Summary
Dit protocol beschrijft een muismodel van de orthopedische chirurgie die is gebruikt voor het bestuderen van de mechanismen van postoperatieve neuroinflammation en gedragsveranderingen, en wanneer deze wordt gecombineerd met parabiosis, om te studeren weefselregeneratie tijdens veroudering.
Abstract
Chirurgie wordt vaak gebruikt om te verbeteren en het handhaven van de kwaliteit van het leven. Helaas, bij kwetsbare patiënten zoals ouderen, kunnen complicaties optreden en aanzienlijk verminderen de uitkomst. Inderdaad, na een routine orthopedische operatie om te herstellen van een breuk, maar liefst 50% van de oudere patiënten lijden aan neurologische complicaties zoals delirium. Ook de capaciteit om te helen en te regenereren van weefsel na de operatie vermindert met de leeftijd en kan invloed hebben op de kwaliteit van de breuk reparatie en zelfs werden integratie van implantaten. Dus, een beter begrip van de mechanismen die deze leeftijd-afhankelijke veranderingen rijden zou kunnen bieden strategische doelen om te minimaliseren van risico voor dergelijke complicaties en optimaliseren van de resultaten. Hier introduceren we een klinisch relevante muismodel van tibiale breuk. De postoperatieve veranderingen in deze muizen nabootsen sommige van de cognitieve afboekingen vaak waargenomen na routine orthopedische chirurgie bij de mens. Kortom, een insnijding wordt uitgevoerd in de juiste hind-limb onder strikt aseptische condities. Spieren zijn losgekoppeld en een 0.38-mm roestvast stalen pin wordt ingevoegd in de bovenste top van de tibia, binnen het intramedullaire kanaal. Osteotomie wordt vervolgens uitgevoerd, en de wond is geniet. Wij hebben dit model gebruikt om de onderzoeken van de effecten van het chirurgisch trauma op postoperatieve neuroinflammation en gedragsveranderingen. Door het toepassen van deze fractuur model in combinatie met parabiosis, een chirurgische model waarin 2 muizen zijn anastomosed, hebben wij bestudeerd cellen en secreted factoren die systemisch orgel functie en weefsels regeneratie na blessure verjongen. Door het volgen van onze stapsgewijze protocol, deze modellen kunnen worden gereproduceerd met high-fidelity, en kunnen worden aangepast aan het ondervragen van vele biologische trajecten die worden gewijzigd door chirurgische trauma.
Introduction
Chirurgie heeft getransformeerd het medische systeem van gezondheidszorg is voortdurend bij te dragen tot de cutting edge technologie, verbetering van de veiligheid, en onderhouden van kwaliteit van leven. Helaas, chirurgie ook induceert uitlokkende reacties die kunnen leiden tot postoperatieve complicaties waaronder wond infecties, neurologische waardeverminderingen en zelfs sterfte, vooral in oudere patiënten1,2. Orthopedische chirurgie wordt routinematig, vooral bij oudere volwassenen, kwaliteit van leven verbeteren en herstellen van gemeenschappelijke beenverwondingen uitgevoerd. Echter, tot 50% van de patiënten van de orthopedische chirurgie die 65 jaar en ouder ervaring neurologische waardeverminderingen zoals postoperatieve delirium. Deze consequent correlaten met slechte prognose, dat wil zeggen, 5-fold verhoogd risico op mortaliteit op 6 maanden, voortdurende daling van de functionele, verhoogde verpleegkunde tijd per patiënt, toegenomen lengte van verblijf in het ziekenhuis, en hogere tarieven van verpleeghuis plaatsing 3 , 4 , 5. sommige risicofactoren, inclusief gevorderde leeftijd, zijn geïdentificeerd, maar er is weinig bekend over de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor neurologische waardeverminderingen na de operatie.
Aangezien fracturen veel voor bij ouderen komen, hebben we vastgesteld dat een muismodel van tibiale breuk te bepalen van de invloed van perifere trauma op postoperatieve terugwinning, met inbegrip van neuroinflammation en brain gezondheid (cognitieve functie)6, 7. dit model, oorspronkelijk beschreven door Harry et al. 8, bestaat uit intramedullaire vastzetten en tibiale breuk onder narcose en Analgesie, en bootst zo het letsel van de huid, spier trauma, en bot herstellen geassocieerd met gemeenschappelijke lange-botbreuken en herstellen bij de mens. Na deze procedure muizen laten zien veranderingen in inflammatoire merkers vergelijkbaar met wijzigingen waargenomen in mens9,10, evenals de activering van het microglial in de hippocampus, die geassocieerd met tekorten in de declaratieve geheugen wordt en hippocampal Neuroplasticiteit6,7,11. We hebben eerder deze fractuur model gecombineerd met parabiosis. Parabiosis is een chirurgische model waarbij 2 muizen zijn anastomosed, en dus delen een bloedsomloop. Dit model heeft een doorbraak in het begrip van regelgevende gevolgen van de circulerende cellen en humorale factoren op orgaanfunctie in het kader van leeftijd en ziekte12,13,14. Met behulp van deze aanpak ontdekt we onlangs systemische factoren die samenhangen met leeftijd-afhankelijke fractuur genezing van12.
Hier introduceren we een protocol dat de tibiale fractuur model combineert met parabiosis om te studeren van bot-naar-brain age-afhankelijke mechanismen, die relevant voor regeneratieve geneeskunde en neuroimmunology zijn. Protocol 1A de parabiosis procedure, en Protocol 1B details tibiale fractuur wordt de procedure beschreven (figuur 1A). Deze kunnen worden uitgevoerd onafhankelijk van elkaar of in combinatie, afhankelijk van de aard van de ondervraging.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, en goedgekeurd door de institutionele Animal Care & gebruik Comité (IACUC) aan de Duke University.
1. proefdieren
- Dat muizen in een airconditioned omgeving met 12-h licht/donker cycli en juiste toegangsrechten standaard voedsel en water. Huis van niet meer dan 5 nestgenoten per kooi en dat omstandigheden die tot vechten aanzetten kunnen.
- Het gebruik van vrouwtjes C57BL6/J muizen op 3 maanden oud (jonge) of 18 maanden (oude).
- Voor parabiosis, acclimatiseren 2 muizen samen voor ten minste twee weken voor de operatie. Muizen zijn wild-type C57BL6/J of eGFP +.
- Controleer de conditie van het lichaam en de totale uitstraling van muizen dagelijks.
2. preoperatieve Setup voor Parabiosis en orthopedische chirurgie
- Weeg de 2 muizen.
- Het beheren van algemene verdoving via een systeem van de verdoving bij een constant debiet van de O2 van 0.2 L/min. gebruik 5% Isofluraan voor inductie in de zaal van een inductie.
Opmerking: De diepte van de verdoving kan worden bevestigd met behulp van een teen snuifje. - Plaats de muizen op een verwarmde pad in een liggende positie. Gebruik een rectale sonde lichaamstemperatuur tijdens de chirurgische procedure volgen.
- Lager te handhaven anesthesie, de ingeademde concentratie van Isofluraan tot 2,0% in 0,2 L/min. door een gelaatsmasker. Monitor om voldoende diepte van de verdoving.
- Controleren van fysiologische parameters (ademhaling, zuurstof saturatie en hart beat) niet-gebeurt met behulp van een pulse oximeter (optioneel).
3. parabiosis chirurgie (Protocol 1A)
- Analgesia beheren (buprenorfine, SR/slow release, 0,1 mg/kg subcutaan) na inductie en voor chirurgische manipulatie. Injecteren bupivacaine (0,25%) op de flanken net vóór de opening. Toepassing oog smeermiddel.
Opmerking: Het parabiosis-protocol kan worden uitgevoerd onafhankelijk van de Tibia fractuur. - Gebruik voor alle interne lichaam betreft, 4-0 polydioxanone hechtdraad materiaal. Gebruik voor alle externe betreft, 4-0 polypropyleen hechtdraad materiaal.
- Scheren van elk van de 2 muizen langs een aaneengesloten lijn vanaf de elleboog, de flank en de knie aan de kant te worden samengevoegd. Ontsmet met jodium + 70% alcohol huid schrobben meer dan 3 afwisselend cycli ter voorbereiding van de snede.
Gesteriliseerde met autoclaaf instrumenten gebruikt en onderhouden van een steriel veld.
Opmerking: Plaats de wild-type muis rechts van de eGFP muis en de linker flank van het wild-type muis en de rechterflank van de muis eGFP voorbereiden op operatie (Figuur 1). - Op elke muis, gebruik een schaar om een huid incisie langs de flank, variërend van proximale aan de knie tot net proximale aan de elleboog en zonder verstoring van de spieren onder de huid.
- Word lid van de triceps van de dieren met 2 onderbroken hechtingen.
- Word lid van de wanden van het lichaam langs de flanken met een draaiend, continu hechtdraad van 7-9 passen.
- Word lid van de quadriceps van het dier met 2 onderbroken hechtingen.
- Sluit de huid van de 2 parabionts met onderbroken hechtingen.
- Laat de muizen te ontwaken in de lucht.
- Om succes te verzekeren van dit protocol, de gezondheid van de paren moet worden gehandhaafd: controleren van de paren dagelijks; uitvoeren van lichaam voorwaarde scoren twee keer per week; en wegen de paren twee keer per week.
Opmerking: Elk paar is individueel gehuisvest.
Opmerking: Als regelmatige buprenorfine (dwz niet SR/slow release) vervolgens beheren 0,1 mg/kg subcutaan in 1 mL zoutoplossing per muis tweemaal daags gedurende 3 dagen. - 4 weken hersteltijd gedeelde luchtcirculatie tussen de parabionts als tibiale fractuur chirurgie uitvoeren toestaan.
4. Tibia fractuur chirurgie (Protocol 1B)
- Analgesia beheren (buprenorfine, 0,1 mg/kg subcutaan) na inductie en voor chirurgische manipulatie. Injecteren bupivacaine (0,25%) op de chirurgische site proximale aan de knie net vóór de opening. Toepassing oog smeermiddel.
- Scheren van de mediale aspect van de juiste hind-limb van de muis om het chirurgische gebied bloot te stellen, en ontsmet met jodium + 70% alcohol huid scrub meer dan 3 afwisselend cycli. Het handhaven van een steriele chirurgische veld tijdens de gehele procedure. Beperken van verontreiniging; gebruik gesteriliseerde met autoclaaf instrumenten en handschoenen; voltooien van de operatie onder een ontleden Microscoop (facultatief); en gebruik van een verwarming pad te handhaven van de lichaamstemperatuur.
Opmerking: Als het protocol wordt uitgevoerd op parabionts, slechts 1 muis is gebroken in het paar (de juiste tibia van de rechter muisknop). Zie figuur 1B voor een schematisch diagram van de breuk op parabionts. - Gebruik een schaar om een insnijding van de huid langs het mediale aspect van de juiste hind-limb proximale aan de knie tot de midshaft van de tibia op de rechter muisknop.
- De midshaft van de tibia bloot en visueel Zoek de diaphysis. De knie Flex en visualiseren het tibiale plateau met behulp van de patella femorale ligament als een mijlpaal.
- Visualiseren van de Patellaire pees; handmatig boor door het walsen van duim en wijsvinger een gat 0.5 mm in het kanaal van de intramedullaire met behulp van een 25-meter-naald.
Opmerking: Het geboorde gat zal parallel lopen langs het scheenbeen, in via het tibiale plateau. - Invoegen van een 0.38-mm roestvast stalen pin door het gat van ongeveer 15 mm in de Wallenberg holte totdat weerstand gevoeld, en gesneden flush met het tibiale plateau met behulp van een draadknipper (Zie aanvullende Video 1 voor een 3D reconstructie).
- Met behulp van rechte Bonn schaar, fractuur van de tibia-midshaft (diaphysis). Zie Figuur 1 c voor een schematisch diagram van de breuk.
- Visueel observeren de fractuur site en aangrenzende weefsels te inspecteren voor stabilisatie van de aanblik van de breuk.
- Sluit met dermale nietjes.
- Plaats de muizen op verwarmde pads te herstellen voordat u terugkeert hen naar een schone kooi. De normale zout 1 mL voorverwarmde (37 ° C) in elke muis voor vloeistof vervanging subcutaan te injecteren.
- Controleer muizen dagelijks op tekenen van kreupelheid, infectie of bloeden.
Opmerking: Als regelmatige buprenorfine (dwz niet SR/slow release) vervolgens beheren 0,1 mg/kg subcutaan in 1 mL zoutoplossing dagelijks voor 3 dagen.
Representative Results
Na dwarse osteotomieën werden zorgvuldig uitgevoerd onder steriele omstandigheden met gestage invoeging van de insteeknokken en de juiste wordt, betekent dit dat muizen geen symptomen van kreupelheid, infectie of bloeding in het linkerbeen na de operatie vertoonde. Orthopedische genezing werd beoordeeld met behulp van radiografische analyse en histomorphometry na Safranine-O kleuring (Figuur 2). Röntgenfoto's van de midshaft gebroken tibiae aangegeven meer weefsel depositie in de breuk eelt van jonge muizen dan in de eelt van de fractuur van leeftijd muizen. Fractuur eelt waren vastgelegde ontkalkte en ingebed in paraffine ter voorbereiding van histologische analyse. Secties zijn gekleurd met Safranine-O en weefsel depositie werd gekwantificeerd aan de hand van de histomorphometry analyse. Fractuur eelt van jonge muizen bevatte meer bot en minder fibrotische weefsel dan fractuur eelt van leeftijd muizen.
Tibiale fractuur induceert systemische en centrale ontsteking6,7,11,15,16. Inderdaad, perifere niveaus van pro-ontsteking cytokinen en gevaar-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) zijn snel verheven na orthopedische chirurgie, zowel in muizen en mens7,17,18. Dit draagt bij tot activering van microglial cellen in de hersenen via verschillende signalering mechanismen neuronale, humorale en cellulaire trajecten7,15,19,20, waarbij 21. Na chirurgie, endotheel disfunctie, opening van de bloed - hersenbarrière en perifere macrofaag infiltratie bijdragen aan acute hippocampal neuroinflammation in wild-soorten en Ccr2RFP / + Cx3cr1GFP / + volwassen muizen15 , 19, en zijn geassocieerd met de latere geheugen tekorten die lijken op menselijke delirium en postoperatieve cognitieve dysfunctie15,19,22. Deze neuroinflammatoire reactie wordt verergerd in leeftijd dieren, met significante veranderingen in de morfologie van de microglial, zoals gedetecteerd door IBA-1 immunokleuring (Figuur 3).
Met behulp van het model van de Tibia fractuur beschreven hier, vonden wij ook Transient verminderde hippocampal neurogenese, zoals blijkt uit een daling doublecortin (DCX) immunokleuring in de getand gyrus20. Electrophysiologic metingen van langdurige potentiëring (LTP), een surrogaat voor de geheugenfunctie, bleek een ontwrichting van de tijd-afhankelijke in Neuroplasticiteit postoperatief11. Bijzondere waardeverminderingen weergeven muizen na de operatie ook in hippocampal-afhankelijke geheugenfunctie, bijvoorbeeld met behulp van angst conditionering gedrags beoordeling (Figuur 4). Bij vreesconditionering, zijn muizen geplaatst in een kamer en blootgesteld aan een auditieve cue, gevolgd door een aversieve stimulus (dat wil zeggen, footshock). Drie dagen na de tibiale operatie, muizen zijn getest in de kamer airconditioning, ditmaal zonder een auditieve of aversieve stimulatie, en bevriezing van gedrag wordt vastgelegd als een index van geheugen (voor een gedetailleerde protocol Zie23).
Gevorderde leeftijd is een belangrijke risicofactor voor de daling van het geheugen. Nog, naarmate we ouder worden, de capaciteit voor weefselherstel en regeneratie ook vermindert hoewel deze mechanismen slecht begrepen blijven. Dus wij gebruikt van de hierin beschreven voor het uitvoeren van heterochronic parabiosis (pairing jonge/oude dieren) protocollen en beoordeeld fractuur genezing binnen de leeftijd muis (voor een gedetailleerde parabiosis protocol Zie24). Bloed-verdeling tussen parabiotic paren werd bevestigd, en vastgesteld dat gelijke12. Blootstelling aan een jeugdige verkeer verbeterde bot reparatie met eerdere Unie, verhoogde bot depositie, en verminderde van fibrose (Figuur 5)12. Deze verjonging van bot regeneratie is onafhankelijk van de endogene osteocalcin-positieve botcellen (Figuur 5, bruin cellen) opgetreden, maar eerder gebaseerd op CD45-positieve cellen die gemigreerd van de jonge parabiont (Figuur 5, blauwe cellen) . Deze resultaten wijzen erop dat de CD45-positieve hematopoietische cellen afscheiden een jeugdige en gezonde niche, wie vermag signaal naar de leeftijd osteoblastic cellen inducerende hen actiever geworden.
Figuur 1: schematische weergave van de parabiosis en de tibiale fractuur chirurgie. (A) tijdlijn voor het uitvoeren van parabiosis en tibiale fractuur (protocol 1A) of Tibia fractuur alleen (protocol 1B). (B) Tibiae van 20-maand oude muizen in isochronic of heterochronic parabiotic paren werden gebroken (rechterbeen van de juiste muis is gebroken, zoals aangeduid met een X). Grijze muizen verbeelden wildtype muizen terwijl groene muizen eGFP muizen verbeelden. (C) schematisch diagram van Tibia fractuur model met intramedullaire vastzetten en halverwege schacht breken. Zie ook aanvullende Video 1 voor een 3D reconstructie van de achterste ledematen en vastzetten van het scheenbeen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: tibiale fractuur genezing binnen jong en oud Muismodellen. De tibiae van jonge of oude muizen werden gebroken en breuk eelt waren onderzochte 21 dagen post letsel. (A) radiografische beeldvorming en histologische kleuring (Safranine-O) werden gebruikt om te evalueren van de fractuur eelt 21 dagen post breuk. Kleuring toont collagene weefsels in blauw en proteoglycans (deel uitmaakt van kraakbeen) in het rood. Stippellijnen geschatte locatie van de fractuur eelt. (B) Histomorphometry werd gebruikt voor het beoordelen van de hoeveelheid bot, kraakbeen en fibrotische weefsel gestort binnen de fractuur eelt 21 dagen post breuk. Gegevens worden uitgedrukt als bedoel ± 95%-betrouwbaarheidsintervallen, * P < 0,05, statistisch significant (one-way ANOVA, de Dunnett-test), schaal-2 mm voor de staven, en beelden werden verkregen met behulp van een Microscoop, 1.25 x doelstelling. n = 9 voor elk monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: chirurgie geïnduceerde leeftijd-afhankelijke microglial activering in de hippocampus. Tibiale fractuur chirurgie induceert groter hippocampal neuroinflammation in leeftijd muizen (20-maand-oude) ten opzichte van 4-maand-oude C57BL6/J muizen. Hersenen-sectie kleuring met microglial marker IBA-1 toont meer positieve cellen en morfologische veranderingen in chirurgische groepen 24u na de operatie. Beelden werden verkregen met een epifluorescerende-Microscoop met vergroting 100 x.; schaal staaf vertegenwoordigt 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: verminderde neurogenese, op lange termijn potentiëring en geheugenfunctie na tibiale fractuur chirurgie. (A) DCX, een kwantitatieve marker voor neurogenese, is aanzienlijk verminderd in de hippocampus getand gyrus bij 24 h na de operatie. Beelden werden verkregen met een confocale laser scanning microscoop doelstelling met een vergroting van 10 x; schaal bar vertegenwoordigt 10 µm. (B) electrofysiologie in hippocampal plakjes van besturingselementen of muizen 24u na de operatie. Op lange termijn potentiëring (LTP) was geïnduceerd door hoogfrequente stimulatie (HFS) en meer dan 1 h. opgenomen veld excitatory postsynaptisch potentieel (fEPSPs) werden opgenomen van de CA1 stratum radiatum met behulp van een precisiepipet van de extracellulaire opname gevuld met regelmatige kunstmatige cerebrospinale vloeistof. 24 uur na de operatie, is LTP inductie opmerkelijk verminderd in vergelijking met controle muizen. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± s.e.m. n = 3, * p < 0.05 1-way ANOVA. (C) Hippocampal-afhankelijke geheugenfunctie (gedefinieerd als % van bevriezing met overtrekken angst conditionering) in muizen na chirurgie in vergelijking met besturingselementen en op narcose alleen blootgestelde dieren is aangetast. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± s.e.m. n = 9-10, * p < 0.05 1-way ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Parabiosis chirurgie leidt tot verjonging van breuk genezing, bloed-delen en donor-cel engraftment. Isochronic en heterochronic parabiosis-pairings werden opgericht en de leeftijd muis in elk paar was gebroken en beoordeeld voor bot genezing. (A) breuk eelt werden onderzocht met behulp van radiografische beeldvorming. Stippellijnen geschatte locatie van de fractuur eelt. (B) Engraftment van eGFP + cellen werd bevestigd in het beenmerg. (C) Immunohistochemistry van de fractuur eelt werd gebruikt voor het identificeren van eGFP+ donor cellen (blauw) en osteocalcin+ osteoblastic cellen (bruin) van de parabiont. Schaal staven 50 µm en beelden werden verkregen met behulp van een 40 x doelstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Video 1: 3D reconstructie van de hind-limb en vastzetten van de tibia. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Fracturen zijn een veelvoorkomend probleem van de klinische en blijven een belangrijke oorzaak van morbiditeit, met name in de snel groeiende senior bevolking. Hier introduceren we een stapsgewijze protocol voor een muismodel van tibiale breuk te bestuderen van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor postoperatieve neuroinflammation en cognitieve stoornissen. Dit model kan worden gecombineerd met parabiosis chirurgie naar neuro-immuun-interacties, Weefselregeneratie en andere signalering processen bestuderen. Inzicht in deze mechanismen zorgt voor strategische doelen om te minimaliseren van de risico's voor postoperatieve complicaties en optimaliseren van de resultaten.
Verschillende orthopedische modellen zijn ontwikkeld om te bestuderen van bot reparatie in knaagdieren25. Wij aangenomen en deze procedure tibiale fractuur, oorspronkelijk beschreven door Harry et al. gewijzigd 8, effecten van orthopedische chirurgie op hersenfunctie te bestuderen. We hebben ook dit model van de breuk gebruikt in combinatie met onze parabiosis model te onderzoeken factoren die verantwoordelijk voor de genezing van bot en leeftijd-afhankelijke weefselregeneratie zijn. Wanneer onder vluchtige algemene verdoving uitgevoerd, deze tibiale fractuur procedure vereist slechts ongeveer 15 min per dier, resulteert in nul tot minimale sterfte (afhankelijk van de leeftijd van de muis en de onderliggende genetische gevoeligheid) en recapituleert gemeenschappelijk beledigingen geassocieerd met lange-botbreuk en orthopedische chirurgische trauma. Dit model is dus ideaal voor biologische trajecten ondervragen en longitudinale evaluaties uit te voeren. Het is echter essentieel dat de osteotomie en vastzetten reproduceerbaar zijn, en dat schade aan het zachte weefsel strookt. Zacht weefselschade kan worden gedifferentieerd, bijvoorbeeld door het strippen van het beenvlies en knijpen de omliggende spieren zodat de operatie traumatischer. Modellen van traumatische fractuur door niet-vaste stomp trauma of een drie-punt buigen zou geen dergelijke consistentie of nauwkeurigheid. Deze procedures resulteren vaak in re-blessure, die tot langdurige inflammatoire respons leidt. Modellen van breuk met stijve fixatie hebben daarentegen een meer gematigde ontsteking, die niet volledig de schade in verband met orthopedische chirurgie26,27 recapituleren doet.
Andere modellen met behulp van titaanlegering pinning zijn ontwikkeld om nauw nabootsen menselijke artroplastiek en wellicht relevanter te ondervragen prothese instabiliteit, osteolyse en prothese-geassocieerde complicaties in muizen28,29 . Drill holes modellen vrees zoals degene die hier gepresenteerd bieden voldoende stabilisatie, en muizen kunnen worden getest in behavioral paradigma's zonder aanzienlijke tekorten die taken zoals verwarren kunnen airconditioning of open veld motoriek/angst voor het testen van6 ,7,11,15,19,20. Roterende misvormingen kunnen zich echter voordoen als de fixatie wordt niet goed vergrendeld. Sommige modellen gebruiken een externe fixator, die biedt superieure stabilisatie, maar is een uitdaging om uit te voeren in een muis tibia, hoewel het kan worden geïmplementeerd in een muis dijbeen27.
Cognitieve beperkingen, met inbegrip van delirium en postoperatieve cognitieve dysfunctie, zijn gemeenschappelijke complicaties na orthopedische chirurgie voor reparatie van de fractuur, vooral in ouderen en kwetsbare patiënten30. Dit klinisch relevante muismodel van Tibia fractuur chirurgie toont aan dat postoperatieve systemische cytokine release6,7,17, verminderde15,19 van de functie van de bloed - hersen barrière , gewijzigd microglial morfologie16,22, bijdragen aan de aantasting van geheugen en essentiële functies van de postoperatieve neurologische complicaties na orthopedische chirurgie bij vele patiënten gezien kan vertegenwoordigen. Het is belangrijk op te merken dat andere chirurgische ingrepen zijn gebruikt om het model van postoperatieve cognitieve dysfunctie in muizen. Het gaat hierbij om abdominale31,32,33 en vasculaire34 chirurgie, evenals oppervlakkige trauma35,36. De parabiosis-techniek is van toepassing op al deze modellen, die delen van soortgelijke eindpunten, met inbegrip van ontsteking, gliale activering en gedrags tekorten, die kunnen worden bemiddeld door gemeenschappelijke mechanismen.
Studies waarin parabiosis is gebleken nieuwe rollen voor circulerende factoren die van invloed kunnen cognitieve functie, neuroinflammation en weefsel verjonging in leeftijd dieren37,38,39,40 ,41,42. We hebben aangetoond dat parabiosis met succes kan worden gecombineerd met het model van de Tibia fractuur hier beschreven studie van mechanismen waarbij bloed overgedragen factoren dat invloed genezing en breuk12 reparerente ondervragen regeneratieve trajecten. Hier, toonden we aan dat de capaciteit van de fractuur-reparatie van een ouder dier wanneer het dier ouder is anastomosed aan een jong dier kan worden verjongd. Deze omkering van leeftijd was geworteld in de engraftment van hematopoietische cellen op de site van de breuk. Interessant is dat kan dergelijke verjonging ook bereikt worden via transplantatie van beenmerg jonge leeftijd muizen. In dit verband kan beenmergtransplantatie worden beschouwd als een meer directe en eenvoudiger alternatieve aanpak van parabiosis. Parabiosis is echter een meer robuuste model voor het onderzoek naar de functie van de circulerende cellen en factoren. We verwachten dat een combinatie van parabiosis en orthopedische chirurgie modellen een belangrijke rol spelen zal bij het beantwoorden van belangrijke vragen in perioperatieve zorg en biologie van veroudering.
Kortom introduceren we een stapsgewijze protocol voor een muismodel van tibiale breuk te bestuderen van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor postoperatieve neuroinflammation en cognitieve stoornissen na orthopedische chirurgische ingrepen. Dit model kan worden gecombineerd met een parabiosis procedure te bestuderen van neuro-immuun-interacties, Weefselregeneratie en andere trajecten. Definiëren van deze mechanismen zorgt voor strategische doelen om te minimaliseren van de risico's voor postoperatieve complicaties en optimaliseren van de resultaten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Kathy Gage, BS (departement voor Anesthesiologie, Duke University Medical Center, Durham, NC) voor redactionele ondersteuning. NT erkent steun van een droom innovatie subsidie van hertog anesthesiologie en NIH/NIA R01 AG057525-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
| Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
| 10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
| MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
| Shaver | Wahl | 9854L | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades - #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
| Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
| Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
| 22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
| Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
| Suture | Look | 1079B | |
| C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
| eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |
References
- Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
- Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
- Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
- Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
- Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
- Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
- Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
- Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
- Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211 (2016).
- Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
- Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
- Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131 (2015).
- Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90 (2011).
- Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
- Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
- Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
- Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
- Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
- Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
- Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
- Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229 (2017).
- Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
- Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, Suppl 4. S3-S6 (2007).
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
- Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
- AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
- Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268 (2016).
- Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
- Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346 (2015).
- Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
- Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
- Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
- Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
- Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).
