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Medicine

Percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित Intramyocardial इंजेक्शन और कोशिका प्रसव एक बड़े से नैदानिक मॉडल में

Published: January 21, 2018 doi: 10.3791/56699
* These authors contributed equally

Summary

उपंयास चिकित्सकीय रणनीति कार्डिएक अपक्षयी दवा में व्यापक और विस्तृत अध्ययन बड़े पूर्व नैदानिक पशु मॉडल में जरूरत है इससे पहले कि वे मनुष्यों में उपयोग के लिए विचार किया जा सकता है । यहाँ, हम खरगोशों में एक percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित intramyocardial इंजेक्शन तकनीक का प्रदर्शन करते हैं, जो इस तरह के उपन्यास उपचारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने की परिकल्पना के लिए मूल्यवान है ।

Abstract

सेल और जीन थेरेपी कम इंजेक्शन अंश (HFrEF) के साथ दिल की विफलता की सेटिंग में कार्डियक पुनर्जनन के प्रयोजन के लिए रोमांचक और होनहार रणनीतियों रहे हैं । इससे पहले कि वे उपयोग के लिए विचार किया जा सकता है, और मनुष्यों में कार्यांवित, व्यापक नैदानिक अध्ययन बड़े पशु मॉडलों में आवश्यक सुरक्षा, प्रभावकारिता, और injectate के भाग्य का मूल्यांकन करने के लिए (जैसे, स्टेम सेल) एक बार मायोकार्डियम में दिया । छोटे कुतर मॉडल लाभ प्रदान करतेहैं (उदा., लागत प्रभावशीलता, आनुवंशिक हेरफेर के लिए सुविधा); हालांकि, इन मॉडलों की अंतर्निहित सीमाएं दी, इन निष्कर्षों में शायद ही कभी क्लिनिक में अनुवाद । इसके विपरीत, खरगोश जैसे बड़े पशु मॉडल, लाभ (जैसे, मनुष्यों और अन्य बड़े जानवरों की तुलना में इसी तरह के कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी), whilst एक अच्छी लागत प्रभावी संतुलन बनाए रखने. यहां, हम प्रदर्शन कैसे एक percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित intramyocardial इंजेक्शन (IMI) तकनीक है, जो ंयूनतम इनवेसिव, सुरक्षित है, अच्छी तरह से सहन, और बहुत प्रभावी injectates के लक्षित प्रसव में, कोशिकाओं सहित प्रदर्शन करने के लिए, एक खरगोश मॉडल के मायोकार्डियम के भीतर कई स्थानों में । इस तकनीक के कार्यांवयन के लिए, हम भी एक व्यापक रूप से उपलब्ध नैदानिक इकोकार्डियोग्राफी प्रणाली का लाभ ले लिया है । अभ्यास में डालने के बाद प्रोटोकॉल यहां वर्णित है, बुनियादी अल्ट्रासाउंड ज्ञान के साथ एक शोधकर्ता के प्रयोगों में नियमित उपयोग के लिए इस बहुमुखी और ंयूनतम इनवेसिव तकनीक के प्रदर्शन में सक्षम हो जाएगा, की परिकल्पना परीक्षण के उद्देश्य से खरगोश मॉडल में कार्डिएक पुनर्जन्म चिकित्सकीय की क्षमताओं । एक बार दक्षता हासिल की है, पूरी प्रक्रिया के भीतर किया जा सकता है 25 मिनट के बाद खरगोश anaesthetizing ।

Introduction

सेल और जीन चिकित्सा रोमांचक और कभी HFrEF में घायल मायोकार्डियम को पुनः उत्पन्न करने/मरंमत के लिए रणनीति विकसित कर रहे हैं । कुछ अध्ययनों से प्रभावशीलता की तुलना की है (जैसे, सेल वितरण के विभिंन मार्गों है, जो लगातार intracoronary या नसों में IMI की श्रेष्ठता का प्रदर्शन किया है के प्रकोष्ठ प्रतिधारण दर1,2 , 3 , 4 , 5. इस प्रकार, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि घायल मायोकार्डियम के स्टेम सेल थेरेपी के शोधों मॉडल पर अध्ययन का एक बड़ा अनुपात, एक खुले सीने में प्रत्यक्ष दृश्य के तहत प्रदर्शन किया IMI के माध्यम injectate उद्धार प्रक्रिया6,7 . हालांकि, इस दृष्टिकोण प्रक्रिया है, जो पेरि-प्रक्रियात्मक मृत्यु (अक्सर के तहत रिपोर्ट)8के जोखिम वहन के इनवेसिव प्रकृति सहित कई सीमाएं हैं. इसके अलावा, प्रत्यक्ष दृश्य के तहत एक IMI वेंट्रिकुलर गुहा में अनजाने इंजेक्शन के लिए संभावना को खत्म नहीं करता है । नैदानिक अभ्यास में एक IMI ओपन चेस्ट सर्जरी के दौरान चिकित्सीय कोशिका प्रसव के लिए एक उपयुक्त विधि हो सकता है, जैसे, कोरोनरी धमनी बाईपास भ्रष्टाचार सर्जरी (CABG) के दौरान; हालांकि, यह प्रकिया हो सकता है नहीं हो सेल डिलीवरी के लिए वैश्विक cardiomyopathy में गैर-कोरोनरी मूल (जैसे, HFrEF द्वितीयक करने के लिए anthracycline-प्रेरित cardiomyopathy (AICM)) ।

इसमें कोई शक नहीं है कि कोरोनरी हृदय रोग (IHD) HFrEF का सबसे आम कारण है (~ ६६%)9,10; हालांकि, AICM सहित गैर कोरोनरी cardiomyopathy, अभी भी HFrEF के साथ रोगियों का एक महत्वपूर्ण अनुपात को प्रभावित करता है (३३%)9 . वास्तव में, नैदानिक ऑन्कोलॉजी में हाल ही में प्रगति से अधिक १०,०००,००० अकेले संयुक्त राज्य अमेरिका में कैंसर के जीवित बचे11, यूरोप में एक समान संख्या के अनुमान के साथ, कैंसर रोगियों के सुधार के अस्तित्व की दिशा में एक समग्र प्रवृत्ति के अनुरूप12 ,13. इस प्रकार, गैर-कोरोनरी cardiomyopathy के लिए स्टेम सेल प्रत्यारोपण के रूप में उपंयास उपचार के लाभों की खोज, साथ ही साथ स्टेम सेल डिलीवरी के एक प्रभावी और ंयूनतम इनवेसिव मार्ग के परीक्षण अत्यंत महत्वपूर्ण है, रोगियों की बढ़ती हुई संख्या को देखते हुए cardiotoxicity माध्यमिक से प्रभावित विरोधी दवाओं के लिए ।

नोट की, परिकल्पना परीक्षण स्टेम सेल थेरेपी की मरंमत के लिए लक्ष्य का उपयोग करते हुए अध्ययन/मायोकार्डियम अक्सर छोटे कुतर (जैसेचूहों और चूहों) का उपयोग शामिल है । इन मॉडलों अक्सर रोधगलन के मूल्यांकन के लिए महंगी उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड सिस्टम की आवश्यकता होती है, आमतौर पर रैखिक सरणी ट्रांसड्यूसर जो कुछ निहित संबद्ध सीमाएं (उदा, प्रतिध्वनि)14के साथ सुसज्जित है । हालांकि, ऐसे खरगोश के रूप में अंय मॉडलों, एक बड़े नैदानिक मॉडल का प्रतिनिधित्व, HFrEF में स्टेम सेल उपचार की परिकल्पना परीक्षण के लिए कुछ फायदे हैं । इस प्रकार, चूहों और चूहों के विपरीत, खरगोश एक Ca+ 2 परिवहन प्रणाली और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी कि मनुष्यों और अन्य बड़े जानवरों (जैसे, कुत्तों और सूअरों के जैसा दिखता है बनाए रखने के लिए15,16,17 ,18,19. एक और लाभ, कार्डियक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए अपनी सुविधा अपेक्षाकृत सस्ती और व्यापक रूप से उपलब्ध नैदानिक इकोकार्डियोग्राफी अपेक्षाकृत उच्च आवृत्ति चरण सरणी ट्रांसड्यूसर से सुसज्जित प्रणालियों का उपयोग कर, जैसे, 12 मेगाहर्ट्ज, जैसे वे अक्सर नवजात और बाल चिकित्सा कार्डियोलोजी में इस्तेमाल किया । इन पद्धतियों कला प्रौद्योगिकी के राज्य के साथ उत्कृष्ट echocardiographic इमेजिंग की अनुमति है, और वे सुरीले इमेजिंग20की श्रेष्ठता का लाभ ले । इसके अलावा, कार्डियक अपक्षयी उपचारों की क्षमता का व्यापक परिकल्पना परीक्षण (उदा., स्टेम सेल थेरेपी), उनकी सुरक्षा, प्रभावकारिता, cardiomyogenic क्षमता, साथ ही injectate के भाग्य का मूल्यांकन एक बार में दिया गया मायोकार्डियम, अनिवार्य है इससे पहले कि वे मानव उपयोग के लिए विचार किया जा सकता है, और वे इस तरह के खरगोश17,19के रूप में बड़े पूर्व नैदानिक पशु मॉडल, के उपयोग की आवश्यकता है । यहाँ, हम percutaneous कंट्रास्ट के माध्यम से सेल डिलीवरी के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक का वर्णन-इकोकार्डियोग्राफी निर्देशित IMI एक नैदानिक इकोकार्डियोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर, जो स्टेम सेल प्रत्यारोपण के उद्देश्य से है गैर के लिए चिकित्सा आधारित-कोरोनरी cardiomyopathy20 . हम भी भारत इंक के लाभों का वर्णन (InI, भी चीन स्याही के रूप में जाना जाता है) एक अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट के रूप में और खरगोश दिल में injectate के सीटू अनुरेखक में

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Protocol

इस के साथ साथ वर्णित प्रयोगों मर्सिया, स्पेन के एथिकल रिसर्च कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था, और 2010 के निर्देशन के अनुसार प्रदर्शन किया गया था/ वर्णित चरणों मानक ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल है कि काम की योजना का हिस्सा थे और केवल इस पत्र के साथ वीडियो फिल्माने के प्रयोजन के लिए नहीं किया गया है के तहत प्रदर्शन किया गया ।

1. कोशिकाओं और स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर की तैयारी

नोट: यहां, हम संक्षेप में एक सेल लाइन (मानव भ्रूण गुर्दे २९३ (HEK-२९३)) की तैयारी और अभिकर्मक के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन; हालांकि, कक्ष प्रकार के हित के लिए उपयुक्त कक्ष विशिष्ट प्रोटोकॉल (उदा., स्टेम सेल) ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए ।

  1. बनाए रखने HEK-२९३ उच्च ग्लूकोज Dulbecco में कोशिकाओं संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 1% सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी Glutamine, 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक है, और एक humidified वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन 5% सह2 शामिल . एक बार कोशिकाओं उप-धाराप्रवाह, 1:3 के अनुपात में विभाजित कर रहे हैं ।
  2. मीडिया aspirating द्वारा कोशिकाओं विभाजन शुरू, तो बाँझ फॉस्फेट के साथ एक बार धोने (पंजाब) खारा बफर, अतिरिक्त पंजाबियों को हटाने और फिर 0.5 x Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (5 मिनट, ३७ डिग्री सेल्सियस) के २.५ मिलीलीटर के साथ मशीन ।
    1. DMEM मीडिया का एक खंड जोड़ें (पूरक के रूप में ऊपर वर्णित) प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, और फिर धीरे से कोशिकाओं को अलग करके और धीरे aspirating ऊपर और नीचे एक इलेक्ट्रॉनिक पिपेट के साथ ।
  3. फिर, एक उपयुक्त कंटेनर के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण (उदा., 15-50 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब) । एक स्विंग बाल्टी में केंद्रापसारक (१०० एक्स जी), supernatant त्यागें और दो बार बाँझ पंजाबियों के साथ गोली धो लो ।
  4. ताजा DMEM मीडिया और बीज में एक उपयुक्त कोशिका घनत्व पर गोली reसस्पेंड (उदा, 1 x 106 कोशिकाओं में एक ७५ सेमी2 कुप्पी) में ताजा संस्कृति की कुप्पी या बड़े बर्तन में स्थानीय प्रयोगशाला प्रथाओं के अनुसार ।
    1. मौजूदा मीडिया हर 2 दिन ताजा मीडिया के साथ बदलें ।
      नोट: अभिव्यक्ति वेक्टर pIRES1hyg से व्युत्पंन किया गया था और पहले वर्णित के रूप में निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयोग किया गया21। पी (EGFP) IRES1hyg के द्वारा उत्पन्न किया गया उपक्लोनिंग EGFP सीडीएनए के रूप में BamHI + नोटि से pEGFP-N1 में सम्मिलित BamHI + नोटि पच pIRES1hyg२१.
  5. अभिकर्मक से पहले 1 दिन, बीज HEK-२९३ कोशिकाओं के घनत्व पर ०.५ x 105 कोशिकाओं/12 या 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में सेमी2
  6. अभिकर्मक के दिन, तैयार डीएनए-लिपिड अभिकर्मक एजेंट परिसरों में अलग १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों (1 ट्यूब/
    1. प्रत्येक ट्यूब में कम सीरम माध्यम के २५० µ एल जोड़कर शुरू करें, और फिर 4 µ जी डीएनए (धीरे मिश्रण) जोड़ें ।
    2. तत्पश्चात, एक पहले से तैयार मिश्रण से २५० µ l जोड़ें 10 µ l लिपिड अभिकर्मक रिएजेंट और २५० µ एल की कम सीरम मध्यम, प्रत्येक ट्यूब के लिए (फिर धीरे से मिश्रण).
    3. अंत में, transfections के साथ आगे बढ़ना, 4 एच के लिए डीएनए लिपिड अभिकर्मक रिएजेंट परिसरों के साथ HEK-२९३ कोशिकाओं की मशीन द्वारा, और फिर DMEM माध्यम के साथ प्रतिस्थापित (चरण १.१) ऊपर वर्णित के रूप में पूरक, और एक और ४८ एच के लिए मशीन transfectants के साथ १०० µ जी/एमएल hygromycin बी.
  7. अलग HEK-२९३ ऊपर वर्णित के रूप में trypsin के साथ कोशिकाओं (चरण १.२) । बाँझ पंजाब में कोशिकाओं को धोने के बाद, एक उपयुक्त वाहन में reसस्पेंड (उदा, 10% वी/पंजाब में v InI), 5 x 106/mL. के एक अंतिम कोशिका एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए

2. खरगोश की तैयारी

नोट: खरगोश और IMI के लिए transducer की स्थिति आकृति विज्ञान और पशु के दिल के समारोह का मूल्यांकन करने के लिए इष्टतम नहीं है । इस प्रकार, यह सलाह दी जाती है एक पूर्ण echocardiographic परीक्षा प्रदर्शन करने के लिए20 से पहले IMI (नीचे देखें), और बाद में समय अंक के रूप में प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा परिभाषित किया । यह एक इंजेक्शन प्राप्त होगा कि पशु में दिल की आधारभूत संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए लक्ष्य होगा, और भी दिल के समारोह में IMI के प्रभाव का मूल्यांकन,.

  1. एक अंधा फैशन में इस परीक्षा प्रदर्शन और पशु चिकित्सा आंतरिक चिकित्सा के अमेरिकी कॉलेज के इकोकार्डियोग्राफी समिति के दिशा निर्देशों का पालन और इकोकार्डियोग्राफी के अमेरिकन सोसायटी/ 22 , 23 , 24.
  2. एक साथ 1-सीसा इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) पूरे echocardiographic अध्ययन भर में अनुरेखण प्राप्त करें ।
  3. Anesthetize खरगोश के साथ ketamine 10 मिलीग्राम/किग्रा, medetomidine २०० µ g/kg, इंट्रामस्क्युलर (आइएमएस) इंजेक्शन के साथ संयोजित ।
  4. संज्ञाहरण के प्रशासन के बाद 10-20 मिनट संज्ञाहरण के स्तर को सत्यापित करें ।
  5. एक बाल क्लिपर का उपयोग कर छाती के बाल व्यापक रूप से हटाने (उदा, गर्दन के नीचे उप असिरूप क्षेत्र के लिए) (चित्रा 1a) ।
  6. सही forelimb (mediocubital क्षेत्र) और दोनों हिंद अंगों (mediotibial क्षेत्र) (आंकड़ा 1b) के आंतरिक चेहरे में 1-2 cm2 के अतिरिक्त क्षेत्रों दाढ़ी ।
  7. अंगों के मुंडा क्षेत्रों पर चिपकने वाला ईसीजी इलेक्ट्रोड की प्रक्रिया (चित्रा 1C) के दौरान दिल ताल को तुल्यकालिक मॉनिटर करने के लिए जगह.
  8. एक थर्मल कंबल पर decubitus लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस, अंगों (चित्रा 1C) तालिका से जुड़ी सर्जिकल टेप का उपयोग कर फैलाया के साथ.
    1. सुनिश्चित करें कि कान सिर के पीछे पिछड़े ठोके है/वापस खरगोश के, और एक स्थिति है कि अपने forelimbs से कम है पर, के बाद से इस प्रक्रिया में जानवर के छाती की सही स्थिति को बनाए रखने में मदद करता है ।
  9. जानवर सहज साँस लेने के लिए पूरे प्रक्रिया में चेहरे मास्क द्वारा ऑक्सीजन प्रशासन whilst की अनुमति दें (१००%, 2-3 L/

Figure 1
चित्र 1. IMI के लिए खरगोश की तैयारी । () छाती से क्लिप बाल; () अंगों से बालों को क्लिप; () इलेक्ट्रोड देते है और एक थर्मल कंबल पर फैलाया पैरों के साथ खरगोश की स्थिति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. Percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-खरगोश में निर्देशित IMI तकनीक

  1. chlorhexidine-आधारित समाधान के साथ छाती की त्वचा को साफ और संक्रमित करें ।
    1. पूरी प्रक्रिया में एक रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें, वर्तमान सबसे अच्छा अभ्यास के अनुसार ।
    2. जब भी संभव हो, और अगर यथोचित व्यवहार्य, सहित एक पूरी तरह से बाँझ प्रक्रिया, प्रदर्शन, लेकिन तक सीमित नहीं, इस तरह के गाउन के रूप में बाँझ सामग्री का उपयोग, दस्ताने, सर्जिकल घाव कपड़ा, मेज के लिए बाँझ ड्रेसिंग सामग्री, साथ ही एक बाँझ अल्ट्रासाउंड transducer कवर और बाँझ अल्ट्रासाउंड जेल । यह एक न्यूनतम पशु प्राप्त करने के लिए रोगजनकों शुरू करने के जोखिम को कम करेगा IMI, और नैदानिक सेटिंग में मानक अभ्यास है (उदा., हृदय पंचर के दौरान) ।
      नोट: यह हमेशा स्थानीय संस्था और अभ्यास के देश के लिए लागू पशु अनुसंधान के स्थानीय और राष्ट्रीय विनियमों के साथ लाइन में आगे बढ़ना करने के लिए सिफारिश की है ।
  2. अल्ट्रासाउंड संचरण जेल छाती और/या transducer करने के लिए लागू करें, और प्रयोगकर्ता की गर्दन के आसपास transducer कॉर्ड के साथ, पशु के दिल है, जो अक्सर शरीर रचना विज्ञान कल्पना और IMI के लिए योजना बनाने के लिए उपयोगी है की एक त्वरित विंडो स्कैन करते हैं ।
  3. 4th-6th पसलियों के बीच अंतरिक्ष, 2-3 सेमी दूर transducer पर मैन्युअल रूप से वक्ष दीवार के दाईं ओर के संबंध में ~ ९० ° की घटनाओं का एक कोण के साथ सही parasternal लाइन (चित्रा 2a).
  4. इल्लों मांसपेशियों के स्तर पर एक संशोधित लघु अक्ष देखने के अनुकूलन के लिए पसलियों के बीच अंतरिक्ष के साथ ही इसके anteroposterior और dorsoventral कोण के सापेक्ष transducer के स्थान को समायोजित करें । इस दृश्य में पहचानें सम्यक निलय (RV), वाम निलय (LV), interventricular पट (IVS), पीछे की दीवार (पीडब्लू), साथ ही अग्रपाश्विक (AL) और posteromedial (पीएम) इल्लों मांसपेशियां (चित्रा बीसी).
    1. काफी गहराई से प्रणाली पर उचित नियंत्रण का उपयोग करके देखने की एक विस्तृत क्षेत्र है (उदा., बटन, डायल) ।
    2. इस दृश्य में एक सममित छवि प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से ध्यान देना, साथ ही endocardial और epicardial आकृति के उचित भेदभाव, और, यदि आवश्यक हो, छवि अनुकूलन नियंत्रण के माध्यम से समायोजित (उदा, लाभ) ।
  5. एक बार जब इष्टतम echocardiographic देखने (चित्रा बी) प्राप्त किया है), प्रक्रिया के बाकी भर में इस स्थिति को बनाए रखने, whilst एक दूसरे ऑपरेटर प्रदर्शन करता है IMI (नीचे देखें) ।
    1. transducer होल्डिंग Whilst, transducer अभिविन्यास निशान छुपा से बचने, जो हमेशा आगे का सामना करना चाहिए, इस प्रकार बाद में कदम (चित्रा 2a, सी) में सुई के साथ अपने संरेखण की अनुमति.
  6. एक 24 जी सुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी के साथ, transducer के संबंध में एक सममित मिरर स्थिति में बाईं hemithorax की त्वचा के लिए सुई बंद जगह । फिर, मैन्युअल रूप से सुई transducer अभिविन्यास चिह्न के साथ एक कोण पर संरेखित करें ~ ९० ° (चित्रा 2c), और धीरे-धीरे त्वचा के माध्यम से और छाती गुहा में सुई अग्रिम.
    नोट: इस स्थिति और अभिविन्यास में percutaneous सुई प्रविष्टि अल्ट्रासाउंड बीम (चित्रा 2d, ) के विमान में सुई के दृश्य की सुविधा है, इस प्रकार वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति है और, जब आवश्यक, के समायोजन मायोकार्डियम (चित्रा 2g, H) के लक्ष्य क्षेत्र के सापेक्ष सुई का स्थान.
  7. लक्ष्य स्थान पर टिप के साथ, धीरे injectate (इंजेक्शन साइट प्रति ०.२५ मिलीलीटर करने के लिए) 10-30 एस के भीतर (चित्रा 2E), धीरे whilst और धीमी गति से इंजेक्शन के दौरान सुई वापस लेने मायोकार्डियम इलाज की हद तक बढ़ाने के लिए उद्धार ।
    1. का प्रयोग करें 10% (v/v) पंजाब में तकनीक के मानकीकरण के लिए पतला है, और एक सीटू अनुरेखक में क्षमता प्राप्त whilst के रूप में, के रूप में अच्छी तरह के रूप में सकल विकृति विज्ञान और histopathology द्वारा मायोकार्डियम के भीतर सभी चार IMI साइटों के सफल लक्ष्यीकरण की पुष्टि करने के लिए (देखें प्रतिनिधि परिणाम) । एक बार योग्यता हासिल की है, InI एक उपयुक्त वाणिज्यिक अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है अगर वांछित ।
      नोट: 10% (v/v) के साथ या तो transmural hyperechogenicity में मायोकार्डियम परिणामों (यानी, इको उज्ज्वल उपस्थिति) में इंजेक्शन (चित्रा 2E, एफ) के लक्ष्य साइट पर कोशिकाओं के साथ या उसके बिना में पतला InI का वितरण । क्षणिक मंदी या दिल की दर का त्वरण, समयपूर्व वेंट्रिकुलर संकुचन के साथ जुड़े (जैसे, पृथक, दोहे और जुड़वां) अक्सर epicardium के साथ सुई के पहले संपर्क से भी मनाया जाता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से के दौरान और/या शीघ्र ही IMI के बाद । हालांकि, कोई जीवन धमकी ताल विकारों विकसित कर रहे हैं, और तीव्र प्रतिकूल प्रभाव शायद ही कभी ०.२५ मिलीलीटर (१.२५ एक्स 106 कोशिकाओं) IMI इंजेक्शन साइट प्रति injectate का उपयोग कर मनाया जाता है ( प्रतिनिधि परिणाम और चर्चादेखें) ।
  8. सुई की घटनाओं के कोण में सूक्ष्म परिवर्तन करने के लिए आवश्यक के रूप में चार लक्ष्य IMI साइटों में से प्रत्येक के लिए ०.२५ मिलीलीटर के इंजेक्शन पूरा करने के लिए (बाईं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार (LVFW) में तीन और IVS में से एक) ।
  9. percutaneous कन्ट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित IMI प्रक्रिया को पूरा करने के बाद, दिल ताल का मूल्यांकन (उदा., सीरियल ईसीजी ट्रेस और/या 24 एच Holter ईसीजी) के माध्यम से, और के अभाव की पुष्टि करने के लिए धारावाहिक खिड़की echocardiographic स्कैन प्रदर्शन जटिलताओं, जब तक पशु पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है, और केवल तब एक प्रकाश चक्र कमरे में स्थानांतरण ।
    1. यहां, हम 24 एच Holter ईसीजी का उपयोग 24 ज के लिए दिल ताल पर InI के साथ IMI के प्रभाव पर नजर रखने के लिए । इस के लिए, हम सामान्य phenotype के साथ 6 खरगोशों के एक समूह की तुलना (सामान्य समूह) और 6 खरगोशों के एक समूह है कि डॉक्सोरूबिसिन के नसों में प्रशासन प्राप्त (एक cardiotoxic anthracycline दवा, आमतौर पर कैंसर के उपचार के लिए इस्तेमाल किया; DOX समूह) की एक खुराक पर 2 मिलीग्राम/kg/सप्ताह के लिए 8 सप्ताह, और फिर दोनों साथियों के साथ IMI प्राप्त किया ।

Figure 2
चित्र 2 . Percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-खरगोश में निर्देशित intramyocardial इंजेक्शन । () सही hemithorax में transducer के एक कोण पर स्थान ~ ९० ° । () खरगोश में इल्लों की मांसपेशियों के स्तर पर दिल के एक parasternal लघु अक्ष दृश्य (PSSX) की प्रतिनिधि छवि । () transducer ओरिएंटेशन मार्क के सापेक्ष ~ ९० ° के कोण पर सुई का संरेखण । () दिल के एक PSSX दृश्य में लक्ष्य स्थल पर सुई का स्थान (ध्यान दें कि सुई अल्ट्रासाउंड बीम के विमान में आसानी से visualized है) । ( और एफ) भारत स्याही के साथ intramyocardial इंजेक्शन पर लक्ष्य साइट पर hyperechogenicity के प्रदर्शन (ऐरोहेड transmural hyperechogenicity पर प्रकाश डाला) । () LV चैंबर में सुई का आकस्मिक स्थान (ऐरोहेड सुई शाफ्ट पर प्रकाश डाला). () एल. वी. मुक्त दीवार के लिए सुई का जमाव (ऐरोहेड सुई शाफ्ट पर प्रकाश डाला) । RV = सम्यक निलय; LV = वाम निलय; IVS = interventricular पट; पीडब्लू = पीछे दीवार; अल = अग्रपाश्विक इल्लों बलवान; PM = posteromedial इल्लों बलवान. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

4. पद IMI िरा

  1. खरगोशों से दिल के ऊतकों के नमूनों की histopathological विश्लेषण प्रदर्शन ।
    1. 10% formaldehyde में 24 घंटे के लिए ऊतक फिक्स, इस प्रकार के रूप में इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने के साथ निर्जलीकरण के बाद:
      • ७०% (६० मिनट) में 1x
      • ९५% इथेनॉल में 1x/5% मेथनॉल (६० मिनट)
      • १००% (६० मिनट) में 1x
      • १००% (९० मिनट) में 1x
      • १००% (१२० मिनट) में 1x
      नोट: उपरोक्त सभी मशीन कमरे के तापमान (आरटी) में आयोजित की जाती हैं । फिर, १००% xylene (1 एच, आरटी) के साथ दो बार स्थानापन्न, और अंत में दो चरणों में तेल में एंबेड (६० मिनट, ५८ ° c)25
    2. 4-5 µm ऊतक अनुभागों को एक microtome25के साथ निष्पादित करें । स्लाइड पर अनुभाग माउंट ।
    3. hematoxylin-eosin और Masson के trichrome तरीकों25,26,27के साथ धुंधला प्रदर्शन ।
  2. प्रत्यारोपण दिल से ऊतक वर्गों में, EGFP (+) HEK-२९३ कोशिकाओं का पता लगाने के लिए immunohistochemistry प्रदर्शन (उदा., avidin-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) विधि का उपयोग करके), संक्षेप में:
    1. De-मोम 4-5 µm में मोटी दिल वर्गों १००% xylene (10 मिनट, आरटी पर) । इथेनॉल एकाग्रता समाधान कम (१००% (2 मिनट) में 2x के साथ धोने से हाइड्रेट ऊतक; ९५% में 2x (2 मिनट), ७०% (2 मिनट); 1x में ५०% (2 मिनट); 1x में 30% (2 मिनट); 1x ddH2O (2 मिनट)) आरटी में ।
    2. १०० µ एल के साथ वर्गों को कवर करके अंतर्जात peroxidase निषेध प्रदर्शन 3% एच22 मेथनॉल में पतला (एच22के 30% शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ तैयार है, और जोड़ने मेथनॉल ५० मिलीलीटर की कुल मात्रा तक) ( 30 मिनट की मशीन, आर टी), और फिर Tris बफर खारा के साथ विसर्जन से धो (टीबीएस पीएच ७.६) ।
    3. एंजाइमी उपचार के माध्यम से प्रतिजन बेपर्दा प्रदर्शन, ०.१% Pronase के १०० µ एल के साथ वर्गों को कवर (०.०१ जी Pronase 10 मिलीलीटर टीबीएस में पतला के साथ तैयार) (मशीन 12 मिनट, आर टी), तो टीबीएस के साथ धो (5 मिनट, आर टी) ।
    4. (30 मिनट, आरटी) स्लाइड प्रति १०० µ एल का उपयोग (टीबीएस में 10% पर सामांय बकरी सीरम) को अवरुद्ध समाधान में मशीन, और टीबीएस (5 मिनट, आरटी) के साथ धो लो ।
    5. चिकन एंटी ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) प्राथमिक एंटीबॉडी (टीबीएस में 1:500) (1 एच, 30 डिग्री सेल्सियस), और टीबीएस (5 मिनट, आरटी) के साथ धोने के रूप में के साथ मशीन ।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी biotinylated बकरी-विरोधी चिकन आईजीजी (टीबीएस में 1:250) (1 एच, 30 डिग्री सेल्सियस), और फिर टीबीएस (5 मिनट, आरटी) के साथ धो के साथ मशीन ।
    7. avidin-बायोटिन जटिल (20 मिनट, 30 डिग्री सेल्सियस), और फिर 3, 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (ढाब) (आरटी, 5-10 मिनट) का उपयोग कर लेबल के साथ मशीन ।
    8. अंत में, (30% (2 मिनट) में 1x इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने में धुलाई द्वारा निर्जलीकरण; ५०% (2 मिनट) में 1x, ७०% (2 मिनट) में 1x; ९५% (2 मिनट) में 2x; RT पर १००% (2 min)) में 2x, hematoxylin-eosin विधि का उपयोग कर counterstain वर्गों25, और उसके बाद माउंट आवरण स्लाइड । सकारात्मक, नकारात्मक और साथ ही isotype नियंत्रण शामिल हैं ।
      नोट: संक्षिप्त प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित सामान्य immunohistochemistry उपयोग के लिए इरादा नहीं है; ब्याज और शर्तों के ऊतकों के लिए अनुकूलन आवश्यक है ।

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Representative Results

Percutaneous विपरीत इकोकार्डियोग्राफी-InI के साथ निर्देशित IMI:

प्रोटोकॉल का उपयोग ऊपर वर्णित है, और एक बार सुई की नोक की इष्टतम स्थिति इकोकार्डियोग्राफी द्वारा पुष्टि की और इंजेक्शन शुरू किया गया था, transmural hyperechogenicity (10% वी/पंजाब में) (चित्रा 2E) InI के वितरण के दौरान मनाया गया , और साथ ही शीघ्र ही लक्ष्य क्षेत्र (चित्रा 2F) को IMI के बाद । जब IMI तुरंत इच्छामृत्यु के बाद और दिल हटा दिया गया था, InI की जमा आसानी से दिल की बाहरी परीक्षा पर दिखाई दे रहे थे (3 अंक) । इसके अलावा, हृदय ऊतक वर्गों, जैसे, इल्लों मांसपेशियों के स्तर पर लघु अक्ष अनुभाग (चित्र बी), इंजेक्शन साइट पर InI डाई के transmural जमा से पता चला, इस प्रकार के सफल और प्रभावी वितरण का प्रदर्शन इस तकनीक का उपयोग कर मायोकार्डियम में injectate । नोट की, transmural hyperechogenicity IMI (चित्रा 2E, एफ) के दौरान vivo में मनाया, पूर्व vivo नमूनों (चित्रा 3, बी) में InI के transmural जमा के साथ अच्छी तरह से संबंधित. यह स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया कि InI IMI की स्थापना में दोहरी गुण है: के रूप में एक vivo अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक पूर्व vivoin सीटू अनुरेखक । इन संपत्तियों के दोनों पहल इस तकनीक में दक्षता के अधिग्रहण के दौरान विशेष रूप से प्रशिक्षण के लिए एक बहुत बहुमुखी और सस्ती अल्ट्रासाउंड इसके विपरीत एजेंट, बनाते हैं । इस प्रकार, InI के echogenic गुण IMI की निगरानी करने में मदद उदा, सफल IMI बनाम आकस्मिक अंतर कक्ष या pericardial अंतरिक्ष इंजेक्शन, और जब आवश्यक हो, अल्ट्रासाउंड के वास्तविक समय इमेजिंग क्षमताओं को देखते हुए, बनाने के लिए वास्तविक समय में सुई ट्रैक के सुधार (चित्रा 2g, एच). दूसरी ओर, सीटू ट्रेसिंग क्षमताओं में InI के लक्ष्य मायोकार्डियम के पूर्व vivo नमूनों में injectate का पता लगाने के लिए मान रहे हैं ।

Percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित IMI के साथ InI और EGFP (+) HEK-२९३ कक्ष:

IMI करने से पहले, EGFP के सफल अभिकर्मक (+) HEK-२९३ कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा की पुष्टि की गई इन विट्रो संस्कृति की स्थिति (चित्र 3सी). मायोकार्डियम में EGFP (+) HEK-२९३ कोशिकाओं के सफल वितरण दिल ऊतक वर्गों जहां InI जमा मनाया गया के immunohistochemistry विश्लेषण के माध्यम से प्रदर्शन किया गया । इस प्रकार, avidin-बायोटिन जटिल विधि का उपयोग (४.२ कदम देखें), प्रचुर मात्रा में EGFP (+) HEK-२९३ कोशिकाओं के भीतर की पहचान की गई मायोकार्डियम interspersed के साथ InI जमा (चित्र 3d) । ini के जमा अभी भी थे 24 IMI के बाद खरगोश कि EGFP (+) HEK-२९३ कोशिकाओं (चित्रा 3E), या अकेले ini (चित्रा 3F) के साथ संयोजन में या तो ini प्राप्त से रोधगलन के नमूनों में एच । नोट, एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया इस समय बिंदु पर मनाया गया था, एक प्रमुख neutrophilic घुसपैठ के साथ, EGFP प्राप्त पशुओं से नमूनों में (+) HEK-२९३ कोशिकाओं (चित्रा 3E), इस प्रकार तीव्र सेलुलर अस्वीकृति का सुझाव. दूसरी ओर, मैक्रोफेज अकेले प्राप्त जानवरों में मनाया गया (चित्रा 3F) ।

Figure 3
चित्र 3 . सीटू में macroscopic और histopathological मूल्यांकन और injectate का पता लगाएँ. ((ऐरोहेड इंजेक्शन की साइटों पर प्रकाश डाला) एक IMI के साथ एक उत्पाद का दिल के बाहरी परीक्षा पर injectate की उपस्थिति का प्रदर्शन () । () इल्लों की मांसपेशियों के स्तर पर दिल के एक अनुप्रस्थ खंड में IMI के बाद injectate के transmural वितरण का प्रदर्शन (ब्लू ऐरोहेड transmural InI जमा पर प्रकाश डाला; सफेद तीर के एक दृश्य जमा पर प्रकाश डाला गया IVS पर InI) । () Autofluorescence इन विट्रो में EGFP (+) HEK-२९३ कोशिकाओं का उपयोग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी. (डी-एफ) इंजेक्शन साइटों के Histopathological विश्लेषण । EGFP (+) कोशिकाएं मायोकार्डियम में 0 h (D) और 24 h (E) पोस्ट IMI (नीली ऐरोहेड हाइलाइट EGFP (+) कक्ष के भीतर InI जमाराशियों के साथ interspersed हैं; लाल तीर न्यूट्रोफिल की उपस्थिति को हाइलाइट करते हैं) । मायोकार्डियम के भीतर ini interspersed के जमा 24 ज () IMI के बाद अकेले ini के साथ (नीले तीर मैक्रोफेज की उपस्थिति पर प्रकाश डाला) । RV = सम्यक निलय; LV = वाम निलय; IVS = interventricular पट; IMI = Intramyocardial इंजेक्शन; InI = भारत इंक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

होने पर ६० percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित IMI प्रक्रियाओं की तारीख करने के लिए, हम मानते है कि विस्तार और अच्छे जानवर से निपटने और देखभाल के लिए सावधान ध्यान के साथ, प्रक्रिया आम तौर पर अच्छी तरह से सहन किया है, और तीव्र जटिलताओं बहुत दुर्लभ है और आम तौर पर हल्के । सामांय में, IMI से गुजरना है कि पशुओं में, सबसे लगातार अवलोकन के दौरान और शीघ्र ही प्रक्रिया के बाद क्षणिक त्वरण या हृदय की दर के मंदी, पृथक समयपूर्व वेंट्रिकुलर परिसरों (पीवीसी) (चित्र 4a) के साथ जुड़े है. इस प्रकार, 24 ज Holter पशुओं की ईसीजी की निगरानी कि IMI के माध्यम से अकेले InI प्राप्त की, पता चला कि सबसे अक्सर अतालता पाया (24 घंटे के भीतर एपिसोड की कुल संख्या) परमवीर चक्र अलग था, भले ही एपिसोड की एक उच्च संख्या पशुओं में पाया गया कि थे पहले 8 सप्ताह (चित्र 5) के लिए DOX के साथ इलाज किया । दोहे और जुड़वां में परमवीर चक्र कम दिखाई देते हैं (चित्रा 4B, सी और चित्रा 5B, सी), भले ही जुड़वां काफी कम अनुपचारित सामान्य खरगोश (चित्रा DOX) में से इलाज 5C में लगातार कर रहे हैं. दूसरी ओर, गैर-निरंतर वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता (NSVT) सामांय जानवरों (चित्रा 4d और चित्रा 5d) में अधिक बार मनाया गया । गौरतलब है, whilst मतलब दिल की दर DOX और सामांय समूहों के बीच अलग IMI प्राप्त करने के बाद नहीं था अकेले (चित्रा 5E), सामांय r-r अंतराल (SDNN) के मानक विचलन, काफी कम था (< १०० ms) में DOX समूह ( चित्रा 5F). SDNN हृदय स्वास्थ्य की स्थिति का एक गैर रेखीय उपाय है, और इसलिए इस परिणाम इंगित करता है कि DOX समूह अपने हृदय शारीरिक स्थिति में वैश्विक परिवर्तन किया है ।

Figure 4
चित्र 4 वेंट्रिकुलर अतालता 24 एच Holter निगरानी में खरगोशों कि InI के साथ IMI प्राप्त के दौरान मनाया । दिखाया छवियों Holter ईसीजी tachograms से प्राप्त स्क्रीनशॉट ऑफ़लाइन विश्लेषण के दौरान स्क्रीन पर प्रदर्शित कर रहे हैं, और निगरानी के 24 एच के दौरान पाया ताल विकारों के सबसे आम प्रकार के प्रतिनिधि उदाहरण वर्णन. (A) परमवीर चक्र पृथक । () परमवीर चक्र दोहे में. () जुड़वां में पीवीसी. (D) NSVT । पीवीसी = समयपूर्व वेंट्रिकुलर संकुचन; NSVT = न वृ वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . Arrhythmic घटनाओं द्वारा पता लगाया 24 एच Holter ईसीजी निगरानी के बाद IMI में पहल के साथ खरगोश. पृथक परमवीर चक्र की कुल संख्या (A), परमवीर चक्र में दोहे (B), जुड़वां में परमवीर चक्र, (सी) और NSVT (डी), अनुपचारित खरगोशों में (सामान्य + IMI) बनाम डॉक्सोरूबिसिन-इलाज (3 मिलीग्राम/kg/सप्ताह के लिए 6 सप्ताह) खरगोश (DOX + IMI), के बाद IMI । मतलब हृदय की दर () और SDNN (), खरगोशों में सामान्य से + IMI और DOX + IMI समूहों के बाद InI के साथ IMI. डाटा अर्थ ± SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । * p < ०.०५; और # p < ०.०१ को इंगित करता है, सामांय + IMI बनाम DOX + IMI समूहों की तुलना t-परीक्षण द्वारा करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्राथमिक लक्ष्य एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक है कि खरगोश के मायोकार्डियम में स्टेम सेल के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित करने के लिए (एक बड़े आकार के नैदानिक पशु मॉडल)17,18, whilst के उपयोग का लाभ लेने के लिए एक अपेक्षाकृत सस्ती इमेजिंग प्रणाली कई नैदानिक और अनुसंधान केंद्रों में आसानी से उपलब्ध है । यहां, हम बताते है कि, एक नैदानिक इकोकार्डियोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर, और पहल द्वारा सहायता प्राप्त, एक व्यापक रूप से उपलब्ध एजेंट, दोनों सीटू अनुरेखण क्षमताओं और echogenic गुण में , सफल percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित IMI बहुत प्रभावी है खरगोश दिल के लक्ष्य क्षेत्रों के लिए injectate पहुंचाने में । जहां तक हम जानते हैं, इस तरह के खरगोश18,19के रूप में एक बड़े पशु मॉडल में एक percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित IMI और सेल डिलीवरी का पहला विवरण है । Whilst InI injectate के ऊतकों में सीटू स्थानीयकरण के लिए अध्ययन में पहले इस्तेमाल किया गया है7,28, यह हमारे ज्ञान के लिए है, vivo में एक के रूप में इस एजेंट के दोहरे गुणों का पहला विवरण अल्ट्रासाउंड इसके विपरीत एजेंट और injectate पूर्व vivoके सीटू अनुरेखक में एक के रूप में. दरअसल, इसके विपरीत एजेंटों के जटिल मिश्रण और सीटू अनुरेखण पदार्थों में पहले murine अध्ययनों में वर्णित किया गया है मायोकार्डियम में injectates पहुंचाने के उद्देश्य से29. हालांकि, InI के echogenic गुण और उसके सीटू में अनुरेखण क्षमताओं को देखते हुए, इस पदार्थ बहुत क्षमता अधिग्रहण whilst इस तकनीक के साथ प्रशिक्षण के दौर के दौरान उपयोगी हो सकता है ।

दोनों InI युक्त injectate के वितरण की पुष्टि के रूप में अच्छी तरह के रूप में EGFP (+) HEK-२९३ immunohistochemistry का उपयोग कर कोशिकाओं को इस तकनीक की प्रयोज्यता स्टेम सेल थेरेपी के उद्देश्य से नैदानिक अनुसंधान को दर्शाता है । EGFP के साथ संयोजन के रूप में एक IMI (+) HEK-२९३ एक प्रमुख neutrophilic घुसपैठ के साथ एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप, तीव्र सेलुलर अस्वीकृति की प्रतिक्रिया (24 घंटे के भीतर) xenogeneic कोशिकाओं को सुझाव । यह प्रतिक्रिया शायद एक असुरक्षित जानवर में आश्चर्य की बात नहीं है । दूसरी ओर, अकेले भी एक IMI के साथ एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया (24 घंटे के भीतर) इलाज रोधगलन ऊतक है, जो एक प्रमुख macrophage घुसपैठ का प्रदर्शन किया । यह एक खुले सीने में प्रत्यक्ष दृश्य के तहत IMI निंनलिखित अध्ययन में वर्णित तीव्र सूजन के अवलोकन के साथ लाइन में है प्रक्रिया4,30,31,३२,३३। तीव्र सूजन भी मायोकार्डियम३४में सामांय खारा या पंजाब समाधान के इंजेक्शन पर देखा गया है,३५, और यहां तक कि चूहे३६के gastrocnemius मांसपेशियों में, और इसलिए इस प्रतिक्रिया गया है सीधे ऊतक चोट के बजाय injectate के लिए जिंमेदार ठहराया प्रति30 , 31 , ३२ , ३४ , ३५ , ३६ वास्तव में, हृदय शोधों अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय समाज IMI की स्थापना में सूजन की आम घटना को स्वीकार करता है, लेकिन इस प्रक्रिया को कम करने के लिए या नहीं उपायों के रूप में कोई आम सहमति है कि पेरि-प्रक्रियात्मक समय उपयोगी होते हैं (उदा, नसों में (I.V.) corticosteroids)३७. हालांकि इस अध्ययन में सूजन भी प्रत्यक्ष ऊतक चोट जिंमेदार जा सकता है, परिणाम भी सुझाव है कि एक विदेशी शरीर के रूप में ini भी इस प्रक्रिया में एक भूमिका निभानी चाहिए, मैक्रोफेज के एक नंबर प्रदान करने के लिए phagocytizing InI (चित्रा 3F) दिखाई देते हैं । इस तीव्र सूजन के कार्यात्मक प्रभाव की एक पूरी तरह से विश्लेषण के भीतर IMI को माध्यमिक दिल, या या नहीं इन नियत्रंण दवाओं के प्रशासन के माध्यम से इस तरह corticosteroids के रूप में उन्नत किया जा सकता है इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर है । फिर भी, percutaneous विपरीत इकोकार्डियोग्राफी-मायोकार्डियम के चार लक्ष्य क्षेत्रों के लिए निर्देशित IMI, ०.२५ मिलीलीटर (१.२५ x 106 कोशिकाओं) प्रति injectate साइट के IMI की एक मात्रा के साथ, खरगोश में बहुत अच्छी तरह से सहन किया गया था ।

अधिक से अधिक ६० की तारीख को प्रदर्शन किया प्रक्रियाओं के साथ, और योग्यता के बाद प्राप्त किया गया था, मृत्यु प्रक्रिया को माध्यमिक बहुत कम था । उदाहरण के लिए, IMI के बाद चरण ३.९ (सामांय और DOX समूह) में वर्णित दो पलटनों में कोई मृत्यु नहीं हुई । दरअसल, तिथि करने के लिए ६७ IMI एक चल रहे अनुसंधान कार्यक्रम के भाग के रूप में प्रदर्शन प्रक्रियाओं के बाद, हम केवल दो मौतें सीधे प्रक्रिया से संबंधित था (२.९% मृत्यु दर) । इनमें से एक में, एक hemopericardium की उपस्थिति पोस्ट मार्टम परीक्षा में प्रदर्शन किया, whilst अंय विकसित नैदानिक स्नायविक संकेत, तीव्र सेरेब्रल एक cardioembolic घटना को माध्यमिक ischemia के अनुरूप है, इस प्रकार एक की आवश्यकता थी मानव अंत बिंदु । यह मृत्यु दर (२.९%) कि लू एट अल द्वारा सूचित की तुलना में काफी कम है । (11%)8 और ंयू एट अल (27%)३८, कि एक खुली छाती प्रक्रिया में प्रत्यक्ष देखने के तहत IMI प्राप्त खरगोशों में । इस प्रकार, हम वर्तमान अध्ययन में वर्णित प्रक्रिया पर विचार करने के लिए सुरक्षित है, और हम चल रहे अध्ययन में इस तकनीक का उपयोग कर रहे है स्टेम सेल का मूल्यांकन करने का वादा परिणाम३९,४०के साथ AICM के एक खरगोश मॉडल में चिकित्सा आधारित है ।

वहां एक सफल percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित IMI के लिए कई महत्वपूर्ण अंक हैं । सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि इल्लों मांसपेशियों के स्तर पर एक parasternal लघु अक्ष को देखने के endocardial और epicardial आकृति के स्पष्ट विरेखांकन के साथ प्राप्त की है । अगले, यह सुनिश्चित करें कि सुई टिप हर समय देखने के क्षेत्र के भीतर है एक बार यह छाती गुहा और मायोकार्डियम pericardial अंतरिक्ष या LV चैंबर में आकस्मिक प्रसव को रोकने के लिए प्रवेश किया है । फिर, छाती गुहा के माध्यम से मार्ग की एक ंयूनतम संख्या को रखने के लिए सुनिश्चित करें, और पेरीकार्डियम और मायोकार्डियम में, क्योंकि यह स्थानीय आघात की संभावना को बढ़ा सकताहै (जैसे, पंगु) इन संरचनाओं के लिए, और जुड़े जोखिम के hemopericardium । इस के लिए, whilst छाती गुहा में सुई बनाए रखने (और कुछ लक्ष्य साइटों के लिए, आंत पेरीकार्डियम में प्रवेश के एक ही बिंदु पर (उदा., पार्श्व दीवार)), ध्यान से सुई की घटनाओं के कोण में सूक्ष्म परिवर्तन करने के लिए । अंत में, हमेशा एक सुई है कि छाती गुहा में त्वचा के माध्यम से एक स्पष्ट और आसान मार्ग है, इस प्रकार मायोकार्डियम में प्रवेश करने से कुंद सुई बेवल्स से परहेज है और महत्वपूर्ण नुकसान के कारण का उपयोग करें ।

प्रक्रिया यहां वर्णित है, न केवल मायोकार्डियम के भीतर कई लक्ष्य साइटों के लिए injectate के विश्वसनीय और सफल वितरण की अनुमति देता है, लेकिन यह भी वास्तविक समय में सुई पथ के सुधार परमिट, इस प्रकार आकस्मिक intrachamber वितरण को रोकने ( चित्रा 2g, H). बंद छाती IMI प्रक्रियाओं चूहों में पहले वर्णित किया गया है Whilst, वहाँ कई इस छोटे जानवर मॉडल के लिए निहित सीमाएं हैं । इन सीमाओं चिकित्सा के लिए उत्तरदाई मायोकार्डियम के लक्ष्य क्षेत्रों की संख्या में शामिल हैं, और कम मात्रा/कोशिकाओं है कि लक्ष्य साइट29,४१प्रति इंजेक्ट किया जा सकता है की संख्या । इसके अलावा, injectate का सही वितरण अक्सर एक चिंता का विषय है, एक सफलता की दर के साथ 60-70%४२के करीब है, और इसलिए कम व्यापक रूप से उपलब्ध उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड प्रणालियों का उपयोग आमतौर पर आवश्यक है29,४१, ४२. इन प्रणालियों रैखिक सरणी ट्रांसड्यूसर से सुसज्जित है कि भी अंतर्निहित इमेजिंग सीमाएं है (जैसे, गूंज एक लगातार विरूपण साक्ष्य है)14। ऐसे चूहों और चूहों के रूप में छोटे कुतर मॉडल की एक और सीमा, सीए में उनके आंतरिक मतभेद+ 2 परिवहन प्रणाली और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, जो मनुष्यों और बड़े कुत्ते, सूअर और खरगोश के रूप में पशु मॉडल के आकार से अलग है 15,16,४३. इन सभी सीमाओं अक्सर इन मॉडलों में एक बड़े जानवर मॉडल में पूर्व पुष्टि के बिना क्लिनिक में निष्कर्षों का अनुवाद करने में कठिनाइयों पैदा करते हैं ।

पेरि में पशु की सावधानीपूर्वक निगरानी-प्रक्रिया अवधि प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल के लिए समकालीन दिशा निर्देशों के अनुसार अनिवार्य है । के रूप में यहां दिखाया गया है, यह धारावाहिक इकोकार्डियोग्राफी खिड़की स्कैन और ईसीजी tracers द्वारा किया जा सकता है, जब तक जानवर संज्ञाहरण से जाग रहा है कम । दिल ताल पर IMI के तीव्र प्रभाव भी 24 एच Holter ईसीजी द्वारा निगरानी की जा सकती है और हमारे मानक अभ्यास है । ध्यान दें, सबसे अक्सर अतालता पीवीसी, जो प्रकृति में अपेक्षाकृत सौंय रहे है अलग थे, और जो पशुओं में अधिक आम थे कि डॉक्सोरूबिसिन के साथ IMI से पहले इलाज किया गया है InI ( चित्र 4a और आंकड़ा 5) देखें) । अन्य अतालता कि अपेक्षाकृत कम थे अक्सर शामिल हैं: दोहे में परमवीर चक्र; जुड़वां में पीवीसी; साथ ही NSVT (see figure 4B-d and figure 5B-d). हालांकि, कोई जीवन ऐसी निरंतर वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता के रूप में अतालता धमकी देखा गया । नोट की, हम यह भी पाया कि DOX समूह में कुछ cardiotoxic अभिव्यक्तियों Holter ईसीजी निगरानी द्वारा पता लगाया जा सकता है, समय आवृत्ति का उपयोग करते हुए हृदय दर परिवर्तनशीलता (HRV) के डोमेन चर जैसे SDNN. इस प्रकार, एक कम SDNN (चित्रा 5E, एफ), हृदय स्वास्थ्य की स्थिति का एक गैर रेखीय उपाय, सामान्य समूह की तुलना में DOX समूह में मनाया गया. यह कम HRV की पहली रिपोर्ट है, के रूप में एक कम SDNN द्वारा प्रदर्शन किया, AICM के एक खरगोश मॉडल है, जो अवलोकन है कि कम SDNN HFrEF के साथ रोगियों में हृदय की मौत का एक शक्तिशाली स्वतंत्र कारक है के साथ लाइन में है के संदर्भ में४४ ,४५,४६. DOX समूह में SDNN में परिवर्तन शायद IMI प्रक्रिया से ही संबंधित नहीं हैं; फिर भी, डॉक्सोरूबिसिन प्राप्त खरगोशों में इन निष्कर्षों की पुष्टि, साथ ही सामांय जानवरों है कि IMI प्राप्त नहीं है, की आवश्यकता है । चाहे HFrEF में कम SDNN भी सुधार किया जा सकता है, और इसलिए स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के लाभ के एक किराए के उपाय के रूप में इस्तेमाल किया, रहता है मूल्यांकन किया जाएगा, और भविष्य के अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया जाएगा ।

दिल में कोशिकाओं की डिलीवरी के कई मार्गों का पता लगाया गया है, नसों सहित, intracoronary, और intramyocardial वितरण; हालांकि, intramyocardial मार्ग के रूप में यहां इस्तेमाल किया, लगातार सबसे बड़ा स्तर के सेल प्रतिधारण दर1,2,3,4,5,३७दिखाया गया है । हम यहां प्रस्तुत अध्ययनों में सेल प्रतिधारण दर का आकलन नहीं किया, के रूप में इस्तेमाल किया पद्धति मजबूत और काफी विशिष्ट नहीं है vivo में quantitate या पूर्व vivo, जो इस अध्ययन की एक सीमा है । इसके बजाय, हम EGFP (+) HEK-२९३ कोशिकाओं जिसका phenotypic विशेषताओं हमें आसानी से मायोकार्डियम के भीतर इन कोशिकाओं की उपस्थिति, इस प्रकार सफल intramyocardial वितरण का संकेत करने के लिए भेदभाव करने की अनुमति का इस्तेमाल किया । हालांकि, मुख्य उद्देश्य के लिए एक ंयूनतम इनवेसिव तकनीक है जिससे हम एक बड़े आकार के मायोकार्डियम में IMI और सेल डिलीवरी प्रदर्शन सकता है विकसित किया गया था, गैर-कोरोनरी cardiomyopathy के नैदानिक मॉडल । के रूप में चित्रा 2 और चित्रा 3में प्रदर्शन किया, यह percutaneous कंट्रास्ट इकोकार्डियोग्राफी द्वारा पहली बार के लिए निपुण था-निर्देशित IMI । इसके अलावा अध्ययन सेल प्रतिधारण दर का आकलन करने के लिए आवश्यक है और साथ ही स्टेम कोशिकाओं के किसी भी संभावित लाभकारी प्रभाव मायोकार्डियम में वितरित की प्रक्रिया का उपयोग कर यहां वर्णित; फिलहाल ये पढ़ाई चल रही है । हम हाल ही में कार्यात्मक प्रभाव३९,४०के संबंध में आशाजनक परिणाम प्रेषित ।

एक खुले सीने प्रक्रिया में IMI की तुलना में, एक percutaneous इसके विपरीत इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित इस अध्ययन में वर्णित के रूप में एक बड़ी नैदानिक मॉडल में IMI, काफी कम प्रक्रिया के बाद पशु के त्वरित वसूली के साथ प्रकृति में आक्रामक है, और, के रूप में उपर्युक्त, यह भी कम मृत्यु दर8,३८है । IMI के लिए एक और दृष्टिकोण कैथेटर आधारित IMI है, जो भी नैदानिक मॉडल और कई छोटे नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया गया है (एक समीक्षा के लिए, शेंग एट अल देखें.) ४७. इस दृष्टिकोण के साथ, एक कैथेटर LV गुहा में उंनत और फिर endocardium के भीतर लक्ष्य साइटों पर तैनात है । इन लक्षित साइटों या तो प्रक्रिया से पहले की पहचान कर रहे हैं, जैसे, इसके विपरीत कार्डियक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (सीएमआर)४८का उपयोग, या प्रक्रिया के दौरान, जैसे, विद्युत endocardial मानचित्रण (EEM), द्वारा स्पष्ट रूप से ४९इंजेक्शन से पहले व्यवहार्य मायोकार्डियम अंतर । यह उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण कम इनवेसिव प्रत्यक्ष देखने के तहत छाती IMI खुले तुलना में है, जो एक स्पष्ट लाभ है । इसके अलावा, के बाद से मनुष्यों में IHD एक patcher वितरण है, EEM विशेष रूप से चिकित्सा मायोकार्डियम, जो IHD की स्थापना में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है की व्यवहार्य साइटों के लिए प्रत्यक्ष में मदद करता है । हालांकि, एक प्रमुख दोष वेंट्रिकुलर ताल विकारों, जो सभी IMI दृष्टिकोण की एक आम सुविधा है की प्रेरण है । अंय कमियां लंबा प्रक्रियात्मक समय शामिल हैं, EEM प्रदान एक अत्यधिक मांग तकनीक है जो व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता है, और हृदय वेध के एक जुड़े जोखिम है । इसके विपरीत, percutaneous इसके विपरीत इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित IMI के रूप में इस अध्ययन में वर्णित है, तकनीकी रूप से कम कैथेटर आधारित IMI की मांग है, और, एक बार क्षमता हासिल की है, यह संज्ञाहरण के बाद 25 मिनट के भीतर सुरक्षित रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है । इसी प्रकार, सुई का केवल एक छोटा सा हिस्सा मायोकार्डियम में उन्नत है, हृदय वेध के एक कम जोखिम है, हालांकि कार्डियक पंगु अभी भी संभव है.

अंत में, percutaneous इसके विपरीत इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित IMI तकनीक ऐसे खरगोश16,४३के रूप में एक बड़े पशु मॉडल में इस अध्ययन में वर्णित है, सुरक्षित है, अच्छी तरह से सहन, और में injectate पहुंचाने में प्रभावी दिल. इसलिए, यह गैर-कोरोनरी cardiomyopathy (जैसे, AICM), सहित, लेकिन सीमित करने के लिए, स्टेम सेल आधारित चिकित्सा में कार्डियक अपक्षयी चिकित्सकीय के प्रभाव के नैदानिक परिकल्पना परीक्षण के लिए एक होनहार रणनीति का गठन किया ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक शीला Monfort, बे्रंडा मार्टिनेज, कार्लोस Micó, अल्बर्टो Muñoz, और मैनुअल मोलिना उत्कृष्ट समर्थन के लिए डेटा के संग्रह के दौरान प्रदान की, और Bueno (+) EGFP-२९३ कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए कार्लोस HEK धंयवाद । इस काम के भाग में समर्थित था द्वारा: Fundación Séneca, एजेंसियाें de Ciencia y Tecnología, Región de मर्सिया, स्पेन (संयुक्त) (अनुदान संख्या: 11935/PI/ रेड डे Terapia Celular, ISCIII-उप. ग़ाल. Redes, VI PN de i + D + i 2008-2011 (अनुदान सं. RD12/0019/0001) (झामुमो), यूरोपीय संघ (फेडर) (झामुमो) के संरचनात्मक वित्तपोषण के साथ सह-वित्त; और, पढ़ने के विश्वविद्यालय, यूनाइटेड किंगडम (एजी, जीबी) (केंद्रीय वित्त पोषण) । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

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References

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. , Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. , e51566 (2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

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Giraldo, A., Talavera López,More

Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

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