Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Subretinal transplantasjon av menneskelige embryonale stamcelleforskningen avledet retinal Pigment epitelceller i store øyne modell av geografiske Atrophy

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Netthinnens pigment epitelceller kunne tjene som en erstatning for cellen terapi for avansert form av tørre aldersrelatert makuladegenerasjon. Denne protokollen beskriver generering av en stor-eyed modell av geografiske atrofi og subretinal transplantasjon av menneskelige embryonale Stamcelle-avledet netthinnens pigment epitelceller i denne modellen av sykdom.

Abstract

Geografiske atrofi (GA), sent stadium av tørr aldersrelatert makuladegenerasjon er preget av tap av netthinnens pigment epiteliale (RPE) laget, som fører til etterfølgende degenerasjon av vitale retinal strukturer (f.eks, fotoreseptorer) forårsaker alvorlig synshemming. Tilsvarende sett RPE-tap og reduksjon i synsskarphet i langsiktig følge opp av pasienter med avansert våt alder makuladegenerasjon (AMD) intravitreal anti-vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) behandling. Derfor, på den ene siden, er det grunnleggende å utlede effektivt RPE celler fra en ubegrenset kilde som kan tjene som erstatning terapi. På den annen side, er det viktig å vurdere atferden og integrering av avledede cellene i en modell av sykdom innebærer kirurgiske og tenkelig metoder som nær som mulig å brukes i mennesker. Her gir vi en detaljert protokoll basert på våre tidligere publikasjoner som beskriver generasjonen av prekliniske modell av GA bruker kaninøyne albino for evaluering av den menneskelige embryonale stamcelleforskningen avledet netthinnens pigment epitelceller (hESC-RPE) i en klinisk innstillingen. Differensierte hESC-RPE er transplanted inn i naiv øyne eller øyne med NaIO3-indusert GA-lignende retinal degenerasjon bruke en 25 G transvitreal pars plana teknikk. Evaluering av degenerert og transplantert utføres av flere høyoppløselige ikke-invasiv sanntid tenkelig.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen beskriver generering av en stor-eyed prekliniske modell av geografiske atrofi (GA) som gjør evalueringen av integrering av transplantert hESC-RPE i feltet subretinal. Metodene som er beskrevet i detalj her har blitt brukt i 3 nye publikasjoner som viser produksjon av en beriket, rene og funksjonelle befolkning av RPE celler fra hESC1, samt etablering av ytre retinal skade og en GA-lignende fenotypen indusert av subretinal injeksjon av fysiologiske salt løsninger (i.e.BSS og PBS) eller NaIO3 i kanin øye2,3. Vi viste videre at sub retinal suspensjon transplantasjon av hESC-RPE danner omfattende funksjonelle monolayers med photoreceptor hjelpe kapasitet2.

Flere fordeler følge bruk av kanin øyet for generering av GA modell av sykdom. Først størrelsen på kaninen øyet, som er 70% volumet av en voksen menneskelige øye, kan klinisk meningsfull transplantasjon bruker en celle tetthet som er mye lavere enn rutinemessig brukes i små gnagere øyne (1000 celler/µL vs 50.000 celler/µL)4 , 5. deretter kirurgi i gnagere er vanligvis transscleral gjennom akkord, som kompromitterer retinal barrieren og potensielt utløser en inflammatorisk respons og en mulig avvisning6. Begge faktorer kan sammen føre til multilayering og klumper av transplantert celler, og en generell dårlig integrasjon av transplantert cellene i en forstyrret innfødt retinal vev. Store øyne kanin modellen kan imidlertid utføre en kirurgisk teknikk med instrumentering identisk med en klinisk setting. For det tredje, store øyne modell tillater også høy oppløsning i vivo avbildning og overvåking av transplantert cellene og overliggende netthinnen gjennom tid1,2,3. Således, beskriver vi en klinisk relevant og kostnadseffektiv prekliniske modell som skal være et attraktivt alternativ for gnagere for alle med en interesse i forskning av normal og syke netthinnen og sub retinal plass.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følgende protokollen følger retningslinjene dyr omsorg Karolinska Instituet. Alle dyreforsøk med New Zealand albino kaniner (Tabell for materiale) er godkjent av regional dyreetikk (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (tillater: dnr 56/15). Bruk av hESC (dnr 2011/745-31/3) og overføring og manipulering av hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) er også i henhold til svensk lov og Karolinska Institutet forskrifter, og har blitt godkjent av regional menneskelige etikk komité ( Regionala Etikprövningsnämnden jeg Stockholm).

1. subretinal injeksjon av natrium Iodate (NaIO3) i en stor-eyed dyremodell

  1. Bedøve dyr av intramuscular administrasjon i låret med en blanding av 35 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazine i saltvann bruker en 30 G sprøyte og dilate elevene med aktuelle øyedråper bruker en blanding av 0,75% cyclopentolate og 2,5% phenylephrine. Riktig anesthetization er bekreftet hvis dyret ikke reagerer på en vanskelig klype tilbake bein.
  2. Sett kaninen under kirurgisk mikroskop med hodet mot kirurgen (figur 1A). Bruk et lokk festepunkt for å fjerne øyelokk og nictitans membran med en bakteriefri å minimere risikoen for forurensning. Bruk balansert salt løsning (BSS) for å hindre tørrhet under anesthesia i begge øynene.
  3. Mikrokirurgi, bruk en 2-port (eller valgfri 3-port) 25 G transvitreal pars plana teknikk med ikke-valved trocars for innsetting av Mikrokirurgiske instrumenter (figur 1B). Multifunksjons vitrectomy maskinen har porter for å koble en infusjon kanyle, endoillumination, vitrector og endolaser. For subretinal injeksjoner er bare endoillumination obligatorisk, som gjør et 2-port oppsett tilstrekkelig. Sett inn endoillumation gjennom den øvre venstre trocar og bruke den øvre høyre trocar subretinal injeksjon kanyle.
    1. For et 3-porters oppsett, kan du bruke den nedre timelige trocar for BSS infusjon kanyle. Hvis valgfrie instrumenter (for eksempel en vitrector) er brukt, sette dem gjennom den øvre høyre trocar.
    2. Sett de øvre 2 trocars 1-2 mm fra limbus bruker klorte tang til å fange og fortrenge Konjunktiva overliggende innsetting site.
    3. Kontroller trocars er innsatte transsclerally i 30-45° limbus parallelle vinkel og videre til midten av spissen av trocar. Deretter slår trocar 90° og gå inn i øyet, sikte på den bakre Polen på øyet. Denne fremgangsmåten vil unngå etter kirurgiske fra sclerotomies, og også redusere risikoen for endophthalmitis (dvs. bakteriell infeksjon i øyet). Se også figur 2B for trocar posisjoner.
    4. Sette en enkel bruk flat kontaktlinse på hornhinnen visualisere netthinnen, med syntetisk tårer som kontaktgel mellom øyet og kontaktlinse (figur 1A).
    5. Trekke 500 µL NaIO3 i 1 mL sprøyte koblet til en utvidelse rør (drives av hjelperen) og en 38 G polytip kanyle (drives av kirurgen).
    6. Sett den endoillumination sonden gjennom den øvre venstre trocar og injeksjon kanyle gjennom den øvre høyre trocar, og fremme kanyle gjennom glasslegemet plassen mot netthinnen, satsing for området rett under synsnerven hodet.
    7. La spissen av kanyle sakte berøre netthinnen til en fokal hvithet er synlig. Injeksjon selv vil trenge netthinnen, slik at subretinal levering. Ikke la kanyle trenge netthinnen, siden dette kan forårsake blødning.
    8. Sette inn 50 µL NaIO3 subretinally løpet 5 s. Siden det er et naturlig cleavage fly mellom netthinnen og den underliggende akkord, bør en tydelig delvis gjennomsiktig bleb gradvis danne under injeksjon.
    9. Under injeksjon, sakte trekke nålen, men sørg for at spissen er opprettholdt i bleb å minimere reflux.
    10. Etter fjerning av de endoillumation og injeksjon kanyle, fjerne trocars bruker klorte tang og bruke lett trykk for 30 å selvtettende Sutur mindre sclerotomies spissen eller sløv slutten av tang.
  4. Post-surgically gi 10 mL saltoppløsning subcutaneously å hindre dehydrering. Ikke gi etter kirurgiske aktuelt steroider eller antibiotika. For smertestillende gi 0,5 mL av buprenorfin 0,3 mg/ml subcutaneously etter kirurgi, samt dagen etter operasjonen.
  5. Etter bruk, vask alle instrumenter av leve dem for et par sekunder først i 70% etanol, dernest i 45% etanol, og til slutt i destillert vann. Tørk dem riktig med et papirhåndkle.
  6. Delta dyr før de igjen tilstrekkelig og plassere dem alle single encaged. Hvis nødvendig (f.eksfor immunohistochemistry formål), avlive dyrene ved intravenøs injeksjon av 100 mg/kg pentobarbital (se Tabell for materiale).
  7. Vent 7 dager for å fortsette med transplantasjon av hESC-RPE celler.

2. subretinal transplantasjon av hESC-RPE celler i behandlede dyr

  1. Administrere 2 mg (100 µL) av intravitreal triamcinolone i bedøvet dyr bruker en 30 g injeksjon nål satt 1-2 mm fra limbus i nedre timelige kvadranten 1 uke før transplantasjon av hESC-RPE, og å administrere det hver 3 måneder. Pass på å peke spissen mot bakre stangen av øyet for å unngå en linse touch.
  2. Kultur en hESC-RPE monolayer som beskrevet tidligere1.
  3. Fjerne celle differensiering media (se Tabell for materiale) av en 24-og confluent hESC-RPE-monolayer og vask hver med 500 µL av PBS uten Ca2 + og Mg2 +. Gjenta denne handlingen igjen, for totalt 2 vasker.
  4. Forkaste nedbryting legge 500 µL av trypsin per brønn og ruge i 12 min på 37 ° C.
  5. Tilt platen og fjern forsiktig trypsin (cellene skal være knyttet til platen). Samle celler i 800 µL av fersk 37 ° C prewarmed differensiering media av mild pipettering eller skraping selv om nødvendig for å få en enkeltcelle suspensjon.
    Merk: Bruk en 40 µm celle sil hvis cellen klumper er observert.
  6. Telle celler i en hemocytometer kammer med 0,2% Trypan blå, i henhold til produsentens instruksjoner.
  7. Legge til 5 mL av differensiering media og sentrifuger celler ved romtemperatur, 300 x g i 5 min.
  8. Forkast nedbryting og resuspend pellets i friske filter-steriliseres PBS (bestått gjennom et 25 mm sprøyte filter) til en siste konsentrasjon av 1000 celler/µL.
  9. Aliquot forrige celle suspensjon i 600 µL dele og holde på is inntil og under operasjonen.
  10. Bedøve dyr av intramuscular administrasjonen i låret med en blanding av 35 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazine i saltvann bruker en 30 G sprøyte. Dilate elevene med aktuelle øyedråper bruker amix av 0,75% cyclopentolate og 2,5% phenylephrine. Riktig anesthetization er bekreftet hvis dyret ikke reagerer på en vanskelig klemme på tilbake bein.
  11. Sett kaninen med hodet mot kirurgen. Bruk et lokk festepunkt for å fjerne øyelokk og nictitans membran med en bakteriefri å minimere risikoen for forurensning. Bruk BSS for å hindre tørrhet under anesthesia i begge øynene.
  12. Mikrokirurgi, bruk en 2-port (eller valgfri 3-port) 25 G transvitreal pars plana teknikk med trocars plassert i samme posisjoner som beskrevet i trinn 1.3 og figur 2. Hvis de forrige sclerotomies vises, utføre trocar innsetting bare sammenhengende, men ikke gjennom disse, for å minimere risikoen for postoperativ lekkasje.
    1. Sette en enkel bruk flat kontaktlinse på hornhinnen visualisere netthinnen, med syntetisk tårer som kontaktgel mellom øyet og kontaktlinse (figur 1A).
    2. Etter riktig tips posisjonering (se trinn 1.3.5 og 1.3.6), injisere 50 µL av en forsiktig blandet hESC-RPE suspensjon (50 000 celler) subretinally. Satse på sentrum av NaIO3 forbehandlet området preges av en karakteristisk "metallic-endo-belysning refleks. Neurosensory netthinnen bør skille lett opprette en tydelig bleb. Flush nålen med sterilt H2O i mellom kaniner/etter bruk å unngå nål tilstopping på grunn av cellen grupperer. Endre nålen når tilstopping er merket.
    3. Under injeksjon, sakte trekke nålen men sørg for at spissen er opprettholdt i bleb å minimere reflux.
    4. Etter fjerning av de endoillumation og injeksjon kanyle, fjerne trocars bruker klorte tang og bruke lett trykk for 30 å selvtettende Sutur mindre sclerotomies spissen eller sløv slutten av tang.
  13. Post-surgically gi 10 mL saltoppløsning subcutaneously å hindre dehydrering. Ikke gi etter kirurgiske aktuelt steroider eller antibiotika. For smertestillende gi 0,5 mL av buprenorfin 0,3 mg/ml subcutaneously etter kirurgi, samt dagen etter operasjonen.
  14. Etter bruk, vask alle instrumenter av leve dem for et par sekunder, først i 70% etanol, dernest i 45% etanol, og til slutt i destillert vann. Tørk dem riktig med et papirhåndkle.
  15. Delta dyr før de igjen tilstrekkelig og plassere dem alle single encaged. Hvis nødvendig (f.eks for immunohistochemistry formål) avlive dyrene ved intravenøs injeksjon av 100 mg/kg pentobarbital.

3. i Vivo Retinal og Subretinal Imaging

  1. Bruke en spektral domene optical coherence tomografi (SD-oktober) enhet med den medfølgende programvaren (se tabell for materiale) å få cross-sectional b-skanninger av behandlet dyrene, i henhold til produsentens instruksjoner. For å unngå uskarphet, sørg for å holde hornhinnen fuktig ved flushing med aktuelle saltvann hver 30-60 s.
    1. Plass bedøvet og elev-dilated dyrene (se trinnene 1.1 og 2.10) i en justerbar mount å få en uhindret bane fra instrument lyskilden til kaninen netthinnen.
    2. Få minst 3 OCT skanninger med samtidige infrarød-AC confocal skanning laser ophthalmoscopy (IR-cSLO) refleksjon referanse bilder som representerer den øvre, sentrale og lavere delen av området injisert.
    3. Få en ansikt fundus bilder med cSLO blå, grønn, infrarød og flerfarget laser refleksjon (dvs., flere samtidige laser farger), henholdsvis.
    4. Ta blå lys autofluorescence (BAF) bilder med blå lys laser evnen til SD-oktober enheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Representant i vivo bilder av BAF og IR-cSLO SD-oktober av en normal albino kanin netthinnen vises i figur 2. Merk de ulike retinal lagene med sine karakteristiske nivåer av lys refleksjon av SD-oktober instrumentet.

I tallene 1A og figur 1B, for å opprette sub retinal blebs er illustrert: et lokk festepunkt er plassert, utsette øye løftes for å tillate innsetting av 3 trocars (figur 1B) 1-2 mm langt fra limbus, for å unngå en linse Touch, og i 30-45 ˚ limbus parallelle vinkel. Trocars gjør det mulig innføring av en valgfri infusjon kanyle, i tillegg til en lys og injeksjon nålen gjennom sclera. Dilated elev sammen med en flat kontaktlinse vil lette en visning av øye fundus og sub retinal plass mens den kirurgiske prosedyren utføres.

Etter injeksjon av 50 µL av 1 mM NaIO3 -løsning opprettes en bleb i feltet subretinal som vil løse og gradvis degenerert ytre netthinnen, som vist i figur 3A SD-oktober bildet tre måneder etter injeksjon. Verdsette fortynning av ytterste neuroretinal lagene i SD-oktober og hypo-BAF områdene, tilsvarer RPE tap dermed å skape en GA-lignende fenotypen. Ved identifisering av skade er 50 000 hESC-RPE i et 50 µL volum reinjisert for transplantasjon, opprette en andre bleb som løser som vist i av BAF og multi-farge (MC) bilder i figur 3B. Gjenkjenne milde til moderate hyper-BAF områder med en fokal økt hyper-BAF inferiorly i grenselandet av skade, indikativ kronisk stress av den opprinnelige RPE i SD-oktober skanner med fravær av pigmentert områder MC. Bleb tilsvarer injeksjon av 50 µL av hESC-RPE (50 000 celler) i ikke-forbehandlet øyne viser flekker av pigmentert celler i (MC) bildet og godt bevarte retinal strukturer i SD-oktober skanningen vises for sammenligning (Figur 3 c).

Kollektivt denne prosedyren og metodikk tillater studiet av integrering av subretinal suspensjon transplantasjon av hESC-RPE i en relevant modell GA.

Figure 1
Figur 1: injeksjon satt opp (A) bilder som viser kirurgisk opplegget for sub retinal injeksjoner. Dyret er plassert under kirurgisk mikroskopet (venstre) og kirurgen holder endoillumination sonde inn gjennom den venstre trocar i venstre hånd, og intravitreal kirurgisk apparatet (f.eks subretinal injeksjon kanyle) inn gjennom den venstre trocar i høyre hånd (midten). En flat kontaktlinse plassert på hornhinnen kan forstørre fundus under kirurgiske prosedyren (høyre). (B) nært skjematisk visning av albino kanin øyet lokket festepunkt og brystvorten fra trocars satt 1-2 mm dypt fra limbus og i 30-45 ° parallelle vinkel, sammen med trocars som underlette innføringen av ekstrautstyr infusjon kanyle, lys og nålen for injeksjon. En flat kontaktlinse ligger på eleven vil bidra til å få en bedre visning av øye fundus under kirurgiske prosedyren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Normal albino kanin netthinnen i vivo bildebehandling. I vivo BAF og IR-cSLO SD-oktober bilder som representerer en vanlig albino kanin netthinnen. En blåse opp av SD-oktober med tilsvarende merkingen av ulike retinal lagene er sett i SD-oktober bildet: GCL (ganglion celle lag), IPL (indre plexiform lag), INL (indre kjernefysiske lag), OPL (ytre plexiform lag), bare (ytre kjernefysiske lag), OLM (ytre begrense membran), EZ (ellipsoid sone), OS (ytre segmenter), RPE (netthinnens pigment epitel) og BM (Bruchs membran). Skalere barer = 1 mm (BAF og IR-cSLO bilder), 200 µm (SD-oktober bilder). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Subretinal suspensjon injeksjoner i store øyne kanin modellen. (A) BAF, MC og SD-oktober bilder av subretinal injeksjon av 1 mM NaIO3 3 måneder etter skade induksjon. Note det hypo-BAF omgitt av hyper-BAF områder tilsvarer bleb og den degenerert neuroretina i SD-oktober (B) BAF, MC, og SD-oktober bilder av øyne forbehandlet med 1 mM NaIO3 i 1 uke etterfulgt av subretinal transplantasjon av 50.000 hESC-RPE i suspensjon og analysert 3 måneder etter transplantasjon. Merk de hyper-BAF områdene i fravær av integrert pigmentert celler i MC og atrofier neuroretina i SD-oktober (C) MC og SD-oktober bilder tilsvarer ikke forbehandlet naiv øyne 3 måneder etter subretinal transplantasjon av BAF bildet hESC-RPE i suspensjon. Merk pigmentert områdene på MC bildet og bevart neuroretinal strukturen på SD-oktober SD-oktober skanne fly er merket (grønn pil). Hvit pilspisser markerer grensen til blebs i eget ansikt og SD-oktober bilder. Skalere barer = 1 mm (BAF og MC bilder), 200 µm (SD-oktober bilder). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Generasjonen av en stor-eyed modell av GA og prekliniske bruk for å vurdere hESC-RPE integrasjon i vivo er beskrevet i denne protokollen.

For oversettelse av regenerativ Therapy for GA og sykdommer til klinikken7er det viktig å utvikle og optimalisere metoder som trofast fange de kliniske metodene for transplantasjon og bildebehandling. Kaninen er i dette aspektet attraktive: det har en relativt stor øye som tillater intraokulært kirurgi og bruk av standard bildebehandling, og er billig og lett ligger i forhold til andre store øyne dyr.

Vi beskriver bruk av standard transvitreal 25-gauge pars plana vitrectomy teknikk for å skape sub retinal blebs å indusere sub retinal skade eller transplantasjon hESC-RPE. Først, brukte vi en 3-porters oppsett, som vist i figur 1B, å bruke infusjon porten (trocar), i tilfelle en vitrectomy ble utført under prosedyren. Men siden vi ikke har funnet en vitrectomy å være nødvendig for å bruke sub retinal injeksjoner, er infusjon porten utelatt. Likevel, den tredje enkeltport bør forbli hvis prosedyren er mer tilpasset og en vitrectomy utføres.

Kaninen store øyne er en veletablert okulær modell med akkumulert data om anatomi og fysiologi siste århundrene8. Videre kanin er enkel å håndtere og rase, økonomisk attraktive (f.eks, Kjøp, boliger, og holde), og lett tilgjengelig i forhold til andre store øyne pattedyr modeller. En stor fordel med en stor eyed-modell er at det muliggjør bruk av høy oppløsning klinisk Bildeteknikker, som igjen tillater sporing av transplantert hESC-RPE celler i feltet subretinal over tid. Men til tross for lagomorphs blir phylogenetically nærmere mennesker enn gnagere, må det opplyses at de har en merangiotic netthinnen og en visuell strek, sammenlignet med en holangiotic netthinnen og en fovea i primater9. Merangiotic netthinnen betyr at de fleste av blod forsyning av indre netthinnen er avledet fra choriocapillaris, en forskjell som en må vurdere siden det kan øke risikoen for leksjonen og blødning. En eksperimentell fordel er at det tillater modellering tidligere stadier av GA etter subretinal blebs av fysiologiske løsninger alene, som det har vært tidligere vist1,3. Disse studiene foreslo at en subretinal bleb forårsaker timelige retinal hypoksi i merangiotic miljøet kan være nok til å forårsake photoreceptor død; men i denne sammenheng har RPE tap vist sannsynligvis genereres av sub retinal flyten indusert ved hjelp av en 1 mL sprøyte og en 50 µL bleb volum, et tilfeldig fenomen som igjen potentiates Nevro-retinal atrofi. Derfor kan bleb volumet har direkte innvirkning på netthinnen strekk skadene, noe som betyr at jo større volumet brukes (f.eks100 µL, som er brukt i andre studier10), jo mer skadelig det kan bli.

Et kritisk steg til sikre integrering av injisert cellene er å unngå reflux celler i linsen mens injisering, og plasseringen av nålen i feltet subretinal. Hvis plassert for dypt, det ytre retinal barriere/akkord vil bli penetrert og immunceller kan invadere sub retinal plass, forårsaker uimottakelig avvisning til tross for bruk av immunsuppresjon. Et annet viktig aspekt for transplantasjon suksess er linsen. I den nåværende modellen utføres ikke vitrectomy for å minimere reflux og kirurgisk traumer. Men det har blitt lagt merke til at i noen øyne er det vanskelig å få en skikkelig tips posisjon på netthinnen som spissen fast pre retinal glasslegemet interphase fører til dannelsen av liten eller ingen blebs. Selv om det er en relativt sjelden hendelse, indikerer det at variasjon av kaninen glasslegemet må tas i betraktning under kirurgi og post-kirurgiske analyse.

Dessuten er riktig injeksjon av triamcinolon avgjørende for å unngå å skjule fundus av hvite steroid krystaller, som deretter vil hemme kirurgi og post-kirurgiske fundus visualisering av SD-oktober. For å minimere problemet, bør injeksjon av triamcinolon gjøres i lavere timelige kvadranten. Tilsvarende plasseres trocars som 1-2 mm fra limbus å unngå glasslegemet blødning fra ciliary kropp og rørende unproportionally stor kanin linsen med nålen. Litt linsen vil føre en cataract som i sin tur vil hindre riktig visualisering av sub retinal plass under postoperativ bildebehandling.

Steroider, inkludert triamcinolone, kan selv forårsake grå stær over tid. Vi har ikke observert dette etter triamcinolone administrasjon for opptil 8 måneder. Imidlertid er det sannsynlig at steroid-indusert cataracts vil utvikle hvis administrerer triamcinolone over omfattende tid.

Metodene beskrevet kan brukes både for kirurgisk opplæring og analyse for celle-integrasjon og funksjon som beskrevet her og i våre tidligere publikasjoner. Metoden har også høy relevans for administrasjon av sub retinal viral vektorer nå i klinisk studie for flere arvelig retinal dystrophies. Modifikasjoner kan inkludere transplantasjon av mer komplekse materialer som ark bærere og biogels. Som nye kliniske tenkelig metoder dukker opp, vil disse være lett tilpasses kaninøyne, uten modifikasjoner.

In Conclusion, store øyne kanin modellen er vist for å være en relevant pre-klinisk modell som har flere fordeler sammenlignet med gnager modeller i) recapitulating ulike stadier av GA, ii) å bruke pasienten relevante kirurgiske og tenkelig metoder og iii ) vurderer integrering av donor cellene som skal brukes som cellen erstatning terapi for GA og relaterte lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av forfatterne har konkurrerende interesser eller motstridende interesser.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av tilskudd fra Karolinska Institutet, Kronprinsesse Margareta grunnlaget for den synshemmede, Edwin Jordan grunnlaget for Ophthalmological forskning, svenske øye grunnlaget, Kong Gustav V Foundation, ARMEC Lindeberg Foundation, og Cronqvist Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6, (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (2), 1314-1322 (2017).
  4. Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (8), 5431-5444 (2014).
  5. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, (3), 189-199 (2006).
  6. Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214, (2), 347-361 (2008).
  7. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, (9817), 713-720 (2012).
  8. Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12, (1), 123-138 (1972).
  9. Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (6), 2913-2920 (2012).
  10. Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130, (1), 65-75 (2012).
Subretinal transplantasjon av menneskelige embryonale stamcelleforskningen avledet retinal Pigment epitelceller i store øyne modell av geografiske Atrophy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter