Summary
Questo protocollo descrive l'uso di un t-labirinto modificato per valutare l'apprendimento/memoria funzionale nell'ischemia cerebrale indotta da arresto cardiaco di asfissia.
Abstract
Priorità bassa: Valutazione da lieve a moderata danno conoscitivo in un modello di ischemia cerebrale globale (cioè arresto cardiaco) può essere difficile dovuto povera locomozione dopo la chirurgia. Ad esempio, ratti che subiscono le procedure chirurgiche e sono sottoposti a labirinto dell'acqua di Morris non possono essere in grado di nuotare, quindi invalidare l'esperimento.
Nuovo metodo: Abbiamo stabilito un test t-labirinto di alternanza spontanea del comportamento modificato. Il principale vantaggio del protocollo t-labirinto modificato è il suo design relativamente semplice che è abbastanza potente per valutare la memoria/apprendimento funzionale dopo ischemia. Inoltre, l'analisi dei dati è semplice e lineare. Abbiamo usato il t-labirinto per determinare i deficit di memoria e apprendimento dei ratti sia in presenza o assenza di lieve a moderata (6 min) arresto cardiaco asphyxial (ACA). Ratti hanno una naturale tendenza per esplorazione ed esploreranno le braccia alternative in t-il labirinto, mentre ratti hippocampal-lesi tendono ad adottare un lato-preferenza con conseguente rapporti di alternanza spontanea in diminuzione, rivelando il hippocampal-correlate memoria/apprendimento funzionale in presenza o assenza di ACA.
Risultati: ACA gruppi hanno maggiori rapporti di preferenza di lato e alternanze inferiore rispetto al controllo.
Confronto con metodi esistenti: The Morris acqua e labirinto di Barnes sono più prominenti per valutare le funzioni di memoria e apprendimento. Tuttavia, il labirinto di acqua di Morris è più stressante di altri labirinti. Il labirinto di Barnes è ampiamente usato per misurare la memoria di riferimento (lungo termine), mentre i deficit neurocognitivi ACA-indotta sono più strettamente connesse all'utilizzo di memoria (a breve termine).
CONCLUSIONI: Abbiamo sviluppato una strategia semplice, ma efficace per delineare la memoria (a breve termine) tramite il t-labirinto di lavoro nel nostro modello di ischemia cerebrale globale (ACA).
Introduction
Secondo l'American Heart Association (2017), arresto cardiaco (CA)-indotto mortalità si verifica ogni quattro minuti e colpisce oltre 400.000 persone all'anno in Stati Uniti d'America1. È ben documentato che CA può causare lesioni di un neurone del cervello a seguito di sangue insufficiente perfusione2,3,4. Lesione cerebrale indotta da CA si verifica nella regione CA1 ischemia-sensibile del ippocampo5,6,7, che interessa i neuroni che sono fondamentali per apprendimento e memoria8,9, 10,11,12. Inoltre, la perdita di densità di spine dendritiche, in condizioni ischemiche nell'ippocampo (cioè neuroni CA1), svolge un ruolo critico nella memoria spaziale danno13,14,15. A causa di queste alterazioni patologiche dopo CA, disturbi comportamentali come: ansia, depressione, disturbo post-traumatico da stress e perdita di memoria sono più prevalenti. Anche se ci sono stati progressi nella tecnologia medica (cioè efficiente servizio ambulatoriale) che correlano con i tassi di sopravvivenza migliorati di CA, la maggior parte dei trattamenti neuroprotettivi (ad eccezione di ipotermia) non riescono a migliorare i risultati funzionali dopo CA16 ,17. Superstiti di CA in genere hanno una scarsa qualità di vita e sono gravati con incrementale medical spendendo16.
Le valutazioni dello stato cognitivo per ischemia cerebrale tramite test comportamentali sono importanti per determinare sia l'efficacia dei farmaci e infine sviluppare un successo clinico. Nel 1940, Edward Tolman progettato la prima prova di comportamento per studiare la memoria spaziale ippocampo-based18. Successivamente, sono stati sviluppati diversi labirinti (cioè Morris acqua labirinto, labirinto radiale, T - o Y-labirinto e labirinto di Barnes) per valutare l'apprendimento spaziale basato su hippocampal e memoria in ratti19,20,21,22 ,23. Uno dei test comportamentali più ampiamente usato è il labirinto di acqua di Morris, che esamina l'apprendimento spaziale e memoria nel ratto modelli24. Tuttavia, il labirinto di Morris acqua richiede il ratto di nuotare e di esercitare controllo e funzione integrale del motore. Per esperimenti di ischemia come il modello di asphyxial arresto cardiaco (ACA, un modello del ratto di CA), incannulazione della vena/arteria femorale sono necessaria per ottenere la pressione del sangue vitale, di gas del sangue e introduzione di varie droghe. Poiché l'incannulamento dell'arteria femorale/vena può inibire la mobilità gamba rendering capacità del ratto di nuotare correttamente, il labirinto di Morris acqua non può essere la più appropriata verificare i danni conoscitivi sotto ACA.
Il labirinto di Barnes è l'altro test comportamento ampiamente usato per esaminare l'apprendimento spaziale e memoria nei modelli del roditore. Il labirinto di Barnes non richiede l'esercizio della funzione integrale del motore e controllo e quindi meno stressante che il labirinto dell'acqua di Morris. In passato, abbiamo effettuato esperimenti utilizzando il labirinto di Barnes per determinare se si verificano differenze di memoria/apprendimento funzionale tra controllo o della falsità contro i ratti ACA-indotta. I dati ottenuti per il labirinto di Barnes non ha avuto la risoluzione per verificare i danni conoscitivi, seguito da lieve a moderata ACA dovuta al fatto che il labirinto di Barnes è ampiamente usato per misurare il riferimento (lungo termine) memoria25,26, mentre Deficit neurocognitive ACA-indotta più strettamente correlati al lavoro (a breve termine) memoria27,28,29,30 suggerendo che il labirinto di Barnes è meno praticabile per la valutazione della funzione di memoria nel nostro ACA modello.
Abbiamo così sviluppato un t-labirinto modificato utilizzando alternanza spontanea test per valutare la memoria (a breve termine) di lavoro dopo ACA. Il vantaggio principale di test modificato per la spontanea alternanza t-labirinto è sua semplicità e il minimo stress sui ratti rispetto ad altre prove del comportamento dovuto al fatto che il t-labirinto modificata non richiede precedente formazione animale, come ben pesante computazionale analisi o sub-routines (cioè dei video imaging del ratto) come richiesto dal labirinto dell'acqua di Morris e labirinto di Barnes. Qui indichiamo che il test di alternanza spontanea t-labirinto modificato è un paradigma di prova del comportamento semplice e ancora altamente efficiente che può offrire una risoluzione sufficiente per accuratamente rilevare e valutare la funzione hippocampal nelle malattie che causano perdita di memoria a breve termine (cioè ACA).
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health e approvate dal comitato di uso (LSU Health Sciences Center-Shreveport) e istituzionali Animal Care per l'utilizzo del maschio (di ratti Sprague Dawley 300-350 g, 9-10 settimane). Ratti sono stati tenuti a digiuno durante la notte prima dell'intervento ACA.
1. t-labirinto apparato design e ambiente
Nota: Basare la progettazione di t-labirinto il diacono e il 'Rawlins 2006 modello31.
- La struttura 3D del labirinto che utilizzano SketchUp32. Per creare una struttura 3D del t-labirinto, costruire il braccio di inizio con una lunghezza esterna di 200 mm, larghezza di 165 mm e altezza di 148 mm per adattarsi entro le dimensioni di stampa della stampante 3D. Utilizzare uno spessore di 5,5 mm e uno spessore di pavimento di 8 mm.
- Stampa il labirinto usando una stampante 3D (Vedi tabella materiali)32. Se una stampante 3D non è disponibile in laboratorio, è possibile utilizzare altri materiali come legno, medium density fiberboard o di plastica (cioè cloruro di polivinile), che possa essere acquistato da depositi domestici di miglioramento.
- A causa di restrizioni di altezza nell'area di stampa, costruire i muri del labirinto in due stampe 3D separati e si uniscono all'Assemblea di labirinto (vale a dire, un secondo muro di altezza è stato aggiunto alla sezione labirinto per aumentare l'altezza di 140 mm, per un'altezza totale della parete di 280 mm). Ogni base di stampa 3D separata contenuta una "T" a forma di meccanismo di bloccaggio, dove una sezione collegato a quello successivo.
- All'incrocio del braccio inizio con le braccia di obiettivo, creare una sezione ampia-165mm per unire la larghezza del braccio inizio con quello delle braccia obiettivo. Costruire le braccia di obiettivo usando un metodo di progettazione simile come il braccio di inizio; Tuttavia, è possibile ridurre la larghezza del braccio fino a 100 mm per il disegno di diacono e Rawlins.
- Per schema/dimensioni dettagliate del t-labirinto, vedere Figura 1 .
- Includono una partizione centrale nel design all'incrocio tra il braccio di inizio e le armi di obiettivo. Estendere la partizione dalla parete di fondo della t-il labirinto e 200 mm nel braccio inizio a dividere le braccia di obiettivo. Questa partizione estesa anche l'altezza del labirinto (Figura 1).
2. asphyxial arresto cardiaco (ACA)
- Strumenti chirurgici autoclave (121 ° C per 15 min) prima dell'inizio della chirurgia. Disinfettare il tavolo operatorio di etanolo al 70% per 15 min. radere i peli di animali presso il sito della chirurgia. Applicare una soluzione di betadine per superfici per l'intervento chirurgico di pelle.
- Amputate
- Anestetizzare ratti con 4% isoflurane e 30: 70 miscela di O2 e N2O (300 mL/min O2 e 700 mL/min N2O) tramite maschera.
- Dare i ratti intubazione endotracheale per la ventilazione meccanica (dopo intubazione, i ratti sono stati collegati ad un ventilatore).
- Mantenere l'anestesia abbassando isoflurano dal 4% al 2% con una miscela di 30: 70 di O2 e N2O. uso il metodo di pizzico-risposta per determinare la profondità dell'anestesia.
- Applicare unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Regulae la temperatura corporea di un roditore Termoforo con una sonda anale come un riferimento di temperatura.
- Intubazione endotracheale
- Posto il ratto nella camera di induzione. Anestetizzare i ratti con miscela di isoflurano e 30: 70 di 4% di O2 e N2O.
- Rimuovere il ratto dalla camera di induzione. Animali anestetizzati posto in posizione supina con la faccia del ratto verso la maschera di anestesia.
- Muovere delicatamente la lingua verso sinistra o destra dell'animale con il pollice sinistro e l'indice.
- Scivolare un catetere endovenoso flessibile di 14-gauge (49 lunghezza mm) sopra un ago di pipettaggio punta smussata 17 calibri (93 mm-lungo con angolo di 10 gradi sulla punta dell'ago). Inserire l'ago di pipettaggio punta smussata 17 calibri nella trachea.
- Estrarre delicatamente l'ago di pipettaggio 17 calibri dalla trachea. Collegare l'hub di catetere 14-misuratore al ventilatore. Regolare volume sistolico ventilatore a 0,67 mL/100 g e la frequenza respiratoria di 60 respiri/min.
- Mantenere la testa e la temperatura corporea a 37 ° C durante l'intera procedura da un roditore Termoforo con sonda anale come un riferimento di temperatura.
- Cateterismo arterioso e venoso femorale
- Radersi i capelli vicino alla zona inguinale (entrambi i lati) e applicare betadine sulla pelle di superfici per l'intervento chirurgico.
- Inserito il ratto nella posizione supina. Fare un'incisione (10 mm) nella zona inguinale con forbici chirurgiche.
- Separare il tessuto connettivo dal forcipe punta smussata fino a quando il legamento inguinale è esposto. Utilizzare una pinza emostatica per afferrare il legamento inguinale. L'arteria femorale e la vena si trovano sotto il legamento inguinale.
- Utilizzare pinze punta smussata per separare il tessuto connettivo fino a quando l'arteria femorale e la vena sono esposti.
- Separare delicatamente il nervo femorale che corre lungo l'arteria femorale tramite pinze a punta fine. Attentamente separare l'arteria femorale e vena come unità tramite pinze a punta fine.
- Utilizzare pinze a punta fine per separare l'arteria femorale dalla vena.
- Posizionare i 2 pezzi di sutura seta 5-0 (uno verso la gamba e l'altra verso il corpo) sotto la vena.
- Fare un nodo sciolto sul lato vicino al corpo. Utilizzare una pinza emostatica per afferrare e tirare la sutura per quanto possibile verso i lati opposti del corpo.
- Fare un nodo sciolto sul lato vicino alla gamba. Afferrare e tirare la sutura verso la gamba tramite una pinza emostatica per consentire la vena a riempirsi di sangue.
- Micro-dissezione Forbici (ad un angolo di 45°), effettuando una piccola incisione nella vena (circa 0,1 mm). Assorbire il sangue con una garza sterile.
- Collegare una siringa con ago smussato punta (riempita con soluzione fisiologica con eparina di 20 U/mL) a un catetere PE-50. Riempire il catetere PE-50 con soluzione fisiologica con eparina di 20 U/mL. Tagliare il catetere PE-50 con le forbici dissezione ad un angolo di 45° per creare un punto o taglienti fine. Utilizzare pinze punta smussata per tenere l'estremità del catetere PE-50. Inserire delicatamente il catetere di PE-50 nella vena femorale.
- Dopo che il catetere è inserito completamente, lentamente somministrare 0,1 mL di eparina/soluzione fisiologica per garantire che non c'è nessuna perdita. Legare la sutura ferma nodi (single-nodo) per stabilizzare il catetere PE-50. Tenere il catetere PE-50 continuo iniettabile per uso endovenoso (IV) di varie droghe.
- Usare una siringa da 1 mL connesso con un 23 calibro adattatore Luer per l'amministrazione di bromuro di vecuronio (0,67 mg/kg, somministrato ogni 10 min) tramite la vena femorale per immobilizzare il ratto durante tutta la procedura.
- Posizionare i 2 pezzi di sutura seta 5-0 (uno verso la gamba e l'altra verso il corpo) sotto l'arteria.
- Fare un nodo sciolto sul lato vicino alla gamba. Utilizzare una pinza emostatica per afferrare e tirare la sutura per quanto possibile verso la gamba.
- Fare un nodo sciolto sul lato vicino al corpo. Afferrare e tirare la sutura verso il corpo tramite una pinza emostatica per consentire l'arteria a riempirsi di sangue.
- Micro-dissezione Forbici (ad un angolo di 45°), effettuando una piccola incisione nell'arteria (circa 0,1 mm).
- Collegare una siringa con ago smussato punta (riempita con soluzione fisiologica con eparina di 20 U/mL) a un catetere PE-50. Riempire il catetere PE-50 con soluzione fisiologica con eparina di 20 U/mL. Tagliare il catetere PE-50 con dissezione Forbici un angolo di 45 gradi per creare un end point o sharp. Utilizzare pinze punta smussata per tenere l'estremità del catetere PE-50. Utilizzare pinze punta smussata per tenere l'estremità del catetere PE-50. Inserire delicatamente il catetere di PE-50 nell'arteria femorale.
- Dopo che il catetere è inserito completamente, lentamente arretrare la siringa per assicurarsi che il catetere sia funzionale. Legare la sutura ferma nodi (single-nodo) per stabilizzare il catetere PE-50. Tenere il catetere PE-50 per la registrazione continua di gas di pressione e sangue arterioso.
- Asphyxial procedura di arresto cardiaco (ACA)
- Regolare i parametri fisiologici (cioè pO2, pCO2, pressione sanguigna e valore pH) modulando volume sistolico, O2 o N2O livelli. Utilizzare gamme normali fisiologiche di questi parametri: pO2: 100 mmHg, pCO2: 35-40 mmHg, la pressione sanguigna: 100 mmHg e pH: 7,4.
- Utilizzare una siringa da 1 mL, collegata con un adattatore Luer 23 gauge per amministrare bromuro di vecuronio (0,67 mg/kg, I.V.) tramite vena femorale e attendere 2 min. Assicurarsi che la pressione del sangue è a o circa 100 mmHg prima di eseguire ACA.
- Indurre apnea (6 min) scollegando il tubo endotracheale (14-calibro catetere) dal ventilatore. Una siringa da 1 mL per garantire completo apnea ulteriormente bloccare il tubo endotracheale.
Nota: Il tempo di 6 minuti asfissia è definito come il periodo tra la sconnessione del ventilatore e l'inizio della rianimazione. Completo arresto cardiaco è definita come una pressione arteriosa media inferiore a 10 mmHg. - Durante gli ultimi minuti di apnea, regolare il ritmo respiratorio del ventilatore a 80 respiri/min e aumentare O2 a 2 L/min con 0% N2O. Questa azione farà esplodere fuori qualsiasi restante isoflurano o N2O rimanenti nel ventilatore.
- min dopo il apnea, rimuovere la siringa da 1 mL dal tubo endotracheale. Ricollegare il tubo endotracheale al ventilatore.
- Usare una siringa da 1 mL connesso con un 23 gauge adattatore Luer per amministrare epinefrina (0,005 mg/kg, I.V.) tramite vena femorale e amministrare le compressioni del torace manuale di pollice, indice e le barrette centrali sul petto dell'animale in un leggero movimento circolare sulla x e asse z (200/min) fino al ritorno di circolazione spontanea (pressione arteriosa media ≥ 50 mmHg)33,34,35.
- Usare un'altra siringa da 1 mL connesso con un 23 gauge adattatore Luer per l'amministrazione di bicarbonato di sodio (1 meq/kg, I.V.) tramite vena femorale immediatamente dopo il ritorno di circolazione spontanea (50 mmHg o superiore)33,34, 35 per alleviare l'acidosi respiratoria.
- Sangue di misura gas ancora 10 min dopo la rianimazione per determinare lo stato acido-base (pH dopo ACA dovrebbe essere circa 7,35 a 7,40)
- Utilizzare una pinza emostatica per bloccare l'arteria femorale e la vena. Lentamente e delicatamente rimuovere cateteri arteriosi e venosi utilizzando pinze punta smussata. Legare la vena/arteria femorale con una sutura seta 5 / 0 per prevenire il sanguinamento. Chiudere la pelle che ricopre il sito chirurgico utilizzando una sutura seta 3-0. Utilizzare la tecnica di sutura interrotta per ridurre al minimo le possibilità che la riapertura della ferita.
- Attendere fino a quando il ratto si respira (solitamente 30 min a 60 min dopo la rianimazione), scollegare il ratto dal ventilatore e rimuovere delicatamente il tubo endotracheale.
- Posto il ratto nell'incubatrice del bambino (27 ° C, 50% umidità) durante la notte. Posizionare il cibo ammorbidito (fatta da li ammollo in acqua) e acqua in incubatrice del bambino durante la notte.
- Trasferire il ratto alla gabbia individuale e riportare il ratto al animale con acqua e cibo regolare. Test t-labirinto iniziare 3 giorni dopo ACA.
3. t-labirinto
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Preparazione degli animali
- Il giorno prima dell'intervento chirurgico (falsità o ACA), gestire ogni ratto per 5 min. Mai elevare ratti dalla loro gabbia (480 x 250 mm x 200 mm, in plastica trasparente gabbia) quando gestione (Figura 2).
- Dopo aver maneggiato il ratto, raccogliere delicatamente il ratto dalla sua coda con una mano con l'altra mano di sostegno suo ' le gambe. Fatele saltare dalla mano alla gabbia (altezza 100 mm) 5 volte. Separare ogni ratto in gabbie individuali, così essi non dominerà per cibo e/o di lotta.
- Tre giorni dopo falsità o chirurgia ACA (Figura 2), trasferire i ratti con la gabbia in una stanza silenziosa e buia prima dell'inizio della prima manche. Solo accendere una lampada di scrittorio di potere basso e posizionarlo nell'angolo della sala prove per mantenere l'illuminazione minima. Consentire il ratto di adattarsi al buio per 10 min.
- Eseguire tutti gli esperimenti nel pomeriggio per evitare eventuali effetti di variazione giornaliera sulle prestazioni dei ratti. Non consigliamo l'operatore il quale ratto ricevuto falsità o chirurgia ACA.
-
Alternanza spontanea
- Stendere un sottile strato di lettiera (~ 10 mm di spessore) per coprire l'intero piano del labirinto. Quindi posizionare il ratto al braccio start (in basso della "T"), che è il punto di partenza di ogni esecuzione e consentire a ciascuno del ratto 3 min per esplorare il braccio destro o sinistro obiettivo.
- Una volta che il ratto si impegna ad un braccio di particolare obiettivo (tutti i quattro zampe del ratto hanno inserito il braccio di obiettivo), bloccare l'incrocio a "T" tra il braccio di inizio e l'avversaria obiettivo (Figura 1) per impedire l'ingresso del braccio avversaria di obiettivo di ratto. Lasciare il topo nel labirinto per 30 secondi, poi prendere il ratto e inserirlo di nuovo nella sua gabbia per un tempo minimo (circa 30 secondi). Rimuovere poi all'incrocio a "T" (125 mm X 230 mm X 65 mm, fatta da una stampante 3D) impediscono il t-labirinto.
- Posizionare il ratto al braccio inizio e ripetere 3.2.2. Alternanza è definita come: quando il topo entra il braccio opposto rispetto al precedente eseguire36. Sono ratti eseguire 4 corse al giorno come segue:
1st run
eseguire 2nd
10-minuti di pausa
eseguire 3rd
eseguire 4th - Cambiare la biancheria da letto durante la pausa di 10 min e tra gli animali per eliminare pregiudizi di profumo. Pulire il t-labirinto con etanolo 75% seguita da acqua distillata alla fine di ogni giornata sperimentale.
- Ripetere i passaggi da 3.2.1. -3.2.4. per altri due giorni (12 piste in totale) come in Figura 2.
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Calcoli di tasso preferenza alternanza tasso e lato
- Calcolare la % di alternanza e il % preferenza di lato, dove
L: i ratti scegliere il braccio sinistro
R: i ratti scegliere il braccio destro
Scelta corretta: la 2nd eseguire è diverso dal 1st in un dato insieme (ogni set contiene due esecuzioni)
Scelta errata: i ratti scegliere lo stesso braccio simile alla precedente esecuzione
Esempio:
Giorno 1: L L / L L
Giorno 2: L L / L R
Giorno 3: R L / L L
Alternanza: 2 (scelte corrette) 6 (totale set eseguito) * 100 = 33,33%
Preferenza di lato: 10 (L, lato preferito) 12 (Totale esecuzioni eseguite) * 100 = 83,33%
- Calcolare la % di alternanza e il % preferenza di lato, dove
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Cure post-operatorie:
- Dare i ratti buprenorfina (0,01 mg/kg IP) ogni 12 h per 2 giorni dopo la chirurgia. Osservare ratti per fino a 1 h dopo l'arresto cardiaco.
- È possibile associare ratti per il ventilatore e il riscaldamento pad finché ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Per mantenere la temperatura corporea degli animali dopo l'intervento chirurgico, posizionare il ratto in un'incubatrice del bambino (impostato a 27 ° C, 50% di umidità).
- Fornire ammorbidito chow (effettuata mediante immersione in acqua) agli animali per le prime 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Se i ratti non erano acqua potabile, amministrare batteriostatico salino (100 mL/kg/giorno, I.P.) fino a che l'animale recupera e acqua potabile liberamente.
- Dare l'antibiotico topico di ratti con sollievo dal dolore (bacitracina e lidocaina pomata) presso tutte le ferite. Spostare nuovamente ratti all'alloggio degli animali dopo recuperano completamente.
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Metodo di eutanasia
- Utilizzare isoflurano 5% e 100% N2O per eutanasia degli animali alla fine dell'esperimento.
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Representative Results
ACA (ischemia cerebrale globale) provoca soprattutto lavorando (a breve termine) memoria deficit28,29. Per valutare la funzione di apprendimento e memoria dopo ACA, abbiamo usato il test modificate alternanza spontanea per valutare lavorando (a breve termine) memoria30. I risultati di test di alternanza spontanea suggeriscono che il tasso di alternanza da tre giorni consecutivi nel gruppo ACA (26,19 ± 4,96%) era significativamente più basso rispetto al gruppo di controllo (62,96 ± 6,07%) (* p0.05) 35 a causa del fatto che i ratti sottoposti ad ACA sviluppato un bias di lato rispetto al controllo (82,14 ± 4,57% v. 62,89 ± 2.86%, * p0.05) (Figura 3a e 3b)35, così presentato con basso tasso di alternanza spontanea. Risultati sono stati espressi come mezzi ± s.e.m. dati analizzati usando il One-way ANOVA seguita da post hoc test37 della Turchia. p < 0.05 (95% intervallo di confidenza) è stato considerato statisticamente significativo.
Figura 1. Il design di t-labirinto.
La piattaforma a forma di T del labirinto (per ratti) è stata costruita con un braccio di inizio 600 mm x 165 mm e armi obiettivo 400 mm x 100 mm all'apice superiore della "T". Lo spessore delle pareti era 5,5 x 8 mm (spessore di pavimento). Una partizione centrale era all'incrocio tra il braccio di inizio per il braccio di obiettivo, dove questa partizione estesa dalla parete di fondo del t-labirinto e 100 mm nel braccio inizio dividendo le braccia di obiettivo. Le piazze punteggiate rappresentano la posizione del blocco di giunzione "T" che bloccato entrambi i bracci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Timeline sperimentale per chirurgia ACA/sham e t-labirinto.
Prima del giorno della chirurgia ACA, ratti sono stati gestiti 4 volte (5 min/ogni volta, al giorno 0) per acclimatare il topo a tocco umano. Dopo l'intervento chirurgico ACA, i ratti sono stati consentiti per guarire e stabilizzare oltre i 3 giorni seguenti. Dopo il recupero, i ratti ha eseguito le prove di alternanza spontanea per 3 giorni consecutivi (12 piste, 4 corse al giorno). Ogni ratto esegue 4 corse al giorno. La timeline sperimentale è lo stesso per la chirurgia di sham. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Deficit di memoria a breve termine dopo ACA.
Un aumento nel tasso di preferenza di lato possa essere osservato in ratti sottoposti ad ACA (a). Tasso di alternanza spontanea è stata diminuita in ratti con ACA rispetto al controllo (b). I numeri tra parentesi indicano gli animali per gruppo. Risultati sono stati espressi come mezzi ± s.e.m. * P < 0.05 indica significativamente differente da controllo. L'analisi statistica è stata valutata mediante ANOVA unidirezionale con test post-hoc di Tukey. Questa figura è stata modificata da Lee et al., 201735. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nello studio presente rispetto al diacono e 'Rawlins protocollo31sono state apportate modifiche. La stampante 3D è stata utilizzata per costruire il t-labirinto. La stampa 3D fornisce alternative economica e remunerativa per commercializzato t-labirinto. Per ridurre l'ansia dei ratti durante la prova, il t-labirinto è stato effettuato in camera oscura con illuminazione minima. Una volta che il topo inserito uno dei bracci di obiettivo, abbiamo bloccato delicatamente il braccio opposto. Questo evita possibili sollecitazioni da test, nonché di possibili danni alla coda dei ratti mentre abbassa la porta a ghigliottina. Qualsiasi inutile stress inibiscono la prestazioni del ratto nelle esecuzioni successive. Così, abbiamo utilizzato un blocco di giunzione "T" come il cancello nello studio presente per eliminare qualsiasi rumore stridente da ghigliottina plastica porte scorrevoli durante la prova. Questo passaggio può ridurre significativamente l'ansia dei ratti durante l'esperimento di t-labirinto.
L'assuefazione è un passo fondamentale per gli studi di successo t-labirinto poiché ansiosi ratti non sono motivati a correre nel labirinto. Pertanto, è imperativo per garantire che i ratti acclimatano al tocco umano, l'altezza e lo spostamento dalla gabbia per il labirinto prima degli esperimenti. Ansioso di ratti rendono cigolio o sibilante suono quando gli operatori tenta di toccarle. Inoltre, ansioso di ratti sia presentano con risposte lungo congelamento o rifiutano di eseguire nel labirinto durante l'intero t-labirinto esperimenti. Solitamente trascorrono la maggior parte del tempo nel braccio inizio senza esplorare il labirinto. Se i ratti non si esegue nel labirinto, toccare delicatamente la loro coda e corrono. L'altra ragione possibile è che i ratti hanno ricevuto insufficiente assuefazione. Delicatamente mettere il topo nella gabbia e attendere 10 min per ridurre la loro ansia. Se il ratto non riesce a completare la corsa ancora una volta, quel ratto è escluso dallo studio. Se i ratti non possono completare una corsa singola in 3 min, tornare alla sua gabbia e attendere per 10 min. Se il ratto non riesce a completare la corsa, il topo deve essere esclusi dallo studio. I ratti non devono eseguire il test per una durata estesa o frequenza o soggiornare in sala prove per più di un'ora, altrimenti si fermeranno in esecuzione a causa della mancanza di novità.
Gli studi precedenti hanno indicato che il 70% dei ratti esibiscono sinistra o destra bias38,39. Questa distorsione laterale peggiora le prestazioni del t-labirinto nel ratto39. Così, abbiamo specificato i criteri di inclusione ed esclusione per i ratti nello studio presente. Abbiamo testato un totale di 15 ratti hanno ricevuto ACA chirurgia nel nostro studio t-labirinto. Il tasso medio alternanza in ratti trattati con ACA è 29 ± 4%. Poiché ratti di controllo o della falsità non hanno alcun pregiudizio hippocampal o i deficit di memoria e apprendimento, abbiamo supposto che il controllo o ratti sham dovrebbero avere prestazioni migliori t-labirinto (alternanza tasso ≥ 29 ± 4%) rispetto agli animali di ACA-trattati. Di conseguenza, ratti di controllo o della falsità con alternanza tasso < 29% (il numero totale di alternanza ≤ 1), che suggeriscono i ratti hanno preferenza di lato o non è riuscito a imparare nel labirinto dovrebbero essere esclusi dallo studio. Abbiamo applicato questo criterio di esclusione per 25 ratti di controllo. 6 di loro (24%) eseguita con alto tasso di preferenza (85 ± 3%) e bassa alternanza spontanea (inferiore al 29%) sono stati esclusi dagli studi.
L'esperimento di alternanza spontanea del t-labirinto dipende fortemente dalla tendenza naturale dei ratti per esplorare le novità. Così, la limitazione principale del protocollo t-labirinto alternanza spontanea è che il topo alla fine smetterà di funzionare nel labirinto. Base alle nostre esperienze passate, il ratto è solo disposto a correre nel labirinto per tre giorni consecutivi. Poiché asphyxial arresto cardiaco si traduce principalmente in deficit di memoria a breve termine, possiamo estrapolare i nostri risultati attuali di altre lesioni/malattie del cervello (cioè la malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson e attacco ischemico transitorio) che sono anche legati alla deficit di memoria breve.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dall'istituti di salute nazionale Istituto nazionale di disturbi neurologici e colpo concedere 1R01NS096225-01A1, l'American Heart Association concede AHA-13SDG1395001413, 17GRNT33660336 AHA, AHA-17POST33660174, il Louisiana State University Grant nel Consiglio di ricerca di aiuto, la compagnia ricerca cardiovascolare Malcolm Feist ed Evelyn F. McKnight Brain Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | MakerBot | Replicator | Fifth generation |
| 3D Printer Filament | Hatchbox | PLA, 1.75 mm filament diameter | |
| 200 Proof Pure Ethanol | Koptec | V1005SG | |
| Sani-Chips | PJ Murphy-Forest Products | Size: 8 to 20 mesh; 2.2 cubic foot/package; autoclavable bags | |
| Rat | Charles River Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Vecuronium bromide | Sun Pharmaceutical | 47335-931-40 | 10 mg |
| Epinephrine | Par Pharmaceutical | 42023-103-01 | Adrenalin Chloride Solution 1 mg/mL, 1:1000 |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection | Pfizer | 00409-2012-32 | 0.3mg/mL |
| SketchUp | Trimble Inc. | 3D modeling software | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | Animals raging in size from mouse to guinea pig (10g to 1kg) |
| PowerLab 8/35 | Adinstruments | PL3508 | 8 analog input channels – 4 of which can be used in differential mode. |
| Bio Amps | Adinstruments | FE132 | The Bio Amp is a galvanically isolated, high-performance differential bio amplifier optimized for the measurement of a wide variety of biological signals such as ECG, EMG and EEG recordings. |
| Quad Bridge Amp | Adinstruments | FE224 | A four-channel, non-isolated bridge amplifier designed to allow the PowerLab to connect to most DC bridge transducers. |
| LabChart 8 | Adinstruments | ||
| ABL80 FLEX CO-OX blood gas analyzer | Radiometer | pH / p CO2 / p O2 | |
| SURFLO Teflon I.V. Catheter | Terumo | sc-361556 | Only use the flexible thin wall catheter (49-mm long) |
| Pipet/Infusion Needle | Hamilton | 7748-03 | 17-gauge; 93-mm long; 10-degree angle |
| Classic T3 Vaporizer | SurgiVet | VCT302 | Classic T3 Isoflurane Funnel Fill |
| ENVIRO-PURE Charcoal Canister | SurgiVet | 32373B10 | Designed to absorb waste anesthetic gas |
| O2 single flowmeter | SurgiVet | 32375B1 | 0-1000 mL |
| N2O Flowmeter | VetEquip | 401721 | 0-4LPM |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter (Sterile) | Becton Dickinson | 427565 | 23 gauge |
| Micro Forceps | Black and Black surgical | B3FRC-18 RM-8 | 7 1/4" (18 cm), 8mm RH, counterweight w/ guide pin 2mm, platform 6 x .3 mm, curved. |
| Halstead Mosquito Forceps | Roboz | RS-7111 | Curved; 5" Length, 1.3 mm tip diameter, 2.1 mm jaw width |
| Mixter Forceps | Roboz | RS-7291 | 5.25" Curved Extra Delicate, 1.1 mm tips |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | Straight, Sharp Points; 9 mm Cutting Edge; 0.15 mm Tip Width; 3 1/2" Overall Length |
| Mayo-Stille Scissors | Roboz | RS-6891 | 5.5" Round Curved |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | 45 Deg Dumoxel Tip Size .10 x .06 mm |
| Olsen-Hegar Combination Scissor And Needle Holder | Roboz | RS-7884 | Cross Serration Tip; 5.5" Length |
| Moloney Forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
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