Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’un labyrinthe en t modifié afin d’évaluer l’apprentissage/mémoire fonctionnelle dans l’ischémie cérébrale induite par l’arrêt cardiaque asphyxie.
Abstract
Rappel des faits : Évaluation de légère à modérée troubles cognitifs dans un modèle d’ischémie cérébrale globale (c'est-à-dire un arrêt cardiaque) peut être difficile en raison de la mauvaise locomotion après la chirurgie. Par exemple, les rats qui subissent des interventions chirurgicales et le labyrinthe aquatique de Morris ne subissent peut-être pas capables de nager, annulant ainsi l’expérience.
Nouvelle méthode : Nous avons établi un test du labyrinthe en t mis à jour le comportement alternance spontanée. L’avantage majeur du protocole mis à jour le labyrinthe en t est sa conception relativement simple qui est assez puissante pour évaluer l’apprentissage/mémoire fonctionnelle après ischémie. En outre, l’analyse des données est simple et directe. Nous avons utilisé le labyrinthe en t pour déterminer les déficits d’apprentissage/mémoire rats tant en la présence ou l’absence de légère à modérée (6 min) asphyxie un arrêt cardiaque (ACA). Des rats ont une tendance naturelle à l’exploration et exploreront les bras remplaçant dans le labyrinthe en t, alors que les rats hippocampe-lésés ont tendance à adopter une préférence côté entraînant rapports une diminution spontanée alternance, révélant l’hippocampe-associés apprentissage/mémoire fonctionnelle en présence ou en absence d’ACA.
Résultats : Les groupes ACA ont des taux élevés de préférence de côté et alternances plus faibles par rapport au contrôle.
Comparaison avec les méthodes existantes : l’eau de la Morris et labyrinthe de Barnes sont plus proéminents d’évaluation des fonctions d’apprentissage/mémoire. Toutefois, le labyrinthe de l’eau de Morris est plus stressant qu’autres labyrinthes. Le labyrinthe de Barnes est largement utilisé pour mesurer la mémoire de référence (longue durée), tandis que les déficits neurocognitifs induite par l’ACA sont plus étroitement liés à l’utilisation mémoire (court terme).
Conclusions : Nous avons mis au point une stratégie simple mais efficace pour délimiter le travail de mémoire (court terme) via le labyrinthe en t dans notre modèle d’ischémie cérébrale globale (ACA).
Introduction
Selon l’American Heart Association (2017), un arrêt cardiaque (CA)-mortalité induite se produit toutes les quatre minutes et touche plus de 400 000 personnes par an dans les États-Unis1. Il est bien documenté que CA peut causer des blessures de neuronale cérébrale à la suite de sanguin insuffisant perfusion2,3,4. Lésion cérébrale induite par le CA se produit dans la région sensible à l’ischémie de CA1 de l’hippocampe5,6,7, touchant les neurones qui sont essentielles à l’apprentissage et la mémoire8,9, 10,11,12. En outre, la perte de densité de l’épine dendritique, dans des conditions ischémiques dans l’hippocampe (c.-à-d. les neurones CA1), joue un rôle essentiel dans la mémoire spatiale déficience13,14,15. En raison de ces changements pathologiques après CA, troubles comportementaux tels que : anxiété, dépression, stress post-traumatique et la perte de mémoire sont plus fréquents. Bien qu’il y a eu des progrès dans la technologie médicale (c'est-à-dire un service ambulatoire efficace) qui sont en corrélation avec les taux de survie améliorés CA, la plupart des traitements neuroprotecteurs (à l’exception d’hypothermie) ne parviennent pas à améliorer les résultats fonctionnels après CA16 ,,17. Généralement, les survivants de CA ont une mauvaise qualité de vie et sont accablés avec différentiel médical dépenses16.
Évaluations de la situation cognitive pour ischémie cérébrale par l’intermédiaire de tests comportementaux sont importantes pour déterminer les deux l’efficacité du médicament et en fin de compte développer un essai clinique concluant. Dans les années 1940, Edward Tolman a conçu le premier essai de comportement afin d’étudier la mémoire spatiale axée sur l’hippocampe,18. Par la suite, différents dédales (labyrinthe aquatique de Morris, labyrinthe radial, T - ou labyrinthe en Y et le labyrinthe Barnes) ont été élaborés pour évaluer l’hippocampe apprentissage spatial et la mémoire chez les rats19,20,21,22 ,,23. Un des essais comportementaux plus largement utilisé est le labyrinthe de l’eau de Morris, qui examine l’apprentissage spatial et mémoire chez le rat modèles24. Toutefois, le labyrinthe de l’eau de Morris exige le rat à nager et à exercer le contrôle et la pleine fonction. Pour des expériences telles que le modèle d’un arrêt cardiaque asphyxie (ACA, un modèle de rat de CA), ischémie canulation de l’artère fémorale/veine sont tenus d’obtenir artérielle essentielle, gaz du sang et l’introduction de divers médicaments. Puisque la canulation de l’artère fémorale/veine peut inhiber la mobilité de la jambe rendant de pouvoir le rat nager correctement, le labyrinthe de l’eau de Morris n’est peut-être pas le plus approprié tester des troubles cognitifs en vertu de l’ACA.
Le labyrinthe de Barnes est l’autre test comportemental largement utilisée pour examiner l’apprentissage spatial et la mémoire dans les modèles de rongeurs. Le labyrinthe de Barnes n’exige pas l’effort de motricité complète et le contrôle et donc moins stressant que le labyrinthe de l’eau de Morris. Dans le passé, nous avons effectué des expériences utilisant le labyrinthe Barnes pour déterminer si les différences fonctionnelles d’apprentissage/mémoire se produisent entre contrôle ou imposture que ACA-induite chez les rats. Les données obtenues pour le labyrinthe de Barnes n’avaient pas la résolution pour tester des déficiences cognitives suite légère à modérée ACA due au fait que le labyrinthe de Barnes est largement utilisé pour mesurer la mémoire de référence (long terme)25,26, tandis que Déficits neurocognitifs induite par l’ACA plus étroitement liés à l’utilisation (court terme) mémoire27,28,29,30 suggérant que le labyrinthe de Barnes est moins viable pour évaluer la fonction de mémoire dans notre ACA modèle.
Nous avons donc développé un labyrinthe en t modifié à l’aide spontanée alternance test pour évaluer le travail de mémoire (à court terme) après ACA. Avantage majeur du test modifié du spontanée alternance labyrinthe en t est sa simplicité et la contrainte minimale sur les rats par rapport à d’autres tests comportementaux dû au fait que le labyrinthe en t mis à jour le ne nécessite pas de formation préalable d’animaux, comme bien plus lourd computational analyse ou sous-programmes (c.-à-d. l’imagerie vidéo du rat) comme l’exige le labyrinthe aquatique de Morris et labyrinthe de Barnes. Nous démontrons que le critère d’alternance spontanée en labyrinthe en t modifié est un paradigme du procès comportemental simple et pourtant très efficace qui peut offrir une résolution suffisante pour détecter et évaluer la fonction hippocampe dans les maladies qui causent la perte de mémoire à court terme de manière précise (p. ex. ACA).
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives de la National Institutes of Health et approuvés par le Comité de l’urbanisme (LSU Health Sciences Center-Shreveport) et d’institutionnels animalier pour l’utilisation de mâles Sprague Dawley rats ( 300-350 g, âgés de 9 à 10 semaines). Rats sont à jeun pendant la nuit avant la chirurgie de l’ACA.
1. réglage et conception d’appareils labyrinthe en t
NOTE : Base de la conception du labyrinthe en t sur le diacre et le 'Rawlins 2006 modèle31.
- Concevoir la structure 3D du labyrinthe utilisant SketchUp32. Pour créer une structure 3D de la labyrinthe en t, construire le bras de démarrer avec une longueur extérieure de 200 mm, largeur 165 mm et hauteur de 148 mm pour s’intégrer dans les dimensions d’impression de l’imprimante 3D. Utiliser une épaisseur de 5,5 mm et une épaisseur de plancher de 8 mm.
- Imprimer le labyrinthe à l’aide d’une imprimante 3D (voir la table des matières)32. Si une imprimante 3D n’est pas disponible dans le laboratoire, utiliser d’autres matériaux tels que le bois, panneaux de fibres de moyenne densité, une matière plastique (par exemple le chlorure de polyvinyle), qui peut être achetée dans les magasins de rénovation domiciliaire.
- En raison de restrictions de hauteur dans la zone d’impression, construire les murs du labyrinthe dans deux impressions 3D séparées et de s’unir à l’Assemblée de labyrinthe (c'est-à-dire, une deuxième hauteur de mur a été ajoutée à la section de labyrinthe d’augmenter la hauteur de 140 mm, pour une hauteur de mur total de 280 mm). Chaque base distincte d’impression 3D contenait un « T » en forme de mécanisme de verrouillage, où une section reliée à l’autre.
- À la jonction du bras du début avec les bras de l’objectif, créer une section largeur 165 mm pour rejoindre la largeur du bras démarrer avec celle des bras objectif. Construire les bras de but utilisant une méthode de conception similaire comme le début du bras ; Toutefois, réduire la largeur du bras de 100 mm par la conception du diacre et Rawlins.
- S’il vous plaît voir la Figure 1 pour schéma détaillées/dimensions du labyrinthe en t.
- Inclure une cloison médiane dans la conception, à la jonction du bras de début et de bras de l’objectif. Étendre cette partition du mur arrière de la labyrinthe en t et 200 mm dans le bras de début de diviser les bras de l’objectif. Cette partition a également étendu la hauteur du labyrinthe (Figure 1).
2. asphyxie un arrêt cardiaque (ACA)
- Instruments chirurgicaux de autoclave (121 ° C pendant 15 min) avant le début de la chirurgie. Désinfecter la table d’opération chirurgicale de l’éthanol à 70 % pendant 15 min. de raser les poils d’animaux sur le site de la chirurgie. Appliquer une solution de Bétadine pour surfaces pour une opération chirurgicale de la peau.
- Anesthetization
- Anesthésier les rats avec 4 % isoflurane et 30 : 70 mélange d’O2 et de N2O (300 mL/min O2 et 700 mL/min N2O) par l’intermédiaire de masque.
- Donner les rats l’intubation endotrachéale pour ventilation mécanique (après intubation, les rats étaient reliés à un ventilateur).
- Maintenir l’anesthésie en abaissant l’isoflurane de 4 % à 2 % avec un mélange de 30 : 70 d’O2 et N2O. utiliser la méthode du pincement-réponse afin de déterminer la profondeur de l’anesthésie.
- Appliquer la pommade sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie. Regulae la température du corps par un rongeur coussin chauffant avec une sonde anale comme une référence de la température.
- Intubation endotrachéale
- Place le rat dans la chambre de l’induction. Anesthésier les rats avec 4 % isoflurane et 30 : 70 mélange d’O2 et de N2O.
- Retirer le rat de la chambre de l’induction. Place anesthésiés animal en décubitus dorsal avec face de rat vers le masque d’anesthésie.
- Déplacez doucement la langue soit vers la gauche ou la droite de l’animal avec le pouce gauche et l’index.
- Glisser un cathéter intraveineux flexible de calibre 14 (49 mm de long) sur une aiguille de pipetage calibre 17 pointe émoussée (93 mm de long avec angle de 10 degrés à la pointe de l’aiguille). Introduire l’aiguille de pipetage calibre 17 pointe émoussée dans la trachée.
- Retirez doucement l’aiguille de pipetage 17-calibre de la trachée. Relier l’embase du cathéter 14-GUE au ventilateur. Ajuster le volume systolique ventilateur de 0,67 mL/100 g et de la fréquence respiratoire de 60 respirations/min.
- Maintenir la tête et la température corporelle à 37 ° C pendant toute la procédure par un rongeur coussin chauffant avec une sonde anale comme une référence de la température.
- Fémorale cathétérisme artériel et veineux
- Se raser les cheveux près de la région inguinale (de chaque côté) et appliquer la bétadine pour les surfaces pour une opération chirurgicale de la peau.
- Placé le rat en décubitus dorsal. Faites une incision (10 mm) dans la région inguinale avec ciseaux chirurgicaux.
- Séparer le tissu conjonctif par pinces à pointe émoussée, jusqu'à ce que le ligament inguinal est exposé. Utilisez une pince hémostatique pour saisir le ligament inguinal. L’artère fémorale et la veine se trouvent sous l’arcade crurale.
- Pinces à extrémité arrondie permet de séparer le tissu conjonctif, jusqu'à ce que l’artère fémorale et la veine sont exposés.
- Doucement, séparer le nerf fémoral qui court le long de l’artère fémorale par l’intermédiaire de pinces à pointe fine. Soigneusement, séparer l’artère fémorale et veines comme une unité par l’intermédiaire de pinces à pointe fine.
- Pinces à pointe fine permet de séparer l’artère fémorale de la veine.
- Placer 2 morceaux de 5-0 suture soie (l’un vers la jambe et l’autre vers le corps) en vertu de la veine.
- Faire un noeud lâche sur le côté près du corps. Utilisez une pince hémostatique pour tenir et tirer la suture aussi loin que possible vers les côtés opposés du corps.
- Faire un noeud lâche sur le côté près de la jambe. Tenir et tirer la suture à la jambe par une pince hémostatique pour permettre à la veine remplir de sang.
- Faire une petite incision dans la veine (environ 0,1 mm) de ciseaux micro-dissection (à un angle de 45°). Imprégnez-vous de sang avec de la gaze stérilisée.
- Fixez une seringue de l’aiguille pointe émoussée (remplie avec une solution saline avec 20 héparine U/mL) à un cathéter de PE-50. Remplir le cathéter de PE-50 avec une solution saline avec 20 héparine U/mL. Couper le cathéter de PE-50 avec des ciseaux de dissection à un angle de 45° pour créer un point ou un bien fin. Pinces à extrémité arrondie permet de tenir l’extrémité du cathéter PE-50. Insérez doucement le PE-50 cathéter dans la veine fémorale.
- Après que le cathéter est inséré à fond, lentement administrer 0,1 mL d’héparine/sérum physiologique pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuite. Attacher les nœuds de suture ferme (single-noeud) pour stabiliser le cathéter de PE-50. Garder le cathéter de PE-50 pour continue intraveineuse (IV) de diverses drogues.
- Utilisez une seringue de 1 mL connectée avec un 23 jauge adaptateur stub Luer pour administrer vécuronium bromure (0,67 mg/kg, administré toutes les 10 min) par l’intermédiaire de la veine fémorale pour immobiliser le rat tout au long de la procédure.
- Placer 2 morceaux de 5-0 suture soie (l’un vers la jambe et l’autre vers le corps) en vertu de l’artère.
- Faire un noeud lâche sur le côté près de la jambe. Utilisez une pince hémostatique pour tenir et tirer la suture aussi loin que possible vers la jambe.
- Faire un noeud lâche sur le côté près du corps. Tenir et tirer la suture vers le corps par une pince hémostatique pour permettre l’artère pour remplir de sang.
- Faire une petite incision dans l’artère (environ 0,1 mm) de ciseaux micro-dissection (à un angle de 45°).
- Fixez une seringue de l’aiguille pointe émoussée (remplie avec une solution saline avec 20 héparine U/mL) à un cathéter de PE-50. Remplir le cathéter de PE-50 avec une solution saline avec 20 héparine U/mL. Couper le cathéter de PE-50 avec des ciseaux de dissection à un angle de 45 degrés pour créer une fin point ou sharp. Pinces à extrémité arrondie permet de tenir l’extrémité du cathéter PE-50. Pinces à extrémité arrondie permet de tenir l’extrémité du cathéter PE-50. Insérez doucement le cathéter de PE-50 dans l’artère fémorale.
- Après que le cathéter est inséré à fond, lentement retirer la seringue pour faire en sorte que le cathéter est fonctionnel. Attacher les nœuds de suture ferme (single-noeud) pour stabiliser le cathéter de PE-50. Garder le cathéter de PE-50 pour l’enregistrement continu de gaz de sang et la pression artérielles.
- Procédure d’arrêt cardiaque (ACA) asphyxie
- Ajustez les paramètres physiologiques (c.-à-d. pO2BCP2, pression artérielle et le pH) au besoin en modulant le volume systolique, O2 ou N2O niveaux. Utiliser les limites physiologiques normales de ces paramètres : pO2: 100 mmHg, BCP2: 35-40 mmHg, la pression artérielle : 100 mmHg et pH : 7,4.
- Utiliser une seringue de 1 mL connectée avec un 23 calibre Luer stub adaptateur pour administrer vécuronium bromure (0,67 mg/kg, I.V.) via la veine fémorale et attendre 2 min. Assurez-vous que la tension artérielle est à ou près de 100 mmHg avant d’effectuer l’ACA.
- Induire apnée (6 min) en déconnectant la sonde endotrachéale (embase du cathéter 14-GUE) de la ventilation. Plus bloquer la sonde endotrachéale par une seringue de 1 mL pour apnée complete.
NOTE : Le temps de 6 min asphyxie est défini comme la période comprise entre le débranchement du respirateur et le début de la réanimation. Un arrêt cardiaque complet est défini comme une pression artérielle moyenne inférieure à 10 mm Hg. - Durant les dernières min d’apnée, la fréquence respiratoire du ventilateur à 80 respirations/min et augmentent O2 à 2 L/min avec 0 % de N2O. Cette action va souffler sur n’importe quel restant isoflurane ou N2O restant dans le ventilateur.
- min après apnée, retirez seringue de 1 mL de la sonde endotrachéale. Reconnecter la sonde endotrachéale au ventilateur.
- Utilisez une seringue de 1 mL reliée avec un 23 calibre adaptateur stub Luer pour administrer de l’épinéphrine (0,005 mg/kg, I.V.) via la veine fémorale et administrer massage cardiaque manuel par le pouce, l’index et médius sur la poitrine de l’animal à un léger mouvement circulaire sur le x et axe z (200/min) jusqu’au retour de circulation spontanée (pression artérielle moyenne ≥ 50 mmHg)33,34,35.
- Utilisez une autre seringue de 1 mL relié avec un 23 calibre adaptateur stub Luer pour administrer bicarbonate de sodium (1 meq/kg, I.V.) via la veine fémorale, immédiatement après le retour à une circulation spontanée (50 mmHg ou supérieur),33,34, 35 pour atténuer une acidose respiratoire.
- Sang de mesure gaz à nouveau 10 min après réanimation pour déterminer l’état acido-basique (pH après que ACA devrait être environ de 7,35 à 7.40)
- Utilisez une pince hémostatique pour bloquer l’artère fémorale et la veine. Lentement et délicatement enlever les cathéters artériels et veineux à l’aide de pinces à pointe émoussée. Ligaturer l’artère fémorale/veine avec une suture de soie de 5-0 pour prévenir les saignements. Fermer la peau recouvrant le champ opératoire à l’aide d’une suture de soie de 3-0. Utilisez la technique de suture interrompue afin de minimiser les chances de la réouverture de la plaie.
- Attendez que le rat respire lui-même (habituellement de 30 min à 60 min après réanimation), débranchez le rat du ventilateur et retirez doucement la sonde endotrachéale.
- Place le rat dans l’incubateur de bébé (27 ° C, 50 % d’humidité) pour la nuit. Placer les aliments adoucie (fait en les trempant dans l’eau) et de l’eau dans l’incubateur du bébé du jour au lendemain.
- Transférer le rat dans la cage individuelle et revenir le rat en animalerie avec chow ordinaire et l’eau. Tests de labyrinthe en t commencer 3 jours après ACA.
3. labyrinthe en t
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Préparation animaux
- La veille de la chirurgie (trompe-l'œil ou ACA), gérez tous les rats pendant 5 min. Jamais élever rats de leur cage (480 mm x 250 mm x 200 mm, en plastique transparent cage) quelle manipulation (Figure 2).
- Après avoir manipulé le rat, doucement ramasser le rat par la queue d’une main avec l’autre main soutenant ses "jambes. Qu’ils sautent de la main à la cage (hauteur 100 mm) 5 fois. Séparer chaque rat en cages individuelles, donc ils ne domineront pas pour la nourriture et/ou de lutte.
- Trois jours après l’imposture ou chirurgie de l’ACA (Figure 2), transférer les rats avec la cage dans une pièce calme et sombre avant le début de la première manche. Seulement allumer une lampe de bureau de faible puissance et le placer au coin de la salle d’examen pour maintenir l’éclairage minimum. Laissez le rat de s’adapter à l’obscurité pendant 10 min.
- Effectuer toutes les expériences dans l’après-midi pour éviter tout effet de variation diurne sur les performances des rats'. Ne conseille pas de l’opérateur sur lequel imposture de rat a reçu ou de la chirurgie de l’ACA.
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Alternance spontanée
- Étendre une mince couche de litière (~ 10 mm d’épaisseur) pour couvrir la totalité du sol du labyrinthe. Puis placer le rat sur le bras de démarrer (en bas de la « T »), qui est le point de départ de chacun et permettra de chaque rat 3 min pour explorer le bras gauche ou droit objectif.
- Une fois que le rat s’engage à un bras de but en particulier (les 4 pattes du rat sont entrés le bras de l’objectif), bloquer la « T » de jonction entre le bras de début et le bras de but adverse (Figure 1) pour empêcher le rat dans le bras de but adverse. Laisser le rat dans le labyrinthe pendant 30 secondes, puis ramasser le rat et le placer dans sa cage pendant une période minimale (~ 30 secondes). Puis retirez la « T » de jonction bloquer (125 mm X 230 mm X 65 mm, faite par une imprimante 3D) du labyrinthe en t.
- Placez le rat sur le bras de départ et répétez 3.2.2. Alternance est définie comme : quand le rat dans le bras opposé par rapport à la précédente exécution de36. Avoir des rats effectuer 4 séries par jour comme suit :
1st manche
2ème course
pause de 10 min
3rd exécuter
4ème run - Changer la literie pendant la pause de 10 min et entre les animaux pour éliminer les biais de parfum. Nettoyer le labyrinthe en t avec 75 % d’éthanol suivie d’eau distillée à la fin de chaque journée expérimentale.
- Répétez les étapes 3.2.1. -3.2.4. deux jours de plus (12 pistes au total) comme illustré à la Figure 2.
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Calculs de taux de préférence alternance taux et côté
- Calculer le % alternance et le côté de préférence, où
L : les rats choisissent le bras gauche
R: les rats choisissent le bras droit
Corriger les choix : la 2ème manche est différent du 1st dans un ensemble donné (chaque ensemble contient deux manches)
Choix incorrect : les rats choisissent le même bras semblable à exécution précédente
Exemple :
Jour 1 : L L / L L
Jour 2 : L L / L R
Jour 3 : R L / L L
Alternance : 2 (bon choix) 6 (ensembles totales effectués) * 100 = 33,33 %
Préférence de côté : 10 (L, côté préféré) 12 (totales runs effectués) * 100 = 83,33 %
- Calculer le % alternance et le côté de préférence, où
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Soins post-opératoires :
- Donner les rats buprénorphine (IP de 0,01 mg/kg) toutes les 12 h pendant 2 jours après la chirurgie. Observer des rats jusqu'à 1 h après un arrêt cardiaque.
- Fixer des rats sur le ventilateur et le coussin chauffant jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Pour maintenir la température corporelle des animaux après la chirurgie, placez le rat dans un incubateur à bébé (fixé à 27 ° C, 50 % d’humidité).
- Fournir adoucie chow (élaboré en faisant tremper dans l’eau) aux animaux pour les premières 24 h après la chirurgie. Si les rats n’étaient pas l’eau potable, administrer une solution saline bactériostatique (100 mL/kg/jour, I.P.) jusqu’au point où l’animal récupère l’eau potable librement.
- Donner l’antibiotique topique de rats avec soulagement de la douleur (pommade de bacitracine et de lidocaïne) à toutes les plaies. Ramener des rats dans l’animalerie après qu’ils se remettre complètement.
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Méthode d’euthanasie
- Utiliser 5 % isoflurane et 100 % N2O pour euthanasier les animaux à la fin de l’expérience.
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Representative Results
ACA (ischémie cérébrale globale) provoque principalement travailler (court terme) mémoire déficits28,29. Pour évaluer la fonction de l’apprentissage et la mémoire après ACA, nous avons utilisé le test mis à jour l’alternance spontanée pour évaluer le travail de mémoire (court terme)30. Résultats du test de l’alternance spontanée suggèrent que le taux d’alternance de trois jours consécutifs dans le groupe de l’ACA (26,19 ± 4,96 %) est significativement plus faible par rapport au groupe contrôle (62,96 ± 6,07 %) (* p 0,05) 35 en raison du fait que les rats soumis à ACA développé un biais de côté par rapport au contrôle (± 82,14 4,57 % v. 62,89 ± 2,86 %, * p0.05) (figures 3 a et 3 b)35, ainsi présenté avec taux d’alternance spontanée. Les résultats ont été exprimés comme moyen ± S.E.M. données analysées à l’aide d’ANOVA à suivie de test post hoc37 par la Turquie. p < 0,05 (niveau de confiance de 95 %) a été considérée comme statistiquement significative.
La figure 1. La conception du labyrinthe en t.
La plate-forme en forme de T du labyrinthe (chez le rat) a été construite avec un bras de démarrage de 600 mm x 165 mm et bras objectif 400 mm x 100 mm à l’apex haut du « T ». L’épaisseur des murs était de 5,5 x 8 mm (épaisseur de plancher). Une cloison médiane a été à la jonction du bras sur le bras de l’objectif, début où cette partition étendue du mur arrière du labyrinthe en t et 100 mm dans le bras de départ divisant les bras de l’objectif. Les carrés en pointillés représentent l’emplacement du bloc de jonction « T » qui bloquait soit le bras. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Montage expérimental pour la chirurgie de l’ACA/sham et labyrinthe en t.
Avant le jour de la chirurgie de l’ACA, les rats ont été traitées 4fois (5 min/chaque fois à jour 0) pour acclimater le rat human touch. Après la chirurgie de l’ACA, les rats ont été autorisés à guérir et à stabiliser durant les 3 jours suivants. Après la restauration, les rats a effectué les tests de l’alternance spontanée pendant 3 jours consécutifs (12 pistes, pistes 4/jour). Chaque rat effectue 4 séries par jour. Le montage expérimental est le même pour la chirurgie de l’imposture. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Déficits de mémoire à court terme après ACA.
Une augmentation des taux de préférence de côté peut être observée chez des rats soumis à ACA (un). Taux d’alternance spontanée a été diminuée chez les rats avec ACA par rapport au contrôle (b). Chiffres entre parenthèses indiquent les animaux utilisés par groupe. Les résultats ont été exprimés comme moyen ± S.E.M. * P < 0,05 indique diffère significativement de contrôle. L’analyse statistique a été évalué par ANOVA à avec les post-hoc test de Tukey. Ce chiffre a été modifié de Lee et al., 201735. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Des modifications ont été apportées dans la présente étude comparativement à diacre et 'Rawlins protocole31. L’imprimante 3D a été utilisé pour construire le labyrinthe en t. L’impression 3D fournit des solutions de rechange abordables et rentables de commercialisé en labyrinthe en t. Pour réduire l’anxiété des rats pendant l’essai, le labyrinthe en t a été réalisée dans la chambre noire avec éclairage minimum. Une fois que le rat entré un des bras objectif, nous avons bloqué doucement le bras adverse. Cela évite le stress possible depuis le test, mais aussi des dommages possibles à la queue de rats tout en abaissant la porte guillotine. Tout stress inutile va inhiber la performance de la rat lors des exécutions suivantes. Ainsi, nous avons utilisé un bloc de jonction « T » comme la porte dans la présente étude afin d’éliminer tout bruit de meulage de coulissantes en plastique guillotine au cours de l’essai. Cette étape peut réduire considérablement l’anxiété des rats pendant l’expérience du labyrinthe en t.
L’accoutumance est une étape essentielle pour des études de labyrinthe en t comme rats anxieux ne sont pas motivés à courir dans le labyrinthe. Ainsi, il est impératif de veiller à ce que les rats s’acclimater au contact humain, la hauteur et se déplaçant de la cage pour le labyrinthe avant les expériences. Des rats anxieux font couinement ou sifflement lorsque opérateurs essaient de les toucher. En outre, soucieux de rats soit présentent une longue congélation réponses ou refuser d’exécuter dans le labyrinthe pendant tout le labyrinthe en t expériences. Habituellement, ils passent la plupart du temps dans le bras de démarrer sans explorer le labyrinthe. Si les rats n’exécutent pas dans le labyrinthe, touchez légèrement leur queue et ils fonctionneront. L’autre raison possible est que les rats ont reçu accoutumance insuffisante. Doucement, remettez le rat dans la cage et attendre 10 min diminuer leur anxiété. Si le rat ne parvient pas à terminer la course encore une fois, ce rat est exclus de l’étude. Si les rats ne peut pas terminer une course unique en 3 min, remettre à sa cage et attendez pendant 10 min. Si le rat ne parvient toujours pas à terminer la course, le rat doit être exclu de l’étude. Les rats ne devraient pas effectuer le test pour une longue durée ou la fréquence ou rester dans la salle d’examen pendant plus d’une heure, sinon ils seront arrête de tourner en raison de l’absence de nouveauté.
Des études antérieures ont montré que 70 % des rats pièce gauche ou droite biais38,39. Ce biais latéral s’aggrave performance en labyrinthe en t dans le rat39. Ainsi, nous avons précisé les critères d’inclusion et d’exclusion pour les rats dans la présente étude. Nous avons testé un total de 15 rats ont reçu ACA chirurgie dans notre étude du labyrinthe en t. Le taux moyen d’alternance chez les rats traités ACA est de 29 ± 4 %. Contrôle ou imposture rats n’ayant pas toute blessure hippocampe ou les déficits d’apprentissage/mémoire, nous avons émis l’hypothèse que le contrôle ou rats sham devraient avoir meilleure performance en labyrinthe en t (alternance taux ≥ 29 ± 4 %) par rapport à des animaux traités à l’ACA. Par conséquent, des rats contrôle ou simulacre avec alternance taux < 29 % (le nombre total d’alternance ≤ 1), qui donnent à penser les rats ont la préférence de côté ou n’a pas reconnu dans le labyrinthe devraient être exclues de l’étude. Nous avons appliqué ce critère d’exclusion à 25 rats témoins. 6 d'entre eux (24 %) avec taux de préférence côté élevé (85 ± 3 %) et alternance spontanée faible (inférieur à 29 %) ont été exclus des études.
L’expérience d’alternance spontanée de labyrinthe en t dépend fortement de la tendance naturelle des rats pour explorer la nouveauté. Ainsi, la limitation majeure du protocole spontanée alternance labyrinthe en t est que le rat finit par cesse de fonctionner dans le labyrinthe. Basée sur nos expériences passées, le rat n’est disposé à exécuter dans le labyrinthe pendant trois jours consécutifs. Depuis un arrêt cardiaque asphyxie entraîne principalement des déficits de mémoire à court terme, nous pouvons extrapoler nos résultats récents d’autres blessures/maladies cérébrales (maladie d’Alzheimer, de Parkinson et accident ischémique transitoire) qui sont également liés aux déficits de la mémoire courte.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National instituts de santé/National Institute of Neurological Disorders et accident vasculaire cérébral accorde 1R01NS096225-01-a-1, l’American Heart Association accorde AHA-13SDG1395001413, AHA-17GRNT33660336, AHA-17POST33660174, le Louisiana State University subvention en aide research council, The Malcolm Feist Cardiovascular Research Fellowship et Evelyn F. McKnight Brain Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | MakerBot | Replicator | Fifth generation |
| 3D Printer Filament | Hatchbox | PLA, 1.75 mm filament diameter | |
| 200 Proof Pure Ethanol | Koptec | V1005SG | |
| Sani-Chips | PJ Murphy-Forest Products | Size: 8 to 20 mesh; 2.2 cubic foot/package; autoclavable bags | |
| Rat | Charles River Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Vecuronium bromide | Sun Pharmaceutical | 47335-931-40 | 10 mg |
| Epinephrine | Par Pharmaceutical | 42023-103-01 | Adrenalin Chloride Solution 1 mg/mL, 1:1000 |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection | Pfizer | 00409-2012-32 | 0.3mg/mL |
| SketchUp | Trimble Inc. | 3D modeling software | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | Animals raging in size from mouse to guinea pig (10g to 1kg) |
| PowerLab 8/35 | Adinstruments | PL3508 | 8 analog input channels – 4 of which can be used in differential mode. |
| Bio Amps | Adinstruments | FE132 | The Bio Amp is a galvanically isolated, high-performance differential bio amplifier optimized for the measurement of a wide variety of biological signals such as ECG, EMG and EEG recordings. |
| Quad Bridge Amp | Adinstruments | FE224 | A four-channel, non-isolated bridge amplifier designed to allow the PowerLab to connect to most DC bridge transducers. |
| LabChart 8 | Adinstruments | ||
| ABL80 FLEX CO-OX blood gas analyzer | Radiometer | pH / p CO2 / p O2 | |
| SURFLO Teflon I.V. Catheter | Terumo | sc-361556 | Only use the flexible thin wall catheter (49-mm long) |
| Pipet/Infusion Needle | Hamilton | 7748-03 | 17-gauge; 93-mm long; 10-degree angle |
| Classic T3 Vaporizer | SurgiVet | VCT302 | Classic T3 Isoflurane Funnel Fill |
| ENVIRO-PURE Charcoal Canister | SurgiVet | 32373B10 | Designed to absorb waste anesthetic gas |
| O2 single flowmeter | SurgiVet | 32375B1 | 0-1000 mL |
| N2O Flowmeter | VetEquip | 401721 | 0-4LPM |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter (Sterile) | Becton Dickinson | 427565 | 23 gauge |
| Micro Forceps | Black and Black surgical | B3FRC-18 RM-8 | 7 1/4" (18 cm), 8mm RH, counterweight w/ guide pin 2mm, platform 6 x .3 mm, curved. |
| Halstead Mosquito Forceps | Roboz | RS-7111 | Curved; 5" Length, 1.3 mm tip diameter, 2.1 mm jaw width |
| Mixter Forceps | Roboz | RS-7291 | 5.25" Curved Extra Delicate, 1.1 mm tips |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | Straight, Sharp Points; 9 mm Cutting Edge; 0.15 mm Tip Width; 3 1/2" Overall Length |
| Mayo-Stille Scissors | Roboz | RS-6891 | 5.5" Round Curved |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | 45 Deg Dumoxel Tip Size .10 x .06 mm |
| Olsen-Hegar Combination Scissor And Needle Holder | Roboz | RS-7884 | Cross Serration Tip; 5.5" Length |
| Moloney Forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
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