Summary
심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.
Abstract
세포 및 유전자 치료는 흥분 하 고 심장 마비와의 설정에서 심장 재생을 위해 유망 전략 감소 방출 분수 (HFrEF). 전에 그들은 사용을 위해 고려 하 고 인간에서 구현 수, 광범위 한 임상 연구 필요 큰 동물 모델에서 안전, 효능, 심근에 전달 한 번 injectate (예를들면, 줄기 세포)의 운명을 평가 합니다. 작은 설치류 모델 제공 장점 (예를 들어, 비용 효율성, 유전자 조작에 대 한 순종); 그러나, 이러한 연구 결과 거의 진료소로 변환 이러한 모델의 한계를 감안할 때. 반대로, 토끼, 동물 모델을 큰 장점 (예, 인간 및 다른 큰 동물에 비해 비슷한 심장 전기 생리학), 있다 좋은 비용 효율적인 균형을 유지 하는 동안. 여기는 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 (IMI) 기술, 최소 침 습, 안전 하 고, 잘 용납 하 고 셀을 포함 하 여 injectates의 대상된 배달에 매우 효과적인 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 토끼 모델의 심근 내에서 여러 위치에 이 기술 구현 하기 위한 우리 또한 널리 임상 심장 초음파 시스템의 장점을 촬영 했습니다. 두기 후에 연습에서 여기에 설명 된 프로토콜, 기본 초음파 기술 연구원 실험, 가설의 목적에서 일상적인 사용을 위한이 다양 하 고 최소한 침략 적 기법의 성능에 유능한 될 것 이다는 토끼 모델에서 심장 재생 치료제의 기능. 역량을 달성 하 고, 일단 모든 절차 토끼 anaesthetizing 후 25 분 내에서 수행할 수 있습니다.
Introduction
세포 및 유전자 치료 흥미로운 고도 HFrEF에 부상된 심근 재생/수리에 대 한 전략을 개발. 몇 가지 연구는 지속적으로 intracoronary 또는 정 맥 경로1,2 이상의 IMI의 우수성을 증명 하고있다 셀 배달의 다른 노선의 효과 (예를 들어, 셀 유지 비율)을 비교 , 3 , 4 , 5. 따라서, 그것은 놀라운 부상된 심근의 줄기 세포 치료의 변환 모델에 대 한 연구의 큰 비율 IMI는 오픈 가슴 절차6,7에서에서 직접 보기 아래 수행을 통해 injectate 제공 . 그러나,이 접근 peri 절차 사망률 (자주 아래 보고)8의 위험을 운반 절차의 침략 적인 본질을 포함 한 몇 가지 제한이 있다. 또한, 직접 보기 아래 IMI는 심 실 구멍에 실수로 주입에 대 한 가능성을 제거 하지 않습니다. 임상 연습에서 오픈 가슴 수술 동안 IMI 치료 세포 배달, 예를 들어에 대 한 적절 한 방법이 될 수, 동안 관상동맥 우회 이식 수술 (관상); 그러나,이 방법은 않을 수 있습니다 셀 배달에 대 한 적절 한 비-허 혈 성 근원 (예를 들어, HFrEF 안트라사이클린 유발 심근 (AICM)을 보조)의 글로벌 심근에.
의심의 여지가 그 허 혈 성 심장 질환 (IHD)는 HFrEF의 가장 일반적인 원인입니다 (~ 66%)9,10; 그러나, AICM를 포함 하 여 비-허 혈 성 심근 여전히 영향을 미치는 환자 HFrEF (33%)9 의 상당 비율을 차지 . 실제로, 임상 종양학의 최근 발전 귀착되 유럽, 암 환자12의 향상 된 생존에 대 한 전반적인 트렌드와 비슷한 숫자의 견적 미국 혼자11, 암 10 백만 이상의 생존자 ,13. 따라서, 환자 수가 증가 주어진와 같은 줄기 세포 이식 줄기 세포 전달의 효과적이 고 최소 침 습 루트의 시험 뿐 아니라 비-허 혈 성 심장 근육 병 증에 대 한 최대 중요성은 소설 치료의 혜택을 탐험, cardiotoxicity 보조 항 암 약물에 의해 영향을 받습니다.
노트, 가설 연구 부상된 심근을 자주으로 수리 재생성을 목표로 줄기 세포 치료를 사용 하 여 테스트 (예:마우스, 쥐) 작은 설치류의 사용을 포함. 이러한 모델 종종 일반적으로 일부 연결된 한계 (예를 들면, 반향)14있는 선형 배열 트랜스듀서를 장착 하는 심근 기능의 평가 위한 비싼 높은 주파수 초음파 시스템을 필요로 합니다. 그러나, 토끼, 대표 하는 대형 전 임상 모델을 다른 모델 HFrEF에서 줄기 세포 치료의 가설에 대 한 몇 가지 장점이 있다. 따라서, 쥐 및 쥐, 달리 토끼 유지 Ca+ 2 교통 시스템 및 인간과 기타 큰 동물 (예:개, 돼지)15,16,17의 유사한 세포 생리학 ,,1819. 또 다른 장점은, 심장 초음파 이미징 사용 하 여 상대적으로 저렴 한과 널리 임상 심장 초음파 시스템 상대적으로 높은 주파수 위상 배열 트랜스듀서, 예를 들면, 12mhz와 같은 대 한 그들의 순종은 그 신생아 및 소아 심장에서 자주 사용 됩니다. 이러한 시스템 첨단 기술, 우수한 echocardiographic 이미징 허용 하 고 그들은 고조파 이미징20의 우월의 활용. 또한,에 배달 심장 재생 요법 (예를 들어, 줄기 세포 치료)의 잠재력, 그들의 안전, 효능, cardiomyogenic 잠재력으로 평가 injectate의 운명의 한 번의 광범위 한 가설에 심근, 인간의 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 그리고 그들은 큰 전 임상 동물 모델, 토끼17,19의 사용을 필요로 하기 전에 필수입니다. 여기, 우리는 줄기 세포 이식에 기초를 둔 치료 비-허 혈 성 심근20 대를 겨냥 하는 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여 경 피 적인 대비-심장 초음파 유도 IMI 통해 셀 배달에 대 한 최소 침 습 기술을 설명합니다 . 우리는 또한 토끼 심장에 injectate의 한 초음파 대비 에이전트와 제자리에서 추적으로 인도 잉크 (InI, 또한으로 알려진 중국 잉크)의 혜택을 설명합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 실험 대학 무르시아, 스페인의 윤리 연구 위원회에 의해 승인 했다 고 유럽 연합 지침 2010/63/유럽 위원회의에 따라 수행 했다. 설명 하는 단계는 작업의 계획의 일부를 전적으로이 종이 동반 비디오 촬영을 위해 수행 되지 표준 작동 프로토콜에서 수행 했다.
1. 셀과 포유류 표정 벡터의 준비
참고: 여기, 우리가 간략하게 설명 준비 및 셀 선 (인간 미 발달 신장 293 (HEK 293));의 transfection에 대 한 프로토콜 그러나, 적절 한 셀의 셀 유형에 대 한 특정 프로토콜 최적화 (예를 들어, 줄기 세포) 이어야 한다.
- 높은 포도 당 Dulbecco HEK 293 세포는이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 1% 페니실린/스, 보충 하 고 5%를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 incubated 수정의 유지 CO2 . 일단 셀 하위 confluent 1: 3의 비율로 분할.
- 분할 셀 미디어, 발음와 살 균 성 세척 한 번는 식 염 수 (PBS)을 버퍼링 시작 하 고 초과 PBS를 제거 한 다음 트립 신-Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (5 분, 37 ° C) x 0.5 2.5 mL와 함께 품 어.
- DMEM 미디어 (위에서 설명한 대로 보충)의 한 볼륨 추가 반응을, 중지 하 고 다음 천천히 그리고 부드럽게 위아래로 전자 피 펫으로 발음 하 여 세포를 분리.
- 다음, 적절 한 컨테이너 (예를 들어, 15-50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브)에 세포 현 탁 액을 전송. Centrifuge 스윙 양동이 (100 x g)에 상쾌한 삭제 하 고, 두 번 살 균 PBS 가진 펠 릿을 세척.
- 신선한 문화 플라스 크 또는 로컬 실험실 관행에 따라 큰 요리에 신선한 DMEM 미디어 및 적절 한 셀 밀도 (예를 들어, 75 cm2 플라스 크에 1 x 106 셀)에 씨앗에 펠 렛을 resuspend.
- 2 일 마다 신선한 미디어와 기존 미디어를 교체 합니다.
참고: 표정 벡터 pIRES1hyg에서 파생 되었고 제조업체의 지침에 따라 앞에서 설명한21사용. p(EGFP) IRES1hyg로 BamHI + 노트를 BamHI로 pEGFP-n 1에서 삽입 + 노트 소화 pIRES1hyg21EGFP cDNA subcloning 의해 생성 된.
- 2 일 마다 신선한 미디어와 기존 미디어를 교체 합니다.
- transfection, 전에 1 일 0.5 x 12 또는 24 잘 조직 배양 배지에서 105 셀/c m2 의 조밀도에 씨 HEK 293 세포.
- Transfection 당일 별도 1.5 mL microcentrifuge 관 (1 관/잘)에서 DNA 지질 transfection 시 약 단지를 준비 합니다.
- 각 튜브에 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L을 추가 하 여 시작 하 고 다음 4 µ g의 DNA를 추가 (부드럽게 혼합).
- 그 후, 각 관에 10 µ L 지질 transfection 시 약의 이전 준비 믹스 및 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L에서 250 µ L을 추가 (다시 부드럽게 혼합).
- 마지막으로, transfections, DNA 지질 transfection 시 단지 4 h, HEK 293 세포를 배양 하 여 진행 DMEM 매체 보충 (단계 1.1), 위에서 설명한 대로 대체 하 고 또 다른 48 h. 안정적인 수행 약물 선택에 대 한 품 어 100 µ g/mL hygromycin B.와 transfectants
- 트립 신 (1.2 단계) 위에서 설명한 대로 HEK 293 세포를 분리 합니다. 씻은 후 멸 균 PBS에 셀, 마지막 셀 5 x 106/mL의 농도 달성 하기 위해 (예를 들어, 10 %v / v PBS에 InI), 적절 한 차량에 resuspend.
2입니다. 토끼의 준비
참고: 최적의 형태 및 동물의 심장의 기능을 평가 하는 IMI에 대 한 토끼와 변환기의 위치. 따라서, 그것은 실험 설계에 의해 정의 된 대로 완전 한 echocardiographic 시험20 IMI (아래 참조), 이전 및 이후의 시간 지점에서 수행 하는 것이 좋습니다. 이것은 특성을 평가 하는 기준 해 부와 기능적인 동물에서 심장의 주사를 받게 되며 또한 심장의 기능에 IMI의 효과 평가 하고자 합니다.
- 심장 혈관 이미징에 대 한 멀게 패션에서 고 수의 내과 및 심장 초음파/유럽 협회의 미국 사회의 미국 대학 심장 초음파 위원회의 지침에 따라이 검사를 수행 22 , 23 , 24.
- 전체 echocardiographic 연구를 통해 동시 1-리드 심전도 (ECG) 추적을 가져옵니다.
- 마 취 제와 함께 토끼를 anesthetize 10 mg/kg, medetomidine 200 µ g/k g, 근육 (인스턴트 메신저) 주사와 함께.
- 마 취의 관리에 따라 10-20 분 후 마 취의 수준을 확인 합니다.
- 널리 가슴 머리를 제거 하는 머리 깎기를 사용 하 여 (예를 들어, 하위 xiphoid 지역 목 아래) (그림 1A).
- 오른쪽 forelimb (mediocubital 지역)의 두 뒷 다리 사지 (mediotibial 지역)의 내부 얼굴에 1-2 cm2 의 추가 영역을 면도 (그림 1B).
- 접착제 ECG 전극 동기적 과정 (그림 1C) 심장 박동을 모니터링 하는 사지의 면도 영역에 배치 합니다.
- (그림 1C) 테이블에 연결 된 외과 테이프를 사용 하 여 뻗은 팔 다리와 동물 열 담요에 부정사 decubitus 위치에 놓습니다.
- 귀는 근육이 수축 거꾸로 뒤는 머리/토끼, 그리고 있기 때문에이 절차를 통해 동물의 흉부의 정확한 위치를 유지 하는 데 도움이 그것의 앞 발 보다 낮은 위치에서 다는 것을 확인 하십시오.
- 동물 얼굴 마스크 전체 절차 (100%, 2-3 L/min)에 걸쳐 산소를 관리 하는 동안 자연스럽 게 호흡을 허용 합니다.
그림 1입니다. IMI는 토끼의 준비. (A) 흉부;에서 헤어 클립 (B) 사지;에서 헤어 클립 (C) 전극을 연결 하 고 열 담요에 뻗은 다리는 토끼를 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
3. 경 피 적인 대비 IMI 심장 초음파 기반 기술 토끼에
- 청소 하 고 소독 액체를 기반 솔루션으로 흉부의 피부.
- 전체 절차를 통해 무 균 기술을 사용 하 여 현재 모범 사례에 따라.
- 가능 하다 면, 그리고 합리적으로 가능한 경우, 포함 하 되이 제한 되지 않음, 가운, 장갑, 외과 상처 커튼, 살 균 초음파로는 테이블에 대 한 자료를 드레싱 살 균 살 균 소재를 사용 하 여 완전히 멸 균 절차 수행 트랜스듀서 커버 및 살 균 초음파 젤. 이 최소 수신 IMI, 동물 병원 균 도입의 위험을 줄일 것 이다 이며 임상 설정 (예를 들어, 심장 찔린 동안)에 표준 연습.
참고: 그것은 항상 로컬 기관에 적용 가능한 동물 연구의 지역 및 국가 규정 및 국가 연습 진행을 권장.
- 가슴 및 변환기, 그리고 실험의 목 변환기 코드 초음파 전송 젤을 적용, 종종 해부학을 시각화 하 고 있는 IMI에 대 한 계획에 도움이 되는 동물의 심장의 빠른 창 스캔 합니다.
- 4회-6번째 있는 공간, 2-3 cm는 부각의 각으로 오른쪽 parasternal 라인에서 변환기를 수동으로 배치 ~ 흉 벽 (그림 2A)의 오른쪽에 관하여 90 °.
- 있는 공간으로 그것의 anteroposterior 및 젖꼭지 근육의 수준에서 수정 된 짧은 축 보기를 최적화 하기 위해 dorsoventral 각도 변환기의 위치를 조정 합니다. 오른쪽 심 실 (RV), 좌 심 실 (LV), interventricular 심장 (IVS), 후부 벽 (비밀 번호), 뿐만 아니라 anterolateral (알) 및 (그림 2B) posteromedial (오후) 젖꼭지 근육이이 보기에서 확인 합니다.
- (예를 들어, 버튼, 다이얼) 시스템에 적절 한 컨트롤을 사용 하 여 깊이 크게 증가 하 여 넓은 시야를가지고.
- 이 보기, 뿐만 아니라 endocardial 및 epicardial 등고선의 적절 한 차별화에 대칭 이미지를 얻기에 특히 주의 하 고, 필요한 경우 이미지 최적화 컨트롤 (예를 들어, 이득)을 통해 조정.
- 일단 최적의 echocardiographic 보기 (그림 2B)을 얻을 두 번째 연산자 IMI (아래 참조)를 수행 하는 동안, 절차의 나머지 부분에 걸쳐이 위치를 유지 합니다.
- 변환기를 들고, 하는 동안 은폐 해야 항상 직면 하 고 있을 앞으로, 이후 단계 (그림 2A, C)에 바늘의 정렬 되므로 변환기 방향 표시 하지 마십시오.
- 24 G 바늘 1 mL 주사기에 연결, 왼쪽된 hemithorax의 피부 근처 바늘 변환기에 관하여 대칭 미러링 위치에 놓습니다. 그런 다음, 수동으로 정렬 바늘의 각도 변환기 방향 마크와 함께 ~ 90 ° (그림 2C), 천천히 바늘을 통해 피부와 흉 강에 진출.
참고:이 위치 및 방향에서 경 피 적인 바늘 삽입을 용이 하 게 초음파 빔 (2D 그림, E)의 비행기에서 바늘의 시각화 되므로 실시간으로 모니터링 하 고, 필요한 경우의 조정 (그림 2 G, H) 심근의 대상 지역 기준으로 바늘의 위치입니다. - 대상 위치에서 팁을 천천히 제공 하는 injectate (최대 사출 사이트 당 0.25 mL) 10-30 s (그림 2E), 치료를 천천히 그리고 부드럽게 주입 심근의 범위를 증가 하는 동안 바늘을 제거 하는 동안 내.
- InI를 사용 하 여 10% (v/v)에 희석 PBS 표준화 기술, 그리고 현장에 추적에 대 한 확인 심근 내의 모든 4 개의 IMI 사이트의 성공적인 대상으로 역량, 또한 취득 하는 동안 심한 병 리와 histopathology (참조 대표 결과)입니다. 역량 달성 되 면 원하는 경우 InI 적당 한 상업적인 초음파 대비 에이전트에 의해 대체 수 있습니다.
참고: 10% (v/v) InI에에서 희석 PBS 또는 셀 없이 과거 hyperechogenicity (즉, 에코 밝은 모양)에서 심근 결과에 주입 (그림 2E, F)의 대상 사이트에서의 배달. 과도 감속 또는 조 숙한 심 실 수축 (예를 들면, 절연 couplets, 세 쌍둥이)와 관련 된 심장 박동의 가속은 epicardium와 바늘의 첫 접촉에서 자주 관찰 된다 뿐만 아니라 동안 또는 IMI 직후. 그러나, 아니 생명을 위협 하는 부정맥, 개발 하 고 심각한 부작용은 거의 IMI 사출 사이트 당 injectate의 최대 0.25 mL (1.25 x 106 셀)를 사용 하 여 관찰 ( 대표 결과 토론을 참조).
- InI를 사용 하 여 10% (v/v)에 희석 PBS 표준화 기술, 그리고 현장에 추적에 대 한 확인 심근 내의 모든 4 개의 IMI 사이트의 성공적인 대상으로 역량, 또한 취득 하는 동안 심한 병 리와 histopathology (참조 대표 결과)입니다. 역량 달성 되 면 원하는 경우 InI 적당 한 상업적인 초음파 대비 에이전트에 의해 대체 수 있습니다.
- (3 심 실 왼쪽에 무료 벽 (LVFW)와 IVS에서) 4 개의 대상 IMI 사이트의 각각에 0.25 mL의 주입을 완료 하는 데 필요한 바늘의 부각의 각의 미묘한 변화를 수행 합니다.
- 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI 절차를 완료 한 후 (예를 들어, 직렬 ECG 추적 및 24 시간 Holter 심전도 통해), 심장 리듬을 평가 하 고 검사 직렬 창 echocardiographic의 부재를 확인 하 합병증, 동물 완전히 가벼운 주기 룸에 마 취 및 다음 전송에서 복구 될 때까지.
- 여기, 우리는 24 h에 대 한 심장 리듬에 InI와 IMI의 효과 모니터링 하는 데 24 시간 Holter ECG 사용 합니다. 이 위해, 우리 정상 표현 형 (일반 그룹)와 6 토끼의 그룹 및 독 소 루비 (cardiotoxic 안트라사이클린 약물, 암;의 처리에 일반적으로 사용의 정 맥 행정을 받은 6 토끼의 그룹 비교 DOX 그룹) 2 mg/kg의 복용량에 / 8 주, 주 다음 두 동료 InI와 IMI를 받았다.
그림 2 . 토끼에서 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입. (A)의 각도에서 오른쪽 hemithorax에 변환기의 배치 ~ 90 °. (B) 토끼에 젖꼭지 근육의 수준에서 심장의 parasternal 짧은 축 보기 (PSSX)의 대표 이미지. (C)의 각도에서 바늘의 맞춤 ~ 변환기 방향 표시를 기준으로 90 °. (D) 심장 (참고 바늘 초음파 광속의 평면에 쉽게 시각 이다)의 PSSX 뷰에서 대상 사이트에서 바늘의 위치입니다. (E 와 F) 인도 잉크 (화살촉 강조 과거 hyperechogenicity)와 intramyocardial 주입 시 대상 사이트에서 hyperechogenicity의 데모. (G) LV 챔버에 바늘의 실수로 위치 (화살촉 바늘 샤프트 강조). (H) Repositioning LV 무료 벽에 바늘의 (화살촉 바늘 샤프트 강조). RV를 = 우 심; 라스베가스 = 왼쪽된 심 실; IVS = interventricular 심장; 비밀 번호 = 후부 벽; 알 = anterolateral 젖꼭지 근육; 오후 = posteromedial 젖꼭지 근육. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
4. 게시물 IMI 분석
- 토끼에서 심장 조직 샘플의 histopathological 분석을 수행 합니다.
- 10% 포름알데히드, 다음과 같이 에탄올 농도 증가 함께 탈수 뒤에 조직 24 h에 대 한 수정:
• 1 x 70% (60 분)
• 1 x 95 %ethanol/5% 메탄올 (60 분)
• 1 x 100% (60 분)
• 1 x 100% (90 분)
• 1 x 100% (120 분)
참고: 위의 모든 외피는 실 온 (RT)에서 실시 됩니다. 100% 크 실 렌 (1 시간, RT), 두 번 대체 다음, 그리고 마지막으로 두 단계 (60 분, 58 ° C)25에 파라핀에 포함. - 톰25와 4-5 µ m 조직 섹션을 수행 합니다. 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
- Masson의 trichrome 방법25,,2627와 hematoxylin에 오신 얼룩이 수행 합니다.
- 10% 포름알데히드, 다음과 같이 에탄올 농도 증가 함께 탈수 뒤에 조직 24 h에 대 한 수정:
- 조직 섹션에서 이식된 마음에서 immunohistochemistry EGFP(+) HEK 293 세포 (예를 들어, avidin 비타민 b 복합체 복합물 (ABC) 메서드를 사용 하 여), 간단히 검색을 수행.
- 드 왁 스 100% 크 실 렌 (10 분, RT)에서 4-5 µ m 두꺼운 심장 섹션. 감소 하는 에탄올 농도 솔루션 (100% (2 분)에 2 배, 2 x 95% (2 분), 70% (2 분)에 1 x; 50% (2 분)에 1 x; 1 x 30% (2 분), 1 x ddH2O (2 분)) 실시간으로 세척 하 여 조직 리하이드레이션
- (준비가 30% H2O2, 고 추가 메탄올의 재고 솔루션의 5 mL와 함께 최대 50 mL의 총 볼륨) 메탄올 (에서 희석 3% H2O2 의 100 µ L로 섹션을 취재 하 여 내 인 성 과산화 효소 억제를 수행 품 어 30 분, RT), 그리고 다음 Tris 버퍼 염 분 (TBS, pH 7.6)와 침수로 세척.
- 0.1%의 100 µ L로 섹션을 취재 하 여 효소 처리를 통해 항 원 unmasking 수행 (0.01 g 10 mL TBS에에서 희석 나 준비) 나 (12 분, RT를 품 어), TBS (5 분, RT) 다음 씻어.
- 차단 하는 솔루션 (TBS에서 10%에서 정상 염소 혈 청)에서 품 어 (30 분, RT), 슬라이드 당 100 µ L를 사용 하 여 및 TBS (5 분, RT)로 씻어.
- (1 시간, 30 ° C), 1 차적인 항 체 (TBS에서 1: 500)으로 닭 반 녹색 형광 단백질 (GFP)와 incubate 그리고 TBS (5 분, RT)로 씻어.
- (1 시간, 30 ° C), 이차 항 체 biotinylated 염소-안티-닭고기 IgG (TBS에서 1: 250)와 incubate 고 TBS (5 분, RT)와 다음 씻어.
- Avidin 비타민 b 복합체 복합물 (20 분, 30 ° C)와 함께 incubate 및 다음 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (한 덩어리) (RT, 5-10 분)를 사용 하 여 레이블.
- 마지막으로 세척 되며 오신 방법25를 사용 하 여 counterstain 섹션에 RT, 에탄올 농도 (1 x 30% (2 분), 50% (2 분)에 1 x, 70% (2 분)에 1 x; 2 x 95% (2 분), 100% (2 분)에 2 배) 증가 하 여 탈수 하 고 커버 슬라이드를 탑재. 긍정적인, 부정적인 isotype 컨트롤 뿐만 아니라이 포함 됩니다.
참고: 위에서 설명한 간단한 프로토콜은 아닙니다 일반 immunohistochemistry; 관심의 조직에 대 한 최적화는 필요 합니다.
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Representative Results
경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI InI:
위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 고 바늘의 팁의 최적의 위치는 심장 초음파와 시작 하는 주입에 의해 확인 되었다, 일단 과거 hyperechogenicity InI의 전달 중 관찰 되었다 (PBS에 10 %v / v) (그림 2E) 대상 지역 (그림 2F) IMI 뿐만 조금 후에. IMI 안락사 후 바로 심장 제거 때 InI의 심장 (그림 3A)의 외부 검사 시 쉽게 볼 수 있었다. 또한, 심장 조직 섹션, 예를 들어, 짧은 축 부분 (그림 3B), 젖꼭지 근육의 수준에 따라서의 성공적이 고 효과적인 납품을 보여주는 주사 사이트에서 InI 염료의 과거 예금 밝혀 이 기술을 사용 하 여 심근에 injectate입니다. 메모의 과거 hyperechogenicity vivo에서 IMI (그림 2E, F), ex vivo 표본 (그림 3A, B)에 InI의 과거 예금와 잘 상관 하는 동안 관찰 했다. 이 명확 하 게 InI IMI의 설정에서 듀얼 속성은 설명: vivoin 원래의 전 추적 뿐만 아니라 vivo에서 초음파 대조 대리인. 이러한 속성의 모두이 기술 하는 능력의 취득 동안에 훈련을 위해 특히 매우 다양 하 고 저렴 한 초음파 대비 에이전트 InI를 확인합니다. 따라서, InI의 echogenic 속성 IMI 예:모니터링, 실시간 이미징 기능 확인을 초음파의 주어진 성공적인 IMI 우발적인 내부 챔버 또는 pericardial 공간 주입, 대 고, 필요한 경우 결정 도움말 바늘의 수정 (그림 2G, H) 실시간으로에서 추적합니다. 다른 한편으로, InI의 현장에서 의 추적 기능 가치 대상 심근의 비보 전 표본에는 injectate를 찾을 수 있습니다.
경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI InI 및 EGFP(+) HEK 293 세포:
IMI, 이전 EGFP(+) HEK 293 세포의 성공적인 transfection는 생체 외에서 문화 상태 (그림 3C) 형광 현미경 검사 법에 의해 확인 됐다. 심근으로 EGFP(+) HEK 293 세포의 성공적인 납품 immunohistochemistry InI 예금 관찰 되었다 심장 조직 단면도의 분석을 통해 입증 되었다. 따라서, avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 메서드를 사용 하 여 (단계 4.2 참조), 풍부한 EGFP(+) HEK 293 세포 InI 예금 (그림 3D) interspersed 심근 내에서 발견 됐다. InI의 예금 InI EGFP(+) HEK 293 세포 (그림 3E)와 함께에서 또는 혼자 InI (그림 3 층)을 받은 토끼에서 심근 조직 샘플에서 IMI 후 24 h는 관찰 아직도 했다. 메모의 급성 염증 반응은이 시간이 시점에서 동물 EGFP(+) HEK 293 세포 (그림 3E), 따라서 급성 세포 거절을 제안 받고에서 샘플에 지배적인 neutrophilic 침투와 관찰 되었다. 다른 한편으로, 대 식 세포는 InI 혼자 (그림 3 층)을 받는 동물에서 관찰 되었다.
그림 3 . 제자리에서 매크로 histopathological 평가 및 injectate의 추적. InI (화살촉의 사출 사이트 강조)와 IMI 다음 삭제 심장의 외부 검사에 injectate의 존재의 (A) 시범. Injectate 다음 젖꼭지 근육의 수준에서 심장의 횡 근 섹션에서 InI와 IMI의 과거 분배의 (B) 데모 (파란색 화살표 강조 과거 InI 예금, 흰색 화살표 표시 예금의 하이라이트 InI는 IVS에서)입니다. (C) Autofluorescence에서 시험관에 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 EGFP(+) HEK 293 세포의. (-DF) 삽입 된 사이트의 histopathological 분석입니다. EGFP(+) 셀 0 h (D)에서 심근 내 InI 예금 interspersed 가시는 고 24 h (E) 게시물 IMI (EGFP(+) 셀을 강조 표시 하는 파란색 화살표, 호 중구의 존재를 강조 하는 빨간색 화살표). InI의 예금 InI 혼자와 IMI 다음 24 h (F)에서 심근 내 산재 (파란색 화살표는 대 식 세포의 존재를 강조 표시). RV를 = 우 심; 라스베가스 = 왼쪽된 심 실; IVS = interventricular 심장; IMI Intramyocardial 주입; = InI = 인도 잉크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
60 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI 절차까지 수행 하는 데, 우리는 믿고 주의 세부 사항 및 좋은 동물 처리 및 관리와 함께 절차는 일반적으로 잘 용납, 급성 합병증은 매우 드문 그리고 일반적으로 온화한. IMI, 동안 가장 자주 관찰을 받아야 하 고 잠시 후 절차는 과도 가속 또는 감속 심장 박동의 격리 조기 심 실 컴플렉스 (PVC) (그림 4A)와 관련 된 동물에서 일반적으로, 따라서, 가장 빈번한 부정맥 감지 (총 편수 24 시간 이내)는 밝혔다 24 시간 Holter ECG 모니터링 InI IMI, 통해 혼자 받은 동물의 에피소드의 더 높은 수는 동물에서 발견 된에 불구, PVC 절연 이전 8 주 (그림 5A) DOX 처리. 대련에 세 쌍둥이 PVC 것 처럼 덜 자주 (그림 4B, C 와 그림 5B, C), 세 쌍둥이 훨씬 적은 비록에 자주 DOX-치료 보다 치료 정상 토끼 (그림 5C). 다른 한편으로, 비 지속적인 심 실 심 박 급진 (NSVT) 더 자주 정상적인 동물에서 관찰 되었다 (그림 4D 와 그림 5D). 크게, 평균 심장 박동 아니었다 DOX 정상적인 그룹 사이 다른 InI 혼자 (그림 5E)와 IMI를 받은 후, 하는 동안 정상적인 R-R 간격 (SDNN)의 표준 편차 크게 감소 했다 (< 100 ms) DOX 그룹 ( 그림 5F)입니다. SDNN 심장 건강 상태, 비-선형 측정 이며 따라서이 결과 DOX 그룹에 글로벌 변경 심장 생리 상태 나타냅니다.
그림 4. 24 시간 Holter InI와 IMI를 받은 토끼에서 모니터링 하는 동안 심 실 부정맥 관찰. Holter ECG tachograms에서 가져온 스크린샷을 표시 이미지 오프 라인 분석, 중 화면에 표시 되 고 부정맥 모니터링의 24 h 동안 발견의 가장 일반적인 유형의 대표적인 예를 보여줍니다. (A) 절연 PVC. 대련에서의 (B) PVC 세 쌍둥이에 (C) PVC NSVT (D)입니다. PVC 조 숙한 심 실 수축; = NSVT = 비 지속적인 심 실 심 박 급진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 토끼에 InI와 IMI 다음 24 시간 Holter ECG 모니터링에 의해 발견 하는 arrhythmic 이벤트. 격리 된 PVC (A), 대련 (B), 세 쌍둥이, (C)에 PVC에에서 PVC의 총 수와 독 소 루비 처리 대 치료 토끼 (일반 + IMI) NSVT (D), (3 mg/kg/6 주 동안 주) 토끼 (DOX + IMI), IMI InI와 후. 의미 심장 박동 (E)과 InI와 IMI 후 그룹 정상 + IMI DOX IMI에서 토끼에서 SDNN (F). 데이터는 평균 ± SEM.로 표현 * p < 0.05;를 나타냅니다 # p < 0.01, 일반 + 대 DOX + IMI IMI 비교 나타냅니다 그룹 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
기본 목표는의 사용을 활용 하는 동안 토끼 (대형 크기의 전 임상 동물 모델)17,18, 심근으로 줄기 세포의 배달을 위해 사용 될 수 있는 최소 침 습 기술을 개발 하는 상대적으로 저렴 한 이미징 시스템을 쉽게 사용할 수 많은 임상 연구 센터. 여기, 우리 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여, 표시 하 고 InI, 추적 기능 제자리에 와 echogenic 속성, 심장 초음파-가이드 성공적인 경 피 적인 대비 널리 사용 가능한 에이전트에 의해 주 었 IMI는 매우 효과적 심장 토끼의 대상 지역에 injectate을 제공 합니다. 우리가 알다시피, 이것은 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI와 셀 배달 토끼18,19등 큰 동물 모델에서의 첫 번째 설명 이다. InI 사용 이전 연구에서 조직7,28내에서 injectate의 위치에 지역화 하는 동안 이것은 우리의 지식으로는 비보에 이 에이전트의 듀얼 속성의 첫 번째 설명 초음파 대비 에이전트와 비보 전injectate의 현장에서 추적. 실제로, 조 영제와 제자리에서 물질을 이전 추적의 복잡 한 혼합물 murine 연구 심근29에 injectates를 제공 하기 위한 설명 있다. 그러나, echogenic 속성 InI 및 그것의 원위치에서 추적 기능을 주어진이 물질 수 있습니다 매우 유용한 능력 중이 기술 훈련을 진행 하는 동안.
뿐만 아니라 두 InI 포함 하는 injectate의 납품의 확인 EGFP(+) HEK 293 세포로 immunohistochemistry를 사용 하 여이 기술 겨냥 한 줄기 세포 치료 임상 연구에의 적용을 보여 줍니다. IMI의 InI 함께에서 EGFP(+) HEK 293와 결과 급성 염증 성 반응과 주된 neutrophilic 침투 xenogeneic 셀 (24 시간) 이내 급성 세포의 응답을 제안. 이 응답 아마 immunocompetent 동물에 놀라운 일이 아니다. 다른 한편으로, 혼자 InI와 IMI 또한 주된 대 식 세포 침투 전시 치료 심근 조직에 (24 시간) 이내 급성 염증 반응 elicited. 이것은 급성 염증의 관찰에 따라 설명 IMI는 오픈 가슴 절차4,,3031,,3233에서 직접 보기 아래 다음 이전 연구에서. 급성 염증은 정상적인 염 분 또는 PBS 솔루션의 심근34,35, 그리고 심지어 쥐36gastrocnemius 근육 주사 시 또한 관찰 되 고 따라서이 반응은 했다 직접 조직 상해 보다는 injectate 당에 돌렸다. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 실로 국제 사회 심장 혈관 변환 연구, IMI의 설정에서 염증의 일반적인 발생 인정 하지만 거기 인지 여부에 관해서는 아무 일치 측정을 동안이 과정을 줄이기 위해는 peri 절차 시간은 유용한 (예를 들어, 정 맥 (I.V.) 코르 티 코 스테로이드)37. 비록이 연구에서 염증 조직 상해를 직접 관찰도 수, 결과 또한 그 InI 외국 몸도 세포 수를 제공 하는이 과정에서 역할을 재생할 합니다 나타납니다 될 phagocytizing InI (그림 3 층)를 제안 합니다. 이 급성 염증 심장 내에서 IMI에 보조의 기능 효과의 철저 한 분석 또는 여부 이러한 코르 티 코 스테로이드와 같은 예방 약물의 관리를 통해 ameliorated 수이 원고의 범위를 벗어납니다. 그럼에도 불구 하 고, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI 사이트 당 최대 0.25 mL (1.25 x 106 셀)의 injectate의 볼륨은 심근의 4 개 대상 지역에 IMI는 토끼에 아주 잘 용납 되었다.
60 개 이상의 절차 수행 날짜, 후 역량을 달성 했다, 절차를 보조 사망률 매우 낮은 했다. 예를 들어 아무 죽음 IMI 후 단계 3.9 (보통 및 DOX 그룹)에서 설명 하는 두 동료에서 발생 했습니다. 실제로, 67 IMI 절차는 진행 하는 연구 프로그램의 일환으로 수행 된 후 지금까지, 우리는 단지 직접 절차 (2.9% 사망률)와 관련 된 두 개의 죽음 했다. 이들 중 하나에 hemopericardium의 존재 입증 되었다 사후 검사에서 다른 임상 신경 증상, 급성 뇌 허 혈 백업은 cardioembolic 이벤트에 보조와 일치를 개발 하는 동안은 자비 롭 끝점입니다. 이 사망률 (2.9%)이 크게 Lu 그 외 여러분 에 의해 보고는 보다 낮은 8 (11%) 뮤 외. (27%)38, IMI 오픈 가슴 프로시저에 직접 보기에서 받은 토끼에서. 따라서, 우리는 안전, 현재 연구에서 설명 하는 절차를 고려 하 고 우리가 사용 하는이 기술은 지속적인 연구에서 유망한 결과39,40AICM의 토끼 모델에서 줄기 세포 기반 치료를 평가 하.
몇 가지 중요 한 포인트는 성공에 대 한 경 피 적인 대조 심장 초음파-가이드 IMI 있다. 첫째, 젖꼭지 근육의 수준에서 parasternal 짧은 축 보기 endocardial 및 epicardial 등고선의 명확한 묘사를 가져온 확인 합니다. 다음, 바늘 팁 인지 확인의 시야 내에서 항상 일단 흉 강 및 pericardial 공간 또는 LV 챔버에 실수로 배달 되지 않도록 하려면 심근이 들어갔습니다. 다음, 때문이 이러한 구조와 관련 된 위험 지역 외상 (예를 들면, 열상)의 가능성을 높일 수 구절 가슴 구멍을 통해 그리고 심 낭, 심근으로의 수는 최소한 유지 있는지 확인 hemopericardium입니다. 이 위해 흉에 (그리고 일부 대상 사이트 (예를 들어, 측면 벽) 내장 심 낭에 항목의 같은 지점에서) 바늘을 유지 하면서, 신중 하 게 바늘의 부각의 각에 미묘한 변화를 수행. 마지막으로, 항상 사용 하 여 바늘을 피부를 통해 명확 하 고 쉬운 통로 흉 강에 따라서 심근을 입력 하 고 큰 피해를 일으키는 무딘 바늘 경사를 피하.
여기에 설명 된 절차는 뿐만 아니라, 심근 내의 여러 대상 사이트에 injectate의 안정적이 고 성공적인 배달을 허용합니다 하지만 그것 또한 실시간으로, 실수로 intrachamber 배달 (방지 바늘 궤적의 수정 허용 그림 2G, H). 폐쇄 하는 동안 가슴 IMI 절차 이전 마우스에 설명 되었습니다,이 작은 동물 모델에 몇 가지 제한이 있습니다. 이러한 한계는 의무가 치료, 심근의 대상 지역 및 낮은 볼륨/수의 대상 사이트29,41당 주입 될 수 있는 셀의 수를 포함 합니다. 또한,는 injectate의 정확한 배달 자주 관심사,42, 60-70 가까운 성공률을 이며 따라서 덜 널리 높은 주파수 초음파 시스템의 사용은 일반적으로 필요한29,41, 42. 이러한 시스템은 이미징 한계는 선형 배열 트랜스듀서 장착 되어 (예를 들면, 반향은 자주 유물)14. 생쥐와 쥐, 작은 설치류 모델의 또 다른 한계는 Ca+ 2 교통 시스템 및 세포질 생리학에 인간과 큰 크기의 동물 모델을 개, 돼지, 토끼 의 그들의 본질적인 차이 15,,1643. 이러한 모든 제한 자주 큰 동물 모델에서 사전 확인 없이 병원에 이러한 모델의 결과 번역에 어려움을 만듭니다.
Peri 절차 기간에는 동물의 주의 깊은 모니터링을 하는 것은 실험 동물의 관리에 대 한 현대 지침에 따라 필수입니다. 다음과 같이,이 할 수 있는 직렬 심장 초음파 창 검사 및 ECG 경시에 의해 적어도 동물 마 취에서 깨어 때까지. 심장 리듬에 IMI의 급성 효과 또한 24 시간 Holter ECG에 의해 모니터링할 수 있습니다 하 고 우리의 표준 연습 이다. 노트의 가장 빈번한 부정맥 고립 된 PVC, 자연, 상대적으로 양성 및는 이전 InI와 IMI 독 소 루비와 함께 치료 하는 동물에서 더 일반적 이었다 ( 그림 4A 및 그림 5A참조). 상대적으로 덜 빈번 했다 다른 부정맥 포함: 대련;에 PVC 세 쌍둥이;에 PVC NSVT 뿐만 아니라 ( 그림 4B-D 와 그림 5B-D참조). 그러나, 지속적인된 심 실 심 박 급진 등 아무 생명 위협 부정맥이 관찰 되었다. 주의 우리는 또한 DOX 그룹에서 일부 cardiotoxic 발현 Holter ECG 모니터링, 시간 주파수 도메인 변수 SDNN과 같은 심장 박동 변화 (HRV)의 사용에 의해 검출 될 수 발견. 따라서, 감소 SDNN (그림 5E, F)는 비-선형의 측정 심장 건강 상태, 정상 그룹에 비해 DOX 그룹에서 관찰 되었다. 이것은 감소 된 HRV의 첫 번째 보고서 감소 SDNN에 의해 증명으로, 토끼의 맥락에서 SDNN 감소 관찰은 AICM의 모델 HFrEF44 를 가진 환자에서 심장 죽음의 강력한 독립적인 예측 인자 ,4546. DOX 그룹에서 SDNN 변경 자체; IMI 절차와 관련이 없는 아마 그럼에도 불구 하 고, IMI, 수신 하지 않은 정상적인 동물 뿐 아니라 독 소 루비, 받는 토끼에서 이러한 연구 결과의 확인이 필요 합니다. HFrEF 감소 SDNN 또한 수 여부, 개선 하 고 따라서 줄기 세포 기반 치료의 혜택의 대리 측정 평가, 남아 사용 및 미래 연구의 초점이 될 것입니다.
정 맥, intracoronary, 및 intramyocardial;를 포함 하 여 심장에 셀의 납품의 여러 노선 탐험 되었습니다. 그러나, 여기서, intramyocardial 경로 셀 고정 요금1,2,3,,45,37의 가장 큰 수준에 지속적으로 표시 했다. 우리는 방법론 사용은 강력 하 고 충분히 quantitate이 vivo에서 또는 비보 전이 연구의 한계는 특정 셀 유지 율, 여기 제시 하는 연구에서 평가 하지 않았다. 대신, 우리는 따라서 성공적인 intramyocardial 납품을 나타내는 EGFP(+) HEK 293 세포의 phenotypic 특성 심근, 내 이러한 세포의 존재를 쉽게 차별을 허용 사용. 그러나, 주요 목표는 그것에 의하여 우리 IMI와 셀 배달 비-허 혈 성 심장 근육 병 증의 큰 크기, 전 임상 모델의 심근으로 수행할 수 있는 최소 침 습 기술을 개발 했다. 그림 2 및 그림 3에 설명 된 대로이 경 피 적인에 의해 처음으로 대조 심장 초음파-가이드 IMI에 달성 되었다. 더 연구는 줄기 세포의 효능 설명 하는 절차를 사용 하 여 여기; 심근에 전달 잠재적인 셀 유지 비율을 평가 하는 데 필요한 이러한 연구는 현재 진행 되 고 있습니다. 우리는 최근 기능 효과39,40에 관한 유망한 결과 전달.
오픈 가슴 프로시저에 IMI에 비해, 심장 초음파 유도 경 피 적인 대비 같은 큰 전 임상 모델에서 IMI이이 연구에서 설명은 크게 덜 침략 적 절차, 동물의 빠른 복구와 자연 위에서 언급 한, 그것은 또한 더 낮은 사망 율8,38있다. IMI에 또 다른 접근은 또한 전 임상 모델 및 몇몇 작은 임상 시험에서 시험 되는 카 테 터 기반 IMI (리뷰, Sheng 외.참조) 47.이 접근, 카 테 터는 LV 구멍으로 고급와 endocardium 내의 대상 사이트에 배치 됩니다. 이러한 대상 사이트는 중 식별 절차, 예를 들면, 대조 심장 자기 공명 영상 (CMR)48를 사용 하 여 이전 또는 절차 동안, 예를 들면, 전기 기계 endocardial 매핑 (EEM), 명확 하 게 사출49이전 실행 가능한 심근 분화. 이 후자의 방식은 덜 침략 가슴 IMI 분명 장점은 직접 보기 아래 열에 비해입니다. 또한, 인간에서 IHD 누 덕 누 덕 배포 이후 EEM IHD의 설정에서 특히 중요 한 치료는 심근의 가능한 사이트를 구체적으로 직접 수 있습니다. 그러나, 주요 결점은 모든 IMI 접근의 일반적인 소견은 심 실 부정맥의 유도. 다른 단점 EEM은 광범위 한 훈련, 그리고 심장 천공에의 한 관련된 위험을 필요로 하는 매우 까다로운 기술 제공 하 긴 절차 시간을 포함. 반면, 심장 초음파 유도 경 피 적인 대비로 IMI이이 연구에서 설명 기술적으로 카 테 터 기반 IMI, 보다 덜 요구 이며, 역량 달성 되 면 그것은 수행할 수 있습니다 25 분 내에 안전 하 게 마 취 후. 마찬가지로, 바늘의 짧은 부분만 심근으로 고급, 이후 야 심장 구멍 뚫 기의 더 낮은 위험 심장 열상이 아직도 가능 하다.
결론적으로, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI 기술43토끼16,등 큰 동물 모델에서이 연구에서 설명은 잘 용납 하 고, 안전 하 고 효과적으로 injectate를 제공 하는 심장입니다. 그것은 전 임상 가설 (예를 들어, AICM), 비 허 혈 성 심근에 심장 재생 치료제의 효과 대 한 유망 전략을 구성 하는 따라서, 포함, 하지만에 국한 되지 않음, 줄기 세포 기반 치료.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 EGFP(+) HEK 293 세포를 제공 하기 위한 데이터와 카를로스 부에 노의 수집 하는 동안 제공 하는 우수한 지원 쉴라 Monfort, 브렌다 마르티네스, 카를로스 Micó, 알베르토 Muñoz와 마누엘 몰리 나 감사. 이 작품은 부분적으로 지원 되었다: Fundación Séneca, Agencia 데 많은 y 과학, Región 드 무르시아, 스페인 (JT) (번호 부여: 11935/파이/09); 레드 드 Terapia Celular, ISCIII-서브 성배입니다. Redes, VI PN 데 나 + D + 2008-2011 (no를 부여 합니다. RD12/0019/0001) (JMM), 공동 구조의 유럽 연합 (페더) (JMM); 자금 융자 그리고, 독서 대학, 영국 (AG, GB) (중앙 자금). Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HD11 XE Ultrasound System | Philips | 10670267 | Echocardiography system. |
| S12-4 | Philips | B01YgG | 4-12 MHz phase array transducer |
| Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | over-the-needle catheter |
| Omnifix-F 1 ml syringe | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamine) | Merial | RN 9767 | Veterinary prescription is necessary |
| Domtor (Medetomidine) | Esteve | CN 570686.3 | Veterinary prescription is necessary |
| Heating Pad | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | India (China) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | 24 h Holter ECG system. |
| Electrodes Blue Sensor® | Ambu (NUMED) | VLC-00-S | Holter ECG electrodes. |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Microscope | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector Elite | Vector Laboratories | PK-6200 | Avidin Biotin Complex Kit. |
| Chicken anti-GFP antibody | Invitrogen | A10262 | Primary antibody. |
| Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-9010 | Secondary Antibody. |
| 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Fluorescence Microscope | Carl Zeiss MicroImaging |
Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter ECG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Fisher Scientific | 11965084 | |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Fisher Scientific | 11573397 | |
| 0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) | Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Fisher Scientific | 31985070 | |
| Hygromycin B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xylene (histological) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronase | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
References
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