Summary
رواية الاستراتيجيات العلاجية في الطب التجديدي القلب تتطلب دراسات شاملة ومفصلة في نماذج حيوانية السريرية كبيرة قبل أن يمكن النظر لاستخدامها في البشر. هنا، نبدي تقنية حقن إينتراميوكارديال توجيه ضربات القلب تباين عن طريق الجلد في الأرانب، الذي قيمة بالنسبة لفرضية اختبار فعالية هذه العلاجات الجديدة.
Abstract
الخلية والعلاج الجيني مثيرة والاستراتيجيات الواعدة غرض التجديد القلب في الإعداد لفشل القلب مع انخفاض كسر قذفي (هفريف). قبل أن يمكن النظر في استخدام، ونفذت في البشر، مطلوبة في نماذج حيوانية كبيرة الدراسات السريرية واسعة النطاق لتقييم سلامة وفعالية، ومصير إينجيكتاتي (مثلاً، الخلايا الجذعية) مرة واحدة سلمت في عضلة القلب. نماذج القوارض الصغيرة توفر مزايا (مثلاً، الفعالية، الانقياد للتحوير الوراثي من حيث التكلفة)؛ ومع ذلك، نظراً للقيود الملازمة لهذه النماذج، ترجمة النتائج التي توصلت إليها في هذه نادراً ما إلى العيادة. على العكس من ذلك، نماذج حيوانية كبيرة مثل الأرانب، بمزايا (مثلاً، الكهربية القلبية مماثلة بالمقارنة مع البشر والحيوانات الكبيرة الأخرى)، مع الاحتفاظ بتوازن جيد فعالة من حيث التكلفة. وهنا، نحن توضح كيفية تنفيذ تقنية حقن (IMI) توجيه ضربات القلب إينتراميوكارديال تباين عن طريق الجلد، التي يتم كسبها، وجيد التحمل وآمنة وفعالة جداً في التنفيذ الهادف إينجيكتاتيس، بما في ذلك الخلايا، في مواقع عدة داخل عضلة القلب نموذج أرنب. لتنفيذ هذه التقنية، ونحن أيضا استفادت من نظام تخطيط صدى القلب السريرية متاحة على نطاق واسع. بعد وضع في الممارسة البروتوكول الموصوفة هنا، سوف تصبح باحث بالمعرفة الأساسية بالموجات فوق الصوتية المختصة في أداء هذا الأسلوب تنوعاً وكسبها للاستخدام الروتيني في التجارب، وتهدف إلى اختبار الفرضية قدرات للمداواة التجدد القلب في نموذج أرنب. متى تحقق الكفاءة، يمكن تنفيذ الإجراء بأكمله خلال 25 دقيقة بعد أنايسثيتيزينج الأرنب.
Introduction
العلاجات الخلية والجينات هي مثيرة ووضع استراتيجيات لتجديد/إصلاح عضلة القلب المصابين في هفريف من أي وقت مضى. وقد عدد قليل من الدراسات مقارنة الفعالية (مثلاً، معدل احتفاظ الخلية) طرق مختلفة لإيصال الخلية، التي أظهرت استمرار تفوق IMI عبر طرق إينتراكوروناري أو عن طريق الحقن الوريدي1،2 , 3 , 4 , 5-وهكذا، ليس من المستغرب أن نسبة كبيرة من الدراسات على نماذج متعدية للعلاج بالخلايا الجذعية لعضلة القلب المتضررة، تسليم إينجيكتاتي عبر IMI المضطلع بها في إطار العرض مباشرة في صدر فتح إجراء6،7 . بيد أن هذا النهج قد العديد من القيود، بما في ذلك طبيعة الغازية من الإجراء، الذي ينطوي على خطر وفيات الإجرائية المحيطة (غالباً ما يبلغ)8. وبالإضافة إلى ذلك، IMI ضمن طريقة العرض المباشر لا يلغي إمكانية حقن غير مقصود في تجويف البطين. في الممارسة السريرية IMI أثناء جراحة الصدر المفتوحة يمكن أن يكون وسيلة مناسبة لإيصال خلية العلاجية، مثلاً، خلال الشريان التاجي الالتفافية جراحة الاختلاس (تحويل)؛ ومع ذلك، هذا النهج قد لا يكون المناسبة لإيصال خلية في اعتلال عضلة القلب العالمية غير الدماغية المنشأ (مثلاً، هفريف الثانوي لاعتلال عضلة القلب الناجم عن انثراسيكلين (أيكم)).
شك في أن مرض القلب الاقفاري (IHD) هو السبب الأكثر شيوعاً هفريف (~ 66%)10من9،؛ ومع ذلك، غير الدماغية اعتلال عضلة القلب، بما في ذلك أيكم، ما زال يؤثر على نسبة كبيرة من المرضى الذين يعانون من هفريف (33%)9 . والواقع أن التقدم الذي أحرز مؤخرا في علم الأورام السريري أسفرت عن أكثر من 10 مليون من الناجين من السرطان في الولايات المتحدة الأمريكية وحدها11، مع تقديرات لعدد مماثل في أوروبا، وتمشيا مع اتجاه العام نحو تحسين البقاء على قيد الحياة لمرضى السرطان12 ،13. وهكذا، استكشاف فوائد العلاجات رواية مثل زرع الخلايا الجذعية لغير الدماغية اعتلال عضلة القلب، فضلا عن تجريب طريق فعالة وكسبها من الخلايا الجذعية التسليم بأهمية قصوى، نظراً للعدد المتزايد من المرضى تتأثر كارديوتوكسيسيتي الثانوي على أدوية السرطان.
من المذكرة، فرضية اختبار دراسات استخدام الخلايا الجذعية العلاج تهدف إلى إصلاح/تجديد عضلة القلب المتضررة كثيرا ما تنطوي على استخدام القوارض الصغيرة (مثلالفئران والجرذان). غالباً ما تتطلب هذه النماذج تكلفة عالية التردد نظم الموجات فوق الصوتية لتقييم وظيفة عضلة القلب، وعادة ما تكون مجهزة بمحولات المصفوفة الخطية التي لديها بعض القيود المتأصلة المرتبطة بها (مثلاً، صدى)14. ومع ذلك، قد نماذج أخرى مثل الأرانب، تمثل نموذجا الإكلينيكية كبيرة، بعض المزايا لاختبار الفرضية لعلاجات الخلايا الجذعية في هفريف. وهكذا، خلافا للفئران والجرذان، الأرانب الحفاظ على نظام النقل+ 2 Ca والكهربية الخلوية التي يشبه البشر وسائر الحيوانات الكبيرة (مثلالكلاب والخنازير)15،16،17 ،،من1819. وهناك ميزة أخرى، هي على الانقياد للقلب بالموجات فوق الصوتية التصوير باستخدام غير مكلفة نسبيا ونظم ضربات القلب السريرية متاحة على نطاق واسع مجهزة بمحولات الصفيف المرحلة ذات تردد عال نسبيا، مثلاً، 12 ميجاهرتز، مثل تلك التي كثيرا ما تستخدم في أمراض القلب في الأطفال حديثي الولادة وطب الأطفال. تسمح هذه النظم التصوير مشخصين ممتازة مع أحدث التكنولوجيا، وأنها تستفيد من تفوق التوافقي التصوير20. وعلاوة على ذلك، اختبار الفرضيات واسعة إمكانات العلاج التجديدي القلب (مثل، العلاج بالخلايا الجذعية)، السلامة، كفاءة، إمكانات كارديوميوجينيك، كذلك تقييم مصير إينجيكتاتي مرة واحدة سلمت إلى عضلة القلب، إلزامية قبل أن يمكن اعتبار للاستخدام البشري، وأنها تتطلب استخدام نماذج حيوانية الإكلينيكية الكبيرة، مثل،من17أرنب19. هنا، يمكننا وصف أسلوب كسبها لإيصال خلية عن طريق IMI التباين عن طريق الجلد-ضربات القلب تسترشد باستخدام نظام تخطيط صدى القلب سريرية، التي تهدف إلى العلاج القائم على زرع الخلايا الجذعية لاعتلال عضلة القلب غير الدماغية20 . كما يصف لنا فوائد الحبر الهند (InI، تعرف أيضا باسم الصين الحبر) كالموجات فوق الصوتية على النقيض عامل و في الموقع الراسم من إينجيكتاتي في قلب الأرنب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
التجارب الموضحة هنا كانت وافقت عليها "لجنة البحوث الأخلاقية" التابعة لجامعة مورسيا، إسبانيا، وأجريت وفقا للتوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي من "المفوضية الأوروبية". تم إجراء الخطوات الموضحة ضمن البروتوكولات التشغيل القياسية التي كانت جزءا من خطة العمل، وأدوا ليس فقط لغرض تصوير الفيديو المصاحبة لهذه الورقة.
1-إعداد الخلايا وناقلات التعبير الثدييات
ملاحظة: هنا، نحن بإيجاز وصف بروتوكول لإعداد وتعداء خط الخلية (الجنينية البشرية 293 (HEK-293) الكلي؛) ومع ذلك، ينبغي أن تكون الخلية المناسبة بروتوكولات معينة لنوع الخلية التي تهم الأمثل (مثلالخلايا الجذعية).
- الحفاظ على الخلايا HEK-293 في ارتفاع الجلوكوز دولبيكو تعديل المتوسطة النسر (دميم) وتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% (FCS)، بيروفات صوديوم 1%، 2 مم الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، والمحتضنة في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5 في المائة شركة2 . عندما تكون الخلايا الفرعية المتلاقية، تقسيم بنسبة 1:3.
- بدء تقسيم الخلايا من يسفط وسائل الإعلام، ثم يغسل مرة واحدة مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) وإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة واحتضان ثم مع 2.5 مل 0.5 × حمض التربسين-الإيثيلين (يدتا) (دقيقة 5، 37 درجة مئوية).
- إضافة وحدة تخزين واحدة من وسائل الإعلام دميم (تستكمل كما هو موضح أعلاه) وقف رد الفعل ومن ثم فصل الخلايا من يسفط ببطء لطف صعودا وهبوطاً مع ماصة إلكترونية.
- ثم قم بنقل تعليق خلية إلى حاوية مناسبة (مثلاً، 15-50 مل الأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي). الطرد المركزي في دلو سوينغ (100 x ز) وتجاهل المادة طافية وتغسل بيليه مرتين مع PBS العقيمة.
- ريسوسبيند بيليه في وسائط الإعلام دميم الطازجة والبذور كثافة خلية ملائمة (مثلاً، 1 × 106 خلايا في قارورة2 75 سم) في قوارير الثقافة الطازجة أو صحون كبيرة وفقا للممارسات المختبرية المحلية.
- استبدال وسائط الإعلام القائمة مع وسائط جديدة كل يومين.
ملاحظة: ناقل التعبير مستمدة من pIRES1hyg واستخدامها طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة كما هو موضح سابقا21. p(EGFP) IRES1hyg تم إنشاؤها بواسطة سوبكلونينغ كدنا اجفب كما بامهي + نوتي إدراج من بيجفب-N1 إلى بامهي + نوتي هضمها pIRES1hyg21.
- استبدال وسائط الإعلام القائمة مع وسائط جديدة كل يومين.
- قبل تعداء، يوم 1 البذور HEK-293 الخلايا في كثافة 0.5 × 105 خلايا/سم2 في لوحات زراعة الأنسجة أيضا 12 أو 24.
- في يوم تعداء، إعداد مجمعات كاشف تعداء الحمض الدهني في أنابيب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 منفصلة (1 أنبوب في البئر).
- ابدأ بإضافة 250 ميليلتر من المصل انخفاض متوسط في كل أنبوب، ثم قم بإضافة 4 ميكروغرام الحمض النووي (المزيج بلطف).
- بعد ذلك إضافة 250 ميليلتر من مزيج معدّة مسبقاً من 10 ميليلتر دهن تعداء كاشف و 250 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط، لكل أنبوبة (المزيج بلطف مرة أخرى).
- وأخيراً، المضي قدما في ترانسفيكتيونس، التي تفرخ الخلايا HEK-293 مع الحمض الدهني تعداء كاشف المجمعات ح 4، وثم استبدال المتوسطة دميم تستكمل كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1، 1)، واحتضانها ل h. 48 آخر إجراء التحديد المخدرات مستقرة ترانسفيكتانتس مع 100 ميكروغرام/مل هيجروميسين باء
- فصل الخلايا HEK-293 مع التربسين كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1، 2). بعد الغسيل الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة، ريسوسبيند في وسيلة مناسبة (مثلاً، 10% v/v InI في برنامج تلفزيوني)، لتحقيق تركيز خلية الأخيرة من 5 × 106/mL.
2-إعداد الأرنب
ملاحظة: وضع الأرنب ومحول ل IMI ليس الأمثل لتقييم وظيفة القلب للحيوان ومورفولوجيا. وبالتالي، فمن المستحسن لإجراء فحص كامل مشخصين20 قبل IMI (انظر أدناه)، وفي وقت لاحق النقاط حسب تعريف التصميم التجريبي. وسيهدف هذا لتقييم خصائص خط الأساس التشريحية والوظيفية للقلب في الحيوان الذي سوف تلقي حقنه، وأيضا بتقييم الآثار، IMI في وظيفة القلب.
- إجراء هذا الفحص على نحو أعمى واتباع المبادئ التوجيهية "اللجنة تخطيط صدى القلب" للكلية الأمريكية للطب الباطني البيطري، والرابطة الأمريكية للمجتمع الأوروبي تخطيط صدى القلب "تصوير القلب والأوعية الدموية" 22 , 23 , 24.
- الحصول على تتبع متزامنة 1-يؤدي رسم قلب (ECG) طوال فترة الدراسة كاملة مشخصين.
- تخدير الأرنب مع الكيتامين 10 مغ/كغ، جنبا إلى جنب مع ميديتوميديني 200 ميكروغرام/كغ، العضلي (الدردشة) الحقن.
- التحقق من مستوى التخدير بعد 10-20 دقيقة بعد الإدارة للتخدير.
- استخدام ماكينة قص شعر إزالة شعر صدره على نطاق واسع (مثل، أسفل الرقبة للمنطقة الفرعية إكسيفويد) (الشكل 1A).
- حلق مناطق إضافية من 1-2 سم2 في الوجه الداخلي حق فوريليمب (منطقة ميديوكوبيتال)، وكل أطرافه هند (منطقة ميديوتيبيال) (الشكل 1B).
- ضع لاصق ECG أقطاب في منطقتي حلق من أطرافه بشكل متزامن رصد ضربات القلب أثناء الإجراء (الشكل 1).
- ضع الحيوان في موقف ضعيف استلقاء على بطانية حرارية، مع أطرافه الممدودة باستخدام الشريط الجراحي المرفقة بالجدول (الشكل 1).
- تأكد من أن يتم استعرضوا أذنيه إلى الوراء خلف الرأس/ظهره الأرنب، وهو موقف الذي أقل من أن الأمامية، حيث يساعد ذلك على الحفاظ على الموضع الصحيح من القفص الصدري للحيوان طوال فترة الإجراءات.
- السماح للحيوان للتنفس تلقائياً حين تدير الأكسجين بقناع الوجه طوال الإجراء بأكمله (100 ٪، 2-3 لتر في الدقيقة).
رقم 1. إعداد الأرنب IMI. (أ) قص الشعر من الصدر؛ (ب) قص الشعر من أطرافه؛ (ج) إرفاق أقطاب وموقف الأرنب مع الساقين الممدودة على بطانية حرارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
3-عن طريق الجلد على النقيض IMI توجيه ضربات القلب تقنية في الأرنب
- تنظيف وتطهير الجلد من القفص الصدري مع حل القائم على الكلورهيكسيدين.
- استخدم أسلوب العقيم طوال الإجراء بأكمله، وفقا لأفضل الممارسات الراهنة.
- كلما كان ذلك ممكناً، وإذا كان ذلك ممكناً بشكل معقول، تنفيذ إجراء عقيمة تماما، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، استخدام المواد المعقمة مثل العباءات، والقفازات، والستائر الجرح الجراحي، عقيمة خلع الملابس المادية للجدول، فضلا عن عقيمة بالموجات فوق الصوتية غطاء محول الطاقة وجل العقيمة بالموجات فوق الصوتية. وهذا سوف يقلل إلى أدنى حد خطر إدخال العوامل الممرضة للحيوان تلقي IMI، والممارسة المتبعة في الإعداد السريرية (مثلاً، أثناء ثقب القلب).
ملاحظة: من المستحسن المضي دائماً وفقا للوائح المحلية والوطنية لبحوث الحيوان المطبقة على المؤسسات المحلية والقطرية من الممارسة.
- تطبيق هلام انتقال الموجات فوق الصوتية في الصدر و/أو إلى محول، ومع محول طاقة الحبل حول رقبة المجرب، إجراء فحص سريع نافذة من القلب للحيوان، والتي غالباً ما تكون مفيدة لتصور التشريح، وأن تخطط IMI.
- ضع محول يدوياً في 4th-6th ربية الفضاء، 2-3 سم بعيداً عن خط باراستيرنال الحق مع حالات من زاوية ~ 90 ° فيما يتعلق بالجانب الأيمن من الجدار الصدري (الشكل 2A).
- ضبط موقع محول بالنسبة إلى مساحة ربية، فضلا عن الصورة وزاوية دورسوفينترال لتحسين طريقة عرض محور قصيرة تم تعديل على مستوى العضلات الحليمية. تحدد في هذا الرأي البطين الأيمن (RV) والبطين الأيسر (LV)، وحاجز إينتيرفينتريكولار (الحبس)، والجدار الخلفي (الأسبق)، فضلا عن أنتيرولاتيرال (AL) والعضلات الحليمية بوستيروميديال (م) (الشكل 2).
- لها مجال رؤية واسع بزيادة عمق باستخدام عنصر التحكم المناسب في النظام (مثلاً، زر، والاتصال الهاتفي).
- إيلاء اهتمام خاص للحصول على صورة متناظرة في هذا الرأي، فضلا عن التمايز المناسبة من معالم للوفلر وابيكارديال، وتعديل إذا لزم الأمر، من خلال الصورة الأمثل عناصر التحكم (مثلاً، الربح).
- حالما يتم الحصول على رأي مشخصين الأمثل (الشكل 2)، الحفاظ على هذا الموقف خلال الفترة المتبقية من هذا الإجراء، في حين يقوم عامل ثان IMI (انظر أدناه).
- في حين عقد محول، تجنب إخفاء علامة الاتجاه محول الطاقة، التي ينبغي دائماً أن تواجه إلى الأمام، مما يسمح المحاذاة مع الإبرة في الخطوات اللاحقة (الشكل 2 أ، ج).
- مع إبرة 24-ز يعلق على حقنه 1 مل، مكان الإبرة قريبة من جلد هيميثوراكس اليسرى في موقف متماثل النسخ المتطابق من محول. ثم، يدوياً محاذاة الإبرة مع علامة الاتجاه محول طاقة بزاوية ~ 90° (الشكل 2)، والنهوض ببطء بالإبرة من خلال الجلد وداخل تجويف الصدر.
ملاحظة: إدخال إبرة عن طريق الجلد في هذا الموقف والتوجه يسهل تصور الإبرة في طائرة شعاع الموجات فوق الصوتية (الشكل 2D، هاء)، مما يسمح للرصد في الوقت الحقيقي، وعند الضرورة، تعديل موقع الإبرة بالنسبة للمنطقة المستهدفة لعضلة القلب (الشكل 2 ز، ح). - مع معلومات سرية في الموقع الهدف، تقديم ببطء في إينجيكتاتي (تصل إلى 0.25 مل في موقع الحقن) خلال 10-30 ثانية (الشكل 2E)، حين تراجعه ببطء لطف الإبرة أثناء الحقن زيادة حجم عضلة القلب معاملة.
- InI استخدام 10% (v/v) المخفف في برنامج تلفزيوني لتوحيد أسلوب، تتبع في الموقع حين اكتساب الكفاءة، فضلا عن تأكيد نجاح استهداف جميع المواقع IMI أربعة داخل عضلة القلب بإجمالي علم الأمراض والتشريح المرضى (انظر نتائج الممثل). متى تحقق الكفاءة، يمكن أن يتم استبدال InI إذا رغبت بعامل تباين الموجات فوق الصوتية تجارية مناسبة.
ملاحظة: تسليم 10% (v/v) InI المخفف في برنامج تلفزيوني أما مع أو بدون الخلايا في عضلة القلب النتائج في هايبريتشوجينيسيتي ترانسمورال (أي، صدى مظهر مشرق) في موقع الهدف من الحقن (الشكل 2 هاء، واو). كثيرا ما لوحظ تباطؤ عابرة أو تسارع معدل ضربات القلب، المرتبطة بانكماش بطيني سابق لأوانه (مثلاً، معزولة، وشعرية وثلاثة توائم) حتى من أول اتصال من الإبرة مع ابيكارديوم، وكذلك أثناء و/أو بعد وقت قصير من IMI. ومع ذلك، توضع لا عدم انتظام ضربات القلب تهدد حياتهم، والتأثيرات السلبية الحادة التي نادراً ما يلاحظ استخدام يصل إلى 0.25 مل (1.25 × 106 خلايا) من إينجيكتاتي لكل موقع الحقن IMI (انظر نتائج الممثل و المناقشة).
- InI استخدام 10% (v/v) المخفف في برنامج تلفزيوني لتوحيد أسلوب، تتبع في الموقع حين اكتساب الكفاءة، فضلا عن تأكيد نجاح استهداف جميع المواقع IMI أربعة داخل عضلة القلب بإجمالي علم الأمراض والتشريح المرضى (انظر نتائج الممثل). متى تحقق الكفاءة، يمكن أن يتم استبدال InI إذا رغبت بعامل تباين الموجات فوق الصوتية تجارية مناسبة.
- إجراء بعض التغييرات الطفيفة في الإصابة الإبرة من زاوية حسب الضرورة لإتمام حقن 0.25 مل لكل موقع من مواقع IMI الأربع المستهدفة (ثلاثة في اليسار بطيني مجاناً الجدار (لففو) وواحدة في مركز الحبس الاحتياطي).
- بعد إكمال الإجراء IMI توجيه ضربات القلب التباين عن طريق الجلد، تقييم ضربات القلب (مثلاً، عن طريق تخطيط القلب المسلسل التتبع و/أو ح 24 ECG هولتر)، وإجراء مسح إطار تسلسلي مشخصين للتحقق من عدم وجود المضاعفات، حتى الحيوان هو تعافي تماما من التخدير، وفقط ثم نقل إلى غرفة في دائرة ضوء.
- هنا، نحن نستخدم ح 24 هولتر تخطيط القلب لرصد آثار IMI مع InI على إيقاع القلب ح 24. لهذا، نحن مقارنة مجموعة من الأرانب 6 مع النمط العادي الظاهري (فريق عادي) ومجموعة من الأرانب 6 التي تلقت الإدارة عن طريق الحقن الوريدي من ميتوتريكسات (كارديوتوكسيك انثراسيكلين المخدرات، تستخدم عادة لعلاج السرطان؛ مجموعة دوكس) بجرعة 2 مغ/كغ/الأسبوع لمدة 8 أسابيع، وثم كلا الأفواج تلقي IMI مع InI.
الشكل 2 . حقن إينتراميوكارديال توجيه ضربات القلب التباين عن طريق الجلد في الأرنب. (A) وضع محول في هيميثوراكس الحق بزاوية ~ 90 °. (ب) صورة تمثيلية لطريقة عرض المحور قصيرة parasternal (بسكس) من القلب على مستوى العضلات الحليمية في الأرنب. (ج) محاذاة الإبرة بزاوية ~ 90 ° بالنسبة إلى علامة الاتجاه محول طاقة. (د) موقع الإبرة في الموقع المستهدف في طريقة عرض بسكس القلب (لاحظ أن الإبرة هو تصور بسهولة في طائرة شعاع الموجات فوق الصوتية). (E و F) دليلاً هايبريتشوجينيسيتي في موقع الهدف عند حقن إينتراميوكارديال مع الحبر الهند (رؤوس الأسهم تسليط الضوء على هايبريتشوجينيسيتي ترانسمورال). (ز) موقع عرضي من الإبرة في قاعة LV (رؤوس الأسهم تسليط الضوء على رمح إبرة). Repositioning (ح) من الإبرة للجدار الحر LV (رؤوس الأسهم تسليط الضوء على رمح إبرة). رف = البطين الأيمن؛ LV = البطين الأيسر؛ الحبس = حاجز إينتيرفينتريكولار؛ PW = الجدار الخلفي؛ نادي = العضلات الحليمية أنتيرولاتيرال؛ م = بوستيروميديال العضلات الحليمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4-نشر تحليلات IMI
- القيام بتحليل نسيجية لعينات أنسجة القلب من الأرانب.
- إصلاح الأنسجة ح 24 في فورمالدهايد 10%، تليها الجفاف مع زيادة تركيزات الإيثانول على النحو التالي:
• 1 x في 70% (60 دقيقة)
• 1 x في 95% ethanol/5% الميثانول (60 دقيقة)
• 1 x 100 في المائة (60 دقيقة)
• 1 x 100 في المائة (90 دقيقة)
• 1 x 100 في المائة (120 دقيقة)
ملاحظة: جميع إينكوبيشنز أعلاه تجري في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم، استبدال مرتين مع 100 ٪ زيلين نفط (1 ح، RT)، وأخيراً تضمين في البارافين في خطوتين (60 دقيقة، 58 درجة مئوية)25. - تنفيذ 4-5 ميكرومتر الأنسجة الأقسام مع مبضع25. تحميل المقاطع على الشرائح.
- القيام بتلوين الهيماتوكسيلين ويوزين وماسون لأساليب تريتشرومي25،،من2627.
- إصلاح الأنسجة ح 24 في فورمالدهايد 10%، تليها الجفاف مع زيادة تركيزات الإيثانول على النحو التالي:
- أقسام الأنسجة من زرع القلوب، تنفيذ إيمونوهيستوتشيميستري للكشف عن الخلايا EGFP(+) HEK-293 (مثلاً، استخدام الأسلوب (ABC) معقدة عبدين-البيوتين)، بإيجاز:
- إزالة الشمع 4-5 ميكرومتر سميكة قلب المقاطع في 100 ٪ زيلين نفط (10 دقيقة، في RT). ترطيب الأنسجة بالغسيل مع تناقص حلول تركيز الإيثانول (x 2 في 100% (2 دقيقة)؛ x 2 في 95% (2 دقيقة)؛ س 1 في % 70 (2 دقيقة)؛ س 1 في 50% (2 دقيقة)؛ و x 1 في 30% (2 دقيقة)؛ 1 x ddH2س (2 دقيقة)) في الرايت
- أداء تثبيط البيروكسيديز الذاتية التي تغطي الأقسام مع 100 ميليلتر من 3 ٪ ح2س2 مخفف في (الميثانول (أعدت مع 5 مل حل الأسهم 30 ٪ ح2س2، وإضافة الميثانول تصل إلى إجمالي حجم 50 مل) احتضان 30 دقيقة، RT)، وثم يغسل بالغمر بالمياه المالحة تريس مخزنة (TBS؛ ودرجة الحموضة 7.6).
- أداء مستضد فضحه عن طريق العلاج الأنزيمي، التي تغطي الأقسام مع 100 ميليلتر من 0.1% برنس (أعدت مع ز 0.01 برنس المخفف في 10 مل TBS) (احتضان 12 دقيقة، RT)، ثم يغسل مع TBS (5 دقائق، RT).
- احتضان في الحل (مصل الماعز العادي بمعدل 10% في تبس) حظر استخدام 100 ميليلتر كل شريحة (30 دقيقة, RT)، وتغسل مع TBS (5 دقائق، RT).
- احتضان مع الدجاج الأخضر المضادة البروتين الفلورسنت (التجارة والنقل) كجسم الأولية (1: 500 في تبس) (ح 1، 30 درجة مئوية)، وتغسل مع TBS (5 دقائق، RT).
- احتضان مع جسم الثانوية بيوتينيلاتيد الماعز-مكافحة-الدجاج مفتش (1: 250 في تبس) (ح 1، 30 درجة مئوية)، وثم يغسل مع TBS (5 دقائق، RT).
- احتضان مع مجمع عبدين-البيوتين (20 دقيقة، 30 درجة مئوية) ومن ثم تسمية باستخدام تيتراهيدروتشلوريدي 3,30-ديامينوبينزيديني (DAB) (RT، 5-10 دقيقة).
- وأخيراً، يذوي بالغسيل في زيادة تركيزات الإيثانول (س 1 في 30% (2 دقيقة)؛ س 1 في 50% (2 دقيقة)؛ س 1 في % 70 (2 دقيقة)؛ x 2 في 95% (2 دقيقة)؛ x 2 في 100% (2 دقيقة)) في الرايت، أقسام كونتيرستين باستخدام أسلوب الهيماتوكسيلين ويوزين25، وثم تحميل الشرائح الغطاء. وتشمل إيجابية وسلبية فضلا عن ضوابط ايستب.
ملاحظة: بروتوكول مختصر الموصوفة أعلاه ليس المقصود للاستخدام العام إيمونوهيستوتشيميستري؛ الأمثل للأنسجة للفائدة وشروط أمر ضروري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التباين عن طريق الجلد IMI توجيه ضربات القلب مع InI:
استخدام البروتوكول الموصوفة أعلاه، وبعد تحديد المواقع المثلى غيض الإبرة أكده تخطيط صدى القلب وحقن بدأت، هايبريتشوجينيسيتي ترانسمورال لوحظ أثناء تسليم InI (10% v/v في برنامج تلفزيوني) (الشكل 2E) ، كذلك وقت قصير بعد IMI للمنطقة المستهدفة (الشكل 2 واو). عندما IMI كان متبوعاً مباشرة بالقتل الرحيم وإزالة القلب، رواسب InI كانت مرئية بسهولة عند فحص خارجي للقلب (الشكل 3A). وباﻹضافة إلى ذلك، كشف القلب أقسام الأنسجة، مثلاً، قسم المحور قصيرة على مستوى العضلات الحليمية (الشكل 3B)، رواسب transmural صبغ InI في موقع الحقن، مدللة بذلك على إيصال ناجحة وفعالة إينجيكتاتي في عضلة القلب باستخدام هذا الأسلوب. من المذكرة، لاحظ هايبريتشوجينيسيتي ترانسمورال في فيفو خلال IMI (الشكل 2E، F)، يرتبط أيضا برواسب transmural InI في العينات السابقين فيفو (الشكل 3 أ، ب). هذا بوضوح أن InI له خصائص المزدوج في تحديد IMI: كعامل تباين الموجات فوق الصوتية في فيفو ، فضلا عن تتبع ex فيفوين الموقع . كل من هذه الخصائص تجعل InI عامل تباين الموجات فوق الصوتية تنوعاً وغير مكلفة للغاية، خاصة بالنسبة للتدريب أثناء الحصول على الكفاءات في هذا الأسلوب. وهكذا، تساعد خصائص اتشوجينيك InI لرصد IMI مثلاً، تحديد IMI ناجحة مقابل عرضي داخل غرفة أو حقن الفضاء التامور، وعند الضرورة، نظراً لقدرات التصوير في الوقت الحقيقي للموجات فوق الصوتية، لجعل تصويبات الإبرة تتبع في الوقت الحقيقي (الشكل 2، ح). من ناحية أخرى، قدرات التتبع في الموقع من InI ذات قيمة لتحديد موقع في إينجيكتاتي في السابقين فيفو عينات من عضلة القلب المستهدفة.
التباين عن طريق الجلد IMI توجيه ضربات القلب مع خلايا HEK-293 InI و EGFP(+):
قبل IMI، أكده تعداء الناجح للخلايا EGFP(+) HEK-293 مجهرية الأسفار خلال في المختبر شروط الثقافة (الشكل 3). النجاح في إيصال EGFP(+) HEK-293 الخلايا في عضلة القلب تجلى عبر تحليل إيمونوهيستوتشيميستري لمقاطع أنسجة القلب حيث لوحظ وجود رواسب InI. وهكذا، باستخدام الأسلوب المعقد عبدين-البيوتين (راجع الخطوة 4، 2)، وحددت وفيرة EGFP(+) HEK-293 الخلايا داخل عضلة القلب تتخللها InI الودائع (3D الشكل). ولوحظت رواسب InI لا يزال ح 24 بعد IMI في عينات الأنسجة عضلة القلب من الأرانب التي تلقت InI في تركيبة مع الخلايا EGFP(+) HEK-293 (رقم 3E)، أو InI وحدها (3F الشكل). من المذكرة، لوحظ استجابة التهابات حادة في هذه النقطة الزمنية، مع ارتشاح بالعدلات الغالبة، في عينات من الحيوانات تلقي الخلايا EGFP(+) HEK-293 (الرقم 3E)، مما يشير إلى رفض الخلوية الحادة. من ناحية أخرى، لوحظ الضامة في الحيوانات تلقي وحدها InI (3F الشكل).
الشكل 3 . في الموقع العيانية ونسيجية للتقييم والبحث عن المفقودين من إينجيكتاتي- (أ) مظاهرة لوجود إينجيكتاتي في الامتحانات الخارجية قصت قلب عقب IMI مع InI (رؤوس الأسهم تسليط الضوء على مواقع الحقن). (ب) إثبات توزيع ترانسمورال إينجيكتاتي عقب IMI مع InI في مقطع عرضية من القلب على مستوى العضلات الحليمية (رؤوس الأسهم الزرقاء إبراز transmural إيداع InI؛ السهم الأبيض يسلط الضوء على إيداع مرئية InI في مركز الحبس الاحتياطي). (ج) أوتوفلوريسسينسي في المختبر من خلايا EGFP(+) HEK-293 باستخدام مجهر الأسفار. (د–و) تحليل مواقع حقن نسيجية. واضح يتخلل خلايا EGFP(+) مع رواسب InI داخل عضلة القلب في ح 0 (د) وآخر ح 24 (ﻫ) IMI (رؤوس الأسهم الزرقاء تمييز الخلايا EGFP(+)؛ وتسليط الضوء على وجود العَدلات الأسهم الحمراء). ودائع InI يتخلل داخل عضلة القلب في ح 24 (و) عقب IMI مع InI وحدها (الأسهم الزرقاء تسليط الضوء على وجود الضامة). رف = البطين الأيمن؛ LV = البطين الأيسر؛ الحبس = حاجز إينتيرفينتريكولار؛ IMI = حقن إينتراميوكارديال؛ InI = الحبر الهند. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
بعد إجراء ما يزيد على 60 التباين عن طريق الجلد توجيه ضربات القلب IMI الإجراءات حتى الآن، نعتقد أن الإجراء هو عموما جيد التحمل مع الحرص على الاهتمام بالتفاصيل وحسن التعامل مع الحيوانات والرعاية، والمضاعفات الحادة نادرة جداً وعادة ما تكون خفيفة. وبصفة عامة، في الحيوانات التي تخضع IMI، الملاحظة الأكثر تواترا خلال وبعد فترة وجيزة من هذا الإجراء هو عابر التسارع أو التباطؤ في معدل ضربات القلب، المرتبطة بمجمعات معزولة بطيني سابق لأوانه (PVC) (الشكل 4 أ). وهكذا، ح 24 ECG هولتر رصد الحيوانات التي تلقت InI وحدها عبر IMI، كشفت أن اضطراب النظم الأكثر تواترا الكشف عن (إجمالي عدد الحلقات داخل ح 24) كان معزولة PVC، حتى ولو تم الكشف عن عدد أكبر من الحلقات في الحيوانات التي كانت تعامل سابقا مع دوكس لمدة 8 أسابيع (الشكل 5A). البلاستيكية في مقاطع وثلاثة توائم يبدو أقل تواترا (الشكل 4 باءو جيم و الرقم 5، ج)، على الرغم من أن ثلاثة توائم أقل بكثير تواترا في تعامل دوكس من الأرانب العادية غير المعالجة (الشكل 5). من ناحية أخرى، لوحظ عدم استدامة خفقان البطين (نسفت) أكثر تواترا في الحيوانات العادية (الشكل 4 و الرقم 5)- إلى حد كبير، في حين أن متوسط معدل ضربات القلب لم يكن مختلفاً بين دوكس والمجموعات العادية بعد تلقي IMI مع وحدة InI (الشكل 5E)، الانحراف المعياري للفاصل الزمني العادي R-R (سدنن)، انخفضت انخفاضا كبيرا (< 100 مللي ثانية) في (مجموعة دوكس 5F الشكل). سدنن غير الخطي قدر-من قلب الوضع الصحي، ولذلك هذه النتيجة تشير إلى أن الفريق دوكس التعديلات العالمية في مركزها فسيولوجية القلب.
الشكل 4- لاحظ عدم انتظام ضربات البطين خلال 24 ساعة هولتر رصد في الأرانب التي تلقت IMI مع InI. الصور تظهر يتم الحصول على الصور من تاتشوجرامس ECG هولتر المعروضة على الشاشة أثناء التحليل دون اتصال، وتوضح الأمثلة التمثيلية من الأنواع الأكثر شيوعاً لعدم انتظام ضربات القلب خلال 24 ساعة لرصد. (أ) معزولة PVC. (ب) بوليفينيل الكلوريد في مقاطع. (ج) بوليفينيل الكلوريد في ثلاثة توائم. (د) نسفت. PVC = انكماش بطيني سابق لأوانه؛ نسفت = خفقان البطين غير المستدام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . أحداث اضطرابات الكشف عنها بواسطة ح 24 ECG هولتر رصد أثر IMI مع InI الأرانب. العدد الإجمالي "عزل بولي كلوريد الفينيل" (A)، بوليفينيل الكلوريد في مقاطع (ب)، بولي كلوريد الفينيل في ثلاثة توائم، (ج) ونسفت (د)، في علاج الأرانب (عادي + IMI) مقابل المعالجة ميتوتريكسات (3 مغ/كغ/الأسبوع لمدة 6 أسابيع) الأرانب (دوكس + IMI)، بعد IMI مع InI. يعني معدل ضربات القلب (E) سدنن (و) من الأرانب من عادي + IMI IMI ودوكس يجمع بعد IMI مع InI. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± sem. * يشير إلى 0.05 < p ؛ ويشير إلى # ف < 0.01، مقارنة عادي + IMI مقابل دوكس + IMI مجموعات من t-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان الهدف الأساسي لتطوير تقنية مينيملي التي يمكن استخدامها لإيصال الخلايا الجذعية في عضلة القلب من الأرانب (كبيرة حجم الإكلينيكية حيوان نموذجا)17،18، بينما الاستفادة من الاستخدام نظام متاحة بسهولة في كثير من السريرية التصوير غير مكلفة نسبيا ومراكز البحوث. هنا، نعرض، باستخدام نظام تخطيط القلب السريري، ويساعده InI، عامل متاح على نطاق واسع، مع كل من الموقع تتبع قدرات وخصائص اتشوجينيك، والتباين عن طريق الجلد الناجح توجيه ضربات القلب IMI فعالة جداً في إيصال إينجيكتاتي إلى المناطق المستهدفة الأرنب القلب. وبقدر ما نعلم، هذا هو أول وصف بالتباين عن طريق الجلد توجيه ضربات القلب IMI وخلية التسليم في نموذج حيوانات كبيرة مثل أرنب18،19. بينما InI قد استخدمت سابقا في الدراسات للتعريب في الموقع من إينجيكتاتي داخل الأنسجة7،28، هذا على حد علمنا، أول وصف لخصائص المزدوج لهذا العامل في فيفو عامل تباين الموجات فوق الصوتية، وتتبع في الموقع من إينجيكتاتي السابقين فيفو. في الواقع، قد وصف الخلائط المعقدة من عوامل التباين و في الموقع تتبع المواد سابقا مورين دراسات تهدف إلى تقديم إينجيكتاتيس في عضلة القلب29. بيد نظراً لخصائص اتشوجينيك InI وقدراته التتبع في الموقع ، هذه المادة يمكن أن تكون مفيدة جداً أثناء اكتساب الكفاءة بينما يتلقون تدريبا مع هذا الأسلوب.
تأكيد تسليم إينجيكتاتي التي تحتوي على كلا InI كذلك كخلايا EGFP(+) HEK-293 استخدام immunohistochemistry يوضح مدى انطباق هذه التقنية للبحوث الإكلينيكية تهدف إلى العلاج بالخلايا الجذعية. IMI InI بالاشتراك مع EGFP(+) HEK-293 أدت إلى استجابة التهابات حادة مع ارتشاح بالعدلات الغالبة، مما يشير إلى استجابة لرفض الخلوية الحادة (خلال 24 ساعة) للخلايا إكسينوجينيك. ربما أن هذا الرد ليس مفاجئاً في حيوان الأشخاص. من ناحية أخرى، آثار IMI مع InI وحدها أيضا استجابة التهابات حادة (خلال 24 ساعة) في أنسجة عضلة القلب المعالجة، التي عرضت التغلغل بلعم الغالبة. يتم وصف هذا تمشيا مع ملاحظة التهاب حاد في الدراسات السابقة بعد IMI ضمن طريقة العرض المباشر في صدره فتح إجراء4،30،31،،من3233. لوحظ التهاب حاد أيضا عند حقن المحلول الملحي العادي أو حلول برنامج تلفزيوني في ال34،عضلة القلب35، وحتى في عضلات الساق الفئران36، وذا كان هذا الرد وارجع إلى إصابة الأنسجة مباشرة بدلاً من إينجيكتاتي في حد ذاتها. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 الواقع، "المجتمع الدولي" "البحوث متعدية القلب والأوعية الدموية" وتسلم شائع من التهاب في تحديد IMI، ولكن هناك أي توافق في الآراء بشأن ما إذا كان أو لم يكن التدابير الرامية إلى الحد من هذه العملية خلال الوقت الإجرائية المحيطة مفيدة (مثلاً، عن طريق الوريد (رابعا) القشرية)37. على الرغم من التهاب في هذه الدراسة يمكن أن يعزى أيضا إلى نسيج الضرر المباشر، كما تشير النتائج InI كجسم غريب يجب أن تلعب أيضا دوراً في هذه العملية، وقدمت عددا من الضامة يبدو أن يكون فاجوسيتيزينج InI (3F الشكل). تحليل دقيق للآثار الفنية لهذا الالتهاب الحاد الثانوية إلى IMI داخل القلب، أو أم لا هذه يمكن تخفيفها عن طريق إدارة العقاقير الوقائية مثل القشرية خارج نطاق هذه المخطوطة. ومع ذلك، عن طريق الجلد التباين توجيه ضربات القلب IMI إلى أربع مناطق مستهدفة لعضلة القلب، بحجم إينجيكتاتي ليصل إلى 0.25 مل (1.25 × 106 خلايا) في موقع IMI، كان جداً جيد التحمل في الأرنب.
مع أكثر من 60 إجراءات تنفيذها حتى الآن، وبعد تحقيق الكفاءة، وفيات ثانوية بالنسبة للإجراءات التي كانت منخفضة للغاية. على سبيل المثال، أي حالة وفاة حدثت في الأفواج اثنين هو موضح في الخطوة 3.9 (مجموعات عادي ودوكس) بعد IMI. في الواقع، حتى بعد 67 IMI إجراءات تنفيذها كجزء من برنامج البحوث الجارية، لدينا فقط حالتا وفاة تتصل مباشرة بالإجراء (2.9% وفيات). في واحدة من هذه، اتضح وجود تدمي التامور في الفحص بعد الوفاة ، بينما الآخر وضع العلامات العصبية السريرية، تمشيا مع الاسكيمية الدماغي الحاد الثانوي لحدث كارديومبوليك، مما يتطلب نقطة النهاية إنسانية. هذا معدل الوفيات (2.9%) أقل بكثير من التي تبلغ عنها لو et al. (11 في المائة)8 ومو et al. (27 في المائة)،38في الأرانب التي تلقت IMI إطار العرض مباشرة في إجراء فتح صدر. وهكذا، نعتبر الإجراء الموضح في الدراسة الحالية أن تكون آمنة، ونقوم باستخدام هذه التقنية في الدراسات الجارية لتقييم العلاج القائم على الخلايا الجذعية في نموذج أرنب أيكم مع نتائج واعدة39،40.
وهناك عدة نقاط حرجة للنجاح عن طريق الجلد على النقيض IMI توجيه ضربات القلب. أولاً، ضمان الحصول على طريقة عرض محور قصير باراستيرنال على مستوى العضلات الحليمية مع تحديد واضح لملامح للوفلر وابيكارديال. التالية، تأكد من طرف الإبرة داخل مجال الرؤية في جميع الأوقات مرة واحدة وهذا قد دخلت تجويف الصدر وعضلة القلب منع تسليم عرضي في الفضاء التامور أو الدائرة LV. ثم تأكد من أن تبقى إلى الحد أدنى عدد الممرات من خلال تجويف الصدر، وفي تامور وعضلة القلب، وبهذا يمكن أن تزيد من احتمال الصدمات المحلية (مثلاً، تهتك) لهذه الهياكل، والمخاطر المرتبطة بها من تدمي التامور. ولهذا الغرض، مع الحفاظ على الإبرة في تجويف الصدر (وبعض المواقع المستهدفة، في نفس نقطة دخول في تامور الحشوي (مثلاً، الجدار الجانبي))، بعناية إجراء بعض التغييرات الطفيفة في الإصابة الإبرة من زاوية. وأخيراً، دائماً استخدام إبرة يحتوي ممر واضحة وسهلة من خلال الجلد إلى جوف الصدر، وبالتالي تجنب الحافات إبرة حادة من الدخول في عضلة القلب وتسبب في أضرار كبيرة.
الإجراء الموضحة هنا، ليس فقط يسمح تقديم إينجيكتاتي إلى العديد من المواقع المستهدفة داخل عضلة القلب موثوقة وناجحة، ولكن يسمح أيضا تصحيح مسار إبرة في الوقت الحقيقي، وبالتالي منع (التسليم إينتراتشامبير عرضي الشكل 2، ح.) وفي حين أغلقت إجراءات IMI الصدر قد وصفت سابقا في الفئران، وهناك العديد من القيود الملازمة لهذا النموذج الحيوانات الصغيرة. وتشمل هذه القيود العدد من المناطق المستهدفة لعضلة القلب قابلة للعلاج، وانخفاض الحجم/عدد الخلايا التي يمكن حقنها كل هدف الموقع29،41. وباﻹضافة إلى ذلك، تسليم دقيقة إينجيكتاتي غالباً مصدر قلق، مع نسبة نجاح ما يقرب من42من 60-70%، وذلك هو استخدام نظم الموجات فوق الصوتية أقل توافرا عالية التردد المطلوب عادة29،41، 42. هذه الأنظمة مجهزة بمحولات الطاقة الصفيف الخطية التي لها أيضا القيود الملازمة للتصوير (مثلاً، صدى قطعة أثرية متكررة)14. قيد آخر من نماذج القوارض الصغيرة مثل الفئران والجرذان، وهو الخلافات الجوهرية في نظام النقل+ 2 Ca والكهربية الخلوية، التي تختلف عن البشر ونماذج الحيوانات كبيرة الحجم مثل الكلاب والخنازير والأرانب 1516،،43. كل هذه القيود غالباً ما يخلق صعوبات في ترجمة نتائج هذه النماذج في العيادة دون تأكيد مسبق في نموذج حيوانات كبيرة.
أن الرصد الدقيق للحيوان في الفترة القريبة الإجرائية إلزامي وفقا للمبادئ التوجيهية المعاصرة لرعاية الحيوانات المختبرية. كما هو موضح هنا، يمكن أن يتم هذا بمسح إطار المسلسل تخطيط صدى القلب ووسم ECG، على الأقل حتى يصبح الحيوان مستيقظا من التخدير. آثار IMI الحادة على إيقاع القلب أيضا يمكن أن ترصدها ح 24 هولتر تخطيط القلب وممارستنا القياسية. من المذكرة، عدم انتظام ضربات القلب الأكثر شيوعاً كانت معزولة PVC، التي تعتبر معتدلة نسبيا في طبيعتها، والتي كانت أكثر شيوعاً في الحيوانات التي عولجت مع ميتوتريكسات قبل IMI مع InI (انظر الشكل 4A و الشكل 5A). الأخرى عدم انتظام ضربات القلب التي تواترت أقل نسبيا وتشمل: بوليفينيل الكلوريد في مقاطع؛ بولي كلوريد الفينيل في ثلاثة توائم؛ ونسفت (انظر الشكل 4 باء–د و الشكل 5B–د). ومع ذلك، لوحظت لا الحياة يهدد عدم انتظام ضربات القلب مثل خفقان البطين المطرد. من المذكرة، وجدنا أيضا أن بعض مظاهر كارديوتوكسيك في المجموعة دوكس يمكن الكشف عنها بواسطة "تخطيط القلب هولتر" رصد، واستخدام الوقت مجال التردد متغيرات تقلب معدل ضربات القلب (HRV) مثل سدنن. وهكذا، لوحظ انخفاض سدنن (الشكل 5E، F)، غير الخطية تدبير-قلب الحالة الصحية، في المجموعة دوكس مقارنة بالمجموعة العادية. هذا هو التقرير الأول لانخفاض HRV، كما تجلى انخفاض سدنن، ونموذج أيكم، الذي يتماشى مع ملاحظة أن تخفيض سدنن في سياق أرنب مؤشرا مستقلة قوية لموت القلب في المرضى الذين يعانون من هفريف44 ،،من4546. التعديلات في سدنن في المجموعة دوكس ربما لا تتصل بالإجراء IMI نفسها؛ ومع ذلك، تأكيدا لهذه النتائج في الأرانب تلقي ميتوتريكسات، فضلا عن الحيوانات العادية التي لا تتلقى IMI، مطلوب. ما إذا كان انخفاض سدنن في هفريف يمكن أيضا تحسن، وذلك استخدامها كمقياس بديل للاستفادة العلاج بالخلايا الجذعية على أساس، ما زال يتم تقييمه، وسوف يكون التركيز البحوث في المستقبل.
تم استكشاف عدة طرق التسليم من الخلايا إلى القلب، بما في ذلك في الوريد، إينتراكوروناري، وتسليم إينتراميوكارديال؛ بيد أن الطريق إينتراميوكارديال المستخدمة هنا، أظهرت استمرار مستوى أكبر من الخلية معدلات استبقاء1،3،2،،من45،37. ونحن لم تقيم معدل استبقاء خلية في الدراسات المقدمة هنا، المنهجية المستخدمة ليست قوية ومحددة بما يكفي كوانتيتاتي هذا في فيفو أو السابقين فيفو، الذي حد من هذه الدراسة. بدلاً من ذلك، استخدمنا خلايا EGFP(+) HEK-293 خصائصها المظهرية سمح لنا بتميز بسهولة وجود هذه الخلايا في عضلة القلب، مما يشير إلى تسليم إينتراميوكارديال ناجحة. ومع ذلك، كان الهدف الرئيسي لتطوير تقنية مينيملي حيث يمكن أن نقوم بتسليم IMI وخلية في عضلة القلب من نموذج كبير الحجم، السريرية لاعتلال عضلة القلب غير الدماغية. كما هو موضح في الشكل 2 و الشكل 3، تم إنجاز هذا للمرة الأولى قبل عن طريق الجلد على النقيض IMI توجيه ضربات القلب. إجراء المزيد من الدراسات ضرورية لتقييم معدل احتفاظ الخلية، فضلا عن أي احتمال تسليم الآثار المفيدة للخلايا الجذعية في عضلة القلب استخدام الإجراء الموضح في هذه الوثيقة؛ ويجري حاليا هذه الدراسات. نحن أبلغت مؤخرا نتائج واعدة فيما يتعلق بالآثار الفنية39،40.
مقارنة IMI في إجراء فتح صدر، تباين عن طريق الجلد توجيه ضربات القلب IMI في نموذج الإكلينيكية كبير كالمذكورة في هذه الدراسة، إلى حد كبير أقل الغازية في الطبيعة مع انتعاش سريع للحيوان في الإجراء التالي، وحسب المذكورة أعلاه، كما أن معدل وفيات أقل8،38. هو نهج آخر إلى IMI IMI المستندة إلى القسطرة، التي تم اختبارها أيضا في نماذج الإكلينيكية والعديد من التجارب السريرية الصغيرة (استعراض، انظر شنغ et al.) 47-مع هذا النهج، هو المتقدم في تجويف LV قسطرة وثم المتمركزة في المواقع المستهدفة داخل البطانة. هذه المواقع المستهدفة أما قبل الإجراء، مثلاً، استخدام التباين القلب التصوير بالرنين المغناطيسي (CMR)48، أو أثناء الإجراء، مثلاً، التي حددتها الخرائط للوفلر الكهروميكانيكية (يم)، بوضوح التفريق بين عضلة القلب قابلة للتطبيق قبل حقن49. هذا النهج الأخير أقل الغازية مقارنة بفتح الصدر IMI ضمن طريقة العرض المباشر، وميزة واضحة. أيضا، منذ منتمين في البشر توزيعاً متفاوتاً، يساعد أم المباشرة في العلاج على وجه التحديد لمواقع قابلة للاستمرار لعضلة القلب، الذي يكتسي أهمية خاصة في الإعداد للرابطة. عيب رئيسي غير التعريفي لعدم انتظام ضربات البطين، وسمه مشتركة بين جميع IMI النهج. وتشمل العوائق الأخرى الوقت إجرائية مطولة، توفير أم هو أسلوب صعبة جداً التي تتطلب تدريبا مكثفا، وخطر انثقاب القلب المرتبطة بها. في المقابل، التباين عن طريق الجلد توجيه ضربات القلب IMI كما هو موضح في هذه الدراسة، من الناحية الفنية أقل تطلبا من IMI المستندة إلى قسطرة، ومتى تحقق الكفاءة، ويمكن أداؤها بأمان داخل 25 دقيقة بعد التخدير. وبالمثل، منذ جزء قصير من الإبرة فقط متقدمة في عضلة القلب، هناك انخفاض خطر انثقاب القلب، على الرغم من أن تهتك القلب لا يزال ممكناً.
وفي الختام، التباين عن طريق الجلد توجيه ضربات القلب IMI الأسلوب الموصوفة في هذه الدراسة في نموذج حيوانات كبيرة، مثل أرنب16،43، أمن وجيد التحمل، وفعالة في إيصال إينجيكتاتي إلى القلب. ولذلك، فإنه يشكل استراتيجية واعدة لاختبار الفرضية الإكلينيكية من آثار القلب المداواة التجدد في اعتلال عضلة القلب غير الدماغية (مثلاً، أيكم)، بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على، القائمة على الخلايا الجذعية العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون مونفورت شيلا، بريندا مارتينيز، كارلوس Micó، ألبرتو مونيوز، ومانويل مولينا للدعم الممتاز أثناء جمع البيانات، و "كارلوس بوينو" لتزويد الخلايا EGFP(+) HEK-293. وأيد هذا العمل جزئيا: مؤسسة Séneca، ص دي وكالة العلوم التكنولوجيا، المنطقة دي مورسيا، إسبانيا (ج ت) (منح عدد: 11935/PI/09)؛ العلاج دي الأحمر Celular، إيسسيي الفرعية. جرال. Redes، دي PN السادس أنا + د + أنا 2008-2011 (لا منحة. RD12/0019/0001) (جم)، تشترك في تمويله التمويل الهيكلي من "الاتحاد الأوروبي" (FEDER) (جم)؛ وجامعة ريدينغ، المملكة (AG، غيغابايت) المتحدة (التمويل المركزي). وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HD11 XE Ultrasound System | Philips | 10670267 | Echocardiography system. |
| S12-4 | Philips | B01YgG | 4-12 MHz phase array transducer |
| Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | over-the-needle catheter |
| Omnifix-F 1 ml syringe | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamine) | Merial | RN 9767 | Veterinary prescription is necessary |
| Domtor (Medetomidine) | Esteve | CN 570686.3 | Veterinary prescription is necessary |
| Heating Pad | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | India (China) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | 24 h Holter ECG system. |
| Electrodes Blue Sensor® | Ambu (NUMED) | VLC-00-S | Holter ECG electrodes. |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Microscope | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector Elite | Vector Laboratories | PK-6200 | Avidin Biotin Complex Kit. |
| Chicken anti-GFP antibody | Invitrogen | A10262 | Primary antibody. |
| Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-9010 | Secondary Antibody. |
| 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Fluorescence Microscope | Carl Zeiss MicroImaging |
Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter ECG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Fisher Scientific | 11965084 | |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Fisher Scientific | 11573397 | |
| 0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) | Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Fisher Scientific | 31985070 | |
| Hygromycin B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xylene (histological) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronase | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
References
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
- Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
- Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
- Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
- Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
- McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
- Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
- Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
- Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
- De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
- Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
- Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
- Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
- Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
- Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
- Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
- Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
- Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
- Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
- Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
- Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
- Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
- Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
- Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
- Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
- Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
- Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
- Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
- Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. , Academic Press. 13-23 (2016).
- Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
- Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
- Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
- Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
- Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
- Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. , e51566 (2014).
- Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
- Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
- Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
- Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
- Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
- Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).
