Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Hitze Schock-induzierte Protein Expressionssystems (pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem), die verwendet werden können, mit dem Ausdruck Fremdeiweiße oder Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität des potenziellen Fremdeiweiße und ihre abgeschnittenen amino Säuren in Insektenzellen.
Abstract
Das vorübergehende gen Ausdruck System ist eine der wichtigsten Technologien zur Ausführung von Protein Funktionsanalyse in Baculovirus in Vitro Zellkultursystem. Dieses System wurde entwickelt um ausdrückliche Fremdgene unter die Kontrolle des Baculoviral-Promotors in transiente Expression Plasmiden. Darüber hinaus kann dieses System auf eine funktionelle Assay des Baculovirus selbst oder Fremdeiweiße angewendet werden. Das am weitesten verbreitete und kommerziell verfügbar transiente gen Ausdruck System wird basierend auf der sofortigen-früh gen (IE) Veranstalter von Orgyia Pseudotsugata multicapsid Nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) entwickelt. Jedoch wurde eine Ebene geringe Expression von Fremdgenen in Insektenzellen beobachtet. Daher wurde eine transiente gen Expressionssystems gebaut, für die Verbesserung der Proteinexpression. In diesem System waren rekombinante Plasmide konstruiert, um die Zielsequenz unter der Kontrolle von Drosophila Hitze Schock 70 (Dhsp70) Promoter enthalten. Dieses Protokoll stellt die Anwendung von dieser Hitze Schock-basierte pDHsp/V5-HSI (V5 Epitop mit 6 Histidin) /Spodoptera Frugiperda Zelle (sf9 Zellen) System; Dieses System ist nicht nur für gen-Expression, sondern auch für die Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität der Kandidat Proteine in Insektenzellen. Darüber hinaus ist dieses System kann entweder mit einem rekombinante Plasmid transfiziert werden oder Co transfiziert zwei potenziell funktional antagonistischen rekombinante Plasmide in Insektenzellen. Das Protokoll zeigt die Leistungsfähigkeit dieses Systems und bietet einen praktischen Fall diese Technik.
Introduction
Zwei Eiweiß Expressionssysteme werden häufig für die Herstellung von Proteinen: intramolekulare Protein Expressionssysteme (Escherichia coli Gene Expressionssystem) und Eukaryote Expressionssysteme für Protein. Ein beliebtes Eukaryote Protein Ausdruck System ist das Baculovirus Ausdruck Vektor System (BEV)1. Baculoviren dienten zuerst als weltweite biologische Bekämpfungsmittel von Land- und forstwirtschaftliche Schädlinge. In den letzten Jahrzehnten wurden Baculoviren als biotechnologische Werkzeuge für Protein Expressionsvektoren sowie entwickelt. Die Genome von Baculoviren bestehen aus kreisförmigen doppelsträngige DNA und umhüllten Nucleocapsids2. Heute, mehr als 78 Baculovirus wurden Isolate sequenzierten3. Basierend auf den zeitlichen Kaskade von Baculoviral gen Ausdrücke in Wirtszellen Insekt, konnten die Gentranskription in vier zeitliche Kaskaden, einschließlich der sofortigen-früh, verzögert-frühe, späte und sehr späte Gene4eingestuft werden.
BEVSs wurden ausgewiesen, so dass die sehr späten gen Promotoren (d.h., Polyeder oder p10 Promotor) verwendet wurden, um die Zielgene fahren während der rekombinanten Baculovirus durch homologe Rekombination erzeugt wurde. Ausdruck von Fremdproteinen in Insektenzellen durch rekombinante Baculovirus ist ähnlich dem von Säugetieren Proteine in post-translationalen Modifikationen (geeignet für Glykoprotein Produktion). So wurde das Baculovirus verbreitete5,6,7. Eine Einschränkung ist jedoch das Vorhandensein von verschiedenen N-Glykosylierung Wege in Insektenzellen7.
Daher wurde eine neue Baculovirus Expressionssystems Expressionssystems transiente gen entwickelt. Dieses System drückt Fremdgene unter dem Laufwerk Baculoviral unmittelbaren frühen Förderer (dh-1 -Promotor) in Insektenzellen. Durch den Einsatz dieses Systems kann das Zielprotein sofort unter die Kontrolle des dh-1 Promotors ausgedrückt werden, während des Änderns des N-Glykosylierung Weges in Insektenzellen, wodurch bessere N-linked Oligosaccharide7. Darüber hinaus Baculoviral unmittelbaren frühen Gene sind von der Wirtszelle RNA-Polymerase II transkribiert und erfordern keine virale Faktoren für Aktivierung4. Daher können Fremdeiweiße in Insektenzellen innerhalb kurzer Zeit ausgedrückt werden. Bis heute ist die transiente ist gen Expressionssystems eine der wichtigsten Technologien zur Ausführung von Protein funktionelle Assays in Baculovirus in Vitro Zellkultursystem. Das System kann angewendet werden, um die Funktion des Baculovirus oder Fremdeiweiße zu analysieren. Eines der im Handel erhältlichen transiente gen Ausdruck Systeme basiert auf die unmittelbaren frühen gen (IE) Förderer von Orgyia Pseudotsugata multicapsid Nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 und OpIE1 Promotoren).
Im Untergeschoss der Expression von Fremdgenen in Insektenzellen war jedoch noch ein Problem, als Promotor-basierte transiente gen Expressionssystems OpIE verwendeten8,9,10war. So wurde ein anderes Transienten gen Ausdruck System basierend auf der Projektträger der Drosophila Hitze Shock Protein 70 (hsp70) gen8,9erstellt. Die Förderer der hsp70 arbeitet effizienter als Baculoviral IE Promotor, wenn durch einen Hitzeschock in Insektenzellen10. In diesem System wurden die Zielgene unter dem Laufwerk von Drosophila Hitze Schock 70 (Dhsp70) Promoter geäußert. Fremdgene können leicht in die transiente gen Ausdruck Plasmid von PCR-basierten Klonen Methoden geklont werden. Darüber hinaus kann die Kontrolle des Zeitpunkts für die Genexpression durch Hitze Schock Induktion durchgeführt werden.
In diesem Bericht, wir folgen dem Ansatz und drei verschiedenen Trunkierungen des Baculoviral-Gens (Inhibitor der Apoptose 3, iap3 von Lymantria Xylina MNPV) mittels Hitze Schock-basierte transiente Protein Expressionssystems und weiter gelten Sie diese exprimierten Proteine auf Anti-apoptotische Aktivitätsanalyse. Dieses System kann entweder schnell Fremdeiweiße ausdrücken oder zur Bewertung der Anti-apoptotische Proteinaktivität in sf9 Zellen, wobei er auch das Potenzial für andere Protein Aktivität Assays gelten weiter angewendet werden.
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Protocol
1. Vorbereitungen
- Insekt Zellkultur
- 50 mL Zellkulturmedium vorzubereiten. Hierzu hinzufügen 500 µL von Antibiotika (Amphotericin B = 0,25 µg/mL, Penicillin = 100 Einheit/mL Streptomycin = 100 µg/mL) und 5 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum in serumfreien Zellkulturmedium (ohne FBS oder Antibiotika).
Hinweis: Hitze der fötalen Rinderserum bei 65 ° C für 30 min in einem Wasserbad vor Gebrauch. - Pflegen von Spodoptera Frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), sf9 Insektenzellen. Ca. nehmen Sie 80 % der Zellen aus 25 cm2 Zelle Kultur Kolben durch Schütteln der Flasche ab und prüfen Sie unter Lichtmikroskopie. Dann übertragen Sie 50 % der Zellsuspension auf einem neuen 25 cm2 Zelle Kultur Kolben und lassen Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur zu befestigen. Ersetzen Sie das Medium mit 5 mL frischem Zellkulturmedium und wachsen in einem Inkubator bei 28 ° C. Durchgang Zellen alle 2 bis 3 Tage je nach das Zellwachstum.
- 50 mL Zellkulturmedium vorzubereiten. Hierzu hinzufügen 500 µL von Antibiotika (Amphotericin B = 0,25 µg/mL, Penicillin = 100 Einheit/mL Streptomycin = 100 µg/mL) und 5 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum in serumfreien Zellkulturmedium (ohne FBS oder Antibiotika).
- Vorbereitung der Plasmide zur Zelle Transfektion
- Legen Sie die Ziel-DNA-Fragmente (z. B. Lymantria Xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen und ihre Löschung Konstrukte) in pDHsp/V5-HSI von PCR-basierten Klonen Methode11. Überprüfen Sie das Wachstum der transformierten Kolonien durch Kolonie eingestellt PCR mittels PCR Master Mix (2 X) und die pDhsp-F2/Op-IE2R-Grundierung. Bestätigen Sie die Plasmid-Sequenzen durch kommerzielle Sequenzierservice.
Hinweis: Tabelle 1 zeigt die Primer für PCR und die entsprechenden Konstrukte verwendet. - Einzelne sequenzierte Bakterienkolonien Kultur, enthalten die genannten Plasmid-Konstruktionen (Schritt 1.2) in 200 mL LB mittlere mit ausgewählten Antibiotika (50 µg/mL).
- Entziehen Sie die kultivierten E. Coli mit MIDI-Plasmid-Kit nach Herstellerangaben Anweisungen12Plasmide.
- Legen Sie die Ziel-DNA-Fragmente (z. B. Lymantria Xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen und ihre Löschung Konstrukte) in pDHsp/V5-HSI von PCR-basierten Klonen Methode11. Überprüfen Sie das Wachstum der transformierten Kolonien durch Kolonie eingestellt PCR mittels PCR Master Mix (2 X) und die pDhsp-F2/Op-IE2R-Grundierung. Bestätigen Sie die Plasmid-Sequenzen durch kommerzielle Sequenzierservice.
- Bereiten Sie Beschichtung Medium durch das Mischen von 1,5 mL Zellkulturmedium und 8,5 mL serumfreien Zellkulturmedium vor.
- Bereiten Sie Zellkulturmedium Actinomycin D (ActD) durch Zugabe von 1,5 µL des ActD-Lager (1 mg/mL) in 10 mL Zellkulturmedium (Endkonzentration = 150 ng/mL). Shop bei 4 ° C.
(2) vorübergehende Proteinexpression
- Zelle, die Aussaat
- Ernten Sie sf9 Zellen durch Schütteln Kultur Kolben zu, zu stürzen Sie und fallen Sie die Zellsuspension auf 50 mL-Tube und übertragen Sie 10 µL einer P10-Pipette auf Hemocytometer. Zählen Sie die Anzahl von Zellen unter einem Lichtmikroskop.
- Platte 3 × 105 sf9 Zellen in jedem Bohrloch in einer 24-Well-Platte für 15 min bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie das Medium mit 0,5 mL Medium Plattieren.
- Transfektion von Plasmiden
- Verdünnte Zelle Transfection Reagens: verdünnen 8 µL Zelle Transfection Reagens in 100 µL serumfreien Zellkulturmedium und Mischen von vortexen für 1 s.
- Fügen Sie 2 µg Plasmid DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-HSI) in 100 µL serumfreien Zellkulturmedium und Mix durch Vortexen für 1 s (Abbildung 2).
- Kombinieren Sie die verdünnte Plasmid-DNA und verdünnte Zelle Transfection Reagens (210 µL), und 1 S. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur durch Vortexen mischen.
- 210 µL DNA Transfection Reagens Mischung tropfenweise auf die Zellen durch eine Pipette P1000 hinzufügen. Inkubation bei 28 ° C für 5 h.
- Ersetzen Sie die Beschichtung Medium mit 0,5 mL Zellkulturmedium mit einer Pipette P1000. Versiegeln Sie die 24-Well-Platte mit Klebeband und inkubieren Sie die Zellen bei 28 ° C 16 h.
- Heat shock transfizierten Zellen: Legen Sie die Platte in einem 42 ° C-Wasserbad (schwimmt auf der Wasseroberfläche). Für 30 min erhitzen und die 24-Well-Platte in den Inkubator 28 ° C zurück.
- Nachweis von Protein-expression
- Waschen Sie nach 1 h oder 5 h Hitzeschock die Zellen mit 0,5 mL 1 X PBS-Puffer kurz dreimal.
Hinweis: Verdünnen Sie 10 x PBS-Puffer auf 1 x PBS-Puffer durch Zugabe von 1 mL 10 X PBS-Puffer auf 9 mL sterilisiert DdH2O - Lösen Sie die Zellen mit 40 µL 1 x SDS laden Farbstoff durch Pipettieren rauf und runter.
Hinweis: Verdünnen Sie 4 x SDS laden Farbstoff durch Mischen von 30 µL 1 x PBS-Puffer und 10 µL 4 x SDS-Probenpuffer. - Erhitzen Sie die Proteinproben bei 98 ° C für 10 min in einem Heizblock, spin-down für 1 min und setzen auf Eis für Western-Blot-Test.
- Western-blot assay
Folgen Sie das Verfahren der Western-Blot-Test von Eslami und Lujan13. SDS-PAGE Gelen14ausgeführt: ein Gel, Coomassie blaue Färbung (Laden-Steuerung zu überprüfen, ob die Menge der Proteinproben geladen in jedem gut in Betrag entspricht) unterzogen und der anderen ausgesetzt, Western blot Assay nach Eslami und Lujan13 . - V5-Tags Fusionsproteine mit Kaninchen Anti-V5 Antikörper (5 mg/mL) (Verdünnung 1: 5000 in TBST Puffer arbeiten Konzentration 1 µg/mL) und Ziege Anti-Kaninchen IgG-Meerrettich Peroxidase (HRP) Konjugat (0,8 mg/mL) (1: 10000 Verdünnung in TBST Puffer arbeiten zu erkennen Konzentration 0,08 µg/mL).
Hinweis: Passen Sie den Prozentsatz der Polyacrylamid auf 17,5 % Wenn das Protein Molekulargewicht zu < 17 kDa.
- Waschen Sie nach 1 h oder 5 h Hitzeschock die Zellen mit 0,5 mL 1 X PBS-Puffer kurz dreimal.
3. Anti-apoptotische Aktivität assay
- Gen-induzierte Zellapoptose: wiederholen Sie die vorgenannten Ablauf von 2.1 bis 2.3. Co transfizieren 1 µg der pDHsp/D-Rpr/FLAG-HSI Plasmid DNA (mit Apoptose-Induktor gen) mit 1 µg Plasmid DNA [pDHsp70/V5-HSI Vektor (Negativkontrolle), pDHsp70-Ac-P35/V5-HSI (Positivkontrolle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-HSI, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-HSI, bzw..]. 5 h nach dem Hitze-Schock-Behandlung Verhalten der Zelle Lebensfähigkeit Assay (Abbildung 2).
- Chemisch induzierte Zellapoptose: wiederholen Sie die vorgenannten Ablauf von 2.1 bis 2.3. Im Schritt 2.1.2 Platte 1 x 106 sf9 Zellen in jedem Brunnen in einem 6-Well-Platte. Transfizieren 4 µg Plasmid DNA [pDHsp70/V5-HSI Vektor (Negativkontrolle), pDHsp70-Ac-P35/V5-HSI (Positivkontrolle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-HSI, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-HSI, bzw..]. 5 h nach dem Hitzeschock behandeln Sie sf9 Zellen mit 2 mL ActD Zellkulturmedium für 16 h zu und führen Sie die Zelle Lebensfähigkeit Assay (Abbildung 2).
Hinweis: Mindestvolumen Deckung ein Brunnen des 6-Well-Platte beträgt 1 mL. - Durchführen Sie die oben genannten Anti-apoptotische Aktivität Assay Experimente, einschließlich 3.1 und 3.2 in Triplicates.
(4) Zelle Lebensfähigkeit assay
- Waschen Sie die behandelten Zellen durch Zugabe von 1 mL 1 X PBS-Puffer für 1 min 3 Mal. Die Zellen durch Pipettieren 1 mL 1 X PBS-Puffer mit 0,04 % Trypan blau Aufschwemmen und Flecken für 3 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 1,5 mL Reaktionscup.
Hinweis: Verdünnen Sie 0,4 % Trypan blau Lösung durch Mischen von 9 mL 1 X PBS-Puffer und 1 mL 0,4 % Trypan blau Lösung. - Übertragen Sie 10 µL Trypan blau gefärbten Zellsuspension auf der Hemocytometer mit einer Pipette P10 und zählen Sie die tragfähigen intakten Zellen unter einem Lichtmikroskop.
- Statistische Analyse
- Berechnen Sie die aufgezeichneten Daten und präsentieren Sie als Mittel ± S.D. für alle zählt.
- Analysieren Sie die Daten mit Microsoft Excel die Studenten zwei-tailed t-Test durch. Definieren Sie statistisch signifikante Daten als P-Wert < 0,05.
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Representative Results
Die volle Länge und andere zwei Trunkierungen (BIR und RING-Domänen) von Ly-IAP3 von LyxyMNPV wurden in sf9 Zellen überexprimiert basierend auf der Hitze Schock-basierte pDHsp/V5-HSI /Spodoptera Frugiperda Zelle (sf9 Zellsystem). Die pDHsp/V5-HSI enthaltenen Drosophila Hitze Schock Protein Förderer, die nachgeschalteten Genexpression bei einer Temperatur von 42 ° C Zustand antreibt, mithilfe von zellulären transcriptional Faktoren und die Übersetzung System (Abbildung 1)8 ,9,11. Die ganze technologische Flussdiagramm ist in Abbildung 2dargestellt. Nach 1 h oder 5 h Hitzeschock wurden die Zellen lysiert mit Protein Probenpuffer und Western-Blot-Test, die Protein-Expression zu bestätigen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Full-length Proteine, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR und Ly-IAP3-RING, in transfizierten Zellen bei 1 h oder 5 h nach dem Hitzeschock nachgewiesen werden konnte. Darüber hinaus fanden sich die Protein-Ablagerungen bei 5 h nach dem Hitzeschock (Abbildung 3). Somit war nach Angaben der Protein funktionelle Assays zum Zeitpunkt maximaler Protein Ausdruck (5 h nach dem Hitzeschock) durchgeführt.
Gen-induzierte Zellapoptose und chemisch induzierte Zellapoptose könnte dieses System für die Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität (Abbildung 2) angepasst. Für gen-induzierte Zellapoptose waren zwei Konstrukte (Apoptose-Induktor und Ziel Plasmid Genkonstrukte) Co transfizierten in sf9 Zellen und dann Wärme schockiert, Activite Genexpression. Darüber hinaus wurden die Anti-apoptotische Ac-P35 (Positivkontrolle) und eine Apoptose-Induktor Protein (D-RPR) ausgedrückt mit dieser Hitze Schock transiente Expressionssystem.
Nach Hitzeschock begannen beide Gene ausgedrückt und in Proteine übersetzt werden. Im Vergleich zu den Vektor/D-RPR, zeigte die Positivkontrolle (Ac-P35/D-RPR) hohe Anti-apoptotische Aktivität, die bis zu 80 % der Tragfähigkeit Rate erreicht. Aus der Zelle Lebensfähigkeit Ergebnissen der anderen Konstrukte konnten die Forscher die Anti-apoptotische Aktivität miteinander oder mit der Positivkontrolle (Abb. 4A) vergleichen. Für chemisch induzierte Zellapoptose war nur ein Konstrukt in sf9 Zellen transfiziert. Nach 5 h nach dem Hitzeschock Chemikalien (ActD) wurden hinzugefügt, und Zellviabilität wurde nach 16 h (Abbildung 2) gemessen. Im Vergleich mit denen der Positivkontrolle (AC-P35) oder der negativen Kontrolle (Vektor), jedes Konstrukt zeigte die verschiedenen Auswirkungen auf Anti-apoptotische Aktivität (Abbildung 4 b).
Abbildung 1: Diagramm und Nukleotid-Sequenzen von Ly-iap3 relative Plasmid Konstrukte anhand pDHsp/V5-HSI Vektor. Das Start-Codon (ATG) ist fett dargestellt. Unterstreichung zeigt die schneiden Beschränkungsenzymsites (HindIII in roter Farbe; BamHI in blauer Farbe); die Sequenz in grüner Farbe zeigt die Dhsp70-Promotor-Region. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Flussdiagramm der Hitzeschock induzierte Protein Expressionssystems (pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem). Gen-induzierte Zellapoptose und Zelle chemisch induzierte Apoptose Behandlungen waren gekennzeichnet mit dem ersten Schritt (Co-Transfektion mit Apoptose-Induktor gen Plasmid) oder zum späteren Schritt nach Hitzeschock (chemisch induzierte Apoptose), bzw. für Anti-Apoptose-Assay. Geänderte Bild und Legende reproduziert mit freundlicher Genehmigung des Springer-11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Überexpression des AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR und Ly-IAP3-RING mit Hitzeschock induzierte Protein Expressionssystems (pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem). Mindestens 1 h und 5 h Post Hitzeschock wurden Zelle Lysates geerntet und Western-Blot-Test und SDS/PAGE. (A) Western-Blot-Test mit α-V5-Antikörper und (B) SDS/PAGE gebeizt mit Coomassie-Blau wie das Steuerelement laden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Lebensfähigkeit assays für D-Rpr oder Actinomycin D-induzierten Apoptose. (A) sf9 Zellen wurden mit pDHsp70/V5-HSI Vektor (nur Vektor) transfiziert und Co transfizierten pDHsp70/Drpr/FLAG-HSI mit pDHsp70/V5-HSI Vektor, pDHsp70/Ac-P35/V5-HSI, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-HSI, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-HSI, pDHsp70 / Ly-IAP3-RING/V5-HSI, beziehungsweise. Die Unterschiede zwischen Vektor- und P35 und zwischen Vektor- und Ly-IAP3 sind statistisch signifikant (t-test; P < 0,05). (B) sf9, die Zellen transfiziert wurden mit entweder pDHsp70/V5-HSI Vektor oder pDHsp70/Ac-P35/V5-HSI, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-HSI, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-HSI, pDHsp70/Ly-IAP3-RING/V5-HSI, jeweils um 5 Uhr nach Hitzeschock ActD hinzugefügt wurde und später 16 h, die Zellviabilität wurde gemessen. Der Unterschied zwischen Vektor- und P35 ist statistisch signifikant (t-test; P < 0,05). Geänderte Bild und Legende reproduziert mit freundlicher Genehmigung des Springer-11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name | Sequenzen |
| pDHsp-IAP3-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´ |
| pDHsp-IAP3-BamHI-R | 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´ |
| iap3-BIR-BamHI-r | 5´-CG-GGATCC-CGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´ |
| iap3-RING-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´ |
| pDhsp70-F2 | 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´ |
| OP-IE2R | 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´ |
Tabelle 1: die Grundierung-Sets für PCR-basierter Klonmethode verwendet. * Die unterstrichenen DNA-Basenpaare angegeben die Beschränkungsenzymsites. Die modifizierte Primer Liste wiedergegeben mit freundlicher Genehmigung des Springer-11.
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Discussion
Das Konzept der Hitze Schock-basierte pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem wurde erstmals von Clem Et Al. 19948beschrieben. Vergleich der Baculoviral gen Promotor (IE1) und Drosophila hsp70 zeigte, dass hsp70 hatte eine höhere Effizienz in Mücke Zellen10. Darüber hinaus konnte das Timing der Proteinexpression aufgrund der Hitze-Schock-Induktion, genau nach Hitze-Schock-Behandlung kontrolliert werden. Dieses System galt dann für Protein funktionelle Assays von Garnelen und Nucleopolyhedrovirus (NPV) IAP Proteine9,11. In diesem Protokoll wurden insgesamt 6 Plasmid-Konstruktionen verwendet: drei (pDHsp/V5-HSI, pDHsp/Ac-p35/V5-HSI und pDHsp/D-Rpr/FLAG-HSI) wurden zur Verfügung gestellt von Jian-Horng Leu9und die anderen drei Konstruktionen (pDHsp-iap3/V5-HSI, pDHsp-iap3-BIR/V5-HSI, und pDHsp-iap3-RING/V5-HSI) entstanden von Nai Et Al., 201611. Es scheint, dass dieser Promotor in Insekt arbeiten effizienter als Baculoviral gen Promotoren Zellen. Während der Bearbeitung dieses Protokolls sind jedoch einige Punkte, die berücksichtigt werden müssen. Bevor Plasmid Transfection ist die Überprüfung der Einfügung der DNA-Sequenz wichtig für Genexpression; Somit sollte es mit V5 Epitop bilden eine V5-Tags Fusionsproteins am Ende der Zielsequenz fusioniert werden. Darüber hinaus konnte verschiedene Fusion-Tags (d.h. Flagge Epitop) auch in der pDHsp-basierte Vektor für eine in-vitro- Protein Bindung Assay gestaltet werden. Diese Erstreckungsverfahren würde helfen Proteinprotein Interaktionen9weiter zu untersuchen. Daher könnte der kommerziellen V5 polyklonale Antikörper zur Detektion von Proteinen verwendet werden. Das Verhältnis der Transfektion in verschiedenen Insektenzellen sollte vor dem Experiment getestet werden. Niedrigere Transfektion können nicht detektierbare der Proteinexpression führen; so ein pDHsp-Vektor mit einem geeigneten Bericht-gen (d.h.grün fluoreszieren gen) konnte in Insektenzellen Transfektion Effizienz bewerten transfiziert.
Die größte Beschränkung dieser Hitze-Schock-Ausdruck-Plattform ist die Protein-Expression. In einigen Fällen wurde eine niedrige Proteinexpressionsgrad gefunden. Nach einer Pilotstudie gab es keinen signifikanten Effekt dosisabhängig, die auftrat, wenn mehr Plasmid-DNA wurde in sf9 Zellen (Daten nicht gezeigt) transfiziert. So kann dieser Effekt durch das Ubiquitin-Proteasom-Weg (UPP) oder andere unbekannte Mechanismen11verursacht werden. Forscher sollten der Proteinexpression in Anwesenheit des Proteasom-Inhibitor (d. h., MG-132) zu klären und Recolve dieser Ausgabe11untersuchen. Die andere Einschränkung ist, dass nachhaltige Produktion des Proteins zugeordnet die rekombinanten Viren nicht erreicht werden konnte. So sind die Stabilisierung und die Menge an Protein-Expression auch Bedenken in Bezug auf dieses System. Daher sollten ein zeitlichen Verlauf der Proteinproduktion auch durch Western-Blot-Test vor der funktionelle Assay getestet werden. In diesem Protokoll wir zwei Zeitpunkten (1 und 5 h nach Hitzeschock) verglichen und beobachtet die Anhäufung von Ziel-Protein-Produktion von 1 h bis 5 h. Zunahme von Zeitpunkten wird vorgeschlagen, um die besten Timing-Voraussetzungen für das Protein funktionelle Assay zu bestimmen.
Für das Protein funktionelle Assay, der Anti-apoptotische Ac-P35 (Positivkontrolle) und eine Apoptose-Induktor Protein (D-RPR) wurden auch zum Ausdruck mit dieser Hitze Schock transiente Expressionssystem. Diese beiden Proteine werden als funktionelle Antagonisten9,11,15beschrieben. Daher könnte der Vektor/D-RPR und Ac-P35/D-RPR als Negativkontrolle und positive Kontrolle bzw. dienen. Verwenden diesen Vergleich, konnte die Anti-apoptotische Aktivität der Zielproteine ermittelt werden.
Die vorgestellte Protokoll könnte bieten eine Plattform für Fremdeiweiße schneller zum Ausdruck bringen oder weiter angewandt werden, um Anti-apoptotische Proteinaktivität in Insektenzellen zu bewerten. Sobald die vorläufigen Ergebnisse der Proteinfunktion Forscher erhalten haben, könnte dieses System für ein weiterführendes Studium verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Jian-Horng Leu des Institute of Marine Biology, National Taiwan Ocean University für die Bereitstellung von 3 Plasmid-Konstruktionen. Diese Forschung wurde von Grant 106-2311-B-197-001 - aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
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