Summary
ويصف هذا البروتوكول نموذج ماوس لجراحة العظام التي استخدمت لدراسة آليات neuroinflammation بعد العملية الجراحية، والتغيرات السلوكية، وعندما جنبا إلى جنب مع بارابيوسيس، لدراسة تجديد الأنسجة أثناء الشيخوخة.
Abstract
جراحة يستخدم عادة لتحسين والحفاظ على نوعية الحياة. ولسوء الحظ، في المرضى الذين يعانون ضعفا مثل كبار السن، مضاعفات قد تحدث وتقلل إلى حد كبير من النتائج. وفي الواقع، بعد جراحة العظام الروتيني لإصلاح كسر، ما يصل إلى 50% مرضى المسنين يعانون من المضاعفات العصبية مثل هذيان. أيضا، القدرة على شفاء وتجديد الأنسجة بعد عملية جراحية يتناقص مع التقدم في العمر، ويمكن أن يؤثر على نوعية إصلاح الكسر والتكامل العظمى حتى يزرع. وهكذا، يمكن أن توفر فهم أفضل للآليات التي تدفع هذه التغيرات تعتمد على العمر أهدافا استراتيجية للتقليل من خطر الإصابة بهذه المضاعفات وتحسين النتائج. هنا، نحن نقدم نموذجا ماوس ذات صلة سريرياً لكسر قصبي. التغييرات بعد العملية الجراحية في هذه الفئران تقليد بعض الإعاقات الإدراكية لوحظ عموما بعد جراحة العظام الروتيني في البشر. باختصار، يتم إجراء شق في أطرافهم هند الحق تحت ظروف معقمة تماما. يتم فصل العضلات، ويتم إدراج pin فولاذ المقاوم للصدأ 0.38 ملم في كريست العلوي من الساق، داخل القناة إينتراميدولاري. ثم يتم تنفيذ العظم، ويتم تدبيس الجرح. وقد استخدمنا هذا النموذج للتحقيق في آثار الصدمات الجراحية على نيوروينفلاميشن بعد العملية الجراحية والتغييرات السلوكية. بتطبيق هذا النموذج الكسر في تركيبة مع بارابيوسيس، نموذج العمليات جراحية التي يتم أناستوموسيد 2 الفئران، وقد درسنا الخلايا ويفرز عوامل تجديد عناصره تجديد الجهاز وظيفة والأنسجة بعد الإصابة. عن طريق اتباع لدينا البروتوكول خطوة بخطوة، هذه النماذج يمكن استنساخها بالدقة العالية، ويمكن تكييفها لاستجواب العديد من الممرات البيولوجية التي يتم استبدالها بواسطة الصدمات الجراحية.
Introduction
جراحة حولت نظام الرعاية الصحية الطبية وتساهم بشكل مستمر للتكنولوجيا المتطورة، وتحسين السلامة، والحفاظ على نوعية الحياة. لسوء الحظ، يدفع جراحة أيضا الردود باثوفيسيولوجيك التي يمكن أن تؤدي إلى مضاعفات ما بعد الجراحة بما في ذلك عدوى الجرح واعتلالات الجهاز العصبي وحتى الوفيات، وبخاصة في المرضى كبار السن1،2. يتم إجراء جراحة العظام بشكل روتيني، لا سيما في البالغين الأكبر سنا، لتحسين نوعية الحياة وإصلاح إصابات العظام شيوعاً. ومع ذلك، تصل إلى 50 في المائة مرضى جراحة العظام الذين هم 65 عاماً وأقدم تجربة العاهات العصبية مثل الهذيان بعد الجراحة. وهذا يرتبط بسوء التشخيص، أي، 5 إضعاف زيادة خطر للوفيات في 6 أشهر، التدني الوظيفي المستمر، ازداد باطراد التمريض الوقت لكل المرضى، وزيادة طول الإقامة في المستشفى، وارتفاع معدلات التوظيف التمريض المنزلي 3 , 4 , 5-وقد حددت بعض عوامل الخطر، بما في ذلك سن متقدمة، ولكن يعرف الكثير عن الآليات المسؤولة عن اعتلالات الجهاز العصبي بعد الجراحة.
منذ الكسور شائعة جداً لدى كبار السن، وقد أنشأنا نموذج ماوس لكسر قصبي لتحديد أثر الصدمة الطرفية على التعافي بعد العملية الجراحية، بما في ذلك نيوروينفلاميشن والدماغ الصحة (الوظائف المعرفية)6، 7-هذا النموذج، الذي وصف في الأصل قبل هاري et al. 8، يتكون من تعلق إينتراميدولاري وكسر قصبي تحت التخدير العام والتسكين، وهكذا يحاكي إصابة الجلد والعضلات الصدمة النفسية، والعظام إصلاح المقترنة مع كسور العظام الطويلة المشتركة وإصلاح البشر. وبعد هذا الإجراء، الفئران تبين التغييرات في علامات التهابات مماثلة للتغيرات التي لوحظت في البشر9،10، فضلا عن تفعيل ميكروجليال في قرن آمون، التي ترتبط بالعجز في الذاكرة التصريحية و أعصاب هيبوكامبال6،،من711. جمعنا سابقا بين هذا النموذج الكسر مع بارابيوسيس. بارابيوسيس هو نموذج العمليات جراحية التي يتم أناستوموسيد الفئران 2، وهكذا مشاركة نظام الدورة الدموية. وقدم هذا النموذج انفراجة في فهم الآثار التنظيمية لتعميم خلايا وعوامل خلطيه في وظيفة الجهاز في سياق العمر والمرض12،،من1314. باستخدام هذا النهج اكتشفنا مؤخرا العوامل المنهجية المرتبطة بكسر السن-تعتمد على شفاء12.
وهنا، نقدم بروتوكول الذي يجمع بين الطراز كسر قصبي مع بارابيوسيس لدراسة آليات تعتمد على سن عظم إلى الدماغ، والتي لها صلة بالطب التجديدي، ونيورويمونولوجي. 1A بروتوكول وصف الإجراء بارابيوسيس، وبروتوكول 1B تفاصيل الإجراء كسر قصبي (الشكل 1A). وهذه يمكن أن يؤديها بشكل مستقل أو في تركيبة، تبعاً لطبيعة عملية الاستجواب.
Protocol
جميع التجارب على الحيوانات كانت تجري وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ديوك.
1-التجريبية الحيوانات
- تبقى الفئران في بيئة مكيفة مع دورات الضوء/الظلام 12-ح والوصول السليم للمياه والغذاء القياسية. بيت ليتيرماتيس لا يزيد عن 5 في قفص، وتجنب الظروف التي يمكن أن تشجع على القتال.
- استخدام الإناث C57BL6/ياء الفئران في 3 أشهر عمر (الشباب) أو 18 شهرا من العمر (القديمة).
- بارابيوسيس، تأقلم الفئران 2 معا لمدة أسبوعين على الأقل قبل الجراحة. الفئران هي أما البرية من نوع C57BL6/ي أو اجفب +.
- تحقق من حالة الجسم والمظهر الكلي للفئران يوميا.
2-قبل الجراحة الإعداد بارابيوسيس وجراحة العظام
- وزن الفئران 2.
- إدارة التخدير العام عن طريق نظام تخدير في معدل تدفق2 س ثابت من 0.2 لتر/دقيقة استخدام 5% إيسوفلوراني لتحريض في دائرة التعريفي.
ملاحظة: يمكن تأكيد عمق التخدير استخدام قرصه أخمص القدمين. - ضع الفئران على لوح ساخن في موقف ضعيف. استخدام مجس المستقيم لرصد درجة حرارة الجسم خلال العملية الجراحية.
- للمحافظة على التخدير، انخفاض تركيز المستنشقة isoflurane إلى 2.0 في المائة في 0.2 لتر في الدقيقة عن طريق فاسيماسك. رصد لضمان العمق الكافي للتخدير.
- رصد المعلمات الفسيولوجية (معدل التنفس وتشبع الأكسجين والقلب تغلب) غير إينفاسيفيلي باستخدام نبض التاكسج (اختياري).
3-بارابيوسيس عملية جراحية (بروتوكول 1A)
- إدارة التسكين (البوبرينورفين، ريال/بطء الإفراج عنه، 0.1 مغ/كغ تحت الجلد) بعد الاستقراء وقبل المعالجة الجراحية. حقن بوبيفاكايني (0.25 في المائة) في الجناحين قبل الافتتاح. تطبيق مواد التشحيم العين.
ملاحظة: بروتوكول بارابيوسيس يمكن أن يؤديها بشكل مستقل من كسر قصبي. - لكل هيئة من الهيئات الداخلية خياطة، وتستخدم مواد خياطة بوليديوكسانوني 4-0. لكل خياطة خارجية، استخدام مادة البوليبروبيلين خياطة 4-0.
- يحلق كل من الفئران 2 على طول خط متجاورة من الكوع والركبة الجانب إلى أن انضم إلى الجناح. تطهير مع اليود + فرك الجلد الكحول 70% أكثر من 3 بالتناوب دورات في التحضير لشق.
تستخدم أدوات يعقم والحفاظ على حقل عقيمة.
ملاحظة: ضع الماوس البرية من نوع إلى يمين الماوس اجفب، وتعد الجناح الأيسر للماوس البرية من نوع والجناح الأيمن من الماوس اجفب للجراحة (الشكل 1). - على كل الماوس، استخدام مقص جعل شق جلد على طول الجناح، تتراوح الدانية للركبة للتو الدانية إلى الكوع، ودون الإخلال بالعضلات تحت الجلد.
- الانضمام إلى ثلاثية الرؤوس الحيوانات مع خيوط توقف 2.
- الانضمام إلى جدران الجسم على طول الجناحين مع خياطة جارية ومستمرة ليمر 7-9.
- الانضمام إلى الفخذ الحيوان مع خيوط توقف 2.
- إغلاق جلد بارابيونتس 2 مع توقف خياطة الجروح.
- السماح للفئران مستيقظا في الهواء المحيط.
- لضمان النجاح لهذا البروتوكول، يجب الحفاظ على صحة الأزواج: رصد الأزواج يوميا؛ أداء حالة الجسم التهديف مرتين أسبوعيا؛ وتزن الأزواج مرتين أسبوعيا.
ملاحظة: يقع كل زوج على حدة.
ملاحظة: إذا كان استخدام البوبرينورفين العادية (أي عدم إطلاق سراح ريال/بطء) ثم إدارة 0.1 مغ/كغ تحت الجلد في 1 مل من المحلول الملحي للماوس مرتين يوميا لمدة 3 أيام. - السماح لمدة 4 أسابيع وقت الاسترداد لضمان تعميم مشترك بين بارابيونتس في حالة إجراء جراحة كسر قصبي.
4. جراحة كسر قصبي (بروتوكول 1B)
- إدارة التسكين (0.1 مغ/كغ، البوبرينورفين تحت الجلد) بعد الاستقراء وقبل المعالجة الجراحية. حقن بوبيفاكيني (0.25 في المائة) في موقع العمليات الجراحية الأقرب إلى الركبة قبل الافتتاح. تطبيق مواد التشحيم العين.
- حلق الجانب الآنسي من أطرافهم هند الأيمن للماوس للكشف عن منطقة العمليات الجراحية، وتطهير أكثر من 3 دورات بالتناوب مع اليود + فرك الجلد الكحول 70%. الحفاظ على حقل جراحية معقمة طوال فترة الإجراءات. للحد من التلوث؛ استخدام الصكوك يعقم وقفازات؛ إكمال عملية جراحية تحت مجهر تشريح (اختياري)؛ واستخدم وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
ملاحظة: إذا كان يتم تنفيذ البروتوكول في بارابيونتس، هو كسر الماوس فقط 1 في الزوج (الساق اليمنى للماوس الأيمن). راجع الشكل 1B رسم تخطيطي للكسر في بارابيونتس. - استخدام مقص جعل شق جلد على طول الجانب الآنسي من أطرافهم هند حق الدانية للركبة وصولاً إلى ميدشافت من الساق على الماوس الأيمن.
- كشف ميدشافت الساق وتحديد بصريا في diaphysis. فليكس في الركبة ووضع تصور لهضبة قصبي استخدام أربطة الرضفة الفخذي كعلامة بارزة.
- تصور وتر الرضفة؛ حفر يدوياً من قبل المتداول الإبهام والسبابة حفرة 0.5 ملم في قناة إينتراميدولاري باستخدام إبرة قياس 25.
ملاحظة: حفر حفرة سوف تخترق موازية على طول الساق، في الهضبة الظنبوبيه. - أدخل pin 0.38 ملم من فولاذ المقاوم للصدأ من خلال الثقب في حوالي 15 ملم في تجويف النخاع حتى المقاومة هو شعر، وقطع تدفق مع هضبة قصبي استخدام قاطع سلك (انظر التكميلي فيديو 1 لإعادة بناء ثلاثي الأبعاد).
- باستخدام مقص بون مستقيم، كسر في الساق ميدشافت (ديافيسيس). انظر الشكل 1 رسم تخطيطي للكسر.
- مراقبة بصريا موقع الكسر والأنسجة المجاورة لتفقد لإضفاء الاستقرار على مرأى الكسر.
- إغلاق بدبابيس الجلد.
- مكان الفئران على منصات ساخنة لاسترداد قبل إعادتهم إلى قفص تنظيف منزل. حقن المحلول الملحي العادي 1 مل بريوارميد (37 درجة مئوية) تحت الجلد في كل الماوس لاستبدال السوائل.
- تحقق من الفئران يوميا لعلامات الضعف أو العدوى أو النزيف.
ملاحظة: إذا كان استخدام البوبرينورفين العادية (أي عدم إطلاق سراح ريال/بطء) ثم إدارة 0.1 مغ/كغ تحت الجلد في 1 مل من المالحة يوميا لمدة 3 أيام.
Representative Results
بعد osteotomies عرضية أجريت بعناية تحت ظروف معقمة مع الإدراج المطرد دبابيس وسليم خياطة، الفئران لم تظهر دلائل الضعف أو العدوى أو النزيف في ساقه اليسرى بعد عملية جراحية. شفاء العظام تم تقييم استخدام التحليل الشعاعي وهيستومورفوميتري بعد سافرانين-O تلطيخ (الشكل 2). وأشارت إلى الصور الشعاعية تايبي مكسور ميدشافت ترسب الأنسجة أكثر في النسيج الكسر من الفئران الشابة مما في النسيج الكسر من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين. ديكالسيفيد النسيج الكسر وجزءاً لا يتجزأ من البارافين في التحضير للتحليل النسيجي. المقاطع كانت ملطخة سافرانين-O وترسب الأنسجة كان كمياً باستخدام تحليل هيستومورفوميتري. كسر النسيج للفئران الصغار الواردة أكثر من العظام والأنسجة تليفية أقل من كسر النسيج من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين.
كسر قصبي يستحث التهاب النظامية والوسطى6،7،11،،من1516. وفي الواقع، مرتفعة سرعة الطرفية مستويات السيتوكينات الموالية التحريضية وأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر (دامبس) بعد جراحة العظام، سواء في الفئران والبشر7،،من1718. وهذا يسهم في تنشيط خلايا microglial في الدماغ عبر عدة آليات إرسال الإشارات التي تنطوي على مسارات خلطيه وخلوية، والعصبية7،،من1519،20، 21. عقب بلعم المحيطية وفتح حاجز الدم في الدماغ، جراحة والخلل غشائي تسهم تسلل neuroinflammation هيبوكامبال الحادة في الأنواع البرية و Ccr2طلب تقديم العروض/+ Cx3cr1التجارة والنقل/+ الفئران البالغين15 , 19، وارتبطت بعجز الذاكرة اللاحقة التي تشبه الهذيان البشري والخلل المعرفي بعد العملية الجراحية15،،من1922. هذه الاستجابة نيوروينفلاماتوري تتفاقم في الحيوانات المسنين، مع تغييرات كبيرة في مورفولوجيا microglial، كما الكشف عنها بواسطة رابطة المحامين الدولية-1 إيمونوستينينج (الشكل 3).
باستخدام نموذج كسر قصبي الموصوفة هنا، وجدنا أيضا الخلايا هيبوكامبال البصر عابر، كما يدل على ذلك انخفاض في إيمونوستينينج دوبليكورتين (DCX) في المغزلي المسنن20. وكشفت القياسات الكهربية للتقوية الطويلة الأجل (الكمونية)، بديل لوظيفة الذاكرة، إلى اضطراب تعتمد على الوقت في أعصاب بعد11. كما عرض الفئران بعد الجراحة العاهات في الدالة هيبوكامبال تعتمد على الذاكرة، على سبيل المثال استخدام الخوف تكييف التقييم السلوكي (الشكل 4). في تكييف الخوف، توضع في غرفة الفئران ويتعرضون لجديلة سمعية تليها حافز البرود (أي، فوتشوك). ثلاثة أيام بعد الجراحة الدانية، يتم اختبارها الفئران في قاعة تكييف، هذه المرة دون أي التحفيز السمعية أو البرود، وتجميد السلوك يتم تسجيلها كمؤشر للذاكرة (لبروتوكول مفصلاً انظر23).
سن متقدمة عامل الخطر حرجة لانخفاض الذاكرة. حتى الآن، ونحن في سن، تقلل القدرة على إصلاح الأنسجة وتجديدها أيضا رغم أن هذه الآليات لا تزال غير مفهومة. وهكذا، استخدمنا البروتوكولات هنا وصف لأداء بارابيوسيس هيتيروتشرونيك (الاقتران الحيوانات الشباب/القديمة) وتقييم الكسر الشفاء داخل الماوس أعمارهم (ل انظر بارابيوسيس مفصل بروتوكول24). تبادل الدم بين أزواج بارابيوتيك أكد، ووجد أن تساوي12. التعرض لإصلاح العظام تداول شباباً المحسن مع الاتحاد السابق، زاد ترسيب العظام والتليف (الشكل 5)12. تجديد هذا التجدد العظام حدث مستقل من خلايا الاوستيوبلاستس osteocalcin نقص المناعة الذاتية (الشكل 5، بني الخلايا)، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على الخلايا CD45 الإيجابية الذي هاجر من بارابيونت الشباب (الشكل 5، الزرقاء الخلايا) . تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا المكونة للدم CD45 إيجابية تفرز مكانة شباباً وصحية، وقادرة على الإشارة إلى الخلايا أوستيوبلاستيك عمره حثهم لتصبح أكثر نشاطا.
رقم 1: التمثيل التخطيطي بارابيوسيس وجراحة كسر قصبي. (أ) الإطار الزمني لتنفيذ بارابيوسيس وكسر قصبي (بروتوكول 1A) أو كسر قصبي وحدها (بروتوكول 1B). كانت كسور في تايبي (ب) من الفئران 20 شهرا في أزواج بارابيوتيك isochronic أو هيتيروتشرونيك (الساق اليمنى للماوس الأيمن هو كسر، كما تتم الإشارة إليها ب X). تصور الفئران الرمادية الفئران wildtype بينما الفئران الأخضر تصور الفئران اجفب. (ج) رسم تخطيطي لطراز كسر قصبي مع تعلق إينتراميدولاري وكسر رمح منتصف. انظر أيضا 1 الفيديو التكميلية لإعمار أطرافهم هند بشكل ثلاثي الأبعاد وتثبيت الساق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: كسر قصبي الشفاء داخل نماذج الماوس صغارا وكبارا- كانت كسور في تايبي الفئران صغارا أو كبارا والنسيج كسر التحقيق 21 يوما بعد الإصابة. التصوير الشعاعي (A) وتلطيخ نسيجية (سافرانين-س) المستخدمة لتقييم الكسر النسيج 21 يوما بعد كسر. ويبين تلطيخ الأنسجة collagenous في بروتيوجليكانس (الواردة ضمن الغضروف) باللون الأحمر والأزرق. تشير الخطوط المتقطعة إلى الموقع التقريبي دشبذ الكسر. هيستومورفوميتري (ب) استخدمت لتقييم كمية العظام والغضاريف وأنسجة تليفية المودعة داخل كسر دشبذ 21 يوما بعد الكسر. يتم التعبير عن البيانات يعني ± فواصل الثقة 95%، * ف < 0.05، معتدا به إحصائيا (ANOVA أحادي الاتجاه، الاختبار في دونيت)، تمثل الأشرطة مقياس 2 مم، والحصول على صور استخدام المجهر، والهدف 1.25 x. n = 9 لكل عينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الجراحة التي يسببها التنشيط microglial تعتمد على العمر في قرن آمون. جراحة كسر قصبي يستحث neuroinflammation هيبوكامبال أكبر في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين (20 عاماً) مقارنة بالفئران C57BL6/ي عمره 4 أشهر. الدماغ-قسم التلوين مع علامة ميكروجليال رابطة المحامين الدولية-1 يبين أكثر إيجابية في الخلايا والسمات التغييرات في العمليات الجراحية المجموعات 24 ساعة بعد الجراحة. وتم الحصول على الصور مع مجهر ابيفلوريسسينت مع بير 100 x.؛ يمثل الشريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: ضعف الخلايا والتقوية طويلة الأجل، ووظيفة الذاكرة بعد جراحة كسر قصبي. DCX (A)، علامة كمي للخلايا، انخفض انخفاضا كبيرا في قرن آمون المغزلي المسنن في 24 ساعة بعد الجراحة. وتم الحصول على الصور مع [كنفوكل] مجهر مسح ليزر هدف مع بير x 10؛ مقياس بار يمثل 10 ميكرون. الكهربية (ب) شرائح هيبوكامبال من عناصر التحكم أو الفئران 24 ساعة بعد الجراحة. التقوية الطويلة الأجل (الكمونية) حملت بتحفيز عالية التردد (أسر)، وسجلت ما يزيد على 1 حاء وسجلت الميدان إمكانات بوستسينابتيك ضادات (فيبسبس) من رادياتوم الطبقة CA1 تسجيل خارج الخلية ماصة مليئة العادية باستخدام السائل الدماغي النخاعي مصطنعة. في 24 ساعة بعد الجراحة، يتم تقليل التعريفي LTP ملحوظ مقارنة بالفئران التحكم. البيانات يتم التعبير عنها ك ± يعني s.e.m. n = 3، * ف < 0.05 ANOVA أحادي الاتجاه. (ج) هيبوكامبال-تعتمد على وظيفة الذاكرة (المحددة كنسبة مئوية من تجميد استخدام تتبع الخوف تكييف) هو ضعف في الفئران بعد الجراحة بالمقارنة مع عناصر التحكم والحيوانات المعرضة للتخدير فقط. البيانات يتم التعبير عنها ك ± يعني s.e.m. n = 9-10، * ف < 0.05 ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: جراحة بارابيوسيس يؤدي إلى تجديد شباب كسر الشفاء، والتشارك في الدم، والخلية المانحة engraftment. تم إنشاء أزواج بارابيوسيس Isochronic وهيتيروتشرونيك والماوس المسنين في كل زوج كان مكسور والمقررة للشفاء العظام. (أ) كسر النسيج وتم التحقيق في استخدام التصوير الشعاعي. تشير الخطوط المتقطعة إلى الموقع التقريبي دشبذ الكسر. وأكد انجرافتمينت (ب) اجفب + الخلايا داخل نخاع العظام. (ج) إيمونوهيستوتشيميستري من دشبذ الكسر استخدمت لتحديد أوستيوكالسين+ أوستيوبلاستيك الخلايا (براون) من بارابيونت واجفب+ المانحة خلايا (أزرق). تمثل أشرطة مقياس 50 ميكرومتر وتم الحصول على الصور باستخدام هدفا 40 x. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو التكميلي 1: إعادة البناء ثلاثي الأبعاد أطرافهم هند وتثبيت الساق. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
كسور مشكلة سريرية مشتركة، ولا تزال سببا رئيسيا للإصابة بالأمراض، لا سيما في سرعة نمو السكان كبار. وهنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لنموذج ماوس لكسر قصبي لدراسة الآليات المسؤولة عن نيوروينفلاميشن بعد العملية الجراحية، وضعف الإدراك. يمكن أن يقترن هذا النموذج إلى جراحة بارابيوسيس دراسة التفاعلات المناعية العصبية، وتجديد الأنسجة، وعمليات إرسال الإشارات الأخرى. وستوفر فهم هذه الآليات أهدافا استراتيجية للتقليل من المخاطر التي يتعرض لها مضاعفات بعد العملية الجراحية وتحسين النتائج.
تم تطوير عدة نماذج العظام لدراسة إصلاح العظام في القوارض25. اعتمدنا وتعديل هذا الإجراء كسر الدانية، وصف في الأصل قبل هاري et al. 8، لدراسة آثار جراحة العظام على وظيفة المخ. نحن أيضا استخدمت هذا النموذج الكسر في تركيبة مع نموذجنا بارابيوسيس للتحقيق في العوامل المسؤولة عن التئام العظام وتجديد الأنسجة تعتمد على العمر. عند إجراء عملية تحت التخدير العام متقلبة، هذا الإجراء كسر قصبي يتطلب فقط حوالي 15 دقيقة لكل الحيوانات، النتائج في صفر إلى وفيات أقل (تبعاً لعمر الماوس وحساسيات الوراثية الكامنة)، ويلخص المشتركة الشتائم المرتبطة بكسر العظام الطويلة والعظام من الصدمات الجراحية. وهكذا، هذا النموذج مثالي لاستجواب الممرات البيولوجية وإجراء تقييمات الطولية. ومع ذلك، من الأهمية بمكان أن العظم وتعلق استنساخه، وأن الضرر الذي يلحق الأنسجة اللينة ويتسق. فعلى سبيل المثال يمكن التضمين تلف الأنسجة اللينة بتجريد في السمحاق ومعسر العضلات المحيطة بها لجعل الجراحة الرضية أكثر. لن يقدم نماذج كسر الصدمة الناجمة عن صدمات حادة غير ثابت أو الانحناء ثلاث نقاط مثل هذا الاتساق أو دقتها. وكثيراً ما تسفر هذه الإجراءات إعادة-الإصابة، مما يؤدي إلى الاستجابة الالتهابية المطول. على العكس من ذلك، نماذج كسور التي تشمل تثبيت جامدة لها التهاب أكثر اعتدالا، التي لا الخص تماما الأضرار المرتبطة بجراحه العظام26،27.
نماذج أخرى باستخدام سبائك التيتانيوم تعلق وضعت لتقويم مفاصل الإنسان تحاكي عن كثب، وقد يكون أكثر صلة باستجواب الأطراف الاصطناعية نتيجة عدم الاستقرار، وعظام النهايات، والمضاعفات المرتبطة ببدلة في الفئران28،29 . نماذج حفر حفرة واحدة المعروضة هنا، توفير الاستقرار الكافي، ويمكن اختبارها الفئران في النماذج السلوكية دون العجز الكبيرة التي يمكن الخلط بين مهام مثل الخوف تكييف أو فتح مجال الحركة/القلق اختبار6 ،،من711،15،،من1920. ومع ذلك، يمكن أن تحدث تشوهات التناوب إذا لم يتم تأمين التثبيت بشكل صحيح. بعض نماذج استخدام التبعي خارجي، الذي يوفر الاستقرار متفوقة ولكنه يمثل تحديا لتنفيذ في الساق ماوس، على الرغم من أنه يمكن تنفيذها بنجاح في عظم الفخذ ماوس27.
العاهات المعرفية، بما في ذلك الهذيان والخلل المعرفي بعد العملية الجراحية، هي المضاعفات المشتركة بعد جراحة العظام لإصلاح كسور، وبخاصة في المرضى كبار السن والضعفاء30. يوضح هذا النموذج الماوس ذات الصلة سريرياً جراحة كسر الدانية أن سيتوكين النظامية بعد العملية الجراحية الإصدار6،7،17، أعاق حاجز الدم في الدماغ الدالة15،19 ، وغيرت microglial مورفولوجيا16،22وتسهم في ضعف الذاكرة، وقد تمثل الميزات الهامة من المضاعفات العصبية بعد العملية الجراحية وينظر في العديد من المرضى بعد جراحة العظام. من المهم ملاحظة أن الإجراءات الجراحية الأخرى قد استخدمت لنموذج الخلل المعرفي بعد العملية الجراحية في الفئران. وتشمل هذه البطن31،،من3233 وجراحة الأوعية الدموية34 ، فضلا عن الصدمات سطحية35،36. تقنية بارابيوسيس ينطبق على كل من هذه النماذج، التي تشترك في النهاية مماثلة، بما في ذلك الالتهاب والتنشيط الدبقية والعجز السلوكية، التي قد تكون بوساطة من الآليات المشتركة.
وقد كشفت الدراسات التي تتضمن بارابيوسيس أدوار جديدة لتعميم العوامل التي يمكن أن تؤثر على الوظائف المعرفية، ونيوروينفلاميشن، وتجديد الأنسجة في الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين37،،من3839،40 ،،من4142. وقد أظهرنا أن بارابيوسيس يمكن أن يكون بنجاح جنبا إلى جنب مع نموذج كسر قصبي الموصوفة هنا لاستجواب مسارات التجدد ودراسة الآليات التي تنطوي على عوامل المنقولة بالدم أن تأثير الشفاء وكسر إصلاح12. وهنا، أثبتنا أن قدرة إصلاح الكسر الحيوان الذين تتراوح أعمارهم بين يمكن أن تجدد شبابها عند الحيوان العمر هو anastomosed لحيوان شباب. هذا عكس العمر متأصل في انجرافتمينت الخلايا المكونة للدم في موقع الكسر. من المثير للاهتمام، يمكن أيضا تحقيق مثل هذا التجديد عن طريق زرع نخاع العظام الشباب في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين. وفي هذا الصدد، يمكن اعتبار زرع نخاع العظام نهج بديلة أكثر مباشرة وأكثر بساطة بارابيوسيس. ومع ذلك، بارابيوسيس نموذجا أكثر قوة للتحقيق مهمة تعميم خلايا وعوامل. ونحن نتوقع أن الجمع بين بارابيوسيس ونماذج جراحة العظام سوف تلعب دوراً هاما في الإجابة على الأسئلة الحرجة في الرعاية المحيطة بالجراحة والبيولوجيا الشيخوخة.
باختصار، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لنموذج ماوس لكسر قصبي لدراسة الآليات المسؤولة عن نيوروينفلاميشن بعد العملية الجراحية، وضعف الإدراك بعد الإجراءات الجراحية العظمية. هذا النموذج يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع إجراء بارابيوسيس لدراسة التفاعلات المناعية العصبية، وتجديد الأنسجة، ومسارات أخرى. وسيوفر تحديد هذه الآليات أهدافا استراتيجية للتقليل من المخاطر التي يتعرض لها مضاعفات بعد العملية الجراحية وتحسين النتائج.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر كاثي غيج، بكالوريوس (قسم التخدير، المركز الطبي بجامعة ديوك، دورهام، كارولاينا الشمالية) للمساعدة التحريرية. وتسلم NT الدعم من "منحة الإبداع" حلم من التخدير ديوك، والمعاهد الوطنية للصحة/نيا R01 AG057525-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
| Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
| 10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
| MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
| Shaver | Wahl | 9854L | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades - #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
| Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
| Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
| 22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
| Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
| Suture | Look | 1079B | |
| C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
| eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |
References
- Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
- Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
- Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
- Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
- Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
- Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
- Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
- Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
- Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211 (2016).
- Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
- Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
- Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131 (2015).
- Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90 (2011).
- Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
- Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
- Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
- Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
- Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
- Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
- Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
- Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229 (2017).
- Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
- Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, Suppl 4. S3-S6 (2007).
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
- Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
- AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
- Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268 (2016).
- Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
- Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346 (2015).
- Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
- Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
- Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
- Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
- Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).
