Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56693
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

Summary

Yabancı proteinler ifade veya anti-apoptotik etkinliğini potansiyel yabancı proteinler ve onların kesilmiş amino değerlendirmek için kullanılabilir bir ısı şok kaynaklı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre), bu iletişim kuralını açıklar asitler böcek hücrelerinde.

Abstract

Geçici gen ifade sistem baculovirus vitro hücre kültür sistemi içinde protein fonksiyonel analiz gerçekleştirmek için en önemli teknolojileri biridir. Bu sistem geçici ifade plazmid baculoviral düzenleyicinin kontrolü altında ifade yabancı genleri için geliştirilmiştir. Ayrıca, bu sistemin fonksiyonel testin kendisi baculovirus veya yabancı proteinler için uygulanabilir. En yaygın ve ticari olarak kullanılabilir geçici gen ifade sistem Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) erken hemen gen (IE) organizatörü göre geliştirilmiştir. Ancak, düşük ifade düzey böcek hücreleri yabancı genlerin gözlendi. Bu nedenle, bir geçici gen ifade sistemi protein ifade artırmak için inşa edilmiştir. Bu sistemde, rekombinant plazmid Drosophila ısı şok 70 (Dhsp70) düzenleyicinin kontrolü altında hedef sıra içerecek şekilde inşa edilmiş. Bu iletişim kuralı bu ısı şok tabanlı pDHsp/V5-O'nun (V5 epitop 6 histidin ile) uygulanması sunar /Spodoptera frugiperda hücre (sf9 hücre) sistemi; Bu sistem sadece gen ekspresyonu böcek hücrelerinde aday proteinlerin anti-apoptotik etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, bu sistem de bir rekombinant plazmid ile transfected ya da iki potansiyel olarak işlevsel antagonistik rekombinant plazmid böcek hücrelerinde ortak transfected. Protokol bu sistemin verimliliği gösterir ve bu teknik pratik olgusu sağlar.

Introduction

İki protein ifade sistemleri yaygın olarak kullanılan proteinler üretmek için: prokaryotlar protein ifade sistemleri (Escherichia coli gen ifade sistemi) ve ökaryot protein ifade sistemleri. Bir popüler ökaryot protein ifade baculovirus ifade vektör sistemi (BEVS)1sistemidir. Baculoviruses ilk dünya çapında biyolojik mücadele etmeni tarım kullanılmıştır ve orman zararlıları. Son birkaç on yıl içinde baculoviruses için protein ifade vektörel çizimler de Biyoteknolojik araçları olarak geliştirilmiştir. Baculoviruses genleri çift iplikçikli dairesel DNA ve saran nucleocapsids2oluşur. , Yetmiş sekiz baculovirus bugüne kadar fazla yalıtır sıralı3olmuştur. Baculoviral gen ifadeleri ana böcek hücrelerinde zamansal çağlayan dayanarak, gen transkripsiyonu gecikme-erken, geç ve çok geç genler4erken acil-dahil olmak üzere dört zamansal cascades sınıflandırılır olabilir.

Böylece çok geç gen rehberleri (Yani, polihedron veya p10 organizatörü) rekombinant baculovirus homolog rekombinasyon tarafından oluşturulan iken hedef genlerin sürücü için kullanılan BEVSs belirlenmiş. İfade içinde böcek hücreleri rekombinant baculovirus tarafından yabancı proteinlerin translasyonel modifikasyonlar (glikoprotein üretimi için uygun) memeli proteinlerin benzer. Böylece, baculovirus yaygın olarak kullanılan5,6,7oldu. Ancak, bir sınırlama böcek hücreleri7farklı N-glikozilasyon yolları varlığıdır.

Bu nedenle, yeni bir baculovirus ifade sistem geçici gen ifade sistem geliştirilmiştir. Bu sistem baculoviral erken hemen rehberleri (yani-1 organizatörü) böcek hücrelerinde sürücü altında yabancı genlerin ifade eder. Bu sistemi kullanarak, hedef protein hemen yani-1 düzenleyicinin kontrolü altında daha iyi N bağlı oligosakkaritler7' kaynaklanan N-glikozilasyon yolu böcek hücrelerinde değiştirirken ifade edilebilir. Ayrıca, baculoviral erken hemen genler konak hücre RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu ve viral herhangi bir faktör harekete geçirmek4için gerek yoktur. Bu nedenle, yabancı proteinler kısa bir süre içinde böcek hücrelerinde ifade edilebilir. Bugüne kadar geçici gen ifade sistem baculovirus vitro hücre kültür sistemi içinde protein işlevsel testleri gerçekleştirmek için kullanılan en önemli teknolojileri biridir. Sistem işlevi ya baculovirus ya da yabancı proteinler, analiz etmek için uygulanır. Piyasada bulunan geçici gen ifade sistemlerinden birini Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 ve OpIE1 rehberleri) erken hemen gen (IE) Organizatör üzerinde temel alır.

Ancak, OpIE organizatörü tabanlı geçici gen ifade sistemi kullanılan8,9,10yaşındayken alt ifade düzeyinde böcek hücreleri yabancı genlerin hala bir sorun oldu. Böylece, başka bir geçici gen ifade sistem Drosophila ısı şok protein 70 (hsp70) gen8,9organizatörü dayalı inşa edilmiştir. Hsp70 organizatörü baculoviral IE organizatörü böcek hücreleri10şokta ısı çarpması çok daha etkili biçimde çalışır. Bu sistemde, Drosophila ısı şok 70 (Dhsp70) organizatörü sürücü altında hedef genlerin ifade edildi. Yabancı genlerin kolayca PCR tabanlı klonlama yöntemlerle geçici gen ifade plazmid kopyalanmış. Ayrıca, gen ekspresyonu için zamanlama kontrolünü ısı şok indüksiyon tarafından gerçekleştirilebilir.

Bu rapordaki yaklaşımı izleyin ve baculoviral gen (apoptosis 3 inhibitörü, Lymantria xylina MNPV dan iap3 ) üç farklı truncations ısı şok tabanlı geçici protein ifade sistemi kullanarak hızlı ve daha fazla ifade bu proteinler anti-apoptotik etkinlik analizi üzerinde uygulamak. Bu sistem de yabancı proteinler hızlı bir şekilde ifade edebilir ya da daha fazla protein anti-apoptotik faaliyet sf9 hücrelerdeki değerlendirilmesi de diğer protein etkinlik deneyleri için uygulanacak potansiyele sahip iken uygulanması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlıkları

  1. Böcek hücre kültürü
    1. Hücre kültür ortamının 50 mL hazırlayın. Bunun için antibiyotik 500 µL ekleyin (Amfoterisin B 0,25 µg/mL, penisilin = 100 birim/mL, streptomisin = 100 µg/mL =) ve ısı inaktive fetal sığır serum serum serbest hücre kültür orta (olmadan FBS veya antibiyotik) 5 mL.
      Not: Fetal sığır serum için kullanmadan önce bir su banyosunda 30 dk 65 ° C'de ısı.
    2. Spodoptera frugiperda korumak (Lepidoptera: Noctuidae), sf9 böcek hücreleri. CA. 25 cm2 hücre kültür şişesi hücrelerinden % 80'i şişeye sallayarak bağlantısını kesin ve ışık mikroskobu altında kontrol edin. Sonra hücre süspansiyon % 50'si yeni 25 cm2 hücre kültür şişesi aktarmak ve hücreleri 15 dakika oda sıcaklığında takmak izin verir. Orta ile 5 mL taze hücre kültür orta yerine ve 28 ° C'de bir kuluçka büyümek Geçiş hücreleri hücre büyümesini bağlı olarak 2-3 günde.
  2. Plazmid hazırlanması için hücre transfection
    1. Hedef DNA parçalarının (Örneğin, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen ve onun silme yapıları) PCR tabanlı klonlama yöntemi11tarafından pDHsp/V5-onun yerleştirin. Kontrol dönüştürülmüş kolonilerin koloni tarafından büyüme PCR PCR Master Mix (2 X) ve pDhsp-F2/Op-IE2R astar kullanarak ayarlayın. Plazmid dizileri ticari sıralama hizmeti tarafından onaylayın.
      Not: Tablo 1 PCR ve karşılık gelen yapıları için kullanılan astar listeler.
    2. 200 mL LB orta içeren olarak anılan plazmid yapılar (Adım 1.2) içeren kültür tek sıralı bakteri kolonileri, antibiyotik (50 µg/mL), sırasıyla seçili.
    3. Plazmid MIDI plazmid seti üreticisinin yönergeleri12göre kullanarak kültürlü E. coli ayıklayın.
  3. Kaplama orta 1,5 mL hücre kültür ortamının ve 8,5 mL serum serbest hücre kültür ortamının karıştırarak hazırlayın.
  4. Hücre kültür orta 10 mL (1 mg/mL) ActD stokunun 1,5 µL ekleyerek Actinomycin D (ActD) hücre kültür ortamı hazırlamak (son konsantrasyonu 150 ng/mL =). 4 ° C'de mağaza

2. protein geçici ifade

  1. Tohum hücre
    1. Kültür şişesi sallayarak sf9 hücre hasat, devirmek ve hücre süspansiyon 50 mL tüp için düşmek ve 10 µL P10 pipet tarafından hemasitometre için transfer. Hafif bir mikroskop altında hücre saymak.
    2. Her şey bir 24-şey plaka 15 dakika oda sıcaklığında5 sf9 hücrelere plaka 3 × 10. Orta orta kaplama 0.5 mL ile değiştirin.
  2. Plazmid transfection
    1. Seyreltik hücre transfection reaktif: 8 seyreltik µL hücre transfection reaktif 100 µL serum serbest hücre kültür orta ve 1 için vortexing tarafından mix s.
    2. Plazmid DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3-yüzük/V5-O'nun) 100 µL serum serbest hücre kültür orta ve karışımı içine 2 µg vortexing 1 için eklemek s (Şekil 2).
    3. Seyreltilmiş plazmid DNA ve seyreltilmiş hücre transfection reaktifi (210 µL) birleştirmek ve oda sıcaklığında 30 dk 1 s. Incubate için vortexing tarafından karıştırın.
    4. DNA transfection reaktif karışımdan dropwise hücreleri üzerine 210 µL P1000 pipet tarafından ekleyin. 28 ° c 5 h için kuluçkaya.
    5. Kaplama Orta hücre kültür P1000 pipet kullanarak Orta 0.5 mL ile değiştirin. Bant ile 24-şey plaka mühür ve 16 h için 28 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  3. Isı şok transfected hücreleri: 42 ° C su banyosunda (su yüzeyinde yüzen) plaka koymak. 30 dk için ısı ve 24-şey plaka 28 ° C kuluçka dönmek.
  4. Protein ifade tespiti
    1. 1 h veya 5 h ısı şok sonra 0.5 mL 1 x PBS arabelleği hücrelerle kısaca üç kez yıkayın.
      Not: 9 mL steril GKD2için O 1 mL 10 x PBS arabelleği ekleyerek 10 x 1 x için PBS arabellek PBS arabellek sulandırmak
    2. 1 x SDS yükleme boya 40 µL hücrelerle yukarı ve aşağı pipetting tarafından parçalayıcı.
      Not: 4 x SDS yükleme boya 30 µL PBS arabellek x 1 ve 4 SDS örnek arabellek x 10 µL karıştırarak oranında seyreltin.
    3. Protein örnekleri için bir ısı blok 10 min 98 ° C'de ısı, 1 dk. için spin aşağı ve Western blot tahlil için buz koymak.
    4. Western blot tahlil
      Western blot tahlil eren ve Lujan13yordamı. SDS-sayfa14jelleri çalıştırın: Coomassie mavi (protein örnekleri her içinde yüklü miktarda de tutara eşit olduğunu kontrol etmek için yükleme denetimi) Boyama tabi bir jel ve diğer Batı tabi blot yöntemi, eren ve Lujan13 göre .
    5. V5 öğesini füzyon protein tavşan anti-V5 antikor (5 mg/mL) (1: 5000 seyreltme konsantrasyonu 1 µg/mL çalışmaya TBST arabelleği) ve keçi Anti-tavşan IgG-horseradish peroksidaz (HRP) eşlenik (0,8 mg/mL) (1:10000 seyreltme çalışma TBST arabelleğe ile tespit konsantrasyon 0,08 µg/mL).
      Not: Polyacrylamide %17.5 yüzdesini ayarlamak zaman olmak protein molekül ağırlığı < 17 kDa.

3. anti-apoptotik etkinliği tahlil

  1. Gene indüklenen hücre apoptosis: 2.3 için 2.1 üzerinden yukarıda belirtilen yordamı yineleyin. Transfect pDHsp/D-rpr/bayrak-O'nun plazmid DNA (içeren apoptosis uyarıcı gen) 1 µg 1 µg plazmid DNA'sı ile birlikte [pDHsp70/V5-O'nun vektör (negatif kontrol), pDHsp70-Ac-P35/V5-O'nun (pozitif kontrolü), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-O'nun, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3-yüzük/V5-O'nun, sırasıyla.]. 5 h sonrası ısı şok tedavisi hücre canlılığı tahlil (Şekil 2) kuralları.
  2. Kimyasal kaynaklı hücre apoptosis: 2.3 için 2.1 üzerinden yukarıda belirtilen yordamı yineleyin. 2.1.2. adımda 1 x 106 sf9 hücreleri bir 6-şey plaka her kuyuya plaka. Plazmid DNA 4 µg transfect [pDHsp70/V5-O'nun vektör (negatif kontrol), pDHsp70-Ac-P35/V5-O'nun (pozitif kontrolü), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-O'nun, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3-yüzük/V5-O'nun, sırasıyla.]. 5 h sonrası ısı şok, ActD hücre kültür orta 16 h için 2mL sf9 hücrelerle tedavi ve hücre canlılığı tahlil (Şekil 2) kuralları.
    Not: 6-şey plaka bir şey kapsayacak şekilde en az 1 mL birimdir.
  3. 3.1 ve 3.2 triplicates dahil olmak üzere yukarıda anti-apoptotik etkinliği tahlil deneyler, gerçekleştirin.

4. hücre canlılığı tahlil

  1. İşlem görmüş hücreleri 3 kez 1 mL 1 x PBS arabelleği için 1 dk ekleyerek yıkayın. Hücreleri %0,04 trypan mavi içeren 1 mL 1 x PBS arabellek pipetting tarafından resuspend ve 3 dakika oda sıcaklığında leke. Hücre süspansiyon 1.5 mL microtube aktarın.
    Not: %0,4 trypan mavi çözüm 9 mL 1 x PBS tamponu ve 1 mL %0,4 trypan mavi çözeltisi karıştırılarak sulandırmak.
  2. Hafif bir mikroskop altında uygun sağlam hücreleri saymak ve 10 µL trypan mavi lekeli hücre süspansiyon hemasitometre P10 pipet ile transfer.
  3. İstatistiksel analiz
    1. Kaydedilen verileri hesaplamak ve mevcut tüm saymak anlamına gelir ± SD olarak.
    2. Microsoft Excel ile öğrencinin iki kuyruklu t-testi ile kullanarak veri analiz. İstatistiksel olarak anlamlı veri Ptanımlamak-değeri < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tam uzunlukta ve diğer iki truncations (BIR ve yüzük etki alanları), Ly-IAP3 LyxyMNPV dan sf9 hücrelerinde ısı şok tabanlı pDHsp/V5-O'nun üzerinde dayalı overexpressed /Spodoptera frugiperda hücre (sf9 hücre) sistem. PDHsp/V5-O'nun hangi hücresel transkripsiyon faktörleri ve çeviri sistemi (şekil 1)8 kullanarak 42 ° C durumu bir ısıda aşağı akım gen ekspresyonu sürücüler bir Drosophila ısı şok protein organizatörü, içerdiği ,9,11. Bütün teknolojik akış çizelgesi Şekil 2' de gösterilmiştir. 1 h veya 5 h ısı şok sonra hücrelerin protein örnek arabellek ile lysed ve protein ifade onaylamak için Western blot tahlil tabi. Sonuçlar tam uzunlukta proteinler, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR ve Ly-IAP3-RING, 1 h veya 5 h sonrası ısı şok, transfected hücrelerdeki tespit edilemedi belirtti. Ayrıca, protein birikimleri 5 h sonrası ısı şok (şekil 3) bulunamadı. Dolayısıyla, verilerine göre en fazla protein ifade süresi noktası (5 h sonrası ısı şok) protein fonksiyonel tahlil gerçekleştirildi.

Apoptozis gen indüklenen hücre ve hücre kimyasal kaynaklı apoptosis anti-apoptotik aktivite (Şekil 2) değerlendirmek için bu sistemi adapte olabilir. Gen-indüklenen hücre apoptosis için iki yapıları (apoptosis uyarıcı ve hedef gen plazmid yapıları) ortak sf9 hücreleri ve sonra ısı activite gen ekspresyonu için şok içine transfected. Ayrıca, anti-apoptotik protein Ac-P35 (pozitif kontrol) ve bir uyarıcı Apoptozis protein (D-RPR) de bu ısı şok geçici ifade sistemi kullanarak ifade.

Isı şoktan sonra her iki gen ifade ve protein çevrilmiş başladı. Vektör/D-RPR için karşılaştırıldığında, olumlu denetim (Ac-P35/D-RPR) canlılık oranı % 80'e kadar ulaştı yüksek anti-apoptotik faaliyet gösterdi. Diğer yapıları hücre canlılığı sonuçlarından, araştırmacılar birbirlerine ya da olumlu denetim (şekil 4A) anti-apoptotik faaliyete karşılaştırabilirsiniz. Kimyasal kaynaklı hücre apoptosis için tek bir yapı sf9 hücrelere transfected. 5 s sonrası ısı şok sonra (ActD) kimyasal madde eklenmiş ve hücre canlılığı 16 h (Şekil 2) sonra ölçüldü. Bu, olumlu denetim (AC-P35) ya da negatif kontrol (vektör), ile her yapı anti-apoptotik etkinlik (4B rakam) üzerinde çeşitli etkileri gösterdi karşılaştırıldığında.

Figure 1
Resim 1: Diyagram ve nükleotid dizisi ly-iap3 göreli plazmid yapıları üzerinde pDHsp/V5-O'nun vektörel tabanlı. Başlama kodonu (ATG) kalın olarak gösterilir. Restriksiyon enzimi kesme siteleri (HindIII; kırmızı renkte altı çizili gösterir BamHI mavi renkli); yeşil renk sırayla Dhsp70 organizatörü bölge gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: ısı şok akış şeması bağlı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre). Gene indüklenen hücre Apoptozis ve kimyasal kaynaklı hücre apoptosis tedavileri olduğunu belirtti ilk adım (apoptosis uyarıcı gen plazmid ile eş transfection) veya daha sonraki adım sonra ısı şok (apoptoz) kimyasal kaynaklı, sırasıyla, için Anti-apoptosis tahlil. Değiştirilen şekil ve efsane Springer11izni ile yayınlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Overexpression AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR ve Ly-IAP3-RING kullanarak ısı şok indüklenen protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre). 1 h veya 5 h mesaj ısı çarpması hücre lysates hasat ve Western blot tahlil ve SDS/sayfa için tabi. (A)Western blot tahlil α-V5 antikor ve (B) SDS/sayfa yükleme denetimi olarak Coomassie mavi lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: D-rpr veya Actinomycin D kaynaklı apoptosis canlılığı deneyleri. (A)sf9 hücreleri ile pDHsp70/V5-O'nun vektör (yalnızca vektör) transfected ve pDHsp70/drpr/bayrak-pDHsp70/V5-O'nun vektör, pDHsp70/Ac-P35/V5-O'nun, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-O'nun, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-O'nun, pDHsp70 ile O'nun co transfected / Ly-IAP3-yüzük/V5-O'nun, anılan sıraya göre. Ve vektör ve Ly-IAP3 vektör P35 arasında istatistiksel olarak anlamlı farklar (t-test; P < 0,05). Hücreleri transfected ya pDHsp70/V5-O'nun vektör veya pDHsp70/Ac-P35/V5-O'nun, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-O'nun, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-O'nun, pDHsp70/Ly-IAP3-yüzük/V5-sırasıyla, ısı şok sonra 5 h ActD eklendi O'nun, ile (B) sf9 ve 16 h daha sonra hücre canlılığı ölçüldü. Vektör ve P35 arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı (t-test; P < 0,05). Değiştirilen şekil ve efsane Springer11izni ile yayınlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adı Dizileri
pDHsp-IAP3-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´
pDHsp-IAP3-BamHI-R 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´
iap3-BIR-BamHI-r 5´-CGGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´
iap3-yüzük-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´
pDhsp70-F2 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´
Op-IE2R 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´

Tablo 1: PCR tabanlı klonlama yöntemi için kullanılan astar kümeleri. * Altı çizili DNA baz çifti restriksiyon enzimi siteleri belirtti. Değiştirilmiş astar liste Springer11izni ile yayınlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Isı şok tabanlı pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre sistemi kavramı ilk Clem ve ark. 19948tarafından tanımlanmıştır. Drosophila hsp70 baculoviral gen Düzenleyici (IE1) ile karşılaştırması gösterdi o hsp70 daha yüksek bir verim sivrisinek hücreleri10dakika sonra vardı. Ayrıca, ısı şok indüksiyon nedeniyle protein ifade zamanlama tam olarak ısı şok tedavi sonrası kontrol. Bu sistem o zaman protein için karides ve nucleopolyhedrovirus (NBD) işlevsel testleri uygulandı IAP proteinler9,11. Bu protokol için toplam 6 plazmid yapıların kullanılmıştır: üç (pDHsp/V5-O'nun, pDHsp/Ac-p35/V5-His ve pDHsp/D-rpr/bayrak-O'nun) Jian-Horng Leu9ve diğer üç yapıların (pDHsp-iap3/V5-O'nun, pDHsp-iap3-BIR/V5-O'nun, tarafından sağlanan ve pDHsp-iap3-yüzük/V5-O'nun) Nai ve arktarafından inşa edildi., 201611. Bu böcek içinde bu organizatörü baculoviral gen Organizatör çok daha etkili biçimde çalışır hücreleri gibi görünüyor. Ancak, bu iletişim kuralını düzenleme sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç nokta vardır. Plazmid transfection önce DNA dizisi ekleme kontrol gen ekspresyonu için önemlidir; Böylece, hedef sıra sonundaki V5 öğesini füzyon protein oluşturmak için V5 epitop ile erimiş. Ayrıca, farklı füzyon Etiketler (Yani, bayrak epitope) vitro protein bağlayıcı tahlil için pDHsp tabanlı vektör de tasarlanabilir. Bu uzantı yordamı daha fazla protein-protein etkileşimleri9araştırmak yardımcı olacaktır. Bu nedenle, ticari V5 poliklonal antikor protein tespiti için kullanılabilir. Transfection oranı farklı böcek hücrelerinde deneme önce test edilmelidir. Transfection oranları daha düşük protein ifadenin non-detectable neden olabilir; Böylece, uygun rapor gen içeren bir pDHsp vektör (Yani, yeşil bulabilsem gen) transfection etkinliğini değerlendirmek için böcek hücrelere transfected.

Önemli Bu ısı şok ifade platformu protein ifade düzey kısıtlamasıdır. Bazı durumlarda, bir düşük protein ifade düzey bulundu. Pilot bir araştırmaya göre ne zaman daha fazla plazmid DNA sf9 hücrelere (veri gösterilmez) transfected oluşan önemli doz bağımlı etkisi vardı. Böylece, bu etkiyi Ubikuitin proteasome yolu (UPP) ya da diğer bilinmeyen mekanizmaları11tarafından neden olabilir. Araştırmacılar protein ifade proteasome inhibitörü (Yani, MG-132) açıklığa kavuşturmak ve recolve huzurunda bu sorunu11incelemek gerekir. Diğer rekombinant virüsler ile ilişkili protein sürdürülebilir üretim değil elde edilebilir kısıtlamadır. Böylece, istikrar ve protein ifade miktarı da bu sistem ile ilgili endişeleri vardır. Bu nedenle, bir zaman ders protein üretiminin de tarafından Western blot tahlil fonksiyonel tahlil önce test edilmelidir. Bu iletişim kuralı, biz iki zaman puan (1 ve 5 ısı şoktan sonra s) karşılaştırıldığında ve hedef protein üretiminden 1 h 5 h birikimi gözlenmiştir. Zaman Puan artış protein fonksiyonel tahlil için en iyi zamanlama koşulları belirlemek için önerilmektedir.

İçin protein fonksiyonel tahlil, anti-apoptotik protein Ac-P35 (pozitif kontrol) ve bir uyarıcı Apoptozis protein (D-RPR) da ifade bu ısı şok geçici ifade sistemi kullanarak. Bu iki protein fonksiyonel antagonistleri9,11,15açıklanmıştır. Bu nedenle, vektör/D-RPR ve Ac-P35/D-RPR bir negatif kontrol ve pozitif kontrol sırasıyla hizmet verebilir. Bu karşılaştırma kullanarak, hedef proteinlerin anti-apoptotik aktivite tespit edilemedi.

Sunulan Protokolü yabancı proteinler daha hızlı bir şekilde ifade etmek için bir platform sağlamak veya daha fazla protein anti-apoptotik etkinlik böcek hücrelerinde değerlendirmek için uygulanabilir. Araştırmacılar protein işlevinin ilk sonuçlar elde sonra bu sistemi daha fazla çalışmalar için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Dr. Jian-Horng Leu, Enstitüsü deniz biyoloji, Ulusal Tayvan Üniversitesi okyanus 3 plazmid yapılar sağlamak için teşekkür ederiz. Bu araştırma tarafından Grant 106-2311-B-197-001 - Bakanlığı bilim ve Teknoloji (en) destek verdi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

Tags

Genetik sayı 132 geçici ifade protein fonksiyonel tahlil sf9 hücre satırı Lymantria xylina birden çok nucleopolyhedrovirus Ly-inhinbitor Apoptosis-3 Drosophila ısı şok 70 organizatörü pDHsp/V5-onun Drosophilia ölüm meleği actinomycin-D
Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J.… More

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C. H., Nai, Y. S. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter