Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Övergående uttryck av främmande gener i insekt celler (sf9) för Protein funktionell analys

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56693
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

Summary

Det här protokollet beskriver en värme chock-inducerad protein uttryck systemet (pDHsp/V5-hans/sf9 cellsystem), som kan användas för att uttrycka främmande proteiner eller utvärdera anti-apoptotiska aktiviteten av potentiella främmande proteiner och deras trunkerade amino syror i insekt celler.

Abstract

Systemets övergående gen uttryck är en av de viktigaste teknikerna för att utföra protein Funktionalanalys i baculoviridae i vitro cell kultur systemet. Detta system utvecklades för att uttrycka främmande gener under kontroll av baculoviral arrangören i övergående uttryck plasmider. Detta system kan dessutom tillämpas på en funktionell analys av baculoviridae själv eller främmande proteiner. Det mest allmänt och kommersiellt tillgängliga övergående gen uttryck systemet är utvecklat utifrån omedelbara-tidig genen (IE) arrangören av Orgyia pseudotsugata multicapsid nukleopolyedervirus (OpMNPV). Emellertid observerades en låg uttryck nivå av främmande gener i insekt celler. Därför konstruerades en övergående gen uttryck system för att förbättra proteinuttryck. I det här systemet konstruerades rekombinant plasmider innehåller sekvensen mål under kontroll av Drosophila värme chock 70 (Dhsp70) arrangören. Detta protokoll presenterar tillämpningen av denna värme chock-baserade pDHsp/V5-hans (V5 epitop med 6 histidin) /Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) systemet. Detta system är tillgängliga inte bara för genuttryck utan också för att utvärdera anti-apoptotiska aktiviteten av kandidat proteiner i insekt celler. Dessutom detta system kan vara antingen transfekterade med en rekombinant plasmid eller samtidig transfekterade två potentiellt funktionellt antagonistiska rekombinant plasmider i insekt celler. Protokollet visar effektiviteten av detta system och ger ett praktiskt fall av denna teknik.

Introduction

Två protein uttryck system har vanligen använts för att producera proteiner: prokaryoter protein uttryck (Escherichia coli gen uttryck system) och Eukaryoter protein uttryck system. En populär Eukaryoter protein uttryck systemet är baculoviridae uttryck vector systemet (BEVS)1. Baculoviruses användes först som världen över biologiska kontrollagenter jordbruks och skog skadedjur. Under de senaste decennierna utvecklades baculoviruses som biotekniska verktyg för protein uttryck vektorer samt. Genomen hos baculoviruses bestå av dubbelsträngat cirkulär DNA och höljeförsedda nucleocapsids2. Hittills har mer än Sjuttioåtta baculoviridae har isolat sekvenserade3. Baserat på den temporal kaskaden av baculoviral genuttryck i värd insekt celler, skulle transkriptionen av gener kunna klassificeras i fyra temporal kaskader, inklusive omedelbar-tidig, försenad-tidigt, sent och mycket sena gener4.

BEVSs designerades så att mycket sent gen initiativtagarna (dvs, polyeder eller p10 arrangören) användes för att driva målet generna, medan den rekombinanta baculoviridae genererades av homolog rekombination. Uttryck för främmande proteiner i insekt celler genom rekombinant baculoviridae är liknande till det av protein från däggdjur i post-translationella modifieringar (passar för glykoprotein produktion). Baculoviridae har således varit utbredda5,6,7. En begränsning är dock förekomsten av olika N-glycosylation vägar i insekt celler7.

Därför utvecklades ett nytt baculoviridae uttryck system, övergående gen uttryck systemet. Detta system uttrycker främmande gener under drevet av baculoviral omedelbar-tidigt initiativtagare (dvs-1 arrangören) i insekt celler. Med detta system, kan målproteinet omedelbart uttryckas under kontroll dvs-1 arrangören samtidigt ändra N-glycosylation vägen i insekt celler, vilket resulterar i bättre N-länkade oligosackarider7. Dessutom baculoviral omedelbar-tidiga gener transkriberas av värdcellen RNA-polymeras II och kräver inte någon viral faktor för aktivering4. Därför, främmande proteiner kan uttryckas i insekt celler inom en kort tid. Hittills, övergående är gen uttryck system en av de viktigaste teknikerna för att utföra protein funktionella analyser i baculoviridae i vitro cell kultur systemet. Systemet kan användas för att analysera funktion antingen baculoviridae eller främmande proteiner. En av de kommersiellt tillgängliga övergående gene expression system baseras på omedelbar-tidig genen (IE) initiativtagarna till Orgyia pseudotsugata multicapsid nukleopolyedervirus (OpMNPV) (OpIE2 och OpIE1 initiativtagare).

Den lägre nivån för uttryck av främmande gener i insekt celler var dock fortfarande ett problem när OpIE arrangören-baserade övergående gen uttryck systemet var används8,9,10. Således, en annan övergående gen uttryck systemet konstruerades utifrån arrangören av Drosophila heat shock protein 70 (hsp70) gen8,9. Främjare av hsp70 fungerar mer effektivt än baculoviral IE arrangören när induceras av värme chock i insekt celler10. I detta system uttrycktes av målgener under drevet av Drosophila värme chock 70 (Dhsp70) arrangören. Främmande gener kan klonas enkelt in övergående gen uttryck plasmiden av PCR-baserade kloning metoder. Kontroll av tidpunkten för genuttryck kan dessutom utföras av värme chock induktion.

I detta betänkande, vi följer metoden och express tre olika truncations av baculoviral-genen (hämmare av apoptos 3, iap3 från Lymantria xylina MNPV) med hjälp av värme chock-baserade övergående protein uttryck systemet och vidare tillämpas dessa uttryckta proteiner på anti-apoptotiska verksamhetsanalys. Detta system kan antingen uttrycka främmande proteiner snabbt eller tillämpas ytterligare utvärdering av anti-apoptotiska proteinaktiviteten i sf9 celler, medan du också har potential att tillämpas på andra protein aktivitet analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. förberedelser

  1. Insekt cellkultur
    1. Förbereda 50 mL cellodlingsmedium. Till gör så, tillsätt 500 µL av antibiotika (amfotericin B = 0,25 µg/mL, Penicillin = 100 enheter/mL, Streptomycin = 100 µg/mL) och 5 mL Värmeinaktiverade fetalt bovint serum i serumfritt cellodlingsmedium (utan FBS eller antibiotika).
      Obs: Värm den fetala bovint serumen vid 65 ° C under 30 minuter i vattenbad innan användning.
    2. Upprätthålla Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: nattflyn), sf9 insekt celler. Lossa ca. 80% av cellerna från 25 cm2 cell kultur kolven genom att skaka kolven och kolla under ljusmikroskop. Sedan överföra 50 procent av cellsuspensionen till en ny 25 cm2 cell kultur kolv och tillåta cellerna att fästa under 15 minuter vid rumstemperatur. Ersätta mediet med 5 mL färsk cellodlingsmedium och växa i en inkubator vid 28 ° C. Passagen celler varje 2 till 3 dagar beroende på celltillväxten.
  2. Beredning av plasmider för cell transfection
    1. Sätt mål DNA fragment (t.ex. Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen och dess borttagning konstruktioner) i pDHsp/V5-hans av PCR-baserade kloning metod11. Kontrollera tillväxten av transformerade kolonier av kolonin PCR med hjälp av PCR-Master Mix (2 X) och pDhsp-F2/Op-IE2R primer inställd. Bekräfta de plasmid sekvenserna av kommersiella sekvensering service.
      Obs: Tabell 1 visar primers för PCR och motsvarande konstruktioner.
    2. Kultur enda sekvenserade bakteriekolonier, som innehåller de ovan nämnda plasmid konstruktionerna (steg 1.2) i 200 mL LB medium som innehåller utvalda antibiotika (50 µg/mL), respektive.
    3. Extrahera plasmidsna från den odlade E. coli med Midi Plasmid Kit enligt tillverkarens instruktioner12.
  3. Förbered plätering medium genom att blanda 1,5 mL cellodlingsmedium och 8,5 mL serumfritt cellodlingsmedium.
  4. Förbereda Actinomycin D (ActD) cellodlingsmedium genom att lägga 1,5 µL av ActD lager (1 mg/mL) i 10 mL cellodlingsmedium (slutlig koncentration = 150 ng/mL). Förvaras vid 4 ° C.

2. övergående proteinuttryck

  1. Cell sådd
    1. Skörda sf9 cellerna genom att skaka kultur kolv, störta och falla cellsuspensionen till 50 mL tub och överföra 10 µL till hemocytometer genom en P10-pipett. Räkna antalet cell under ett ljusmikroskop.
    2. Tallrik 3 × 105 sf9 celler i varje brunn i en 24-well platta under 15 minuter vid rumstemperatur. Ersätta mediet med 0,5 mL av plätering medium.
  2. Transfection av plasmider
    1. Utspädd cell transfection reagens: Späd 8 µL av cell transfection reagens i 100 µL serum-fri cellodlingsmedium och mix av vortexa för 1 s.
    2. Lägg till 2 µg av plasmid DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans) i 100 µL serum-fri cellodlingsmedium och blanda genom vortexa för 1 s (figur 2).
    3. Kombinera den utspädda plasmid DNA och utspädda cell transfection reagens (210 µL), och blanda genom vortexa för 1 s. Inkubera i 30 min i rumstemperatur.
    4. Tillsätt 210 µL av DNA transfection reagens blandningen droppvis på cellerna av P1000 pipett. Inkubera vid 28 ° C i 5 h.
    5. Ersätta plätering medium med 0,5 mL av cellodlingsmedium med P1000 pipett. Tätar 24-väl plattan med tejp och inkubera cellerna vid 28 ° C för 16 h.
  3. Värme chock transfekterade cellerna: satte plattan i 42 ° C vattenbad (flyter på vattenytan). Värm i 30 min och återgå 24-väl plattan till 28 ° C inkubatorn.
  4. Påvisande av proteiner
    1. Efter 1 h eller 5 h värme chock, tvätta cellerna med 0,5 mL av 1 x PBS-bufferten kort tre gånger.
      Obs: Späd 10 x PBS-bufferten till 1 x PBS-bufferten genom att tillsätta 1 mL 10 x PBS-bufferten till 9 mL sterilt ddH2O
    2. Lysera cellerna med 40 µL av 1 x SDS lastning Dye genom pipettering upp och ner.
      Obs: Späd 4 x SDS lastning Dye genom att blanda 30 µL 1 x PBS-bufferten och 10 µL 4 x SDS prov buffert.
    3. Värma protein proverna vid 98 ° C i 10 min i ett värme block, snurra ner för 1 min och lägga på is för Western blot analys.
    4. Western blot-test
      Följ förfarandet i Western blot-analys från Eslami och Lujan13. Kör SDS-PAGE geler14: en gel utsätts Coomassie blå färgning (lastning kontroll för att kontrollera att mängden protein prover laddade i varje väl är lika stora) och andra utsätts för Western blot analys, enligt Eslami och Lujan13 .
    5. Upptäcka V5-taggade fusionsproteinerna med kanin-anti-V5-antikropp (5 mg/mL) (1: 5000 spädning i TBST buffert att arbeta koncentrationen 1 µg/mL) och get anti-kanin IgG-pepparrot konjugat av pepparrotperoxidas (HRP) (0,8 mg/mL) (1:10000 spädning i TBST buffert att arbeta koncentration 0,08 µg/mL).
      Obs: Justera procentandelen av polyakrylamid till 17,5 procent när protein molekylvikten vara < 17 kDa.

3. anti-apoptotiska aktivitet assay

  1. Gen-inducerad cell apoptos: upprepa det ovannämnda förfarandet från 2,1 till 2.3. Samtidig transfect 1 µg av pDHsp/D-rpr/flagga-hans plasmid DNA (innehållande apoptos inducerare genen) med 1 µg av plasmid DNA [pDHsp70/V5-hans vektor (negativ kontroll), pDHsp70-Ac-P35/V5-hans (positiv kontroll), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans, respektive.]. På 5 h efter chock värmebehandling, bedriver cell lönsamhet analysen (figur 2).
  2. Kemisk-inducerad cell apoptos: upprepa det ovannämnda förfarandet från 2,1 till 2.3. I steget 2.1.2 tallrik 1 x 106 sf9 celler i varje brunn i en 6-bra platta. Transfect 4 µg av plasmid DNA [pDHsp70/V5-hans vektor (negativ kontroll), pDHsp70-Ac-P35/V5-hans (positiv kontroll), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans, respektive.]. På 5 h efter värme chock, behandla sf9 celler med 2 mL ActD cellodlingsmedium för 16 h och genomföra cell lönsamhet analysen (figur 2).
    Obs: Minsta volym att täcka ett väl 6-well platta är 1 mL.
  3. Utföra ovanstående anti-apoptotiska aktivitet assay experimenten, inklusive 3.1 och 3.2 i exemplar.

4. cell livskraft assay

  1. Tvätta de behandlade cellerna genom att tillsätta 1 mL 1 x PBS-bufferten för 1 min 3 gånger. Omsuspendera cellerna genom pipettering 1 mL 1 x PBS-bufferten innehåller 0,04% trypan blå och fläckar i 3 min i rumstemperatur. Överföra cellsuspensionen i en 1,5 mL mikrorör.
    Obs: Späd 0,4% trypan blå lösning genom att blanda 9 mL 1 x PBS-bufferten och 1 mL 0,4% trypan blå lösning.
  2. Överföra 10 µL trypan blå-färgade cellsuspension till hemocytometer med en P10-pipett och räkna de livskraftiga intakta cellerna under ett ljusmikroskop.
  3. Statistisk analys
    1. Beräkna den inspelade data och presentera som den medel ± S.D. för alla punkter.
    2. Analysera data med hjälp av Students tvåsidiga t-test av med Microsoft Excel. Definiera statistiskt signifikanta data som P-värdet < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Full längd och andra två truncations (BIR och RING domäner) av Ly-IAP3 från LyxyMNPV var i ökad utsträckning hos sf9 celler, baserat på den värme chock-baserade pDHsp/V5-hans /Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system. Den pDHsp/V5-hans innehöll en Drosophila heat shock protein arrangören, som driver nedströms genuttryck vid en temperatur på 42 ° C tillstånd med hjälp av cellulära transkriptionell faktorer och den översättning system (figur 1)8 ,9,11. Hela teknisk flödesschemat visas i figur 2. Efter 1 h eller 5 h värme chock, var cellerna lyserat med protein prov buffert och utsätts för Western blot-analys att bekräfta proteinuttryck. Resultaten indikerade att de hellånga proteinerna, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR och Ly-IAP3-RING, kunde detekteras i transfekterade celler på antingen 1 h eller 5 h efter värme chock. Dessutom hittades de protein ansamlingar på 5 h efter värme chock (figur 3). Således, enligt uppgifter från protein funktionella analysen utfördes vid den maximala protein uttryck tidpunkten (5 h efter värme chock).

Både gene-inducerad cell apoptos och kemiska-inducerad cell apoptos kunde anpassas till detta system för att utvärdera anti-apoptotiska aktivitet (figur 2). För gene-inducerad cell apoptos var två konstruktioner (apoptos inducerare och mål genen plasmid konstruktioner) samtidig transfekterade i sf9 celler och sedan värme chockad att activite genuttryck. Anti-apoptotiska proteinet Ac-P35 (positiv kontroll) och en apoptos-inducerare protein (D-RPR) uttrycktes det dessutom också använder denna värme chock övergående uttryck systemet.

Efter värme chock började båda gener uttrycks och översättas till proteiner. Jämfört med den vektor/D-RPR, positiv kontroll (Ac-P35/D-RPR) visade hög anti-apoptotiska aktivitet, som nådde upp till 80% av livskraft. Från cellen livskraft resultaten av andra konstruktioner, kunde forskarna jämför anti-apoptotiska aktiviteten till varandra eller den positiva kontrollen (figur 4A). För kemisk-inducerad cell apoptos, var endast en konstruktion transfekterade sf9 celler. Kemikalier (ActD) lades till efter 5 h efter värme chock, och cellernas viabilitet mättes efter 16 h (figur 2). Jämfört med den positiva kontrollen (AC-P35) eller den negativa kontrollen (vector), varje konstruktion visade de olika effekterna på anti-apoptotiska aktivitet (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Diagram- och nukleotidanaloger sekvenser av ly-iap3 relativa plasmid konstruktioner utifrån pDHsp/V5-hans vektor. Start-kodon (ATG) visas i fetstil. Understrykning anger restriktionsenzym skärande webbplatser (HindIII i röd färg; BamHI i blå färg); sekvensen i grön färg indikerar Dhsp70 promotor regionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: flödesschema av värme chock inducerad protein uttryck systemet (pDHsp/V5-hans/sf9 cellsystem). Gen-inducerad cell apoptos och kemiska-inducerad cell apoptos behandlingar indikerades till initsteget (samtidig transfection med apoptos inducerare gen plasmid) eller till det senare steget efter värme chock (kemikalie-inducerad apoptos), respektive, för anti-apoptos assay. Modifierad figur och legend Reproducerad med tillstånd av Springer11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: överuttryck av AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR och Ly-IAP3-RING med värme chock inducerad protein uttryck systemet (pDHsp/V5-hans/sf9 cellsystem). På 1 h eller 5 h post värme chock, var de cell lysates skördas och utsätts för Western blot-analys och SDS/sida. (A) Western blot-analys med α-V5 antikropp och (B) SDS/PAGE fläckade Coomassie blå som lastning kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Livskraft analyser för D-rpr eller Actinomycin D-inducerad apoptos. (A) sf9 celler var transfekterade med pDHsp70/V5-hans vektor (endast Vector) och samtidig transfekterade pDHsp70/drpr/flagga-hans med pDHsp70/V5-hans vektor, pDHsp70/Ac-P35/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-hans, pDHsp70 / Ly-IAP3-RING/V5-hans, respektive. Skillnaderna mellan vektor- och P35 och mellan vektor- och Ly-IAP3 är statistiskt signifikant (t-test; P < 0,05). (B) sf9 celler var transfekterade med antingen pDHsp70/V5-hans vektor eller pDHsp70/Ac-P35/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-RING/V5-hans, respektive, på 5 h efter värme chock, ActD lades och 16 h senare, cellviabiliteten mättes. Skillnaden mellan vektor- och P35 är statistiskt signifikant (t-test; P < 0,05). Modifierad figur och legend Reproducerad med tillstånd av Springer11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Namn Sekvenser
pDHsp-IAP3-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´
pDHsp-IAP3-BamHI-R 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´
iap3-BIR-BamHI-r 5´-CGGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´
iap3-RING-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´
pDhsp70-F2 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´
OP-IE2R 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´

Tabell 1: de primer uppsättningar används för PCR-baserad kloning metod. * De understrukna baspar i DNA anges restriktionsenzym webbplatser. Listan ändrade primer Reproducerad med tillstånd av Springer11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Begreppet värme chock-baserade pDHsp/V5-hans/sf9 cellsystem beskrevs först av Clem et al. 19948. Jämförelse av baculoviral gen arrangören (IE1) och Drosophila hsp70 visade att hsp70 hade en högre effektivitet i mygga celler10. Dessutom på grund av värme chock induktion, kunde tidpunkten för proteinuttryck styras exakt efter värmebehandling chock. Detta system användes sedan för protein funktionella analyser av räkor och nukleopolyedervirus (NPV) IAP proteiner9,11. I detta protokoll, totalt 6 plasmid konstruktioner användes: tre (pDHsp/V5-hans, pDHsp/Ac-p35/V5-hans och pDHsp/D-rpr/flagga-hans) tillhandahölls av Jian-Horng Leu9och de andra tre konstruktionerna (pDHsp-iap3/V5-hans, pDHsp-iap3-BIR/V5-hans, och pDHsp-iap3-RING/V5-hans) konstruerades av Nai et al., 201611. Det verkar att detta arrangören i insekt celler fungerar mer effektivt än baculoviral gen promotorer. Men under manipulation av detta protokoll finns det flera punkter som måste beaktas. Innan plasmid transfection, kontrollera införandet av DNA-sekvensen är viktigt för genuttryck; Således bör det vara smält med den V5 epitop att bilda ett V5-taggade fusionsprotein i slutet av sekvensen mål. Dessutom kunde olika fusion Taggar (dvs., flagga epitop) också vara utformad i pDHsp-baserade vektorn för en bindande in vitro- protein analysmetod. Proceduren förlängning skulle bidra till att ytterligare undersöka protein-protein interaktioner9. Därför kunde den kommersiella V5 polyklonala antikroppen användas för påvisande av proteiner. Transfection förhållandet i olika insekt celler bör testas innan experimentet. Lägre transfection priser kan resultera i icke-detekterbara av proteinuttryck. således en pDHsp vektor som innehåller en lämplig rapport gen (dvsgrön fluorescerar genen) kunde vara transfekterade i insekt celler att utvärdera transfection effektivitet.

Den största begränsningen av denna värme chock uttryck plattform är den protein uttryck. I vissa fall hittades en låg proteinnivå uttryck. Enligt en pilotstudie fanns det ingen signifikant dosberoende effekt som uppstod när mer plasmid DNA var transfekterade sf9 celler (inga data anges). Denna effekt kan således orsakas av ubiquitin proteasom vägen (UPP) eller andra okända mekanismer11. Forskare bör undersöka proteinuttryck i närvaro av de proteasom-hämmare (dvs, MG-132) för att klargöra och recolve denna fråga11. Den andra begränsningen är att hållbar produktion av protein är associerad med rekombinanta virus inte kunde uppnås. Således, en stabilisering och mängden proteinuttryck är också oro för detta system. En tidsförloppet för proteinproduktion bör därför också testas med Western blot-analys innan funktionella analysen. I detta protokoll, Vi jämförde två tidpunkter (1 och 5 h efter värme chock) och observerade ansamling av mål proteinproduktion från 1 tim till 5 h. En ökning av tidpunkter föreslås för att avgöra de bästa tidsinställningsförhållanden för protein funktionella analysen.

För protein uttrycktes också funktionell analys, anti-apoptotiska proteinet Ac-P35 (positiv kontroll) och en apoptos-inducerare protein (D-RPR) använder denna värme chock övergående uttryck systemet. Dessa två proteiner beskrivs som funktionella antagonister9,11,15. Därför kunde den vektor/D-RPR och Ac-P35/D-RPR tjäna som en negativ kontroll och positiv kontroll, respektive. Med denna jämförelse, kunde anti-apoptotiska aktiviteten hos målproteiner bestämmas.

Presenterade protokollet kunde ge en plattform för att uttrycka främmande proteiner snabbare eller längre kunde användas för att utvärdera protein anti-apoptotiska aktivitet i insekt celler. När forskare få de preliminära resultaten av proteinfunktion, kunde detta system användas för fortsatta studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Jian-Horng Leu av Institutet för marinbiologi, National Taiwan Ocean University för att tillhandahålla 3 plasmid konstruktioner. Denna forskning stöddes av Grant 106-2311-B-197-001 - från ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

Tags

Genetik fråga 132 övergående uttryck protein funktionell analys sf9 cellinje Lymantria xylina flera nukleopolyedervirus Ly-inhinbitor av apoptos-3 Drosophila värme chock 70 promotorn pDHsp/V5-hans Drosophilia Reaper actinomycin-D
Övergående uttryck av främmande gener i insekt celler (sf9) för Protein funktionell analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J.… More

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C. H., Nai, Y. S. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter