Summary
このプロトコルを記述する外国蛋白質を表現するまたは潜在的な外国蛋白質とその切り捨てられたのアミノ酸の抗アポトーシス活性を評価に使用することができます熱衝撃によるタンパク質発現システム (pDHsp/V5-彼/sf9 細胞システム)昆虫細胞での酸。
Abstract
一過的遺伝子発現系は、細胞培養システム培養バキュロ ウイルスのタンパク質機能解析を実行するための最も重要な技術の一つです。このシステムは、エクスプレス遺伝子一過性発現プラスミドの baculoviral プロモーターの制御下に開発されました。さらに、このシステムは、バキュロ ウイルス自体または外国蛋白質の機能アッセイに適用できます。最も広く、商業的に利用可能な一過的遺伝子発現系は、ヒメシロモンドクガ pseudotsugata multicapsid 核 (OpMNPV) の即時初期遺伝子 (IE) プロモーターに基づいて開発です。ただし、昆虫細胞における外来性遺伝子の低い発現レベルが認められました。したがって、一過的遺伝子発現系が蛋白質の表現を改善するため建設されました。このシステムは、組換えのプラスミッドはショウジョウバエ熱ショック 70 (Dhsp70) プロモーターの制御の下でターゲット シーケンスを格納する建設されました。このプロトコルはこの熱ショック ベース pDHsp/V5 渓 (6 ヒスチジンと V5 epitope) のアプリケーションを提示/ハスモンヨトウ frugiperdaセル (sf9 細胞) システム;このシステムも候補タンパク質を昆虫細胞での抗アポトーシス活性を評価するための遺伝子発現だけでなく、利用可能なです。さらに、このシステムは、組換えプラスミドの 1 つをどちらか導入することができます。 または昆虫細胞の 2 つの潜在的機能的拮抗組換えのプラスミッドを co transfected。プロトコルはこのシステムの効率性を示しますこのテクニックの実践事例を提供しています。
Introduction
2 つの蛋白質の表現システムは、タンパク質を生成するためよく使用されている: 原核生物の蛋白質の表現システム (大腸菌発現系) と真核生物の蛋白質の表現システム。1 つの人気のある真核生物のタンパク質発現系は、バキュロ ウイルス発現ベクター システム (BEVS)1です。バキュロ最初農業の世界の生物的制御因子として使用された森林害虫と。最後の数十年で、バキュロ蛋白質発現ベクターと同様にバイオ テクノロジーのツールとして開発されました。バキュロのゲノムは二本鎖の環状 DNA とエンベロープのヌクレオカプシド2から成っています。までに、七十八バキュロ ウイルスより分離シーケンス3をされています。宿主昆虫細胞における baculoviral 遺伝子発現の時空間のカスケードを基に、遺伝子の転写が即時初期遅延初期、後期、および非常に遅い遺伝子4を含む 4 つの一時的なカスケードに分類できた。
BEVSs は、非常に遅い遺伝子プロモーター (すなわち、多面体または p10 プロモーター) ドライブ ターゲット遺伝子の組換えバキュロ ウイルスの相同組換えによって生成されたときに使用されたので、示されました。組換えバキュロ ウイルス昆虫細胞の異種蛋白の発現は哺乳類 (糖タンパク質生産に適しています) ポスト翻訳の修正蛋白質のそれに似ています。したがって、バキュロは広く使用されている5,6,7をされています。ただし、制限が 1 つ異なる昆虫細胞7N グリコシル化反応経路の存在であります。
したがって、新しいバキュロ ウイルス発現系、一過的遺伝子発現系が開発されました。このシステムは、昆虫細胞での baculoviral 即時初期プロモーター (すなわち 1プロモーター) のドライブの下で外来遺伝子を表現します。このシステムを使用して、ターゲット蛋白質すぐに表現できますすなわち 1プロモーターの制御下で良い N 型糖鎖7昆虫細胞で N グリコシル化反応経路を変更中。また、baculoviral 即時初期遺伝子は宿主細胞の RNA ポリメラーゼ II による転写は、活性化4の任意のウイルスの要因を必要としません。そのため、短い時間内の昆虫細胞で外国蛋白質を表現できます。までに、非定常遺伝子発現システムは細胞培養システム培養バキュロ ウイルスの蛋白質機能の試金を実行するための最も重要な技術の一つです。システムは、バキュロ ウイルスまたは外国蛋白質の機能を解析に適用できます。市販の一過的遺伝子発現系の 1 つは、ヒメシロモンドクガ pseudotsugata multicapsid 核 (OpMNPV) (OpIE2 と OpIE1 プロモーター) の即時初期遺伝子 (IE) プロモーターに基づいています。
ただし、昆虫細胞における外来性遺伝子の低い発現レベル頃まだ問題オピー プロモーターを用いた一過的遺伝子発現系に使用される8,9,10。したがって、別の一過的遺伝子発現系では、ショウジョウバエ熱衝撃蛋白質 70 (hsp70) 遺伝子8,9のプロモーターに基づいてを構築されました。Hsp70 のプロモーターは IE baculoviral プロモーター昆虫細胞10熱ショックによる場合よりも効率的に動作します。このシステムでターゲット遺伝子はショウジョウバエ熱ショック 70 (Dhsp70) プロモーターのドライブの下で表現されました。外来遺伝子を PCR クローニング法による一過的遺伝子発現プラスミドに簡単に複製することができます。さらに、熱衝撃誘導による遺伝子発現のタイミングの制御を実行できます。
本報告では、我々 のアプローチに従うし、熱ショックによる一時的なタンパク質発現系を用いた baculoviral 遺伝子 (3 アポトーシスの阻害剤強 xylina MNPV からiap3 ) の 3 つの異なる切り捨てを表現し、さらに抗アポトーシス活性の解析にこれらの表現された蛋白質を適用します。このシステムは外国蛋白質を即座に表現することができますいずれかまたは他のタンパク質の活性測定法に適用する可能性もしながら sf9 細胞におけるタンパク質抗アポトーシス活性の評価に適用可能します。
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Protocol
1. 準備
- 昆虫の細胞培養
- 細胞培養液の 50 mL を準備します。この操作を行うには、抗生物質の 500 μ L を追加 (アムホテリシン B = 0.25 μ g/mL、ペニシリン 100 単位/mL、ストレプトマイシンを = = 100 μ g/mL) と熱不活化の牛胎児血清 (FBS または抗生物質) なし無血清培の 5 mL。
注:使用する前に水のお風呂に 30 分の 65 ° c ウシ胎児血清を加熱します。 - ハスモンヨトウ frugiperdaを維持 (鱗翅目: ヤガ科)、sf9 昆虫細胞。外し約 25 cm2細胞培養用フラスコ細胞の 80% フラスコを振ることによって、光学顕微鏡下でチェックします。新しい 25 cm2細胞培養用フラスコ、細胞懸濁液の 50% を転送し、室温で 15 分間付けるセルを許可します。5 mL の新鮮な細胞培養培地媒体に置き換えるし、28 ° C の定温器で育つ通路の細胞細胞の増殖によってすべての 2 〜 3 日。
- 細胞培養液の 50 mL を準備します。この操作を行うには、抗生物質の 500 μ L を追加 (アムホテリシン B = 0.25 μ g/mL、ペニシリン 100 単位/mL、ストレプトマイシンを = = 100 μ g/mL) と熱不活化の牛胎児血清 (FBS または抗生物質) なし無血清培の 5 mL。
- セルの transfection のためのプラスミッドの準備
- Pcr クローニング法11pDHsp/V5 彼にターゲット DNA のフラグメント (例えば、強 xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3遺伝子とその削除構成要素) を挿入します。チェックのコロニーによって変換されたコロニーの成長 PCR マスター ミックス (2 X) と pDhsp F2/Op IE2R プライマーを用いた PCR を設定します。商業シーケンス サービスによってプラスミッド シーケンスを確認します。
注:表 1は、PCR および対応する構造のために使用されるプライマーを示します。 - 文化単一シーケンスされた細菌のコロニーの 200 mL の LB 培地を含む上記プラスミド構築 (ステップ 1.2) を含んでいる抗生物質 (50 μ G/ml) をそれぞれ選択。
- 製造元の手順12によると Midi プラスミド キットを使用して培養されたエシェリヒア属大腸菌からのプラスミドを抽出します。
- Pcr クローニング法11pDHsp/V5 彼にターゲット DNA のフラグメント (例えば、強 xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3遺伝子とその削除構成要素) を挿入します。チェックのコロニーによって変換されたコロニーの成長 PCR マスター ミックス (2 X) と pDhsp F2/Op IE2R プライマーを用いた PCR を設定します。商業シーケンス サービスによってプラスミッド シーケンスを確認します。
- 1.5 mL の細胞培養用培地、細胞の無血清培養液の 8.5 mL を混合することによってメッキ媒体を準備します。
- 細胞培養培地 10 mL に ActD 株式 (1 mg/mL) の 1.5 μ L を追加することによってアクチノマイシン D (ActD) 細胞培養培地を準備 (最終濃度 = 150 ng/mL)。4 ° C でのストア
2. タンパク質の一過性発現
- 細胞播種
- Sf9 細胞を培養用フラスコを振ることによって収穫、打倒し 50 mL のチューブに細胞懸濁液を落ちるし、P10 ピペットで 10 μ L を検定に転送します。光学顕微鏡の下で細胞の数をカウントします。
- 室温で 15 分間 24 ウェル プレートの各ウェルに 3 × 105 sf9 細胞をプレートします。0.5 ml 播種培地の培地を交換してください。
- プラスミドのトランスフェクション
- 希薄細胞のトランスフェクション試薬: 100 μ L 細胞の無血清培養液と 1 のボルテックスでミックスの細胞のトランスフェクション試薬の希釈 8 μ s。
- 1 ボルテックス 2 μ g のプラスミド DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-彼または pDHsp70-Ly-IAP3/V5-彼または pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-彼または pDHsp70 Ly-IAP3-リング/V5-渓) 細胞の無血清培養液とミックスの 100 μ L に追加 s (図 2)。
- 希釈したプラスミド DNA と希薄化後細胞のトランスフェクション試薬 (210 μ L) を組み合わせるし、室温で 30 分間 1, 加温のボルテックスでミックスします。
- P1000 ピペットで滴下セルに DNA トランスフェクション試薬混合物 210 μ を追加します。5 h 28 ° C の孵化させなさい。
- P1000 ピペットを使用して細胞培養液 0.5 mL でメッキ媒体を交換してください。テープで 24 ウェル プレートをシールし、28 ° C 16 h でセルを孵化させなさい。
- 熱衝撃 transfected セル: (水の表面に浮かんで) 42 ° C の水浴に皿を置きます。30 分間加熱し、28 ° C の定温器に 24 ウェル プレートを返します。
- 蛋白質の表現の検出
- 1 h、5 h 熱ショック後 0.5 ml の 1 x PBS バッファーのセルを簡潔に 3 回洗います。
注: は、9 mL の滅菌 ddH2O に 1 mL の 10 x PBS バッファーを追加して PBS バッファー PBS バッファー x 1 x 10 を希釈します。 - 上下にピペッティングして SDS のローディングの染料 × 1 の 40 μ L で細胞を溶解させます。
注: は、30 μ L の PBS バッファー x 1 と 4 x SDS サンプルバッファーの 10 μ L を混合することによって SDS 読み込み染料 × 4 を希釈します。 - 熱ブロックで 10 分間 98 ° C で蛋白質のサンプルを加熱、1 分のスピン ・ ダウンと西部のしみの試金のための氷の上に置きます。
- 西部のしみの分析
Eslami ルハン13から西部のしみの分析の手順に従います。SDS ページのゲルの14を実行: ブルー染色 (もそれぞれに読み込まれた蛋白質のサンプルの量が量で等しいことをチェックするためのロード コントロール) を受ける 1 つのゲルおよびその他の西を受ける Eslami、ルハン13 によると、アッセイのしみ. - ヤギ抗うさぎ IgG 西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役 (0.8 mg/mL) (1:10000 作業に TBST バッファーで希釈ウサギ抗 V5 抗体 (5 mg/mL) (濃度 1 μ G/ml の作業に TBST バッファーで希釈 1: 5000) と V5 タグ融合タンパク質を検出します。濃度 0.08 μ g/mL)。
注:17.5% ポリアクリルアミドゲルの割合を調整するときするタンパク質の分子量 < 17 kDa。
- 1 h、5 h 熱ショック後 0.5 ml の 1 x PBS バッファーのセルを簡潔に 3 回洗います。
3. 抗アポトーシス活性測定法
- 遺伝子による細胞アポトーシス: 2.1 から 2.3 まで前述の手順を繰り返します。共同 transfect 1 μ g のプラスミド DNA の 1 μ g と pDHsp/D-rpr/フラグ-彼プラスミド DNA (含むアポトーシス誘導遺伝子) の [pDHsp70/V5 彼ベクトル (マイナス コントロール)、pDHsp70-Ac-P35/V5-彼の (肯定的な制御) pDHsp70 Ly-IAP3/V5-彼、pDHsp70 Ly-IAP3-BIR/V5-渓pDHsp70、Ly-IAP3-リング/V5-彼のまたはそれぞれ。]。5 時間後の熱ショック処理、セル実行可能性の試金 (図 2) を行います。
- 化学的に誘導アポトーシス: 2.1 から 2.3 まで前述の手順を繰り返します。2.1.2 ステップ 6 ウェル プレートの各ウェルに 1 x 106 sf9 細胞をプレートします。4 μ g のプラスミド DNA を transfect [pDHsp70/V5 彼ベクトル (マイナス コントロール)、pDHsp70-Ac-P35/V5-彼の (肯定的な制御) pDHsp70 Ly-IAP3/V5-彼、pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-彼または pDHsp70-Ly-IAP3-リング/V5-彼、それぞれ。]。5 時間後の熱衝撃で ActD 細胞培養培地の 16 h の 2 mL と sf9 細胞を扱い、セル実行可能性の試金 (図 2) を行います。
注:6 ウェル プレートの 1 つの井戸をカバーする最小量は 1 mL です。 - トリプリケートの 3.1 と 3.2 を含む、上記の抗アポトーシス活性アッセイ実験を実行します。
4. セル実行可能性の試金
- 3 回 1 mL の 1 分の 1 の x PBS バッファーを追加することによって扱われた細胞を洗浄します。0.04% トリパン ブルー色素を含む 1 mL 1 × PBS バッファーをピペッティングにより細胞を再懸濁します、室温で 3 分間染色します。1.5 mL マイクロ チューブに細胞懸濁液を転送します。
注:1 x PBS バッファーと 1 mL 0.4% トリパン ブルー溶液 9 mL を混合することによって 0.4% トリパン ブルー溶液を希釈します。 - P10 ピペットの検定を 10 μ L トリパン ブルー染色細胞懸濁液を転送し、光学顕微鏡下で実行可能なそのままセルをカウントします。
- 統計解析
- 記録されたデータを計算し、カウントのすべての平均 ± 標準偏差として存在します。
- スチューデントの両側 t 検定によって Microsoft Excel を使用してデータを分析します。統計的に有意なデータをPとして定義の値 < 0.05。
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Representative Results
フルの長さと他 2 つ切り捨て (BIR とリング ドメイン) LyxyMNPV から Ly IAP3 のしたで過剰に発現 sf9 細胞、熱衝撃による pDHsp/V5-彼に基づく/ハスモンヨトウ frugiperdaセル (sf9 細胞) システム。PDHsp/V5-彼含まれているショウジョウバエ熱ショック蛋白質プロモーターで、42 ° C 状態の温度で細胞の転写因子と翻訳システム (図 1)8 を使用して下流遺伝子の発現をドライブ、9,11。技術全体のフローチャートを図 2に示します。1 h、5 h 熱ショック後細胞蛋白質のサンプルバッファーと分離し、タンパク質の発現を確認する西部のしみの分析を受けます。1 時間または 5 時間後の熱ショックに transfected セルで AC P35、Ly IAP3、Ly-IAP3-BIR Ly IAP3 リング、フルレングスの蛋白質を検出できることが示唆されました。さらに、蛋白質の蓄積は、5 時間後の熱衝撃 (図 3) で発見されました。したがって、データによると蛋白質機能の試金は最大タンパク質式時点 (5 時間後の熱ショック) で行われました。
遺伝子による細胞のアポトーシスと化学的に誘導アポトーシスはこのシステム (図 2) 抗アポトーシス活性を評価するために合わせることができます。遺伝子による細胞のアポトーシスの 2 つの構成体 (アポトーシス誘導およびターゲット遺伝子プラスミドの構造) が cotransfected sf9 細胞と、熱アクティビティ遺伝子発現にショックを受けた。また、抗アポトーシス蛋白 Ac P35 (肯定的な制御) とアポトーシス誘導タンパク質 (D RPR) も表現されたこの熱衝撃一過性発現システムを用いたします。
熱ショック後両方の遺伝子は表現、蛋白質に翻訳し始めた。ベクトル/D-RPR と比較して、肯定的な制御 (Ac-P35/D-RPR) は、生存率の最大 80% に達した高抗アポトーシス活性を示した。他のコンストラクトの細胞生存率の結果から研究者は、互いに肯定的な制御 (図 4 a) 抗アポトーシス活性を比較できます。化学物質による細胞アポトーシスのだけ 1 つの構築は sf9 細胞にトランスフェクションだった。5 時間後の熱ショックを経て、化学物質 (ActD) が追加されたと細胞生存率を測定した 16 h (図 2)。各構成要素を示した (図 4 b) 抗アポトーシス活性に様々 な影響を肯定的な制御 (AC P35) のネガティブ コントロール (ベクトル) と比較。
図 1: 図とヌクレオチドのシーケンスly- pDHsp/V5 彼のベクトルに基づいてiap3相対的なプラスミド構造。開始コドン (ATG) が太字で示されます。下線を示します制限酵素切断サイト (ハインドIII の赤い色。病原ブルーの色で);緑の色の順序は、Dhsp70 プロモーター領域を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ヒート ショックのフロー チャートによるタンパク質発現系 (pDHsp/V5-彼/sf9 細胞システム).遺伝子による細胞アポトーシスと化学的に誘導細胞アポトーシス治療熱ショック (化学物質によるアポトーシス誘導) 後、(アポトーシス誘導遺伝子プラスミドと共トランスフェクション) の最初のステップに、後の手順を示されたのためにそれぞれ、抗アポトーシスの試金します。変更された図と凡例スプリンガー11の許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Ly IAP3 リング、Ly IAP3 BIR Ly IAP3 AC P35 の過剰発現タンパク質発現系 (pDHsp/V5-彼/sf9 細胞システム) による熱ショックを使用しています。1 h、5 h 投稿熱衝撃でセル lysates は収穫され西部のしみの分析と SDS/ページを受けます。Α V5 抗体、ローディング コントロールとしてブルーに染まった (B)/SDS-PAGE の (A) の西部のしみの試金。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 生存率D rprやアクチノマイシン D によるアポトーシス誘導の試金します。(A) sf9 細胞が発現する pDHsp70/V5 彼ベクトル (ベクトルのみ) と co transfected pDHsp70/drpr/旗彼 pDHsp70/V5 彼のベクトル、pDHsp70/Ac P35/V5-彼、pDHsp70/Ly-IAP3/V5-彼、pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-彼、pDHsp70/Ly、IAP3-リング/V5-彼のそれぞれ。ベクトルと P35 およびベクトルと Ly IAP3 間違いが統計的に有意な (t-テスト;P < 0.05)。(B) sf9 細胞はどちらか pDHsp70/V5 彼のベクトルまたは pDHsp70/Ac P35/V5-彼、pDHsp70/Ly-IAP3/V5-彼、pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-彼、pDHsp70/Ly、IAP3-リング/V5-彼のそれぞれ、熱ショック後 5 h で、ActD を追加しましたを導入させたと 16 時間後、細胞生存率を測定しました。ベクトルと P35 の違いは統計的に有意な (t-テスト;P < 0.05)。変更された図と凡例スプリンガー11の許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 名 | シーケンス |
| pDHsp-IAP3-HindIII-F | 5´ GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´ |
| pDHsp-IAP3-病原-R | 5´ GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´ |
| iap3 BIR 病原 r | 5´ CGGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´ |
| iap3 リング HindIII F | 5´ GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT 3´ |
| pDhsp70 F2 | 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´ |
| Op IE2R | 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´ |
表 1: PCR クローニング法の使用されるプライマー セット * 。下線付きの DNA 塩基対は、制限酵素サイトを示されました。変更されたプライマー リストはスプリンガーの11の許可を得て再現。
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Discussion
熱ショックを利用した pDHsp/V5-彼/sf9 細胞システムの概念は、最初 1994年8クレムらによって記述されていた。Baculoviral 遺伝子プロモーター (IE1) とショウジョウバエ hsp70の比較を示したそのhsp70蚊細胞10でより高い効率を持っていた。さらに、正確に熱ショック処理後、熱ショック誘導によるタンパク質発現のタイミングを制御できます。このシステムはエビと核 (NPV) の蛋白質機能の試金を申請した IAP 蛋白質9,11。このプロトコルでは合計 6 プラスミッドの構造が使用された: 3 (pDHsp/V5 彼、pDHsp/Ac、p35/V5-彼のおよび pDHsp/D-rpr/フラグ-彼) は建宏ルー9、および他の 3 つの構造 (pDHsp-iap3/V5-彼、pDHsp、iap3-BIR/V5-彼のによって提供されました。pDHsp-iap3-リング/V5-彼) ナイらにより構築されました。 2016、11。昆虫このプロモーターが作品をより効率的に baculoviral 遺伝子プロモーターも細胞です。ただし、このプロトコルの操作中に考慮すべきいくつかのポイントがあります。プラスミド トランスフェクション前に、DNA シーケンスの挿入をチェックは遺伝子発現の重要ですしたがって、ターゲット シーケンスの末尾で V5 タグ融合タンパク質を形成する V5 エピトープと融合する必要があります。さらに、異なった融合タグ (すなわち、FLAG エピトープ) も体外タンパク質結合アッセイの pDHsp ベースのベクターで設計されています可能性があります。この拡張プロシージャ蛋白質蛋白質の相互作用9をさらに調査に役立つでしょう。したがって、商業 V5 ポリクローナル抗体は、タンパク質の検出される可能性があります。別の昆虫細胞でのトランスフェクション比は、実験前にテスト必要があります。トランスフェクション率が低い可能性があります蛋白質発現の検出可能ですしたがって、適切なレポートの遺伝子を含んでいる pDHsp のベクトル (遺伝子すなわち、緑色蛍光を発する) トランスフェクション効率を評価する昆虫細胞にトランスフェクションでした。
この熱衝撃式プラットフォームの主要な制限は、タンパク質の発現レベルです。いくつかのケースで低蛋白質発現レベルが発見されました。パイロット調査によるより多くのプラスミド DNA sf9 細胞 (データは示されていない) に導入されたときに発生した重大なの用量依存的効果はありませんでした。したがって、この効果は、ユビキチン ・ プロテアソーム (UPP) またはその他の未知のメカニズムの11によって引き起こされることがあります。研究者はこの問題11プロテアソーム阻害剤 (すなわち、MG 132) を明らかにして recolve の存在下でタンパク質の発現を調べる必要があります。その他の制限は、組換えウイルスに関連付けられているタンパク質の持続可能な生産を達成できなかったことです。したがって、安定化とタンパク質の発現量は、またこの制度に関し懸念です。したがって、蛋白質の生産の時間経過は機能アッセイの前に西部のしみアッセイでもテスト必要があります。このプロトコルでは、2 つの時間ポイント (1 および 5 熱ショック後 h) を比較し、ターゲット蛋白質の生産 1 h から 5 h への蓄積を観察しました。タンパク質機能の試金のための最高のタイミング条件を決定するために時間のポイントの増加が示唆されました。
蛋白質この熱衝撃一過性発現システムを使用しても機能アッセイ、抗アポトーシス蛋白 Ac P35 (肯定的な制御) とアポトーシス誘導タンパク質 (D RPR) 表明されました。これら 2 つのタンパク質は、機能的な拮抗薬9,11,15として記述されます。したがって、ベクトル/D-RPR と Ac P35/D RPR は、それぞれネガティブ コントロールと肯定的な制御として役立つことができます。この比較を使用して、ターゲット蛋白質の抗アポトーシス活性を決定可能性があります。
提案するプロトコルはより迅速に外国蛋白質を表現するためのプラットフォームを提供することか、昆虫細胞でのタンパク質抗アポトーシス活性を評価するさらに適用できません。研究者は、タンパク質機能の予備的な結果を取得後、このシステムをさらに研究される可能性があります。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
博士建宏ルー 3 プラスミドの構造を提供する国立台湾海洋大学海洋生物研究所に感謝いたします。この研究によってグラント 106-2311-B-197-001 - 科学省から技術 (ほとんど) に対応しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
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