Summary
Denne protokol beskriver en musemodel af ortopædisk kirurgi, der er blevet brugt til at studere mekanismer af postoperative neuroinflammation og adfærdsmæssige ændringer, og når det kombineres med parabiosis, at studere vævsregeneration under aldring.
Abstract
Kirurgi er almindeligt anvendt til at forbedre og vedligeholde livskvalitet. Desværre, i sårbare patienter som ældre, komplikationer kan forekomme og betydeligt mindske resultatet. Faktisk, efter rutinemæssig ortopædisk kirurgi til at reparere en fraktur, så mange som 50% af ældre patienter lider af neurologiske komplikationer som delirium. Også kapacitet til at helbrede og regenerere væv efter operationen falder med alderen, og kan påvirke kvaliteten af fraktur reparation og endda ossøse integration af implantater. Således kunne en bedre forståelse af mekanismer, der driver ændringerne aldersbetinget give strategiske mål for at minimere risikoen for sådanne komplikationer og optimere resultaterne. Her introducerer vi en klinisk relevante musemodel af tibial fraktur. De postoperative forandringer i disse mus efterligne nogle af de kognitive funktionsnedsættelser almindeligt observeret efter rutinemæssig ortopædisk kirurgi hos mennesker. Kort, et snit er udført i det højre bagben lemmer strengt aseptiske betingelser. Muskler er adskilte, og en 0,38-mm rustfrit stål pin er indsat i den øverste crest af tibia, inde i marvkanalen. Osteotomi udføres derefter, og såret er hæftet. Vi har anvendt denne model til at undersøge virkningerne af kirurgisk traume på postoperative neuroinflammation og adfærdsmæssige ændringer. Ved at anvende denne fraktur model i kombination med parabiosis, en kirurgisk model hvor 2 mus er anastomosed, har vi studeret celler og udskilles faktorer, som systemisk forynge orgel funktion og væv regeneration efter skade. Ved at følge vores trinvise protokol, disse modeller kan gengives med high fidelity, og kan tilpasses til at afhøre mange biologiske veje, der er ændret af kirurgisk traume.
Introduction
Kirurgi har forvandlet den medicinske sundhedssystem og løbende bidrager til banebrydende teknologi, forbedret sikkerhed, og vedligeholdes af livskvaliteten. Desværre, kirurgi også inducerer patofysiologiske svar, der kan føre til postoperative komplikationer herunder sårinfektioner, neurologisk funktionshæmninger og endda dødelighed, især i ældre patienter1,2. Ortopædisk kirurgi udføres rutinemæssigt, især hos ældre voksne, til at forbedre livskvaliteten og reparere almindelige knogle skader. Dog op til 50% af ortopædisk kirurgi patienter, som er 65 år og ældre erfaring neurologiske handicap såsom postoperative delirium. Denne konsekvent korrelerer med dårlig prognose, dvs., 5-fold øget risiko for dødelighed på 6 måneder, vedvarende funktionelle tilbagegang, øgede sygepleje tid pr. patient, øget længden af hospitalsophold og højere priser på Plejehjemmet placering af 3 , 4 , 5. nogle risikofaktorer, herunder fremskreden alder, er blevet identificeret, men lidt er kendt om de mekanismer, der er ansvarlige for neurologiske funktionsnedsættelse efter operation.
Da frakturer er meget almindelige hos ældre, har vi etableret en musemodel af tibial fraktur til at bestemme virkningen af perifere traumer på postoperativ nyttiggørelse, herunder neuroinflammation og hjerne sundhed (kognitiv funktion)6, 7. denne model, oprindeligt beskrevet af Harry et al. 8, består af intramedullært fastgørelse og tibial fraktur under generel anæstesi og analgesi, og dermed efterligner huden skade, muskel traumer, og knoglen reparere forbundet med fælles long-knoglebrud og reparation hos mennesker. Efter denne procedure, mus demonstrere ændringer i inflammatoriske markører svarende til observerede ændringer i mennesker9,10, samt microglial aktivering i hippocampus, som er forbundet med underskud i deklarativ hukommelse og hippocampus neuroplasticitet6,7,11. Vi har tidligere kombineret denne fraktur model med parabiosis. Parabiosis er en kirurgisk model hvor 2 mus er anastomosed, og dermed deler en kredsløbssygdomme. Denne model har givet et gennembrud i forståelsen af regulerende virkninger af cirkulerende celler og humorale faktorer på organfunktion i forbindelse med alder og sygdom12,13,14. Ved hjælp af denne fremgangsmåde opdaget vi for nylig systemiske faktorer forbundet med aldersbetinget fraktur healing12.
Her introducerer vi en protokol, der kombinerer tibial fraktur modellen med parabiosis at studere knogle-til-hjerne alder afhængige mekanismer, som er relevante for regenerativ medicin og neuroimmunology. Protokollen 1A beskriver parabiosis procedure og 1B protokoloplysninger tibial fraktur procedure (figur 1A). Disse kan udføres uafhængigt eller i kombination, afhængig af arten af forhør.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed Guide for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og godkendt af institutionelle Animal Care & Brug udvalg (IACUC) ved Duke University.
1. forsøgsdyr
- Holde mus i en aircondition miljø med 12-h lys/mørke cyklus og ordentlig adgang til standard mad og vand. Hus ikke mere end 5 littermates pr. bur, og undgå forhold, der kunne tilskynde til kampene.
- Bruge hunner C57BL6/J mus på 3 måneder (unge) eller 18 måneder (gamle).
- For parabiosis, acclimate 2 mus sammen i mindst to uger før operationen. Mus er enten vildtype C57BL6/J eller eGFP +.
- Kontroller huld og generelle udseende af mus dagligt.
2. Præoperative opsætningen for Parabiosis og ortopædisk kirurgi
- Veje 2 mus.
- Administrere narkose via en anæstesi system på en konstant O2 gennemstrømningshastighed på 0,2 L/min. Brug 5% isofluran til induktion i en induktion kammer.
Bemærk: Dybde af anæstesi kan blive bekræftet ved hjælp af en tå knivspids. - Placere mus på en opvarmet pad i en liggende stilling. Bruge en rektal sonde til at overvåge kropstemperaturen i hele den kirurgiske procedure.
- For at opretholde anesthesia, sænke isofluran til 2,0% i 0,2 L/min via en ansigtsmaske inhaleret koncentration. Skærm til at sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi.
- Overvåge fysiologiske parametre (respirationsfrekvens, iltmætning og hjertet slå) ikke-invasivt bruger en puls oximeter (valgfrit).
3. parabiosis kirurgi (protokol 1A)
- Administrere analgesi (buprenorphin, SR/langsom frigivelse, 0,1 mg/kg subkutant) efter induktion og før kirurgisk manipulation. Injicere bupivacaine (0,25%) på flankerne lige før åbningen. Anvende øje lubricant.
Bemærk: Parabiosis protokol kan udføres uafhængigt fra den tibial fraktur. - For alle interne krop sutur, bruge 4-0 polydioxanone suture klæde. For alle eksterne sutur, bruge 4-0 polypropylen suture klæde.
- Barbering hver af de 2 mus langs en sammenhængende linje fra albuen, flanken og knæet på siden der skal samles. Desinficere med jod + 70% alkohol hud krat over 3 vekslende cyklusser i forberedelse til snit.
Brugt autoklaveres instrumenter og opretholde et sterilt felt.
Bemærk: Placer wild-type mus til højre for eGFP mus, og forberede kirurgi (figur 1) venstre flanke i wild-type mus og den højre flanke af eGFP musen. - På hver mus, skal du bruge en saks til at gøre en hud indsnit langs flanken, lige proksimalt for knæ for lige proksimalt til albuen, og uden at forstyrre muskler under huden.
- Deltag i triceps af dyr med 2 afbrudt suturer.
- Deltag krop væggene langs flankerne med en kørende, løbende sutur af 7-9 passerer.
- Deltag quadriceps af dyr med 2 afbrudt suturer.
- Lukke huden af de 2 parabionts med afbrudte suturer.
- Tillad mus til at vågne op i luften.
- For at sikre succes i denne protokol, for par sundhed skal bevares: overvåge par dagligt; udføre huld scorede to gange om ugen; og vejer par to gange ugentligt.
Bemærk: Hvert par er opstaldet enkeltvis.
Bemærk: Hvis ved hjælp af regelmæssig buprenorphin (dvs. ikke SR/langsom frigivelse) derefter administrere 0,1 mg/kg subkutant i 1 mL saltvand pr. musen to gange dagligt i 3 dage. - Tillad 4 uger af inddrivelse tid til at sikre fælles omsætning mellem parabionts hvis udfører tibial knoglebrud surgery.
4. tibial knoglebrud Surgery (protokol 1B)
- Administrere analgesi (buprenorphin, 0,1 mg/kg subkutant) efter induktion og før kirurgisk manipulation. Injicere bupivacaine (0,25%) på operationsstedet proksimalt for knæ lige før åbningen. Anvende øje lubricant.
- Barbere den mediale aspekt af højre bagben lemmer af musen til at udsætte det kirurgiske område, og desinficeres med jod + 70% alkohol skin scrub over 3 vekslende cyklusser. Opretholde en steril kirurgiske felt under hele proceduren. At begrænse forurening; Brug autoklaveres instrumenter og handsker; komplet kirurgi under et dissekere mikroskop (valgfri); og bruge en varmepude til at opretholde kropstemperaturen.
Bemærk: Hvis protokollen er udført på parabionts, kun 1 mus er brækket i par (højre skinneben af højre museknap). Se figur 1B for et skematisk diagram over brud på parabionts. - Bruge en saks til at gøre en hud indsnit langs den mediale aspekt af højre bagben lemmer proksimalt for knæ ned til midshaft af skinnebenet på den højre museknap.
- Udsætte midshaft af skinnebenet og synligt lokalisere diaphysis. Bøj knæ og visualisere den tibial plateau ved hjælp af patella-femorale ligament som et vartegn.
- Visualisere patellar senen; manuelt bore af rullende tommelfinger og pegefinger et 0,5 mm hul i marvkanalen ved hjælp af en 25-gauge kanyle.
Bemærk: Det borede hul vil køre parallelle langs skinnebenet, i gennem den tibial plateau. - Indsætte en 0,38-mm rustfrit stål pin gennem hullet omkring 15 mm i den medullære kavitet før modstand er følte, og skåret flugter med den tibial plateau ved hjælp af en wire cutter (Se supplerende Video 1 for en 3D rekonstruktion).
- Bruger lige Bonn saks, fraktur tibia midshaft (diaphysis). Se figur 1 c for et skematisk diagram over bruddet.
- Visuelt observere fraktur websted og tilstødende væv til at inspicere for stabilisering af fraktur synet.
- Luk med dermal hæfteklammer.
- Placere mus på opvarmet puder til at inddrive før returnere dem til et rent hjem bur. Indsprøjte 1 mL forvarmet (37 ° C) normal saltvand subkutant i hvert mus for væske udskiftning.
- Kontrollere mus dagligt for tegn på halten, infektion eller blødning.
Bemærk: Hvis ved hjælp af regelmæssig buprenorphin (dvs. ikke SR/langsom frigivelse) derefter administrere 0,1 mg/kg subkutant i 1 mL saltvand daglig i 3 dage.
Representative Results
Efter tværgående osteotomier blev omhyggeligt udført under sterile forhold med konstant indsættelse af pins og egentlig sutur, musene viste ingen tegn på halten, infektion eller blødning i venstre ben efter operationen. Ortopædisk healing blev vurderet ved hjælp af radiografiske analyse og histomorfometri efter Safranin-O farvning (figur 2). Røntgenbilleder af midshaft brækket skinneben angivet mere væv deposition i hård hud fraktur af unge mus end i fraktur hård hud i alderen mus. Fraktur hård hud var kalkfattige og indlejret i paraffin i forberedelse til histologisk analyse. Sektioner var plettet med Safranin-O og væv deposition blev kvantificeres ved hjælp af histomorfometri analyse. Fraktur hård hud af unge mus indeholdt mere knogle og mindre fibrotisk væv end fraktur hård hud fra alderen mus.
Tibial fraktur inducerer systemiske og centrale betændelse6,7,11,15,16. Perifere niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner og fare-associeret molekylære mønstre (DAMPs) er faktisk hurtigt forhøjede efter ortopædisk kirurgi, både i mus og mennesker7,17,18. Dette bidrager til aktivering af microglial celler i hjernen via flere signaling mekanismer der involverer humorale, cellulære og neuronal veje7,15,19,20, 21. Efter kirurgi, endotel dysfunktion, blod - hjerne barrieren åbning og perifere makrofag infiltration bidrage til akut hippocampus neuroinflammation i naturen-typer og Ccr2RFP / + Cx3cr1normal god landbrugspraksis / + voksne mus15 , 19, og har været forbundet med efterfølgende hukommelse underskud, der ligner menneskets delirium og postoperativ kognitiv dysfunktion15,19,22. Dette neuroinflammatory svar er forværret i alderen dyr, med betydelige ændringer i microglial morfologi, som registreres af IBA-1 immunfarvning (figur 3).
Bruger den tibial fraktur model beskrevet her, fundet vi også forbigående nedsat hippocampus neurogenese, som det fremgår af en reduktion i doublecortin (DCX) immunfarvning i dentate gyrus20. Elektrofysiologisk målinger af langsigtede potensering (LTP), et surrogat for memory funktion, afslørede en tidsafhængig afbrydelse i neuroplasticitet efter operationen11. Mus efter kirurgi også vise funktionshæmninger i hippocampus-afhængige hukommelsesfunktion, for eksempel ved hjælp af frygt conditioning adfærdsmæssige vurdering (figur 4). I frygt conditioning, er mus placeret i et kammer og udsat for en auditiv cue efterfulgt af et afskrækningsmiddel stimulus (dvs, footshock). Tre dage efter tibial kirurgi, mus er testet i conditioning kammer, denne gang uden nogen auditive eller afskrækningsmiddel stimulation, og frysning adfærd er optaget som et indeks af hukommelse (for en detaljeret protokol Se23).
Fremskreden alder er en vigtig risikofaktor for hukommelse tilbagegang. Endnu, som vi alder, evne til væv reparation og regeneration også mindsker selvom disse mekanismer er fortsat dårligt forstået. Dermed, vi brugte de protokoller heri beskrevet for at udføre heterochronic parabiosis (parring unge/gamle dyr) og vurderet fraktur healing i alderen mus (for en detaljeret parabiosis protokol Se24). Blod-deling mellem parabiotic par blev bekræftet, og fundet for at være lige12. Eksponering for en ungdommelig omsætning forbedret knogle reparation med tidligere union, øget knogle deposition og faldt fibrose (figur 5)12. Denne foryngelse af knogle regenerering opstod uafhængigt af de endogene osteocalcin-positive osteoblaster (figur 5, brun celler), men snarere har påberåbt sig CD45-positive celler, der overføres fra den unge parabiont (figur 5, blå celler) . Disse resultater viser, at den CD45-positive hæmatopoietisk celler udskiller en ungdommelig og sund niche, som er i stand til at signalere til alderen osteoblastic cellerne inducerende dem til at blive mere aktive.
Figur 1: skematisk fremstilling af parabiosis og tibial knoglebrud surgery. (A) tidslinje til at udføre parabiosis og tibial fraktur (protokol 1A) eller tibial fraktur alene (protokol 1B). (B) skinneben af 20 måneder gamle mus i isochronic eller heterochronic parabiotic par var brækket (højre ben af højre museknap er brækket, som angivet med et X). Grå mus skildrer vildtype mus mens grønne mus skildrer eGFP mus. (C) skematisk diagram over tibial fraktur model med intramedullært fastgørelse og midten aksel briste. Se også supplerende Video 1 for en 3D rekonstruktion af hind legemsdel og fastgørelse af skinnebenet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tibial fraktur healing inden for unge og gamle musemodeller. Skinneben af unge eller gamle mus var brækket og fraktur hård hud var undersøgte 21 dage post skade. (A) Radiografisk imaging og histologiske farvning (Safranin-O) blev brugt til at evaluere fraktur hård hud 21 dage post fraktur. Farvning viser kollagen væv i blå og proteoglycaner (indeholdt i brusk) i rødt. Stiplede linjer angiver omtrentlig placering af fraktur callus. (B) histomorfometri blev brugt til at vurdere mængden af ben, brusk og fibrotisk væv deponeret inden for fraktur callus 21 dage post fraktur. Dataene udtrykt som betyder ± 95% konfidensintervaller, * P < 0,05, statistisk signifikant (en-vejs ANOVA, Dunnett's test), skala søjler repræsenterer 2 mm, og billeder blev opnået ved hjælp af et mikroskop, 1,25 x mål. n = 9 for hver prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kirurgi induceret aldersbetinget microglial aktivering i hippocampus. Tibial knoglebrud surgery inducerer større hippocampus neuroinflammation i alderen mus (20-måned-forhenværende) sammenlignet med 4-måned-forhenværende C57BL6/J mus. Hjerne-afsnit farvning med microglial markør IBA-1 viser mere positive celler og morfologiske ændringer i kirurgisk grupper 24 timer efter operationen. Billeder blev opnået med en epifluorescerende mikroskop med en forstørrelse på 100 x.; skalalinjen repræsenterer 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: nedsat neurogenese, langsigtede potensering og hukommelsesfunktion efter tibial knoglebrud surgery. (A) DCX, en kvantitativ markør for neurogenese, reduceres betydeligt i hippocampus dentate gyrus på 24 timer efter operationen. Billeder blev opnået med en Konfokal laser-scanning mikroskop mål med en forstørrelse på 10 x; skalere bar repræsenterer 10 µm. (B) Elektrofysiologi i hippocampus skiver fra kontrolelementer eller mus 24 timer efter operationen. Langsigtede potensering (LTP) er fremkaldt ved høj frekvens stimulation (HFS) og indspillet over 1 h. felt excitatoriske postsynaptiske potentialer (fEPSPs) blev indspillet fra CA1 stratum radiatum ved hjælp af en ekstracellulære optagelse pipette fyldt med regelmæssige kunstige cerebrospinalvæsken. På 24 timer efter operationen, er LTP induktion bemærkelsesværdigt reduceret i forhold til kontrol mus. Data er udtrykt i gennemsnit ± s.e.m. n = 3, * p < 0,05 1-vejs ANOVA. (C) Hippocampal-afhængige hukommelsesfunktion (defineret som % af frysning ved hjælp af trace frygter conditioning) er nedsat hos musene efter kirurgi sammenlignet med kontrol og dyr udsættes for anæstesi kun. Data er udtrykt i gennemsnit ± s.e.m. n = 9-10, * p < 0,05 1-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Parabiosis kirurgi fører til foryngelse af fraktur healing, deling af blod, og donor-celle engraftment. Isochronic og heterochronic parabiosis bindinger blev etableret og alderen musen i hvert par var brækket og vurderet for knogleheling. (A) fraktur hård hud blev undersøgt ved hjælp af radiografiske billeddannelse. Stiplede linjer angiver omtrentlig placering af fraktur callus. (B) Engraftment eGFP + celler blev bekræftet i knoglemarven. (C) Immunhistokemi af fraktur callus blev brugt til at identificere eGFP+ donor celler (blå) og osteocalcin+ osteoblastic celler (brun) fra parabiont. Skala søjler repræsenterer 50 µm og billeder blev opnået ved hjælp af en 40 x mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Video 1: 3D rekonstruktion af hind legemsdel og fastgørelse af tibia. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Frakturer er en fælles klinisk problem, og fortsat er en førende årsag til sygelighed, især i den hastigt voksende senior befolkning. Her, indfører vi en trinvis protokol for en musemodel af tibial fraktur at studere mekanismer er ansvarlige for postoperative neuroinflammation og kognitiv svækkelse. Denne model kan kombineres med parabiosis kirurgi til at studere neuro-immune interaktioner, vævsregeneration og andre signaling processer. Forstå disse mekanismer vil give strategiske mål for at minimere risikoen for postoperative komplikationer og optimere resultaterne.
Flere ortopædisk modeller er blevet udviklet for at studere knogle reparation i gnavere25. Vi har vedtaget og ændret denne tibial fraktur procedure, oprindeligt beskrevet af Harry et al. 8, at studere virkningerne af ortopædisk kirurgi på hjernefunktion. Vi har også brugt denne fraktur model i kombination med vores parabiosis model til at undersøge faktorer, der er ansvarlige for knogleheling og alder afhængige vævsregeneration. Når der udføres under flygtige generel anæstesi, denne tibial fraktur procedure kræver kun ca 15 min pr. dyr, resulterer i nul til minimal dødelighed (afhængigt af alder af musen og underliggende genetiske modtagelighed), og sammenfatter fælles fornærmelser forbundet med long-knoglebrud og ortopædisk Kirurgisk traume. Således, denne model er ideel til spørgekriterierne biologiske veje og udføre langsgående vurderinger. Det er imidlertid afgørende at den osteotomi og fastgørelse er reproducerbare, og at skade på det bløde væv er konsekvent. Blødt vævsskader kan moduleres, for eksempel ved stripning periosteum og klemme omkringliggende muskler til at gøre kirurgi mere traumatisk. Modeller af traumatisk fraktur induceret af ikke-fast stumpe traumer eller tre-punkts bøjning ville ikke give sådanne konsistens eller nøjagtighed. Disse procedurer resultere ofte i re-skade, som fører til langvarig inflammatorisk respons. Omvendt, modeller af fraktur med rigid fiksation har en mere moderat betændelse, som ikke fuldt sammenfatte skader forbundet med ortopædisk kirurgi26,27.
Andre modeller bruger titanium-legering fastgørelse er blevet udviklet til nøje efterligne menneskelige artroplastik og kan være mere relevant at afhøre protesen ustabilitet, osteolyse, og protesen-associerede komplikationer i mus28,29 . Drill-hullers modeller frygter som man præsenteres her, give passende stabilisering, og mus kan testes i adfærdsmæssige paradigmer uden betydelige underskud, der kunne forvirre opgaver som aircondition eller åbne feltet bevægelse/angst test6 ,7,11,15,19,20. Men, roterende deformiteter kan opstå Hvis optagelsen ikke er korrekt låst. Nogle modeller bruger en ekstern fiksator, som giver overlegen stabilisering, men er en udfordring for at gennemføre i en mus tibia, selv om det kan gennemføres med succes i en mus lårbenet27.
Kognitive funktionsnedsættelser, herunder delirium og postoperativ kognitiv dysfunktion, er fælles komplikationer efter ortopædisk kirurgi for fraktur reparation, især i ældre og svagelige patienter30. Denne klinisk relevante musemodel af tibial knoglebrud surgery viser postoperative systemisk cytokin release6,7,17, nedsat blod - hjerne barrieren funktion15,19 , og ændret microglial morfologi16,22, bidrage til hukommelse værdiforringelse, og kan udgøre vigtige funktioner for de postoperative neurologiske komplikationer ses hos mange patienter efter ortopædisk kirurgi. Det er vigtigt at bemærke, at andre kirurgiske procedurer er blevet brugt til at modellere postoperativ kognitiv dysfunktion hos mus. Disse omfatter abdominal31,32,33 samt vaskulære34 kirurgi og overfladiske traumer35,36. Parabiosis teknikken er gældende for alle disse modeller, som deler samme endepunkter, herunder betændelse, glial aktivering og adfærdsmæssige underskud, der kan være medieret af fælles mekanismer.
Undersøgelser, der omfatter parabiosis har afsløret nye roller for cirkulerende faktorer, der kan påvirke kognitive funktion, neuroinflammation og væv foryngelse i alderen dyr37,38,39,40 ,41,42. Vi har vist, at parabiosis kan kombineres med succes med den tibial fraktur model beskrevet her til at afhøre regenerativ veje og studere mekanismer der involverer blodbårne faktorer, indflydelse healing og fraktur reparation12. Her, viste vi at fraktur-reparation kapacitet af et ældre dyr kan blive forynget, når alderen dyret er anastomosed til en unge dyr. Denne vending af alder var forankret i engraftment hæmatopoietisk celler på webstedet fraktur. Interessant, ville sådan foryngelse også kunne opnås gennem transplantation af unge knoglemarv i alderen mus. Knoglemarvstransplantation kan i denne forbindelse anses for en mere direkte og enklere alternativ tilgang til parabiosis. Parabiosis er dog en mere robust model for at undersøge funktionen af cirkulerende celler og faktorer. Vi forventer, at en kombination af parabiosis og ortopædisk kirurgi modeller vil spille en vigtig rolle i besvarelsen af kritiske spørgsmål i perioperative pleje og aldring biologi.
I sammendrag indfører vi en trinvis protokol for en musemodel af tibial fraktur at studere mekanismer er ansvarlige for postoperative neuroinflammation og kognitiv svækkelse efter ortopædisk kirurgisk procedurer. Denne model kan kombineres med en parabiosis procedure at studere neuro-immune interaktioner, vævsregeneration og andre veje. Definerer disse mekanismer vil give strategiske mål for at minimere risikoen for postoperative komplikationer og optimere resultaterne.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Kathy Gage, BS (afdeling af Anesthesiology, Duke University Medical Center, Durham, NC) for redaktionelle bistand. NT anerkender støtte fra en drøm Innovation tilskud fra hertug Anesthesiology og NIH/NIA R01 AG057525-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
| Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
| 10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
| MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
| Shaver | Wahl | 9854L | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades - #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
| Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
| Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
| 22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
| Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
| Suture | Look | 1079B | |
| C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
| eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |
References
- Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
- Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
- Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
- Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
- Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
- Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
- Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
- Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
- Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211 (2016).
- Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
- Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
- Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131 (2015).
- Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90 (2011).
- Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
- Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
- Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
- Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
- Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
- Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
- Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
- Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229 (2017).
- Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
- Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, Suppl 4. S3-S6 (2007).
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
- Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
- AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
- Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268 (2016).
- Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
- Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346 (2015).
- Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
- Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
- Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
- Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
- Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).
