом, вектор pDHsp, содержащий подходящие доклада ген (т.е., зеленый флуоресцировать гена) может transfected в насекомое клетки оценить эффективность трансфекции.
Основным ограничением этой платформы выражение теплового шока является уровень выражения протеина. В некоторых случаях было найдено низкопротеиновое выражение уровня. Экспериментальное исследование согласно не значительные дозозависимый эффект, возникающая при более плазмида ДНК был transfected в sf9 клетки (данные не показаны). Таким образом этот эффект может быть вызвано убиквитин протеасом путь (UPP) или других неизвестных механизмы11. Исследователи изучить выражение протеина в присутствии ингибитор протеасом (т.е., MG-132), уточнить и recolve этот вопрос11. Другим ограничением является не добиться устойчивого производства белка, связанный с рекомбинантным вирусов. Таким образом стабилизации и количество белков являются также озабоченность по поводу этой системы. Таким образом курс время производства белка должна быть проверена иммуноблоттинга пробирного до функционального анализа. В этом протоколе мы сравнить два момента времени (1 и 5 ч после теплового шока) и наблюдается накопление целевого белка производства от 1 h до 5 ч. Увеличение времени пунктов предлагается с целью определить наилучшие условия времени для функциональных assay протеина.
Для протеина функциональные пробы, анти apoptotic белка Ac-P35 (положительный контроль) и апоптоз индуктором протеина (D-RPR) были также выражены с помощью этой системы переходных выражение теплового шока. Эти два белка называются функциональными антагонистами9,11,15. Таким образом вектор/D-RPR и Ac-P35/D-RPR может служить отрицательный контроль и позитивного управления, соответственно. С помощью этого сравнения, анти apoptotic активности целевых белков может быть определено.
Представленные протокол мог бы обеспечить платформу для Экспресс инородные белки более быстро или может применяться для оценки деятельности анти apoptotic белка в клетках насекомых. После того, как исследователи получить предварительные результаты функции протеина, эта система может использоваться для дальнейших исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ре Лое Цзянь-Horng институт морской биологии, Национальный университет Тайваня океана для предоставления 3 плазмидные конструкции. Это исследование было поддержано на грант 106-2311-B-197-001 - от министерства науки и технологии (большинство).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
- Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
