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Biology

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Published: January 22, 2018 doi: 10.3791/56702
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 2, 1
1Clinical Neuroscience, Section for Ophtalmology and Vision, Karolinska Institutet, 2Clinical Sciences, Intervention and Technology, Division of Obstetrics and Gynecology, Karolinska Institutet
* These authors contributed equally

Summary

Células epiteliais de pigmento retinal podem servir como uma terapia de reposição celular para a forma avançada de degeneration macular age-related seco. Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica e o subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal embrionárias humanas células-tronco derivadas para este modelo de doença.

Abstract

Atrofia geográfica (GA), a fase tardia do degeneration macular age-related seco é caracterizada por perda de pigmento da retina epitelial (RPE) camada, que leva à subsequente degeneração das estruturas da retina vitais (por exemplo, fotorreceptores) causando deficiência de visão severa. Da mesma forma, RPE-perda e diminuição da acuidade visual é visto no seguimento a longo prazo acima dos pacientes com avançado relacionadas com a idade degeneração macular úmida (AMD) intravitreal tratamento de anti-vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Portanto, por um lado, é fundamental para derivar eficientemente as células RPE de uma fonte ilimitada de que poderia servir como terapia de reposição. Por outro lado, é importante avaliar o comportamento e a integração das células derivadas em um modelo da doença acarrete cirúrgica e métodos de imagem como perto possível aqueles aplicados no corpo humano. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado baseado em nossas publicações anteriores que descreve a geração de um modelo pré-clínicos de GA usando o olho de coelho albino, para avaliação das células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais de pigmento retinal (RPE-hESC) em um configuração de clinicamente relevante. HESC-RPE diferenciado são transplantadas para olhos ingénuos ou olhos com NaIO3-induzido GA-como degeneração da retina usando uma G 25 transvitreal pars plana técnica. Avaliação de áreas degeneradas e transplantadas é realizada pelo multimodal de alta resolução não-invasiva imagens em tempo real.

Introduction

Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos pré-clínicos de atrofia geográfica (GA) que permite a avaliação da integração do transplantado hESC-RPE no espaço subretinal. Os métodos descritos em detalhe aqui têm sido utilizados em 3 publicações recentes que demonstram a produção de uma população enriquecida, pura e funcional das células RPE de hESC1, bem como a criação de danos na retina exterior e um fenótipo de GA-como induzida pela subretinal injeção de soluções salinas fisiológicas (i.e., BSS e PBS) ou NaIO3 no coelho olho2,3. Mais demonstrámos que transplantes de suspensão sub retiniana de hESC-RPE formam extensas monocamadas funcionais com capacidade de resgate do fotoreceptor2.

Várias vantagens acompanham o uso do olho de coelho para a geração de um modelo de GA da doença. Em primeiro lugar, o tamanho do olho de coelho, que é de 70% do volume de um olho humano adulto, permite o transplante clinicamente significativa usando uma densidade de celular que é muito menor do que rotineiramente utilizados em olhos pequenos roedores (1.000 células / µ l vs 50.000 células / µ l)4 , 5. em segundo lugar, a cirurgia em roedores é geralmente transscleral através da coroide, que compromete a barreira da retina e potencialmente desencadeia uma resposta inflamatória e uma possível rejeição6. Os dois fatores juntos podem levar a multilayering e aglutinação de células transplantadas e uma integração total pobre das células transplantadas em um tecido retinal nativo perturbado. No entanto, o modelo de grandes olhos coelho permite executar uma técnica cirúrgica com instrumentação idêntica a um ambiente clínico. Em terceiro lugar, um modelo de grandes olhos também permite alta resolução na vivo de imagens e monitoramento de células transplantadas e retina sobrejacente a tempo1,2,3. Assim, descrevemos um modelo pré-clínicos clinicamente relevante e custo-eficiente que deve ser uma alternativa atraente para roedores para qualquer pessoa com interesse em pesquisa de retina normal e doente e o espaço abaixo da retina.

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Protocol

O seguinte protocolo segue as orientações de cuidados com animais de Karolinska Instituet. Todas as experiências com animais usando coelhos albinos de Nova Zelândia (Tabela de materiais) foram aprovadas pelo Comitê de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permitir: dnr 56/15). O uso de hESC (dnr 2011/745-31/3) e a transferência e manipulação de hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) também está em conformidade com a legislação sueca e regulamentos do Karolinska Institutet e foi aprovado pelo (Comité de ética humana regional Regionala Etikprövningsnämnden eu Stockholm).

1. apresentam injeção de iodato de sódio (NaIO3) em um modelo Animal de olhos grandes

  1. Anestesiar animais por administração intramuscular na coxa com uma mistura de 35 mg/kg de ketamina e xilazina 5 mg/kg em soro fisiológico, utilizando uma seringa de 30 G, e dilatar as pupilas com colírio tópico, usando uma mistura de fenilefrina ciclopentolato e 2,5% de 0,75%. Anesthetization adequada é confirmado se o animal não reage a uma pitada dura de sua perna de trás.
  2. Coloque o coelho sob o microscópio cirúrgico com a cabeça virada para o cirurgião (figura 1A). Use um afastador de tampa para remover as pálpebras e nictitans membrana com um pano estéril para minimizar o risco de contaminação. Uso equilibrado de solução salina (BSS) para evitar ressecamento enquanto sob anestesia em ambos os olhos.
  3. Para microcirurgia, uso uma porta 2 (ou 3-porta opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica com GMD sem válvula, para a inserção de instrumentos microcirúrgicos (figura 1B). A máquina multifunções vitrectomia tem portas para conectar uma cânula de infusão, endoillumination, vitrector e endolaser. Por injeções subretinal, apenas o endoillumination é obrigatório, o que faz um set-up 2 portas suficientes. Insira o endoillumation através do trocarte superior esquerdo e use o trocarte direito superior para a cânula injeção subretinal.
    1. Para uma configuração de 3 portas, use o trocarte temporal inferior para a cânula de infusão de BSS. Se os instrumentos facultativos (como um vitrector) são usados, inseri-los através do trocarte direito superior.
    2. Introduza os 2 trocartes superiores 1-2 mm do limbo usando pinça de garras para agarrar e deslocar a conjuntiva sobrejacente o local de inserção.
    3. Verifique se os trocartes são transsclerally inserido em um ângulo de paralelo de limbo de 30-45° e prosseguir para o meio da ponta do trocarte. Em seguida rode o trocarte 90° e avançar para dentro do olho, visando o polo posterior do olho. Este procedimento irá evitar o escapamento pós-cirúrgica dos sclerotomies e também diminuir o risco de Endoftalmite (ou seja, a infecção bacteriana no olho). Veja também Figura 2B para posições de trocarte.
    4. Colocar uma lente de contato plana de uso único na córnea para visualizar a retina, com lágrimas sintéticas como gel de contato entre o olho e a lente de contato (figura 1A).
    5. Desenhe 500 µ l de NaIO3 em uma seringa de 1 mL, conectado a um tubo de extensão (operado pelo assistente) e uma cânula de polytip de 38 G (operado pelo cirurgião).
    6. Inserir a sonda de endoillumination através do trocarte superior esquerdo e a cânula de injeção através do trocarte superior direito e fazer avançar a cânula através do espaço vítreo para a retina, apontando para a área logo abaixo da cabeça do nervo óptico.
    7. Permitir que a ponta da cânula para tocar lentamente a retina até um clareamento focal é visível. A injeção em si irá penetrar na retina, permitindo a entrega subretinal. Não deixe a cânula penetrar na retina, pois pode causar hemorragia.
    8. Injete 50 µ l de NaIO3 subretinally durante um período de 5 s. Uma vez que existe um plano de clivagem natural entre a retina e a coroide subjacente, uma bolha semitransparente claramente visível deve formar gradualmente durante a injeção.
    9. Durante a injeção, lentamente retratar a agulha, mas certifique-se de que a ponta é mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo.
    10. Após a remoção da cânula endoillumation e injeção, remover os trocartes usando pinça de garras e aplique uma leve pressão para 30 s para os sclerotomies de sutura-menos Auto-selante usando a ponta ou extremidade romba da pinça.
  4. Post-surgically dar 10 mL de soro fisiológico por via subcutânea para prevenir a desidratação. Não dê pós-cirúrgica esteroides tópicos ou antibióticos. Para analgésicos dar 0,5 mL de buprenorfina 0,3 mg/ml por via subcutânea após a cirurgia, bem como o dia após a cirurgia.
  5. Após o uso, lavar todos os instrumentos, mergulhando-os por alguns segundos em primeiro lugar em etanol a 70%, em segundo lugar em etanol a 45% e por último, em água destilada. Secá-las corretamente com uma toalha de papel.
  6. Assistir animais até que recupere a consciência suficiente e colocá-los todos solteiros engaiolado. Se for necessário (por exemplo, para fins de imuno-histoquímica), eutanásia em animais por injecção intravenosa de pentobarbital 100 mg/kg (ver Tabela de materiais).
  7. Espere 7 dias para prosseguir com o transplante de células hESC-RPE.

2. apresentam transplante de células de hESC-RPE em animais tratados

  1. Administrar 2mg (100 µ l) de intravitreal triancinolona em animais anestesiados, usando uma agulha de injeção de 30g inserida 1-2 mm do limbo no quadrante temporal inferior 1 semana antes do transplante de hESC-RPE e administrá-lo novamente a cada 3 meses. Certifique-se de ponto a ponta para o polo posterior do olho para evitar um toque de lente.
  2. Cultura uma monocamada hESC-RPE conforme descrito anteriormente,1.
  3. Remova a mídia de diferenciação celular (ver Tabela de materiais) de uma monocamada confluente 24-bem hESC-RPE e lavar cada um com 500 µ l de PBS sem Ca2 + e Mg2 +. Repita esta ação mais uma vez, para um total de 2 lavagens.
  4. Descartar o sobrenadante, adicione 500 µ l de tripsina por bem e incubar durante 12 min a 37 ° C.
  5. Incline o prato e Retire cuidadosamente a tripsina (células devem permanecer anexadas à placa). Recolha pilhas em 800 µ l de mídia de diferenciação escaldadas fresco 37 ° C por pipetagem suave, ou mesmo raspar se necessário, para obter uma suspensão de célula única.
    Nota: Use um coador de célula de 40 µm se observam-se aglomerados de células.
  6. Contagem de células em uma câmara de hemocytometer usando 0,2% Trypan azul, de acordo com as instruções do fabricante.
  7. Adicione 5 mL de células de mídia e centrífuga de diferenciação à temperatura ambiente, 300 x g durante 5 min.
  8. Descartar o sobrenadante e ressuspender em PBS filtro recém esterilizados (passado através de um filtro de seringa de 25 mm) a uma concentração final de 1.000 células / µ l.
  9. Alíquota a anterior suspensão de eritrócitos em 600 alíquotas µ l e manter no gelo até e durante a cirurgia.
  10. Anestesia animais por administração intramuscular na coxa com uma mistura de 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg de xilazina em Salinas, utilizando uma seringa de 30 G. Dilate as pupilas com colírio tópico usando amix de fenilefrina ciclopentolato e 2,5% de 0,75%. Anesthetization adequada é confirmado se o animal não reage a uma pitada dura em sua perna de trás.
  11. Coloque o coelho com a cabeça virada para o cirurgião. Use um afastador de tampa para remover as pálpebras e nictitans membrana com um pano estéril para minimizar o risco de contaminação. Use BSS para evitar ressecamento enquanto sob anestesia em ambos os olhos.
  12. Para microcirurgia, uso uma porta 2 (ou 3-porta opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica com trocartes colocados nas mesmas posições, conforme descrito na etapa 1.3 e a Figura 2. Se o sclerotomies anteriores são visíveis, realizar inserção de trocarte só adjacente, mas não através destes, para minimizar o risco de fugas no pós-operatório.
    1. Colocar uma lente de contato plana de uso único na córnea para visualizar a retina, com lágrimas sintéticas como o gel de contato entre o olho e a lente de contato (figura 1A).
    2. Após o correcto posicionamento (consulte as etapas 1.3.5 e 1.3.6) da ponta, injete 50 µ l de uma suspensão suavemente misturados hESC-RPE (50.000 células) subretinally. Aponte para o centro da área de3 pré-tratados NaIO distinguida-se por um reflexo característico "metálico" endo-iluminação. A retina marcante deve separar facilmente criar uma bolha visível. Resplendor a agulha com estéril H2O entre coelhos/após utilização para evitar entupimento devido à célula de agulha agrupa. Mudança da agulha quando o entupimento é notada.
    3. Durante a injeção, lentamente, retirar a agulha mas certifique-se de que a ponta é mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo.
    4. Após a remoção da cânula endoillumation e injeção, remover os trocartes usando pinça de garras e aplique uma leve pressão para 30 s para os sclerotomies de sutura-menos Auto-selante usando a ponta ou extremidade romba da pinça.
  13. Post-surgically dar 10 mL de soro fisiológico por via subcutânea para prevenir a desidratação. Não dê pós-cirúrgica esteroides tópicos ou antibióticos. Para analgésicos dar 0,5 mL de buprenorfina 0,3 mg/ml por via subcutânea após a cirurgia, bem como o dia após a cirurgia.
  14. Após o uso, lavar todos os instrumentos, mergulhando-os por alguns segundos, em primeiro lugar em etanol a 70%, em segundo lugar em etanol a 45% e por último, em água destilada. Secá-las corretamente com uma toalha de papel.
  15. Assistir animais até que recupere a consciência suficiente e colocá-los todos solteiros engaiolado. Se for necessário (por exemplo, para fins de imuno-histoquímica), eutanásia em animais por injecção intravenosa de pentobarbital 100 mg/kg.

3. in Vivo Retinal e apresentam imagem

  1. Usar um dispositivo de (SD-OCT) a tomografia de coerência óptica domínio espectral com o software que acompanha (consulte a tabela de materiais) para obter transversais b-exames de animais tratados, de acordo com as instruções do fabricante. Para evitar o desfoque de imagem, certifique-se de manter a córnea úmida por lavagem com solução salina tópica cada 30-60 s.
    1. Coloque os animais anestesiados e pupila dilatada (consulte as etapas 1.1 e 2.10) em uma montagem ajustável para obter um caminho desobstruído da fonte de luz de instrumento para a retina de coelho.
    2. Obter pelo menos 3 exames de OCT com Oftalmoscopia do laser infravermelho-confocal digitalização de simultânea de imagens de referência de reflectância (IR-cSLO) que representa a parte superior, inferior e central da área injetada.
    3. Obter imagens de fundo pt-rosto com cSLO azul, verde, infravermelho e multicolor laser reflectância (ou seja, várias cores simultâneas do laser), respectivamente.
    4. Capture imagens de autofluorescência de luz azul (BAF) usando a capacidade de laser de luz azul do dispositivo SD-OCT.

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Representative Results

Representante na vivo imagens da FAB, IR-cSLO e SD-PTU de uma retina de coelho albino normal são mostradas na Figura 2. Observe as diferentes camadas da retina com seus distintos níveis de reflexão da luz capturada pelo instrumento SD-OCT.

Figura 1A e figura 1B, a instalação para criar bolhas sub retiniana é ilustrada: um retractor de tampa está posicionado, sujeitando as pálpebras para permitir a inserção de 3 GMD (figura 1B) 1-2 mm longe ao limbo, a fim de evitar uma lente toque e ângulo de 30 a 45 ˚ limbo paralelo. Trocartes permitirá a introdução de uma cânula de infusão opcional, além de uma luz e a agulha de injeção através da esclera. Uma pupila dilatada juntamente com uma lente de contato plana facilitará uma vista sobre o fundo de olho e o espaço sub retiniana, enquanto o procedimento cirúrgico é realizado.

Após a injeção de 50 µ l de solução de NaIO3 a 1 mm, uma bolha é criada no espaço subretinal que irá resolver e degenerar progressivamente a retina externa, como mostrado na imagem SD-OCT na Figura 3A , três meses após a injeção. Aprecio o afinamento das camadas ultraperiféricas neuroretinal em SD-OCT e as áreas de hipo-BAF, correspondente à perda RPE, re-criando um GA-como fenótipo. Após a identificação da área de danos, 50.000 hESC-RPE em um volume de 50 µ l é re-injetado para transplante, criando uma segunda bolha que resolve conforme o BAF e imagens de (MC) multi cores na Figura 3B. Reconhece o suave para áreas de hiper-BAF moderada com um focal maior hiper-BAF inferiormente no limite da área de danos, indicativo de estresse crônico do RPE nativo constam os exames de SD-OCT juntamente com a ausência de áreas pigmentadas na imagem do MC. A bolha correspondente para a injeção de 50 µ l de hESC-RPE (50.000 células) nos olhos não pré-tratados mostrando manchas de células pigmentadas na imagem (MC) e estruturas da retina bem preservadas no scan SD-OCT é mostrada para comparação (Figura 3).

Coletivamente, este procedimento e metodologia permitam o estudo da integração de transplantes subretinal suspensão de hESC-RPE em um modelo relevante para GA

Figure 1
Figura 1: conjunto de injeção de cima (A) fotos retratando a afinação cirúrgica para injeções sub retiniana. O animal é colocado sob o microscópio cirúrgico (à esquerda) e o cirurgião detém a sonda endoillumination inserida através do trocarte esquerdo na mão esquerda, e o instrumento cirúrgico intravitreal (por exemplo, cânula para injeção subretinal) inserido através o trocarte esquerdo na mão direita (médio). Uma lente de contato plana sobre a córnea permite uma vista ampliada do fundo durante o procedimento cirúrgico (à direita). (B) estreita visão esquemática do olho de coelho albino com o afastador de tampa no lugar e o mamilo dos trocarte inserido 1-2 mm no fundo do limbo e em um ângulo de 30-45 ° paralelo, juntamente com os trocarte que facilitam a introdução de um opcional cânula de infusão, uma luz e a agulha de injeção. Uma lente de contato plana situada no topo da pupila vai ajudar a ter uma visão melhor do fundo do olho durante o procedimento cirúrgico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Normal albino coelho retina na vivo imagens. Na vivo FAB, IR-cSLO e SD-OCT imagens representando uma retina de coelho albino normal. Um explodir de SD-OCT com a rotulagem correspondente das diferentes camadas da retina é visto na imagem SD-OCT: GCL (camada de células ganglionares), IPL (camada plexiforme interna), INL (camada nuclear interna), OPL (camada plexiforme externa), Oni (camada nuclear exterior), Proteus (exterior limite da membrana), EZ (zona de elipsoide), OS (segmentos exteriores), RPE (epithelium retinal do pigment) e BM (membrana de Bruch). Barras de escala = 1 mm (BAF e IR-cSLO images), 200 µm (imagens SD-OCT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: injeções apresentam suspensão no modelo de grandes olhos coelho. (A) BAF, MC e SD-OCT imagens de subretinal injeção de 1mm NaIO3 3 meses após a indução de danos. Observe o hipo-BAF cercado por áreas de hiper-BAF correspondentes a bolha e o neuroretina degenerado em SD-outubro (B), Fab, MC, e imagens SD-OCT de olhos pré-tratados com 1 mM de NaIO3 para 1 semana, seguida por subretinal transplante de 50.000 hESC-RPE em suspensão e analisados 3 meses após o transplante. Observe as áreas hiper-BAF na imagem BAF, ausência de células pigmentadas integradas o MC e o neuroretina atrófica nas imagens correspondentes aos olhos do ingênuo não pré-tratados 3 meses após transplante subretinal de MC SD-OCT (C) e SD-OCT hESC-RPE em suspensão. Nota as áreas pigmentadas na imagem MC e a estrutura de neuroretinal preservadas na SD SD-outubro-OCT digitalizar aviões são marcados (seta verde). Pontas de seta brancas marcam a fronteira de bolhas no rosto-pt e imagens SD-OCT. Barras de escala = 1 mm (imagens BAF e MC), 200 µm (imagens SD-OCT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste protocolo, a geração de um modelo de grandes olhos de GA e seu uso pré-clínicos para avaliar hESC-RPE integração na vivo é descrita.

Para tradução de terapias regenerativas para GA e doenças relacionadas para a clínica7, é importante desenvolver e aperfeiçoar métodos que fielmente capturar os métodos clínicos para o transplante e de imagem. O coelho é neste aspecto atraente: tem um olho relativamente grande que permite que a cirurgia intra-ocular e uso de imagem padrão, e é barato e facilmente alojados comparado com outros animais de grandes olhos.

Nós descrevemos o uso de transvitreal padrão 25 gauge pars plana vitrectomy técnica para a criação de bolhas sub retiniana para induzir dano secundário da retina ou para transplante hESC-RPE. Inicialmente, usamos uma configuração de 3 portas, conforme ilustrado na figura 1B, com a intenção de utilizar a porta de infusão (trocarte), no caso de uma vitrectomia foi realizada durante o procedimento. No entanto, uma vez que não encontramos uma vitrectomia necessário para aplicar injeções sub retiniana, o porto de infusão foi omitido. No entanto, a terceira opção de porta deverá manter-se o procedimento é mais adaptado e uma vitrectomia é realizada.

O coelho de olhos grandes é um modelo ocular bem estabelecido com dados acumulados na anatomia e fisiologia dos últimos séculos8. Além disso, coelhos são fáceis de segurar e raça, economicamente atraente (por exemplo, compra, habitação e manter), e prontamente disponíveis em comparação com outros modelos de mamíferos grandes olhos. Uma grande vantagem de um modelo de olhos grande é que permite o uso de técnicas de imagem clínicas de alta resolução, que por sua vez permitem rastreamento de células transplantadas hESC-RPE no espaço subretinal ao longo do tempo. No entanto, apesar de lagomorfos sendo filogeneticamente mais próximo aos seres humanos que roedores, deve ser referido que possuem uma retina de merangiotic e uma raia visual, em comparação com um holangiotic de retina e uma fóvea presente em primatas9. Merangiotic meios de retina que maior parte do sangue fornecem da retina interna é derivado do choriocapillaris, uma diferença que você precisa para considerar uma vez que pode aumentar o risco de lesão e hemorragia. Uma vantagem experimental é que ela permite modelagem fases anteriores de GA seguindo subretinal blebs de soluções fisiológicas sozinhos, como tem sido demonstrado anteriormente1,3. Estes estudos sugeriram que uma bolha subretinal causando hipóxia retiniana temporal no meio de merangiotic pode ser suficiente para causar a morte de fotorreceptoras; no entanto, neste contexto, perda RPE tem demonstrada mais provável ser gerado pelo fluxo sub retiniana induzido por meio de uma seringa de 1 mL e um volume de bolha µ l 50, um fenômeno aleatório que por sua vez potencializa neuro-retiniana atrofia. Portanto, o volume da bolha pode ter um efeito direto sobre os danos de estiramento da retina causado, o que significa que quanto maior o volume utilizado (por exemplo, 100 µ l, como tem sido utilizado em outros estudos,10), pode ser mais prejudicial.

Um passo fundamental para garantir a integração das células injetadas é para evitar o refluxo de células para o vítreo durante a injeção e o posicionamento da agulha no espaço subretinal. Se posicionado muito profundo, a barreira/coroide retina exterior vai ser penetrada e células do sistema imunológico podem invadir o espaço secundário da retina, causando rejeição imune, apesar do uso de imunossupressão. Outro aspecto importante para o sucesso do transplante é o estado do vítreo. No presente modelo, vitrectomia não é executada a fim de minimizar o refluxo e trauma cirúrgico. No entanto, foi notado que, em alguns olhos, é difícil conseguir uma posição de ponta adequada na retina, como a ponta fica preso na interfase vítrea pre-da retina, levando à formação de pequenas ou mesmo sem bolhas. Embora seja um evento relativamente raro, ele indica que a variabilidade do vítreo coelho precisa ser tidas em conta durante a cirurgia e análise pós-cirúrgico.

Além disso, a injeção adequada de triamcinolon é crucial para evitar o escurecimento do fundo pelo brancos cristais de esteroides, que então irão dificultar a cirurgia e visualização do fundo pós-cirúrgica por SD-OCT. Para minimizar esse problema, a injeção de triamcinolon deve ser feita no quadrante temporal inferior. Da mesma forma, trocartes devem ser colocados 1 a 2 mm do limbo para evitar hemorragia vítrea do corpo ciliar e tocando a lente coelho unproportionally grande com a agulha. Um toque de lente causará uma catarata que por sua vez impedirão a visualização adequada do espaço sub retiniana durante a imagem latente pós-operatórias.

Esteroides, incluindo triancinolona, se podem causar a catarata ao longo do tempo. Não observamos este após administração de triancinolona por até 8 meses. No entanto, é provável que a catarata induzida por esteroides irá desenvolver se administrar triancinolona por extensos períodos de tempo.

Os métodos descritos podem ser usados para treinamento cirúrgico e para análise de célula-integração e função conforme descrito aqui e em nossas publicações anteriores. O método também tem alta relevância para a administração de vetores virais sub retiniana agora no ensaio clínico para diversas distrofias da retina hereditárias. Modificações futuras podem incluir transplante de materiais mais complexos, tais como portadores de folha e biogels. Como surgem novos métodos de imagens clínicos, estes serão facilmente adaptadas para o olho de coelho, possivelmente sem modificações.

In Conclusion, o modelo de grandes olhos de coelho é demonstrado para ser um modelo pré-clínico relevante que tem várias vantagens em relação aos modelos de roedores para i) sintetizando os diferentes estágios de GA, ii) aplicar métodos cirúrgicos e de imagens relevantes para a paciente e iii ) avaliar a integração das células de doador para ser usado como terapia de reposição celular para GA e distúrbios relacionados.

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Disclosures

Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou interesses conflitantes.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado por concessões do Instituto Karolinska, Fundação do coroa princesa Margareta para os deficientes visuais, Edwin Jordan Fundação para pesquisa oftalmológico, o sueco Eye Foundation, da rei Gustav Foundation V, a ARMEC Lindeberg Foundation e Fundação Cronqvist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
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Biologia celular questão 131 células epiteliais do pigmento da retina células-tronco embrionárias humanas modelo de grandes olhos atrofia geográfica suspensão apresentam transplante tomografia de coerência óptica Transvitreal Pars Plana
Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica
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Petrus-Reurer, S., Bartuma, H.,… More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

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