Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56693
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

Summary

Dit protocol beschrijft een warmte schok-geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel), die kan worden gebruikt voor het uitdrukken van vreemde proteïnen of evaluatie van de anti-apoptotic activiteit van potentiële buitenlandse eiwitten en hun afgeknotte amino zuren in insect cellen.

Abstract

Het voorbijgaande gen expressie systeem is een van de belangrijkste technologieën voor het uitvoeren van de functionaalanalyse eiwit in de baculovirus in vitro celcultuur. Dit systeem werd ontwikkeld om de uitdrukkelijke buitenlandse genen onder de controle van de promotor van de baculoviral in voorbijgaande expressie plasmiden. Dit systeem kan bovendien worden toegepast op een functionele test van de baculovirus zelf of vreemde eiwitten. Het meest algemeen en commercieel beschikbare voorbijgaande gen expressie systeem is ontwikkeld op basis van de promotor van de onmiddellijke-vroege gen (IE) van Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Echter werd een lage expressie niveau van buitenlandse genen in insect cellen waargenomen. Dus werd een voorbijgaande gen expressie systeem gebouwd om eiwituitdrukking te verbeteren. In dit systeem, werden recombinante plasmiden gebouwd om bevatten de volgorde van de doelgroep onder de controle van de Drosophila warmte schok 70 (Dhsp70) promotor. Dit protocol stelt de toepassing van deze warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-Hsi (V5 epitoop met 6 histidine) /Spodoptera frugiperda cel (sf9 cel) systeem; Dit systeem is niet alleen beschikbaar voor de expressie van genen maar ook voor de evaluatie van de activiteiten van de anti-apoptotic van kandidaat-eiwitten in insect cellen. Bovendien, dit systeem ofwel kan zijn transfected met één recombinant plasmide of mede twee potentieel functioneel antagonistische recombinante plasmiden in insect cellen transfected. Het protocol toont de doeltreffendheid van dit systeem en biedt een praktisch voorbeeld van deze techniek.

Introduction

Twee eiwit expressiesystemen zijn meestal gebruikt voor de productie van eiwitten: prokaryote eiwit expressie (Escherichia coli gen expressie systeem) en eukaryote eiwit expressiesystemen. Een populaire eukaryote eiwit expressie systeem is de baculovirus expressie vector systeem (BEVS)1. Baculoviruses werden voor het eerst gebruikt als wereldwijd biologische bestrijders van landbouw en bosbouw van ongedierte. In de afgelopen decennia, werden baculoviruses ontwikkeld als biotechnologische instrumenten voor eiwit expressievectoren evenals. Het genoom van de baculoviruses bestaan uit circulaire dubbelstrengig DNA en omhuld nucleocapsids2. Tot op heden meer dan achtenzeventig baculovirus geweest isolaten gesequenceerd3. Op basis van de temporele cascade van baculoviral gen expressies in insect cellen van de gastheer, kan de transcriptie van het gen worden ingedeeld in vier temporele cascades, met inbegrip van direct-vroege, vertraagd-vroege, late en erg laat genen4.

BEVSs werden aangewezen, zodat het zeer laat gene initiatiefnemers (d.w.z., veelvlak of p10 promotor) werden gebruikt om te rijden de doelgenen, terwijl de recombinante baculovirus werd gegenereerd door homologe recombinatie. Uitdrukking van vreemde proteïnen in insect cellen door recombinant baculovirus is vergelijkbaar met die van zoogdieren eiwitten in posttranslationele modificaties (geschikt voor de productie van glycoproteïne). Aldus, is de baculovirus gebruikte5,6,7. Een beperking is echter de aanwezigheid van verschillende N-glycosylation routes in insect cellen7.

Daarom werd een nieuwe baculovirus expressie systeem, het voorbijgaande gen expressie systeem, ontwikkeld. Dit systeem geeft uiting aan buitenlandse genen onder de schijf van baculoviral onmiddellijk-vroege initiatiefnemers (dwz 1 promotor) in insect cellen. Met behulp van dit systeem, kan de doel-eiwit worden onmiddellijk uitgedrukt onder de controle van ie-1 promotor tijdens het wijzigen van de route van de N-glycosylation in insect cellen, wat resulteert in betere N-linked oligosacchariden7. Bovendien, baculoviral onmiddellijke-vroege genen worden getranscribeerd door de gastheercel RNA polymerase II en vereisen geen enige virale factor voor activering4. Daarom kunnen vreemde eiwitten worden uitgedrukt in insect cellen binnen een korte tijd. Tot op heden, de voorbijgaande is gen expressie systeem een van de belangrijkste technologieën voor het uitvoeren van functionele testen van eiwit in de baculovirus in vitro celcultuur. Het systeem kan worden toegepast om de functie van baculovirus of vreemde eiwitten te analyseren. Een van de verkrijgbare voorbijgaande gen expressiesystemen is gebaseerd op de onmiddellijke-vroege gen (IE) initiatiefnemers van Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 en OpIE1 initiatiefnemers).

Het lagere niveau van de expressie van buitenlandse genen in insect cellen was echter nog steeds een probleem toen het OpIE promotor gebaseerde voorbijgaande gen expressie systeem gebruikte8,9,10. Dus, een ander voorbijgaande gen expressie systeem werd gebouwd op basis van de promotor van de Drosophila warmte schok eiwit 70 (hsp70) gen8,9. De promotor van hsp70 werkt efficiënter dan baculoviral IE promotor wanneer geïnduceerd door warmte schok in insect cellen10. In dit systeem, werden de doelgenen uitgedrukt onder het station van Drosophila warmte schok 70 (Dhsp70) promotor. Buitenlandse genen kunnen gemakkelijk worden gekloond in het voorbijgaande gen expressie plasmide door PCR-gebaseerde klonen methoden. Bovendien is de controle van de timing voor de expressie van genen kan worden uitgevoerd door warmte schok inductie.

In dit verslag, we volgen de aanpak en uiten van drie verschillende opschoningen van het baculoviral gen (remmer van apoptosis 3, iap3 vanaf Lymantria xylina MNPV) met behulp van de warmte schok gebaseerde voorbijgaande eiwit expressie systemen en Verder gelden deze uitgedrukte proteïnen op anti-apoptotic activiteit analyse. Dit systeem kan ofwel express vreemde eiwitten snel of verder worden toegepast op de evaluatie van eiwit anti-apoptotic activiteit in sf9 cellen, terwijl ook het potentieel om te worden toegepast op andere eiwit activiteit testen te hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Insect celkweek
    1. 50 mL cel kweekmedium voor te bereiden. Om dit te doen, voeg 500 µL van antibiotica (Amfotericine B = 0,25 µg/mL penicilline = 100 eenheid/mL streptomycine = 100 µg/mL) en 5 mL van de warmte-geïnactiveerd foetale runderserum in cel serumvrij cultuurmedium (zonder FBS of antibiotica).
      Opmerking: Verwarm de foetale runderserum bij 65 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad vóór gebruik.
    2. Spodoptera frugiperda handhaven (Lepidoptera: Noctuidae, de uilen), sf9 insect cellen. Ontkoppel ca. 80% van de cellen van de kolf van de cultuur van de cel van 25 cm2 door schudden de kolf en controleer onder de lichte microscopie. Vervolgens 50% van de celsuspensie overbrengen in een nieuwe cultuur maatkolf van 25 cm2 cel en de cellen te voegen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur toestaan. Het medium te vervangen door 5 mL verse cel kweekmedium en groeien in een incubator bij 28 ° C. Passage cellen elke 2 tot 3 dagen afhankelijk van de celgroei.
  2. Voorbereiding van plasmiden, cel transfectie
    1. Invoegen de target-DNA-fragmenten (bijvoorbeeld Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen en de constructies van de schrapping) pDHsp/V5-zijn door PCR-gebaseerde klonen methode11. Controleer de groei van getransformeerde kolonies door kolonie PCR met behulp van PCR Master Mix (2 X) en de pDhsp-F2/Op-IE2R primer instellen. Bevestig de plasmide sequenties door commerciële sequencing-service.
      Opmerking: Tabel 1 bevat de inleidingen voor PCR en de bijbehorende constructies gebruikt.
    2. Cultuur één gesequenceerd bacteriële kolonies, waarin de bovengenoemde plasmide constructies (stap 1.2) in 200 mL LB middellange bevattende geselecteerd antibiotica (50 µg/mL), respectievelijk.
    3. Pak de plasmiden uit de gekweekte E. coli met behulp van Midi plasmide Kit volgens fabrikant instructies12.
  3. Bereid plating medium door het mengen van 1,5 mL cel kweekmedium en 8,5 mL cel serumvrij cultuurmedium.
  4. Actinomycin D (ActD) cel kweekmedium bereiden door 1,5 µL van ActD voorraad (1 mg/mL) toe te voegen in 10 mL cel kweekmedium (eindconcentratie = 150 ng/mL). Bewaren bij 4 ° C.

2. eiwituitdrukking voorbijgaande

  1. Cel zaaien
    1. Oogst van de sf9 cellen door schudden de kolf van de cultuur, omver vallen de celsuspensie aan tube 50 mL en hemocytometer 10 µL overbrengen door een pipet P10. Het nummer van de cel onder een lichte Microscoop te tellen.
    2. Plaat 3 × 105 sf9 cellen in elk putje in een 24-well plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Vervang het medium met 0,5 mL medium plating.
  2. De transfectie van plasmiden
    1. Verdunde cel transfectiereagens: Verdun 8 µL van cel transfectiereagens in 100 µL cel serumvrij cultuurmedium en meng door de vortexing voor 1 s.
    2. 2 µg plasmide DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-Hsi) in 100 µL van cel serumvrij cultuurmedium en mix toevoegen door de vortexing voor 1 s (Figuur 2).
    3. Combineer de verdunde plasmide DNA en verdunde cel transfectiereagens (210 µL), en meng door de vortexing voor 1 s. Incubate gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Voeg 210 µL van DNA transfectie reagens mengsel ontkleuring op de cellen door een pipet P1000. Incubeer bij 28 ° C gedurende 5 uur.
    5. Vervang het medium beplating met 0,5 mL van cel kweekmedium met behulp van een precisiepipet P1000. Zegel van de 24-well plaat met tape en Incubeer de cellen bij 28 ° C gedurende 16 h.
  3. Warmte schok transfected cellen: zet de plaat in een waterbad van 42 ° C (drijvend op het watervlak). Verwarm gedurende 30 minuten en de 24-well plaat terug te keren naar de 28 ° C incubator.
  4. Detectie van eiwit expressie
    1. Spoel de cellen met 0,5 mL 1 x PBS buffer kort driemaal na 1 h of 5 h warmte schok.
      Opmerking: Verdun 10 x PBS buffer op 1 x PBS buffer door toevoeging van 1 mL 10 x PBS buffer 9 mL gesteriliseerd ddH2O
    2. Lyse de cellen met 40 µL 1 x SDS laden kleurstof door pipetteren omhoog en omlaag.
      Opmerking: Verdun 4 x SDS laden kleurstof door het mengen van 30 µL 1 x PBS buffer en 10 µL van 4 x SDS monster Buffer.
    3. Verwarm de eiwitsteekproeven bij 98 ° C gedurende 10 minuten in een warmte blok spin down voor 1 min en ijs voor westelijke vlek assay zetten.
    4. Western blot test
      Volg de procedure voor westelijke vlek assay van Eslami en Lujan13. SDS-pagina14gels worden uitgevoerd: één gel onderworpen aan Coomassie blue kleuring (controle op laden om te controleren dat de hoeveelheid EiwitSteekproeven geladen in elk goed gelijke bedragen is) en de andere onderworpen aan de Western blot assay, volgens Eslami en Lujan13 .
    5. Detecteren van fusion V5-gelabelde proteïnen met konijn anti-V5 antilichaam (5 mg/mL) (1:5000 verdunning in de buffer TBST te werken concentratie 1 µg/mL) en geit anti-konijn IgG-horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerde (0,8 mg/mL) (1:10000 verdunning in de buffer TBST te werken concentratie 0.08 µg/mL).
      Opmerking: Aanpassen van het percentage van polyacrylamide tot 17,5% wanneer het molecuulgewicht van de eiwitten als < 17 kDa.

3. anti-apoptotic activiteit assay

  1. Cel gen-veroorzaakte apoptosis: Herhaal de bovengenoemde procedure van 2.1 tot 2.3. Co transfect 1 microgram van pDHsp/D-rpr/vlag-Hsi plasmide DNA (met apoptosis inductor gene) met 1 µg plasmide DNA [pDHsp70/V5-Hsi vector (negatieve controle), pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn (positieve controle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-Hsi of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-zijn, respectievelijk.]. Voeren op 5 h post-warmtebehandeling schok, de cel levensvatbaarheid assay (Figuur 2).
  2. Chemische-geïnduceerde cel apoptosis: Herhaal de bovengenoemde procedure van 2.1 tot 2.3. Plaat in stap 2.1.2, 1 x 106 sf9 cellen in elk putje in een 6-well-plate. Transfect 4 µg plasmide DNA [pDHsp70/V5-Hsi vector (negatieve controle), pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn (positieve controle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-zijn, respectievelijk.]. 5 h na warmte schok, sf9 cellen met 2 mL gestolde voedingsbodem van de cel van de ActD voor 16 h behandelen en uitvoeren van de cel levensvatbaarheid assay (Figuur 2).
    Opmerking: Minimumhoeveelheid ter dekking van een put van 6-well plaat is 1 mL.
  3. Het uitvoeren van de bovenstaande anti-apoptotic activiteit assay experimenten, met inbegrip van 3.1 en 3.2 in triplicates.

4. cel levensvatbaarheid assay

  1. Het wassen van de behandelde cellen door toevoeging van 1 mL 1 x PBS buffer voor 1 min 3 keer. Resuspendeer de cellen door 1 mL 1 x PBS buffer met 0,04% trypan blauwe pipetteren en vlek gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Breng de celsuspensie in een 1,5 mL microtube.
    Opmerking: Verdun 0,4% trypan blauwe oplossing door het mengen van 9 mL 1 x PBS buffer en 1 mL 0,4% trypan blauwe oplossing.
  2. 10 µL trypan blauw gebeitste celsuspensie overbrengen in de hemocytometer met een pipet P10 en levensvatbare intact cellen onder een lichte Microscoop tellen.
  3. Statistische analyse
    1. De opgenomen gegevens berekenen en presenteren als de middelen ± S.D. voor alle tellingen.
    2. Het analyseren van de gegevens van de Student tweezijdige t-test door met Microsoft Excel. Statistisch significante gegevens definiëren als P-waarde < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De volledige lengte en andere twee opschoningen (BIR en RING domeinen) van Ly-IAP3 van LyxyMNPV werden overexpressie in sf9 cellen, op basis van de warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-Hsi /Spodoptera frugiperda cel (sf9 cel) systeem. De pDHsp/V5-Hsi bevatte een Drosophila warmte schok eiwit promotor, die downstream genexpressie bij een temperatuur van 42 ° C aandoening rijdt met behulp van cellulaire transcriptionele factoren en de vertaling systeem (Figuur 1)8 ,9,11. De hele technologische stroomdiagram is afgebeeld in Figuur 2. Na 1 uur of 5 h warmte schok, waren de cellen lysed met eiwit monster buffer en onderworpen aan westelijke vlek assay te bevestigen de eiwit expressie. De resultaten aangegeven dat de full-length eiwitten, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR en Ly-IAP3-RING, kon worden opgespoord in transfected cellen op 1 h of 5 h na warmte schok. Bovendien bleken de eiwit-ophopingen in 5 h na warmte schok (Figuur 3). Dus, volgens de gegevens, de eiwit functionele test werd uitgevoerd op het tijdstip van de maximale eiwit expressie (5 h na heat shock).

Zowel cel gen-veroorzaakte apoptosis en chemische-geïnduceerde cel apoptosis kan worden aangepast aan dit systeem voor de evaluatie van de anti-apoptotic activiteit (Figuur 2). Voor cel gen-veroorzaakte apoptosis waren twee constructies (apoptosis inductor en doel gene plasmide constructies) mede transfected in sf9 cellen en vervolgens hitte geschokt activite genexpressie. Bovendien, het anti-apoptotic eiwit Ac-P35 (positieve controle) en een apoptosis-inductor eiwit (D-RPR) werden eveneens uitgedrukt met behulp van deze warmte schok voorbijgaande expressie systeem.

Na de schok van de warmte begon beide genen te worden uitgedrukt en vertaald in eiwitten. Vergeleken met de vector/D-RPR, de positieve controle (Ac-P35/D-RPR) toonden een hoog anti-apoptotic activiteit, die maximaal 80% van de levensvatbaarheid bereikt. Uit de resultaten van de levensvatbaarheid cel van de andere constructies, kunnen de onderzoekers vergelijken de anti-apoptotic activiteit aan elkaar of de positieve controle (figuur 4A). Voor chemische-geïnduceerde cel apoptosis, was slechts één constructie in sf9 cellen transfected. Na 5 h na warmte schok, de chemische stoffen (ActD) werden toegevoegd en levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten na 16u (Figuur 2). Vergeleken met die van de positieve controle (AC-P35) of de negatieve controle (vector), elke constructie bleek de verschillende effecten op anti-apoptotic activiteit (figuur 4B).

Figure 1
Figuur 1: Diagram en nucleotide sequenties van ly-iap3 relatieve plasmide constructies op basis van pDHsp/V5-Hsi vector. De start codon (ATG) is vetgedrukt. Onderstreping geeft aan de restrictie-enzym snijden sites (HindIII in rode kleur; BamHI in blauwe kleur); de volgorde in de groene kleur geeft aan de Dhsp70 promotor regio. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: het stroomschema van warmte schok geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel). Cel gen-veroorzaakte apoptosis en chemische-geïnduceerde cel apoptosis behandelingen werden aangeduid met de eerste stap (co transfectie met apoptosis inductor gene plasmide) of met de latere stap na warmte schok (chemische-veroorzaakte apoptosis), respectievelijk, voor anti-apoptosis assay. Gewijzigde figuur en legende gereproduceerd met toestemming van Springer11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: overexpressie van AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR en Ly-IAP3-RING met behulp van warmte schok geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel). Op 1 uur of 5 h post warmte schok, werden de cel lysates geoogst en onderworpen aan westelijke vlek assay en SDS/pagina. (A) westelijke vlek assay met α-V5 antilichaam en (B) SDS/pagina gekleurd met Coomassie blue als het besturingselement laden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Levensvatbaarheid testen voor D-rpr of Actinomycin D-veroorzaakte apoptosis. (A) sf9 cellen werden transfected met pDHsp70/V5-Hsi vector (alleen Vector) en mede transfected pDHsp70/drpr/vlag-zijn met pDHsp70/V5-zijn vector, pDHsp70/Ac-P35/V5-Hsi pDHsp70/Ly-IAP3/V5-Hsi, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-Hsi, pDHsp70 / Ly-IAP3-RING/V5-zijn, respectievelijk. De verschillen tussen de vector en P35 en vector- en Ly-IAP3 zijn statistisch significant (t-test; P < 0,05). (B) sf9 cellen werden transfected met ofwel pDHsp70/V5-Hsi vector of pDHsp70/Ac-P35/V5-Hsi, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-Hsi, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-Hsi, pDHsp70/Ly-IAP3-RING/V5-zijn, respectievelijk, 5 uur na de schok van de warmte, ActD werd toegevoegd en later 16 h de levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten. Het verschil tussen vectoren en P35 is statistisch significant (t-test; P < 0,05). Gewijzigde figuur en legende gereproduceerd met toestemming van Springer11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Naam Sequenties
pDHsp-IAP3-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´
pDHsp-IAP3-BamHI-R 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´
iap3-BIR-BamHI-r 5´-CGGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´
iap3-RING-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´
pDhsp70-F2 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´
Op-IE2R 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´

Tabel 1: de primer ingesteld dat wordt gebruikt voor PCR-gebaseerde klonen methode. * De onderstreepte DNA-basenparen aangegeven de restrictie-enzym-sites. De lijst van gemodificeerde primer gereproduceerd met toestemming van Springer11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het concept van warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-zijne/sf9 cel systeem werd voor het eerst beschreven door Clem et al. in 19948. Vergelijking van de baculoviral gen promotor (IE1) en Drosophila hsp70 toonde aan dat hsp70 had een hogere efficiëntie in mug cellen10. Bovendien, als gevolg van de hitte schok inductie, de timing van eiwit expressie kan worden gecontroleerd juist na de schok van de warmtebehandeling. Dit systeem werd vervolgens toegepast voor eiwit functionele testen van garnalen en nucleopolyhedrovirus (NHW) IAP eiwitten9,11. In dit protocol, een totaal van 6 plasmide constructies werden gebruikt: drie (pDHsp/V5-Hsi pDHsp/Ac-p35/V5-zijn en pDHsp/D-rpr/vlag-Hsi) werden verstrekt door Jian-Horng Leu9, en de andere drie constructies (pDHsp-iap3/V5-zijn, pDHsp-iap3-BIR/V5-zijn, en pDHsp-iap3-RING/V5-Hsi) aangelegd door Nai et al.., 201611. Het lijkt erop dat deze promotor in insect werken efficiënter dan baculoviral gene initiatiefnemers cellen. Tijdens de manipulatie van dit protocol zijn er echter verschillende punten die moeten worden overwogen. Voordat de plasmide transfectie, het inbrengen van de opeenvolging van DNA controle is het belangrijk voor genexpressie; het moet dus worden gefuseerd met de V5 epitoop vormen een V5-gelabeld fusieproteïne aan het einde van de reeks van de doelgroep. Bovendien zou de verschillende fusion tags (d.w.z., vlag epitoop) ook in de pDHsp gebaseerde vector voor een in vitro -assay van het eiwit-bindend worden ontworpen. Deze extensie procedure zou helpen eiwit-eiwit interacties9verder te onderzoeken. Daarom kon de commerciële V5 polyclonal antilichaam worden gebruikt voor de detectie van eiwitten. De verhouding van de transfectie in verschillende insect cellen moet worden getest voordat het experiment. Lagere tarieven van de transfectie kunnen resulteren in niet-detecteerbare van eiwit expressie; dus een pDHsp vector met een geschikt verslag-gen (dat wil zeggen, groene lichten gen) kunnen zijn transfected in insect cellen om transfectie doeltreffendheid te beoordelen.

De belangrijkste beperking van deze warmte platform voor de expressie van de schok is het eiwit expressie niveau. In sommige gevallen, werd een laag eiwit expressie niveau gevonden. Volgens een pilot-studie was er geen significant effect van de dosis-afhankelijke dat is opgetreden toen meer plasmide-DNA werd transfected in sf9 cellen (gegevens niet worden weergegeven). Dit effect kan dus worden veroorzaakt door het ubiquitin proteasoom traject (UPP) of andere onbekende mechanismen11. Onderzoekers moeten de eiwituitdrukking in aanwezigheid van het proteasoom-remmer (d.w.z., MG-132) te verduidelijken en de recolve deze kwestie11onderzoeken. De andere beperking is dat duurzame productie van eiwitten die zijn gekoppeld aan de recombinante virussen niet kon worden bereikt. Dus, de stabilisatie en de hoeveelheid eiwit expressie is ook bezorgdheid met betrekking tot dit systeem. Een tijdsverloop van eiwitproductie moet daarom ook worden getest door westelijke vlek assay voordat de functionele test. In dit protocol, we vergeleken twee tijdstippen (1 en 5 h na de schok van de warmte) en waargenomen van de accumulatie van doel de productie van eiwitten van 1 h tot en met 5 h. Een toename van de tijdstippen wordt voorgesteld om te bepalen van de beste timingvoorwaarden voor de eiwit functionele assay.

Voor het eiwit functionele assay, de anti-apoptotic proteïne Ac-P35 (positieve controle) en een apoptosis-inductor proteïne (D-RPR) waren ook uitgedrukt met behulp van deze warmte schok voorbijgaande expressie systeem. Deze twee eiwitten worden beschreven als functioneel antagonisten9,11,15. Dus kon de vector/D-RPR en Ac-P35/D-RPR dienen als een negatieve controle en positieve controle, respectievelijk. Met behulp van deze vergelijking, kon de anti-apoptotic activiteit van doel eiwitten worden vastgesteld.

Het voorgestelde protocol zou kunnen bieden een platform om uit te drukken van vreemde proteïnen sneller of verder kon worden toegepast om te evalueren van eiwit anti-apoptotic activity in insect cellen. Zodra de onderzoekers krijgen de voorlopige resultaten van eiwitfunctie, kan dit systeem worden gebruikt voor verdere studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Jian-Horng Leu van Instituut van mariene biologie, National Taiwan Oceaan University voor het verstrekken van 3 plasmide constructies. Dit onderzoek werd gesteund door Grant 106-2311-B-197-001 - van het ministerie van wetenschap en technologie (MOST).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

Tags

Genetica kwestie 132 voorbijgaande expressie eiwit functionele assay sf9 cel lijn Lymantria xylina meerdere nucleopolyhedrovirus Ly-inhinbitor van Apoptosis-3 Drosophila warmte schok 70 promotor pDHsp/V5-Hsi Drosophilia Reaper actinomycin-D
Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J.… More

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C. H., Nai, Y. S. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter