Summary
Questo protocollo descrive un modello murino di chirurgia ortopedica che è stato usato per lo studio dei meccanismi di neuroinflammation postoperatoria e cambiamenti comportamentali e quando combinato con Parabiosi, per studiare la rigenerazione dei tessuti durante l'invecchiamento.
Abstract
Chirurgia è usato comunemente per migliorare e mantenere la qualità della vita. Purtroppo, in pazienti vulnerabili come gli anziani, le complicazioni possono verificarsi e diminuire significativamente l'esito. Infatti, dopo intervento chirurgico ortopedico di routine per riparare una frattura, oltre il 50% dei pazienti anziani soffrono le complicazioni neurologiche come delirio. Inoltre, la capacità di guarire e rigenerare il tessuto dopo chirurgia diminuisce con l'età e possa influire sulla qualità della riparazione di frattura e anche osseous integrazione degli impianti. Così, una migliore comprensione dei meccanismi che guidano questi cambiamenti età-dipendenti potrebbe fornire obiettivi strategici per ridurre al minimo il rischio di tali complicanze e ottimizzare i risultati. Qui, presentiamo un modello murino clinicamente rilevanti di frattura tibia. I cambiamenti postoperatori in questi topi imitano alcuni dei danni conoscitivi osservati comunemente dopo intervento chirurgico ortopedico di routine in esseri umani. Brevemente, viene eseguita un'incisione nella destra dell'arto in condizioni strettamente asettiche. I muscoli sono dissociati, e un perno di 0,38 mm in acciaio inossidabile è inserito nella cresta superiore della tibia, all'interno del canale intramidollare. Osteotomia viene quindi eseguita, e la ferita viene cucita con punti metallici. Abbiamo utilizzato questo modello per studiare gli effetti del trauma chirurgico postoperatorio neuroinflammation e cambiamenti comportamentali. Applicando questo modello di frattura in combinazione con Parabiosi, un modello chirurgico in cui sono anastomosed 2 topi, abbiamo studiato le cellule e fattori secreti sistemica ringiovanire la rigenerazione di tessuto e la funzione dell'organo dopo la lesione. Seguendo il nostro protocollo di passo-passo, questi modelli possono essere riprodotti con la massima fedeltà e possono essere adattati per interrogare molte vie biologiche che sono alterate tramite il trauma chirurgico.
Introduction
Chirurgia ha trasformato il sistema medico sanitario e continuamente sta contribuendo alla tecnologia d'avanguardia, sicurezza migliorata e mantenuto la qualità della vita. Purtroppo, chirurgia inoltre induce risposte patofisiologiche che possono portare a complicazioni postoperatorie compreso le infezioni della ferita, i danni neurologici e perfino la mortalità, specialmente in pazienti anziani1,2. Chirurgia ortopedica viene eseguita regolarmente, soprattutto in adulti più anziani, per migliorare la qualità della vita e riparare lesioni ossee comuni. Tuttavia, fino al 50% dei pazienti di chirurgia ortopedica che sono 65 anni e più vecchi esperienza menomazioni neurologiche quali delirio postoperatorio. Questo costantemente correla con la prognosi difficile, cioè, 5 volte aumento del rischio per la mortalità a 6 mesi, persistente declino funzionale, aumentato volta al paziente, una maggiore durata della degenza e tassi più alti di disposizione della casa di professione d'infermiera di professione d'infermiera 3 , 4 , 5. alcuni fattori di rischio, compreso l'età avanzata, sono state identificate, ma piccolo è conosciuto circa i meccanismi responsabili per i danni neurologici dopo la chirurgia.
Poiché le fratture sono molto comuni negli anziani, abbiamo stabilito un modello murino di frattura tibia per determinare l'impatto del trauma periferico il recupero postoperatorio, compreso neuroinflammation e cervello salute (funzione cognitiva)6, 7. questo modello, originariamente descritto da Harry et al. 8, composto da appuntare intramidollare e frattura tibia sotto anestesia e analgesia e quindi imita la pelle ferita, trauma muscolare, e osso riparazione associata a fratture di ossa lunghe comuni e riparare in esseri umani. Dopo questa procedura, topi dimostrano cambiamenti in indicatori infiammatori simili a cambiamenti osservati in esseri umani9,10, come pure l'attivazione microglial nell'ippocampo, che è associato con i deficit nella memoria dichiarativa e neuroplasticità hippocampal6,7,11. In precedenza abbiamo combinato questo modello di frattura con Parabiosi. Parabiosi sono un modello chirurgico in cui 2 topi sono anastomosed e quindi condividono un sistema circolatorio. Questo modello ha fornito un importante passo avanti nella comprensione di effetti regolatori di linfociti circolanti e fattori umorali sulla funzione dell'organo nel contesto dell'età e la malattia12,13,14. Utilizzando questo approccio abbiamo recentemente scoperto fattori sistemici associati con età-dipendente frattura guarigione12.
Qui, presentiamo un protocollo che unisce il modello di frattura tibiale con Parabiosi per lo studio dei meccanismi di età-dipendente dell'osso--cervello, che sono rilevanti per Neuroimmunologia e medicina rigenerativa. 1A di protocollo descrive la procedura di Parabiosi e dettagli del protocollo 1B la procedura di frattura tibiale (Figura 1A). Questi possono essere eseguiti in modo indipendente o in combinazione, a seconda della natura dell'interrogatorio.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali erano condotte in conformità con l'istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dal istituzionale Animal Care & uso Committee (IACUC) presso la Duke University.
1. sperimentali animali
- Mantenere i topi in un ambiente climatizzato con cicli di luce/buio di 12 h e adeguato accesso all'acqua e cibo standard. Casa non più di 5 littermates per gabbia ed evitare condizioni che potrebbero incoraggiare la lotta.
- Utilizzare topi C57BL6/J femmine a 3 mesi di età (giovane) o 18 mesi di età (vecchio).
- Per Parabiosi, acclimatare 2 topi insieme per almeno due settimane prima dell'intervento. I topi sono selvaggio-tipo C57BL6/J o eGFP +.
- Controllare la condizione fisica e l'aspetto generale dei topi al giorno.
2. installazione preoperatoria per Parabiosi e chirurgia ortopedica
- Pesare i 2 topi.
- Amministrare l'anestesia generale tramite un sistema di anestesia a una velocità di flusso costante di O2 di 0,2 L/min uso 5% isoflurane per induzione in un'aula di induzione.
Nota: La profondità dell'anestesia può essere confermata con un pizzico di punta. - Posizionare i mouse su un pad riscaldato in posizione supina. Utilizzare una sonda rettale per controllare la temperatura corporea durante tutta la procedura chirurgica.
- Per mantenere l'anestesia, abbassare la concentrazione inalata di isoflurane al 2,0% a 0,2 L/min attraverso una maschera facciale. Monitor per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia.
- Monitorare i parametri fisiologici (frequenza respiratoria, saturazione dell'ossigeno e il cuore battere) non invadente usando un impulso ossimetro (opzionale).
3. Parabiosi chirurgia (protocollo 1A)
- Amministrare l'analgesia (buprenorfina, SR/lento rilascio, 0,1 mg/kg per via sottocutanea) dopo induzione e prima manipolazione chirurgica. Iniettare bupivacaina (0,25%) ai fianchi appena prima dell'apertura. Applicare il lubrificante di occhio.
Nota: Il protocollo di Parabiosi può essere eseguito indipendentemente dalla frattura tibia. - Per tutto il corpo interno suturazione, utilizzare materiale di sutura polidioxanone 4-0. Per tutti i suturare esterni, utilizzare materiale di sutura in polipropilene 4-0.
- Ciascuno dei 2 topi lungo una linea contiguo tra il gomito, il fianco e il ginocchio sul lato da giuntare la barba. Disinfettare con iodio + 70% pelle di alcol macchia oltre 3 cicli in preparazione per incisione alternati.
Usato strumenti sterilizzati in autoclave e mantenere un campo sterile.
Nota: Posizionare il selvaggio-tipo mouse a destra del mouse eGFP e preparare il fianco sinistro del selvaggio-tipo mouse e il fianco destro del mouse eGFP per chirurgia (Figura 1). - Su ogni mouse, è possibile utilizzare una forbice per fare un'incisione della pelle lungo il fianco, che vanno prossimale al ginocchio appena prossimale al gomito e senza disturbare i muscoli sotto la pelle.
- Iscriviti i tricipiti degli animali con i suturare interrotti 2.
- Unire le pareti del corpo lungo i fianchi con una sutura continua, in esecuzione di passaggi 7-9.
- Iscriviti il quadricipite dell'animale con i suturare interrotti 2.
- Chiudere la pelle del 2 parabionts con i suturare interrotti.
- Consentire i topi svegliarsi in aria ambiente.
- Per garantire il successo di questo protocollo, deve essere mantenuta la salute delle coppie: monitorare le coppie al giorno; eseguire la condizione di corpo segnando due volte a settimana; e pesare le coppie due volte a settimana.
Nota: Ogni coppia è alloggiato singolarmente.
Nota: Se si utilizza regolarmente buprenorfina (cioè non SR/lento rilascio) quindi amministrare 0,1 mg/kg per via sottocutanea in 1 mL di soluzione fisiologica per topo due volte al giorno per 3 giorni. - Consentire 4 settimane di tempo di recupero per garantire una circolazione condivisa tra parabionts se si esegue la chirurgia per frattura tibiale.
4. chirurgia per frattura tibiale (protocollo 1B)
- Amministrare l'analgesia (buprenorfina, 0,1 mg/kg per via sottocutanea) dopo induzione e prima manipolazione chirurgica. Iniettare bupivacaina (0,25%) al luogo chirurgico prossimale al ginocchio poco prima dell'inaugurazione. Applicare il lubrificante di occhio.
- Radere la funzione mediale della dell'arto destro del mouse per esporre l'area chirurgica e disinfettare con iodio + 70% alcool pelle scrub più di 3 cicli alternati. Mantenere un campo chirurgico sterile durante tutta la procedura. Per limitare la contaminazione; utilizzare strumenti sterilizzati in autoclave e guanti; completare la chirurgia sotto un microscopio per dissezione (opzionale); e utilizzare un rilievo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea.
Nota: Se il protocollo viene eseguito su parabionts, solo 1 mouse è fratturato nella coppia (la tibia di destra del mouse destro). Vedere Figura 1B per un diagramma schematico della frattura su parabionts. - Utilizzare una forbice per fare un'incisione della pelle lungo la faccia mediale dell'arto posteriore destro ginocchio in giù midshaft della tibia prossimale sul destro del mouse.
- Esporre midshaft della tibia e localizzare visivamente la diafisi. Flettere il ginocchio e visualizzare il tibiale utilizzando il legamento della patella-femorale come punto di riferimento.
- Visualizzare il tendine rotuleo; trapano manuale facendo rotolare il pollice e l'indice un buco di 0,5 mm nel canale intramidollare usando un ago di calibro 25.
Nota: Il foro verrà eseguito parallelo lungo la tibia, in attraverso il plateau tibiale. - Inserire un pin di 0,38 mm in acciaio inossidabile attraverso il foro di circa 15 mm nella cavità midollare fino a resistenza è feltro, tagliato a filo con il plateau tibiale utilizzando una fresa a filo (Vedi supplementare Video 1 per una ricostruzione in 3D).
- Utilizzando Forbici rette di Bonn, frattura midshaft tibia (diafisi). Vedere Figura 1 per un diagramma schematico della frattura.
- Osservare visivamente il sito di frattura e tessuti adiacenti di ispezionare per la stabilizzazione della vista frattura.
- Chiudere con le graffette cutanee.
- Posizionare i topi su riscaldata pastiglie per recuperare prima di restituirli a una gabbia casa pulita. Iniettare 1 mL preriscaldata (37 ° C) soluzione salina normale per via sottocutanea in ogni mouse per sostituzione del fluido.
- Controllare topi al giorno per segni di zoppia, infezione o sanguinamento.
Nota: Se utilizzando buprenorfina regolare (cioè non SR/lento rilascio) quindi amministrare 0,1 mg/kg per via sottocutanea in 1 mL di salino al giorno per 3 giorni.
Representative Results
Dopo osteotomie trasversale con attenzione sono state effettuate in condizioni di sterilità con costante inserimento del PIN e sutura corretta, topi non ha mostrato segni di zoppia, infezione o sanguinamento nel piedino di sinistra dopo la chirurgia. Guarigione ortopedico è stata valutata usando l'analisi radiografica e istomorfometria dopo Safranina O macchiatura (Figura 2). Le radiografie della tibia fratturata del midshaft indicato più deposito tissutale nei calli di frattura di giovani topi rispetto ai calli di frattura dei topi invecchiati. Calli di frattura erano decalcificati e inclusi in paraffina in preparazione per l'analisi istologica. Le sezioni sono state macchiate con safranina-O e deposizione di tessuto è stato quantificato utilizzando istomorfometria analisi. Calli di frattura di giovani topi contenevano più osso e meno fibrotica tessuto rispetto i calli di frattura da topi invecchiati.
Frattura tibia induce l'infiammazione sistemica ed centrale6,7,11,15,16. Infatti, i livelli periferici di citochine pro-infiammatorie e pattern molecolari associati pericolo (Damp) sono rapidamente elevati dopo chirurgia ortopedica, sia nei topi e nell'uomo7,17,18. Questo contribuisce all'attivazione della microglia nel cervello tramite diversi meccanismi di segnalazione che coinvolge le vie neuronali, cellulari ed umorali7,15,19,20, 21. A seguito di chirurgia, disfunzione endoteliale, apertura della barriera emato - encefalica e periferico del macrofago infiltrazione contribuiscono a hippocampal acuta neuroinflammation in tipi selvatici e Ccr2RFP / + Cx3cr1GFP / + topi adulti15 , 19e sono stati associati con i deficit di memoria successiva che assomigliano a delirio umano e disfunzione cognitiva postoperatoria15,19,22. Questa risposta neuroinfiammatorie è aggravata in animali invecchiati, con significativi cambiamenti nella morfologia microglial, come rilevato da IBA-1 immunostaining (Figura 3).
Utilizzando il modello di frattura tibiale descritto qui, abbiamo trovato anche transitoriamente neurogenesi ippocampale, come evidenziato da una riduzione nel doublecortin (DCX) immunostaining nella circonvoluzione dentata20. Misure Electrophysiologic di potenziamento a lungo termine (LTP), un surrogato per la funzione di memoria, ha rivelato una rottura di tempo-dipendente nella neuroplasticità postoperatorio11. Topi dopo l'intervento chirurgico anche visualizzare i danni nella funzione di memoria hippocampal-dipendente, ad esempio usando la paura condizionata test psicometrico (Figura 4). Nel condizionamento alla paura, i topi sono messo in una camera ed esposti a un segnale uditivo seguito da uno stimolo avversivo (cioè, footshock). Tre giorni dopo l'intervento chirurgico tibial, topi sono testati nella camera condizionata, questa volta senza alcuna stimolazione uditiva o avversione, e comportamento di congelamento viene registrata come un indice di memoria (per un protocollo dettagliato Vedi23).
Età avanzata è un fattore di rischio per il declino di memoria. Eppure, mentre invecchiamo, la capacità di rigenerazione e riparazione dei tessuti diminuisce anche anche se questi meccanismi rimangono poco compresi. Così, abbiamo usato i protocolli descritti nel presente documento per eseguire eterocronico parabiosi (accoppiamento animali giovane/vecchio) e valutate la frattura che guarisce entro il mouse invecchiato (per un protocollo dettagliato Parabiosi Vedi24). Sangue-condivisione tra coppie di parabiotiche è stata confermata e trovata per essere uguale12. L'esposizione a una riparazione ossea giovanile circolazione migliorata con precedente Unione, deposizione ossea è aumentato e diminuito fibrosi (Figura 5)12. Questo ringiovanimento della rigenerazione ossea si è verificato indipendente dell'osteoblasto osteocalcin-positivi endogena (Figura 5, marrone cellule), ma piuttosto invocata cellule CD45-positive che migrati dal giovane parabiont (Figura 5, blu cellule) . Questi risultati indicano che le cellule emopoietiche CD45-positive secernono una nicchia giovane e sana, che è in grado di segnalare alle cellule osteoblastiche invecchiate inducendoli a diventare più attivi.
Figura 1: rappresentazione schematica del Parabiosi e chirurgia per frattura tibiale. Timeline (A) per l'esecuzione di Parabiosi e frattura tibia (protocollo 1A) o frattura tibia da sola (protocollo 1B). (B) le tibie dei topi di 20 mesi in coppia parabiotiche isocroniche o eterocronico sono state fratturate (è fratturata la gamba destra di destro del mouse, come indicato con una X). Topi grigi raffigurano topi selvatici mentre green mouse raffigurano eGFP topi. (C) diagramma schematico del modello di frattura tibiale con appuntare intramidollare e metà di-pozzo fratturazione. Veda inoltre complementari Video 1 per una ricostruzione 3D dell'arto posteriore e pinning della tibia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: frattura tibia guarigione all'interno di modelli murini di giovani e meno giovani. Tibie di topi giovani o vecchi sono state fratturate e calli di frattura sono state indagate 21 giorni post infortunio. (A) formazione immagine radiografica e colorazione istologica (Safranina-O) sono stati usati per valutare la frattura calli 21 giorni post frattura. La macchiatura Mostra tessuti collageni in proteoglicani (contenuti all'interno della cartilagine) in rosso e blu. Le linee tratteggiate indicano la posizione approssimativa del callo di frattura. (B) istomorfometria è stato usato per valutare la quantità di osso, cartilagine e tessuto fibrotico depositato entro la frattura callo 21 giorni post frattura. I dati sono espressi come media ± gli intervalli di confidenza di 95%, * P < 0,05, statisticamente significativa (One-way ANOVA, test di Dunnett), barre della scala rappresentano 2 mm, e immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio, un obiettivo x 1,25. n = 9 per ogni campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: chirurgia ha indotto l'attivazione microglial età-dipendenti nell'ippocampo. Chirurgia per frattura tibiale induce maggiore hippocampal neuroinflammation in topi invecchiati (20 mesi) rispetto ai topi C57BL6/J 4-mese-vecchio. Sezione del cervello-macchiatura con indicatore microglial IBA-1 Mostra più positivo cellule e cambiamenti morfologici in chirurgica gruppi 24 h dopo la chirurgia. Immagini sono state ottenute con un microscopio epifluorescente con un ingrandimento di 100 x.; barra della scala rappresenta 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: ridotta neurogenesi, potenziamento a lungo termine e funzione di memoria dopo chirurgia per frattura tibiale. (A) DCX, un indicatore quantitativo per la neurogenesi, è ridotto significativamente nella circonvoluzione dentata ippocampo a 24 h dopo la chirurgia. Immagini sono state ottenute con un obiettivo del microscopio confocale laser-scanner con un ingrandimento di 10x; scala bar rappresenta 10 µm. (B) elettrofisiologia nelle fette hippocampal da controlli o topi 24 h dopo la chirurgia. Long-term potentiation (LTP) è stata indotta dalla stimolazione ad alta frequenza (HFS) e registrato oltre 1 h. potenziali postsinaptici eccitatori di campo (EPSPS) sono stati registrati dal CA1 strato radiato per mezzo di una pipetta di registrazione extracellulare riempita con regolare liquido cerebrospinale artificiale. A 24 h dopo la chirurgia, induzione di LTP è notevolmente ridotto rispetto ai topi di controllo. I dati sono espressi come media ± s.e.m. n = 3, * p < 0,05 1-way ANOVA. (C) Dell'Ippocampo-dipendente dalla funzione di memoria (definito come % di congelamento utilizzando traccia paura condizionata) è alterata in topi dopo chirurgia rispetto ai controlli e animali esposti all'anestesia solo. I dati sono espressi come media ± s.e.m. n = 9-10, * p < 0,05 1-way ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: chirurgia di Parabiosi conduce al ringiovanimento del engraftment di guarigione, la condivisione di sangue e la cellula donatrice di frattura. Abbinamenti di Parabiosi isocrono ed eterocronico sono stati stabiliti e il mouse invecchiato in ciascuna coppia è stato fratturato e valutato per la guarigione dell'osso. (A) frattura calli sono stati studiati usando la formazione immagine radiografica. Le linee tratteggiate indicano la posizione approssimativa del callo di frattura. (B) Engraftment delle cellule di eGFP + è stato confermato all'interno del midollo osseo. (C) Immunohistochemistry del callo di frattura è stato usato per identificare le cellule erogarici eGFP+ (blue) e cellule osteoblastiche osteocalcin+ (marrone) dalla parabiont. Barre della scala rappresentano 50 µm e immagini sono state ottenute utilizzando un obiettivo 40x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementari 1: ricostruzione 3D dell'arto e pinning della tibia. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Le fratture sono un problema clinico comune e rimangono delle cause principali di morbilità, specialmente nella popolazione senior in rapida crescita. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per un modello murino di frattura tibia per studiare i meccanismi responsabili di neuroinflammation postoperatoria e danno conoscitivo. Questo modello può essere combinato con chirurgia di Parabiosi per studiare interazioni neuro-immunitario, rigenerazione dei tessuti e altri processi di segnalazione. Capire questi meccanismi fornirà gli obiettivi strategici per ridurre al minimo i rischi di complicanze postoperatorie e ottimizzare i risultati.
Diversi modelli ortopedici sono stati sviluppati per studiare la riparazione ossea in roditori25. Abbiamo adottato e modificato questa procedura di frattura tibiale, originariamente descritta da Harry et al. 8, per studiare gli effetti della chirurgia ortopedica sulla funzione del cervello. Abbiamo anche usato questo modello di frattura in combinazione con il nostro modello di Parabiosi per studiare i fattori che sono responsabili di guarigione ossea e la rigenerazione tissutale di età-dipendente. Quando eseguito in anestesia generale volatile, questa procedura di frattura tibiale richiede solo circa 15 min per animale, risultati in zero alla minima mortalità (a seconda dell'età del mouse e della suscettibilità genetica sottostante) e ricapitola comune insulti associati con la frattura di ossa lunghe e trauma chirurgico ortopedico. Così, questo modello è ideale per interrogare le vie biologiche ed eseguendo valutazioni longitudinali. Tuttavia, è fondamentale che l'osteotomia e pinning sono riproducibili, e che il danno al tessuto molle è coerenza. Danni ai tessuti molli possono essere modulato, ad esempio da stripping il periostio e pizzicando i muscoli circostanti per rendere l'operazione più traumatica. Modelli di frattura traumatica indotta da trauma smussato non fissa o flessione su tre punti non fornirebbe tale coerenza o la precisione. Queste procedure sono spesso sfociano in re-ferita, che conduce alla risposta infiammatoria prolungata. Al contrario, i modelli di frattura che coinvolgono la fissazione rigida hanno un'infiammazione più moderata, che non completamente ricapitolare il danno connesso con ambulatorio ortopedico26,27.
Altri modelli che utilizzano il blocco di lega di titanio sono stati sviluppati per arthroplasty umana strettamente mimica e potrebbero essere più pertinenti per interrogare l'instabilità della protesi, osteolisi e complicazioni protesi-collegate in topi28,29 . Modelli di foro come quello presentato qui, fornire adeguata stabilizzazione, e topi possono essere testati in paradigmi comportamentali senza deficit significativi che potrebbero confondere tali attività come paura condizionata o aperto campo locomozione/ansia test6 ,7,11,15,19,20. Tuttavia, le deformità di rotazione possono verificarsi se la fissazione non è bloccata correttamente. Alcuni modelli utilizzano un fixator esterno, che fornisce la stabilizzazione superiore ma è difficile da implementare in una tibia di mouse, anche se può essere implementato con successo in un mouse femore27.
Disturbi cognitivi, tra cui delirio e disfunzione cognitiva postoperatoria, sono complicazioni comuni dopo chirurgia ortopedica per la riparazione di frattura, specialmente in pazienti anziani e fragili30. Questo modello di mouse clinicamente rilevanti della chirurgia per frattura tibiale dimostra che postoperatorio sistemica citochina rilascio6,7,17, alterata funzione barriera emato - encefalica15,19 e alterata morfologia microglial16,22, contribuiscono al danno di memoria e può rappresentare caratteristiche critiche delle complicazioni neurologiche postoperatorie vista in molti pazienti dopo chirurgia ortopedica. È importante notare che altre procedure chirurgiche sono state utilizzate per modellare la disfunzione cognitiva postoperatoria in topi. Questi includono addominale31,32,33 e chirurgia vascolare34 , come pure il trauma superficiale35,36. La tecnica di Parabiosi è applicabile a tutti questi modelli, che condividono i punti finali simili, tra cui l'infiammazione, l'attivazione gliale e deficit comportamentali, che può essere mediato da meccanismi comuni.
Gli studi che includono Parabiosi hanno rivelato nuovi ruoli per fattori circolanti che possono influire sulla funzione conoscitiva, neuroinflammation e ringiovanimento del tessuto in animali invecchiati37,38,39,40 ,41,42. Abbiamo dimostrato che Parabiosi possono essere combinati con successo con il modello di frattura tibiale descritto qui per interrogare percorsi rigenerativi e lo studio dei meccanismi che coinvolgono fattori ematica che influenza la guarigione e la frattura di riparazione12. Qui, abbiamo dimostrato che la capacità di riparazione di frattura di un animale invecchiato può essere ringiovanita quando l'animale invecchiato è anastomizzato ad un animale giovane. Questa inversione di età era radicata nell'attecchimento delle cellule ematopoietiche al luogo di frattura. È interessante notare che, tali ringiovanimento potrebbe essere ottenuta anche attraverso il trapianto di midollo osseo giovane in topi invecchiati. A questo proposito, trapianto di midollo osseo può essere considerato un approccio più diretto e semplice alternativo di Parabiosi. Tuttavia, Parabiosi sono un modello più robusto per indagare la funzione di linfociti circolanti e fattori. Ci aspettiamo che una combinazione di modelli di chirurgia ortopedica e Parabiosi giocherà un ruolo importante nel rispondere a domande critiche nel perioperatorio e biologia di invecchiamento.
In sintesi, vi presentiamo un protocollo dettagliato per un modello murino di frattura tibia per studiare i meccanismi responsabili di neuroinflammation postoperatorio ed il danno conoscitivo dopo le procedure chirurgiche ortopediche. Questo modello può essere combinato con una procedura di Parabiosi per studiare interazioni neuro-immunitario, rigenerazione tissutale e altre vie. Definizione di questi meccanismi fornirà gli obiettivi strategici per ridurre al minimo i rischi di complicanze postoperatorie e ottimizzare i risultati.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Grazie Kathy Gage, BS (dipartimento di anestesiologia, centro medico della Duke University, Durham, NC) per assistenza editoriale. NT riconosce sostegno da una sovvenzione di innovazione di sogno da Duke anestesiologia e NIH/NIA R01 AG057525-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
| Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
| 10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
| MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
| Shaver | Wahl | 9854L | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades - #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
| Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
| Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
| 22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
| Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
| Suture | Look | 1079B | |
| C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
| eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |
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