Summary
פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.
Abstract
אחת הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע אנליזה פונקציונלית חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות מערכת ביטוי גנים ארעית. מערכת זו פותחה כדי גנים זרים אקספרס תחת השליטה של האמרגן baculoviral ב ביטוי ארעי פלסמידים. יתר על כן, מערכת זו ניתן להחיל על assay פונקציונלי של baculovirus עצמו או חלבונים זרים. מערכת ביטוי נרחב ביותר מבחינה מסחרית זמינים ג'ין ארעי מפותח בהתבסס על האמרגן מוקדם-מיידי ג'ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). עם זאת, נצפתה רמה נמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים. לכן, מערכת ביטוי גנים ארעי נבנה לשיפור ביטוי חלבון. במערכת זו, פלסמידים רקומביננטי נבנו כדי להכיל את רצף המטרה תחת השליטה של דרוזופילה חום הלם 70 (Dhsp70) האמרגן. פרוטוקול זה מציג את היישום של זה חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו (V5 epitope עם היסטידין 6) /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9); מערכת זו זמינה רק עבור ביטוי גנים אלא גם להערכת פעילות אנטי-מוות של המועמד חלבונים בתאי חרקים. יתר על כן, מערכת זו יכולים להיות transfected שגם עם פלסמיד רקומביננטי אחד או transfected משותפת לשני פלסמידים רקומביננטי אויבת פוטנציאלית פונקציונלית בתאי חרקים. הפרוטוקול מדגים את היעילות של מערכת זו ומספק במקרה המעשי של טכניקה זו.
Introduction
שתי מערכות ביטוי חלבון נפוץ השתמשו לייצור חלבונים: פרוקריוטים חלבון ביטוי (Escherichia coli ג'ין ביטוי מערכת) ומערכות איקריוטים חלבון הביטוי. מערכת אחת של ביטוי חלבון איקריוטים הפופולרי הוא מערכת (BEVS)1וקטור ביטוי baculovirus. Baculoviruses שימשו כסוכנים הדברה ביולוגית ברחבי העולם החקלאיים ואת יער מזיקים. בעשורים האחרונים, baculoviruses פותחו ככלים ביוטכנולוגי וקטורים ביטוי חלבון גם כן. הגנום של baculoviruses מורכב כפול גדילי DNA מעגלי ומעטפת nucleocapsids2. עד היום, יותר מאשר seventy-eight baculovirus היה מבודד ברצף3. בהתבסס על המפל הטמפורלי של ביטויים ג'ין baculoviral בתאי חרקים המארח, שעתוק הגן ניתן לסווג ארבעה מפלי הזמנית, כולל מיידית מוקדם, מוקדם-נדחתה, מאוחר, מאוחר מאוד גנים4.
BEVSs נקבעו כך היזמים הגן באיחור (כלומר, פאון או p10 יזם) שימשו כדי להסיע את הגנים היעד, בזמן baculovirus רקומביננטי נוצר על ידי רקומבינציה הומולוגית. ביטוי של חלבונים זרים בתאי חרקים על-ידי baculovirus רקומביננטי דומה לזה של חלבונים בתרבית של שינויים post-translational (מתאים לייצור גליקופרוטאין). לפיכך, baculovirus כבר בשימוש נרחב5,6,7. עם זאת, מגבלה אחת היא הנוכחות של מסלולים שונים N-גליקוזילציה ב תאים חרקים7.
לכן, baculovirus ביטוי מערכת חדשה, מערכת ביטוי גנים ארעי, פותחה. מערכת זו מבטא גנים זרים תחת הכונן של היזמים מוקדם-מיידי baculoviral (כלומר-1 יזם) בתאי חרקים. באמצעות מערכת זו, חלבון המטרה ניתן מיד לבטא תחת השליטה של ie-1 יזם תוך שינוי מסלול N-גליקוזילציה בתאי חרקים, וכתוצאה מכך oligosaccharides N-מקושרים יותר7. יתר על כן, הגנים מוקדם-מיידי baculoviral משוקלטים על-ידי התא המארח RNA פולימראז II, אינם דורשים כל גורם ויראלי עבור הפעלה4. לכן, חלבונים זרים יכולים להתבטא בתאי חרקים תוך זמן קצר. עד כה, והחולף מערכת ביטוי גנים הוא אחד הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע מבחני פונקציונלי חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות. ניתן להחיל את המערכת כדי לנתח את הפונקציה של baculovirus או חלבונים זרים. אחת ממערכות ביטוי גנים ארעי זמינים מסחרית מבוסס על היזמים מוקדם-מיידי ג'ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2, OpIE1 היזמים).
עם זאת, הרמה הנמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים היה עדיין בעיה כאשר המערכת הביטוי מבוסס-יזם ג'ין ארעי אופי הייתה בשימוש8,9,10. לפיכך, מערכת נוספת של ביטוי גנים ארעי נבנה בהתבסס על האמרגן של דרוזופילה חום הלם חלבון 70 (hsp70) ג'ין8,9. האמרגן של hsp70 עובד ביעילות רבה יותר מאשר יזם baculoviral IE כאשר המושרה על ידי הלם חום בתאי חרקים10. במערכת זו, הגנים היעד שבאו לידי ביטוי תחת הכונן של דרוזופילה הלם חום (Dhsp70) 70 יזם. גנים זרים יכולים להיות בקלות משובטים לתוך פלסמיד ביטוי גנים ארעי על ידי שיטות שיבוט מבוסס ה-PCR. יתר על כן, השליטה של התזמון של ביטוי גנים יכול להתבצע על ידי אינדוקציה הלם חום.
בדו ח זה, אנו בצע את הגישה ולבטא את שלוש truncations שונים של הגן baculoviral (מעכב של אפופטוזיס 3, iap3 מן Lymantria xylina MNPV) באמצעות מערכת ביטוי חלבון ארעי מבוסס-הלם חום, ביטוי חלבונים אלה יחולו על ניתוח פעילות אנטי-מוות. מערכת זו יכול לבטא גם חלבונים זרים במהירות או יותר להחיל על הערכת פעילות אנטי-מוות החלבון בתאים sf9, בעודכם נהנים גם את הפוטנציאל שיוחל מבחני פעילות חלבונים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תכשירים
- תרבית תאים חרקים
- להכין 50 מ של התא תרבות בינוני. כדי לבצע זאת, הוסף µL 500 של אנטיביוטיקה (המפוטריצין = 0.25 µg/mL, פניצילין = 100 יחידות/mL, סטרפטומיצין = 100 µg/mL) ו 5 מ של חום-לא פעיל העובר שור סרום ללא סרום תא בינוני תרבות (ללא FBS או אנטיביוטיקה).
הערה: מחממים את הנסיוב שור עוברית-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים לפני השימוש. - לשמור על זחל כנימה frugiperda (פרפראים: תנשמיתיים), תאים חרקים sf9. ניתוק ca. 80% של תאים מן 25 ס מ2 תא תרבות הבקבוק ע י ניעור את הבקבוק, לבדוק תחת מיקרוסקופ אור. לאחר מכן, להעביר 50% של התליה תא חדש 25 ס מ2 תא תרבות בקבוקון ולאפשר את התאים לצרף למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להחליף את המדיום מ ל תא טריים תרבות בינונית ולצמוח בתוך אינקובטור ב 28 º C. מעבר תאים כל 2-3 ימים בהתאם גדילת התאים.
- להכין 50 מ של התא תרבות בינוני. כדי לבצע זאת, הוסף µL 500 של אנטיביוטיקה (המפוטריצין = 0.25 µg/mL, פניצילין = 100 יחידות/mL, סטרפטומיצין = 100 µg/mL) ו 5 מ של חום-לא פעיל העובר שור סרום ללא סרום תא בינוני תרבות (ללא FBS או אנטיביוטיקה).
- הכנה של פלסמידים תא תרביות תאים
- להוסיף שברי DNA המטרה (למשל, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 ג'ין וקבועים שלה מחיקה) לתוך pDHsp/V5-שלו על ידי מבוססי ה-PCR שיבוט שיטה11. בדוק הצמיחה של טרנספורמציה המושבות על-ידי המושבה PCR באמצעות PCR מאסטר מיקס (2 X) ופריימר pDhsp-F2/אופ-IE2R את הגדר. לאשר את רצפי פלסמיד באמצעות שירות מסחרי רצף.
הערה: טבלה 1 מציגה את צבעי בסיס המשמש PCR של המבנה המתאים. - תרבות בודדת ברצף חיידקי מושבות, אשר מכילים מבנים פלסמיד הנ ל (שלב 1.2) ב 200 מ ל LB בינוני המכיל נבחרת אנטיביוטיקה (50 µg/mL), בהתאמה.
- לחלץ את פלסמידים בתרבית e. coli באמצעות Midi פלסמיד ערכת לפי הוראות היצרן12.
- להוסיף שברי DNA המטרה (למשל, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 ג'ין וקבועים שלה מחיקה) לתוך pDHsp/V5-שלו על ידי מבוססי ה-PCR שיבוט שיטה11. בדוק הצמיחה של טרנספורמציה המושבות על-ידי המושבה PCR באמצעות PCR מאסטר מיקס (2 X) ופריימר pDhsp-F2/אופ-IE2R את הגדר. לאשר את רצפי פלסמיד באמצעות שירות מסחרי רצף.
- מכינים ציפוי בינוני על ידי ערבוב 1.5 mL תא תרבות בינוני ו- 8.5 מ של התא ללא סרום תרבות בינוני.
- להכין ואקטינומיצין D (ActD) תא תרבות בינוני על-ידי הוספת µL 1.5 ActD מניות (1 מ"ג/מ"ל) לתוך 10 מ"ל של התא תרבות בינוני (ריכוז סופי = 150 ng/mL). חנות ב 4 º C.
2. חלבון ביטוי ארעית
- תא זריעה
- לקצור את התאים sf9 ע י ניעור תרבות את הבקבוק, להפלת ליפול התליה תא שפופרת 50 מ ל ו להעביר 10 µL hemocytometer על ידי פיפטה P10. לספור את מספר התאים במיקרוסקופ אור.
- צלחת 3 × 105 תאים sf9 לתוך מכל קידוח לתוך צלחת 24-ובכן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. החלף את המדיום 0.5 מ של ציפוי בינוני.
- תרביות תאים של פלסמידים
- תא שתדללו תרביות תאים ריאגנט: 8 לדלל µL של התא מגיב תקנים 100 µL תא ללא סרום תרבות בינוני, מיקס על ידי vortexing 1 s.
- להוסיף 2 µg של פלסמיד דנ א (pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו) לתוך µL 100 של התא ללא סרום תרבות בינונית, מערבבים על-ידי vortexing עבור 1 s (איור 2).
- לשלב ה-DNA פלסמיד מדולל ו ריאגנט תרביות תאים תאים מדולל (210 µL), ומערבבים על ידי vortexing עבור Incubate ס' 1 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להוסיף µL 210 של ה-DNA תרביות תאים ריאגנט התערובת dropwise על התאים באמצעות פיפטה P1000. דגירה-28 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.
- החלף את המדיום ציפוי 0.5 מיליליטר תא תרבות בינונית בעזרת פיפטה של P1000. לאטום את הצלחת 24-ובכן עם קלטת, דגירה התאים ב 28 ° C עבור 16 h.
- חום לזעזע את התאים transfected: לשים את הצלחת בתוך אמבט מים 42 ° C (צף על פני המים). חום במשך 30 דקות ולחזור את הצלחת 24-ובכן החממה 28 ° C.
- זיהוי של ביטוי חלבון
- לאחר 1 h או 5 שעות הלם חום, לשטוף את התאים 0.5 מ ל 1 x PBS מאגר בקצרה שלוש פעמים.
הערה: לדלל 10 x PBS מאגר 1 x PBS מאגר על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר PBS 10 x 9 מ ל עיקור ddH2O - Lyse התאים עם µL 40 1 x מרחביות בטעינת צבע על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
הערה: לדלל 4 x מרחביות הטעינה לצבוע על ידי ערבוב µL 30 1 x מאגר PBS ו 10 µL של 4 x מרחביות דוגמת המאגר. - מחממים את דגימות חלבון ב 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בתוך גוש חום, ספין למטה עבור 1 דקות, לשים קרח תספיג וזמינותו.
- המערבי כתם assay
בצע את ההליך של שיטת תספיג אסלאמי, Lujan13. לפעול למען חברה דמוקרטית-דף ג ' לים-14: ג'ל אחד נתון כחול Coomassie מכתים (טעינת פקד לבדיקת כי כמות חלבון דגימות טעון בכל טוב שווה סכום) והשני שעבר Western כתם assay, על פי אסלאמי Lujan13 . - לזהות חלבונים מתויג V5 פיוז'ן עם נוגדן anti-V5 הארנב (5 מ"ג/מ"ל) (דילול 1:5000 במאגר TBST לעבוד ריכוז 1 µg/mL), עז ארנב אנטי איג-חזרת peroxidase (HRP) המספר המשלים (0.8 מ"ג/מ"ל) (דילול 1:10000 במאגר TBST לעבודה ריכוז 0.08-µg/mL).
הערה: התאם את אחוז לזיהוי ל- 17.5% כאשר המשקל המולקולרי של חלבון להיות < 17 kDa.
- לאחר 1 h או 5 שעות הלם חום, לשטוף את התאים 0.5 מ ל 1 x PBS מאגר בקצרה שלוש פעמים.
3. אנטי-אפופטוטיים להיפגע פעילות assay
- ג'ין-induced תא אפופטוזיס: חזור על ההליך הנ ל מ 2.1 2.3. שיתוף transfect µg 1 של pDHsp/D-rpr/דגל-שלו פלסמיד DNA (גן המכיל משרן אפופטוזיס) עם µg 1 של פלסמיד ה-DNA [וקטור pDHsp70/V5-שלו (בקרה שלילית), pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו (בקרה חיובית), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו, pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו, בהתאמה.]. ב 5 שעות החום שלאחר טיפול בהלם, לנהל את הבדיקה הכדאיות של התא (איור 2).
- תא כימית-induced אפופטוזיס: חזור על ההליך הנ ל מ 2.1 2.3. בשלב 2.1.2, צלחת עונה 1 פרק 106 sf9 תאים לתוך מכל קידוח לתוך צלחת 6-. טוב. Transfect µg 4 של פלסמיד ה-DNA [וקטור pDHsp70/V5-שלו (בקרה שלילית), pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו (בקרה חיובית), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו, pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו, בהתאמה.]. 5 שעות החום שלאחר הלם, יטפל בתאים sf9 עם 2 מ של ActD תא תרבות בינונית עבור 16 h, לערוך את הבדיקה הכדאיות של התא (איור 2).
הערה: אחסון מינימלי כדי לכסות באר אחת צלחת 6-ובכן הוא 1 מ"ל. - לבצע לעיל אנטי-אפופטוטיים להיפגע פעילות assay הניסויים, כולל 3.1 ו- 3.2 triplicates.
4. תא הכדאיות assay
- לשטוף את התאים שטופלו על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר PBS x 1 על 1 דקות 3 פעמים. Resuspend התאים על ידי pipetting 1 מ"ל-1 x-PBS-מאגר המכיל 0.04% trypan blue, כתם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. העברת התליה תא לתוך microtube 1.5 מ.
הערה: 0.4% trypan blue הפתרון מדולל על ידי ערבוב 9 מ ל 1 x PBS מאגר 1 מ"ל 0.4% trypan blue פתרון. - להעביר hemocytometer עם פיפטה P10 10 µL trypan blue מוכתמת תא ההשעיה ולספור את התאים קיימא שלם תחת מיקרוסקופ אור.
- ניתוח סטטיסטי
- לחשב את נתוני ההקלטות, להציג האמצעים של ± ש בכל סעיפי האישום.
- לנתח את הנתונים באמצעות-זנבית מבחן של התלמיד t על ידי Microsoft Excel. מגדירים נתונים משמעותיים מבחינה סטטיסטית P-הערך < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אורך מלא, אחרים truncations שני (ביר וטבעת תחומים) של Ly-IAP3 מ- LyxyMNPV היו overexpressed בתאים sf9, בהתבסס על החום מבוסס-הלם pDHsp/V5-שלו /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9). PDHsp/V5-שלו הכיל דרוזופילה חום הלם חלבון מקדם מכירות, אשר כוננים ביטוי גנים במורד הזרם בטמפרטורה של 42 ° C בתנאי באמצעות הסלולר גורמים תעתיק תרגום מערכת (איור 1)8 ,9,11. תרשים הזרימה טכנולוגית כל מוצג באיור2. לאחר 1 h או 5 שעות הלם חום, התאים היו lysed עם חלבון לדוגמה מאגר ונחשפו תספיג assay כדי לאשר את הביטוי חלבון. התוצאות הראו, כי החלבונים באורך מלא, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-ביר ו- Ly-IAP3-טבעת, יכול להתגלות בתאים transfected-הלם חום שלאחר 1 h או 5 שעות. יתר על כן, הצטברויות חלבון נמצאו 5 שעות החום שלאחר הלם (איור 3). לפיכך, על פי הנתונים, חלבון פונקציונלי וזמינותו בוצע לעבר נקודת זמן ביטוי חלבון המרבי (5 שעות החום שלאחר הלם).
ג'ין-induced תא אפופטוזיס והן כימית-induced תא אפופטוזיס יכול להיות מותאם למערכת הזאת להערכת פעילות אנטי-מוות (איור 2). ג'ין-induced תא אפופטוזיס, שני מבנים (אפופטוזיס משרן והיעד ג'ין פלסמיד בונה) היו שיתוף transfected sf9 תאים ואז חום בהלם ביטוי גנים activite. יתר על כן, החלבון אנטי-מוות Ac-P35 (בקרה חיובית) וחלבון אפופטוזיס-משרן (D-RPR) היו גם הביע שמשתמשים במערכת הביטוי ארעי הלם חום.
לאחר הלם חום, שני גנים החל להיות מבוטא מתורגמים לחלבונים. בהשוואה ל- D/וקטור-RPR, הפקד חיובי (Ac-P35/D-RPR) הראה פעילות אנטי-מוות גבוה, אשר הגיע עד ל-80% ממחיר הכדאיות. מהתוצאות הכדאיות תא של המבנה השני, החוקרים אפשר להשוות את הפעילות האנטי-מוות אחד את השני או הפקד חיובי (איור 4A). עבור תא כימית-induced אפופטוזיס, לבנות אחד בלבד היה transfected לתאים sf9. לאחר הלם חום שלאחר h 5, הכימיקלים (ActD) נוספו, הכדאיות תא נמדדה לאחר 16 h (איור 2). לעומת אלה של הפקד חיובי (AC-P35) או הפקד שלילי (וקטורית), לבנות כל הראו השפעות שונות על פעילות אנטי-מוות (איור 4B).
איור 1: תרשים של נוקלאוטיד רצפים של ly- בונה פלסמיד היחסיiap3 מבוסס על וקטור pDHsp/V5-שלו. Codon התחלה (ATG) מוצג באותיות מודגשות. קו תחתון מציין את אתרי חיתוך אנזים הגבלה (הינדהשלישי בצבע אדום. BamHI בצבע כחול); הרצף בצבע ירוק מציין האזור יזם Dhsp70. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תרשים זרימה של מכת חום המושרה חלבון ביטוי system (מערכת תא pDHsp/V5-שלו/sf9). ג'ין-induced תא אפופטוזיס וטיפולים אפופטוזיס תא כימית-induced היו המצוין בשלב הראשוני (שותף תקנים עם אפופטוזיס משרן ג'ין פלסמיד) או בשלב מאוחר יותר לאחר הלם חום (כימית-induced אפופטוזיס), בהתאמה, עבור אנטי-אפופטוזיס וזמינותו. איור ששונה ואגדה באדיבות ספרינגר11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ביטוי של AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-ביר Ly-IAP3-טבעת באמצעות הלם חום המושרה חלבון ביטוי system (מערכת תא pDHsp/V5-שלו/sf9). 1 h או 5 שעות פוסט הלם חום, lysates תא היו קוצרים, נתון תספיג assay מרחביות/עמוד. (א) assay תספיג עם נוגדן α-V5 ו מרחביות (B) / מוכתם כחול Coomassie של הפקד טעינת עמוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מבחני הכדאיות D-rpr או אפופטוזיס ואקטינומיצין D-induced. תאים sf9 (א) היו transfected עם וקטור pDHsp70/V5-שלו (וקטורית בלבד), שיתוף transfected pDHsp70/drpr/דגל-שלו עם וקטור pDHsp70/V5-שלו, pDHsp70/Ac-P35/V5-שלו, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-שלו, pDHsp70/Ly-IAP3-ביר/V5-שלו, pDHsp70 / Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו, בהתאמה. ההבדלים בין וקטור P35 ובין וקטור Ly-IAP3 הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית (t-מבחן; P < 0.05). Sf9 (B) התאים היו transfected עם או וקטור pDHsp70/V5-שלו או pDHsp70/Ac-P35/V5-שלו, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-שלו, pDHsp70/Ly-IAP3-ביר/V5-שלו, pDHsp70/Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו, בהתאמה, ב- 5 שעות לאחר הלם חום, ActD נוספה ו- 16 h מאוחר יותר, הכדאיות תא נמדדה. ההבדל בין וקטור P35 הוא משמעותי סטטיסטית (t-מבחן; P < 0.05). איור ששונה ואגדה באדיבות ספרינגר11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם | רצפים |
| pDHsp-IAP3-HindIII-F | ACCATGGACGACGAACGACGCAGAAGCTT5´-GG-3´ |
| pDHsp-IAP3-BamHI-R | 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´ |
| iap3-ביר-BamHI-r | CGGCAGATCGCCGCCGCGGAGGATCC5´-CG-3´ |
| iap3-טבעת-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´... |
| pDhsp70-F2 | 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´ |
| Op-IE2R | 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´ |
טבלה 1: ערכות פריימר המשמש מבוססי ה-PCR שיטת השיבוט. * זוגות בסיס תחתון דנ א ציינו כי האתרים אנזים הגבלה. הרשימה פריימר ששונה באדיבות ספרינגר11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המושג חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת תוארה לראשונה על ידי קלם. et al. ב 19948. השוואה של יזם ג'ין baculoviral (IE1) ודרוזופילה hsp70 הראו שכי hsp70 היה יעילות גבוהה יותר של יתוש תאים10. יתר על כן, כתוצאה אינדוקציה הלם חום, העיתוי של ביטוי חלבון יכול להיות נשלט בדיוק לאחר טיפול הלם תרמי. מערכת זו הוחלה ואז עבור מבחני חלבון פונקציונלי של שרימפס, nucleopolyhedrovirus (NPV) חוג ידידי הפקולטה חלבונים9,11. ב פרוטוקול זה, שימשו סך של קונסטרוקציות פלסמיד 6: שלושה (pDHsp/V5-שלו, pDHsp/Ac-p35/V5-שלו, ו pDHsp/D-rpr/דגל-שלו) נמסרו על-ידי Leu ג'יאן-Horng9ו אחרים שלושה מבנים (pDHsp-iap3/V5-שלו, pDHsp-iap3-ביר/V5-שלו, ו pDHsp-iap3-טבעת/V5-שלו) הוקמו ע י נאי et al., ריו דה ז'ניירו11. נראה כי זו יזם ב חרקים תאים עובד ביעילות רבה יותר מאשר baculoviral ג'ין היזמים. עם זאת, במהלך מניפולציה של פרוטוקול זה, יש כמה נקודות שצריך לקחת בחשבון. לפני פלסמיד תרביות תאים, בדיקת החדרת רצף הדנ א הוא חשוב עבור ביטוי גנים; לכן, זה צריך להיות התמזגו עם epitope V5 כדי ליצור חלבון פיוז'ן מתויג V5 בסוף הרצף היעד. יתר על כן, אפשר גם לעצב תגיות שונות פיוז'ן (קרי, דגל epitope) ב הווקטור מבוססי pDHsp עבור במבחנה חלבון איגוד וזמינותו. הליך הארכת יעזור להמשיך לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון9. לכן, הנוגדן polyclonal מסחרי V5 יכול לשמש עבור זיהוי חלבונים. היחס תרביות תאים בתאי חרקים שונים צריך להיבדק לפני הניסוי. תרביות תאים נמוכים עשוי להתבטא נסתרים של ביטוי חלבון; לפיכך, וקטור pDHsp המכיל גן ח מתאים (כלומר, ירוק לזרוח ג'ין) יכול להיות transfected לתוך תאים חרקים כדי להעריך את יעילות תרביות תאים.
המגבלה העיקרית של הפלטפורמה בביטוי הלם חום היא רמת ביטוי חלבון. במקרים מסוימים, נמצאה רמת ביטוי חלבון נמוכה. על פי מחקר פיילוט, שם היה אין השפעה משמעותית למינון שהתרחשה בעת דנ א פלסמיד יותר היה transfected לתוך תאים sf9 (נתונים לא מוצג). לפיכך, אפקט זה עלולה להיגרם על ידי פרוטאוזום אוביקוויטין (UPP) או אחרים לא ידוע מנגנונים11. חוקרים יש לבחון הביטוי חלבון בנוכחות מעכב פרוטאזום (קרי, MG-132) כדי להבהיר recolve זו בעיה11. המגבלה אחרות היא כי לא ניתן להשיג קיימא לייצור חלבונים הקשורים עם וירוסים רקומביננטי. לפיכך, ייצוב כמות חלבון ביטוי הינם גם חששות לגבי מערכת זו. לכן, קורס זמן של ייצור החלבון צריך להיבדק גם על ידי תספיג assay לפני וזמינותו פונקציונלי. ב פרוטוקול זה, אנו משווים שתי נקודות זמן (1 ו 5 שעות לאחר הלם חום), נצפתה ההצטברות של ייצור החלבון היעד מ 1 h עד 5 שעות. עלייה בנקודות זמן הוא הציע כדי לקבוע את התנאים העיתוי הטוב ביותר עבור חלבון פונקציונלי וזמינותו.
עבור החלבון assay פונקציונלי, החלבון אנטי-מוות Ac-P35 (בקרה חיובית) וחלבון אפופטוזיס-משרן (D-RPR) היו גם הביע שמשתמשים במערכת הביטוי ארעי הלם חום. שני חלבונים אלה מתוארים היריבים פונקציונלי9,11,15. לכן, וקטור/D-RPR ואת Ac-P35/D-RPR יכול לשמש בקרה שלילית, בקרה חיובית, בהתאמה. באמצעות ההשוואה הזאת, פעילות אנטי-מוות של חלבונים היעד יכול להיקבע.
פרוטוקול שהוצגו יכול לספק פלטפורמה להביע חלבונים זרים מהר יותר או יכול להיות מיושם עוד יותר כדי להעריך את פעילות אנטי-מוות החלבון בתאים חרקים. ברגע החוקרים להשיג תוצאות ראשוניות של פונקציה של חלבונים, מערכת זו יכול לשמש למחקרים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים Leu ג'יאן-Horng ד ר של המכון של ביולוגיה ימית, האוניברסיטה הלאומית טייוואן האוקיינוס על מתן 3 מבנים פלסמיד. מחקר זה נתמך על ידי מענק 106-2311-B-197-001 - משרד המדע, הטכנולוגיה (רובם).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
- Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
