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Biology

人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞移植视网膜大眼模型的地理萎缩

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

视网膜色素上皮细胞可作为晚期相关黄斑变性的细胞替代疗法。该协议描述了大眼睛的地理萎缩模型的产生和人类胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞视网膜移植到这种疾病模型。

Abstract

地理萎缩 (GA), 晚期与干年龄相关的黄斑变性的特点是失去视网膜色素上皮 (RPE) 层, 这导致后退化的重要视网膜结构 (, 光) 导致严重视力损害。类似地, 视网膜色素上皮的丧失和视力减退见于长期随访的晚期与湿性黄斑变性 (AMD) 接受玻璃抗血管内皮生长因子 (VEGF) 治疗的患者。因此, 一方面, 这是至关重要的有效地从一个无限的来源, 可以作为替代治疗的视网膜色素上皮细胞。另一方面, 重要的是要评估的行为和整合的模型中衍生细胞的疾病所涉及的外科和影像学方法尽可能接近于那些应用于人类。在这里, 我们提供了一个详细的协议的基础上, 我们以前的出版物, 描述了使用白化兔眼的 GA 前体细胞的生成, 用于评价人类胚胎干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞 (干细胞-RPE) 在临床相关的设置。分化干细胞-RPE 被移植到天真的眼睛或眼睛与 NaIO3诱导的 GA 样视网膜变性使用25克 transvitreal 部扁平技术。采用多模态高分辨率非侵入实时成像技术对退化和移植区进行评价。

Introduction

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该协议描述了一种大眼睛的地理萎缩 (GA) 的临床前模型的产生, 允许评价移植干细胞-RPE 在视网膜空间的整合。本文详细介绍的方法已在3份最近的出版物中使用, 它们展示了干细胞1的视网膜色素上皮细胞的丰富、纯净和功能性种群的产生, 以及产生外视损伤和类似 GA 的表型由视网膜注射的生理盐溶液 (, BSS 和 PBS) 或 NaIO3在兔子眼中2,3。我们进一步证明, 亚视网膜悬吊移植的干细胞-RPE 形成广泛功能单分子膜与感光剂抢救能力2

利用兔眼的几个优点来产生一种 GA 模型的疾病。首先, 兔眼的大小, 这是70% 的成人眼睛的体积, 允许临床有意义的移植使用的细胞密度远远低于常规使用的小鼠眼 (1000 细胞/µL vs. 5万细胞/µL)4,5. 其次, 啮齿类动物的手术通常是通过脉络膜巩膜的, 这会损害视网膜屏障, 并可能引发炎症反应和可能的拒绝6。这两个因素一起可能导致移植细胞的多层和结块, 以及移植细胞在一个被破坏的本地视网膜组织中整体的不良整合。然而, 大眼睛的兔子模型允许执行一项与临床设置完全相同的手术技术。第三, 大眼睛模型也允许高分辨率的在体内成像和监测移植细胞和上覆视网膜通过时间1,2,3。因此, 我们描述了一个临床相关和成本效率的临床前模型, 应该是一个有吸引力的替代啮齿目动物的人有兴趣的研究正常和病变的视网膜和亚视网膜空间。

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Protocol

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下面的协议遵循卡 Instituet 的动物保育指南。所有使用新西兰白化兔的动物实验 (材料表) 已得到区域动物伦理委员会 (召开 Norra Djurförsöksetiska Nämnd) 的批准 (许可证: dnr 56/15)。使用干细胞 (dnr 2011/745-31/3) 和干细胞-RPE (dnr 2013/813-31/2) 的转让和操纵也符合瑞典立法和卡学院条例, 并已得到区域人类伦理委员会的批准 (Regionala Etikprövningsnämnden 我斯德哥尔摩)。

1. 视网膜注射碘酸钠 (NaIO3) 成大眼动物模型

  1. 麻醉动物通过肌肉注射在大腿与35毫克/千克氯胺酮和5毫克/千克嗪在盐水中使用30克注射器, 并扩大学生的局部眼药液使用混合0.75% 喷和2.5% 肾上腺素。如果动物对其后腿的硬捏没有反应, 适当的麻醉被证实。
  2. 将兔子置于外科显微镜下, 头部朝向外科医生 (图 1A)。使用盖子牵引器去除眼睑和 nictitans 膜与无菌布, 以尽量减少污染的风险。使用平衡盐溶液 (BSS), 以防止在两眼麻醉时干燥。
  3. 对于显微外科, 使用2端口 (或可选3端口) 25 克 transvitreal 部扁平技术与非瓣套管插入显微外科仪器 (图 1B)。多功能玻璃体切割机有端口连接输液套管, endoillumination, vitrector, 和 endolaser。对于视网膜注射, 只有 endoillumination 是强制性的, 这使得一个2端口设置足够。插入 endoillumation 通过左上方的套管针, 并使用右上套管针视网膜注射套管。
    1. 对于一个3端口设置, 使用较低的时间套管针的 BSS 输液套管。如果使用可选仪器 (如 vitrector), 请将其插入右上角的套管针。
    2. 用爪钳将上部2套管 1-2 mm 从角膜缘上插入, 并将结膜覆盖在插入部位上。
    3. 确保套管入 transsclerally 在一个 30 - 45°的平行角 , 并进行到套管针的尖端中间。然后转动套管针90°和前进到眼睛, 瞄准后极的眼睛。这一做法将避免手术后的 sclerotomies 渗漏, 也减少了眼内炎 (即,细菌感染的眼睛) 的风险。另请参阅图 2B以了解套管针位置。
    4. 在角膜上放置一个单一的使用平板隐形眼镜来可视化视网膜, 用合成的泪水作为眼睛和隐形眼镜之间的接触凝胶 (图 1A)。
    5. 绘制500µL 的 NaIO3到1毫升注射器连接到延伸管 (由助手操作) 和 38 G polytip 套管 (由外科医生操作)。
    6. 插入 endoillumination 探针通过左上角套管针和注射套管通过右上方的套管针, 并推进套管通过玻璃空间向视网膜, 瞄准的区域略低于视神经头。
    7. 允许导管的尖端慢慢地接触视网膜, 直到焦点美白是可见的。注射本身将穿透视网膜, 允许视网膜分娩。不要让套管穿透视网膜, 因为这可能导致出血。
    8. 在5秒内注入50µL 的 NaIO3下。由于视网膜和底层脉络膜之间有一个天然的劈裂平面, 所以在注射过程中, 明显可见的半透明疱疹应该逐渐形成。
    9. 在注射过程中, 慢慢缩回针头, 但要确保在疱疹内保持尖端, 以减少回流。
    10. 去除 endoillumation 和注射套管后, 取出套管使用爪钳, 并适用于三十年代的光压力自密封缝合-少 sclerotomies 使用尖端或钝端的镊子。
  4. 手术后给予10毫升生理盐水皮下注射, 以防止脱水。不要给手术后的外用类固醇或抗生素。镇痛药给0.5 毫升丁丙诺啡0.3 毫克/毫升皮下手术后, 以及手术后的一天。
  5. 使用后, 先在70% 乙醇中浸泡几秒钟, 然后用45% 乙醇, 最后在蒸馏水中冲洗所有仪器。用纸巾把它们擦干。
  6. 参加动物, 直到他们恢复足够的意识, 并把他们所有的单一笼。如果需要 (例如, 为免疫组化目的), 安乐动物静脉注射100毫克/千克戊巴比妥 (见材料表)。
  7. 等待7天, 进行干细胞-RPE 细胞的移植。

2. 干细胞-RPE 细胞在治疗动物中的视网膜移植

  1. 管理2毫克 (100 µL) 的玻璃曲安在麻醉动物使用30克注射针插入1-2 毫米从角膜缘在下颞象限1周前移植干细胞-RPE, 并重新管理它每3月。确保指向眼睛后极的尖端, 以避免镜头接触。
  2. 干细胞-RPE 单层的培养, 如前所述1
  3. 移除细胞分化介质 (参见材料表) 的24井汇合干细胞-RPE 单层和洗涤每井与500µL PBS 没有 Ca2 +和镁2 +。再次重复此操作, 共2次洗涤。
  4. 丢弃上清液, 每井添加500µL 胰蛋白酶, 在37° c 孵育12分钟。
  5. 倾斜板和小心地去除胰蛋白酶 (细胞应该保持连接到板材)。收集细胞在800µL 新鲜37° c prewarmed 分化培养基由温和的移, 甚至刮如果需要, 获得一个单细胞悬浮。
    注: 如果观察到细胞团簇, 请使用40µm 细胞过滤器。
  6. 根据制造商的指示, 用0.2% 台台台蓝来计数例室中的细胞。
  7. 在室温下加入5毫升的分化培养基和离心机, 300 x g 5 分钟。
  8. 在新鲜的过滤消毒 PBS 中丢弃上清和重颗粒 (通过 25 mm 注射器过滤器), 最终浓度为1000细胞/µL。
  9. 分前细胞悬浮成600µL 等分, 并保持在冰, 直到和手术期间。
  10. 麻醉动物通过肌肉注射在大腿与35毫克/千克氯胺酮和5毫克/千克嗪在盐水中使用30克注射器的混合物。用混合0.75% 喷和2.5% 肾上腺素的局部眼药液扩张瞳孔。如果动物对背部腿部的硬捏没有反应, 适当的麻醉就会被证实。
  11. 把兔子放在头上, 面对外科医生。使用盖子牵引器去除眼睑和 nictitans 膜与无菌布, 以尽量减少污染的风险。用 BSS 预防两眼麻醉时的干燥。
  12. 对于显微外科, 使用2端口 (或可选的3端口) 25 G transvitreal 部扁平技术与套管放置在相同的位置, 如步骤1.3 和图 2所述。如果以前的 sclerotomies 是可见的, 执行套管针插入只是相邻的, 但不是通过这些, 以尽量减少术后渗漏的风险。
    1. 在角膜上放置一个单一的使用平板隐形眼镜来可视化视网膜, 用合成的泪水作为眼睛和隐形眼镜之间的接触凝胶 (图 1A)。
    2. 经过适当的尖端定位 (见步骤1.3.5 和 1.3.6), 注入50µL 轻度混合干细胞-RPE 悬浮液 (5万细胞) 下。目的为 NaIO3预处理区域的中心, 由特征 "金属" 内照射反射来区分。感觉神经视网膜应分离容易形成清晰可见的疱疹。用不育的 H2O 在家兔之间冲洗针头, 避免因细胞结块引起的针头堵塞。当发现堵塞时, 更换针头。
    3. 在注射过程中, 慢慢缩回针头, 但要确保在疱疹中保持尖端, 以减少回流。
    4. 去除 endoillumation 和注射套管后, 取出套管使用爪钳, 并适用于三十年代的光压力自密封缝合-少 sclerotomies 使用尖端或钝端的镊子。
  13. 手术后给予10毫升生理盐水皮下注射, 以防止脱水。不要给手术后的外用类固醇或抗生素。镇痛药给0.5 毫升丁丙诺啡0.3 毫克/毫升皮下手术后, 以及手术后的一天。
  14. 使用后, 把所有的仪器浸泡几秒钟, 首先在70% 乙醇, 其次在45% 乙醇, 最后在蒸馏水。用纸巾把它们擦干。
  15. 参加动物, 直到他们恢复足够的意识, 并把他们所有的单一笼。如果需要 (例如为免疫组织化学目的), 安乐动物通过静脉注射100毫克/千克戊巴比妥。

3.活体视网膜和视网膜成像

  1. 根据制造商的说明, 使用带有随附软件的光谱域光学相干层析 (SD OCT) 设备 (参见材料表), 获得经过处理的动物的横截面 b 扫描。为了避免图像模糊, 确保保持角膜湿润的冲洗与局部生理盐水每30-60 秒。
    1. 放置麻醉和瞳孔扩张的动物 (见步骤1.1 和 2.10) 在一个可调节的坐骑获得一个畅通无阻的路径从仪器光源到兔视网膜。
    2. 获得至少 3 OCT 扫描与同时红外共焦扫描激光眼底 (IR-cSLO) 反射参考图像代表的上部, 中央, 和较低的部分注入区域。
    3. 获得 cSLO 蓝色, 绿色, 红外线和多色激光反射 (, 多个同时激光颜色) 的面部眼底图像分别。
    4. 利用 SD OCT 设备的蓝光激光能力捕获蓝光自荧光 (曝气生物滤池) 图像。

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Representative Results

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图 2中显示了典型的活体图像, 如生物滤池、IR-cSLO 和正常白化兔视网膜的 SD OCT。注意不同的视网膜层与他们的独特水平的光反射捕获的 SD OCT 仪器。

数字 1A图 1B中, 创建子视网膜泡的设置如下所示: 一个盖子牵引器定位, 使眼睛的盖子, 允许插入3套管 (图 1B) 1-2 毫米远离角膜缘, 为了避免透镜触摸, 并在30-45 ˚的平行角。套管将使引进一个可选的输液套管, 除了一盏灯, 和注射针通过巩膜。在手术过程中, 瞳孔放大和平板接触镜可以促进眼底和亚视网膜空间的视线。

在注射50µL 1 毫米 NaIO3溶液后, 在视网膜空间中产生疱疹, 将解决和逐步退化的外部视网膜, 如 SD OCT 图像中所示的图 3A在注射后三月。欣赏在 SD OCT 和低曝气生物滤池区的最外层的盘层的细化, 相应的视网膜色素丧失, 从而再创造一种类似 GA 的表型。在鉴定的损害面积, 5万干细胞-RPE 在50µL 体积是重新注入的移植, 创造了第二次疱疹, 解决如显示在曝气生物滤池和多色 (MC) 图像在图 3B。识别轻度到中度的超曝气生物滤池区域与一个焦点增加的超曝气生物滤池下在边界边缘的损害, 指示慢性应激的本地 RPE 显示在 SD OCT 扫描连同没有色素区的 MC 图像。与注射50µL 的干细胞-RPE (5万细胞) 在非预处理的眼睛显示斑块色素细胞 (MC) 图像和保存完好的视网膜结构在 SD OCT 扫描显示的疱疹, 以比较 (图 3C)。

这一程序和方法的共同研究, 使视网膜悬浮移植的干细胞-RPE 在一个相关的模型的遗传算法。

Figure 1
图 1: 注入设置.(A) 描述用于亚视网膜注射的手术设置的图片。该动物放在外科显微镜 (左) 和外科医生持有 endoillumination 探头插入通过左套管针在左手, 和玻璃外科仪器 (视网膜注射套管) 插入通过右手的左套管针 (中间)。放置在角膜上的平板隐形眼镜允许在手术过程中 (右) 的眼底放大的视野。(B) 关闭 "白化兔眼" 的示意图, 用盖子牵引器到位, 从套管插入1-2 毫米深的从角膜缘和30-45°平行角度, 连同套管, 方便引入一个可选输液套管, 一盏灯, 和注射针头。位于瞳孔上方的扁平隐形眼镜有助于在手术过程中更好地观察眼底。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 正常白化兔视网膜活体成像.在体内生物滤池, 红外 cSLO, 和 SD OCT 图像代表一个正常的白化兔视网膜。sd oct 的一个打击与相应的标记不同的视网膜层是在标清 oct 图像中看到的: 协鑫 (神经节细胞层), 彩光 (内状层), INL (内核层), 组织 (外层状层), 唯一 (外层核层), OLM (外限制膜), EZ (椭球区), OS (外部部分), RPE (视网膜色素上皮) 和 BM (赫的膜)。缩放条形图 = 1 mm (曝气生物滤池和 IR-cSLO 图像), 200 µm (SD OCT 图像)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 大眼兔模型中的视网膜悬浮注射.(A) 曝气生物滤池, MC, 和 SD OCT 图像的视网膜注射1毫米 NaIO3 3 月后, 损伤诱导。注意, 在 sd oct 中, 与气泡和退化 neuroretina 相对应的超曝气生物滤池周围的亚生物过滤. (B) 曝气生物滤池, MC, 和 sd oct 图像的眼睛预处理1毫米 NaIO3 1 周后视网膜移植5万干细胞-视网膜色素上皮悬浮液, 并分析移植后3月。请注意曝气生物滤池图像中的超曝气生物滤过区, mc 中缺乏综合色素细胞和 sd oct 中的萎缩 neuroretina. (C) mc 和 sd oct 图像对应于非预处理的天真眼睛3月后视网膜移植干细胞-RPE 在悬浮。注意 MC 图像上的色素区和 sd oct 上保存的盘结构. 标清扫描平面被标记 (绿色箭头)。白色箭头标记的边界泡在面部和 SD OCT 图像。缩放条形图 = 1 mm (曝气生物滤池和 MC 图像), 200 µm (SD OCT 图像)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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在本协议中, 对遗传算法的大眼模型的生成及其在评价干细胞-RPE 积分的临床应用进行了描述。

为了将 GA 及相关疾病的再生疗法翻译为临床7, 必须开发和优化方法, 以忠实地捕获移植和影像学的临床方法。兔子在这方面有吸引力: 它有一个相对较大的眼睛, 允许眼内手术和标准成像的使用, 是便宜和容易安置相比, 其他大眼睛动物。

我们描述使用标准的 transvitreal 25 规范的玻璃体切除技术, 创造的亚视网膜泡或诱导亚视网膜损伤或移植干细胞-RPE。最初, 我们使用了一个3端口设置, 如图 1B所示, 目的是使用输液口 (套管针), 以防在手术过程中进行玻璃体切除手术。然而, 由于我们没有发现玻璃体切除术是必要的应用亚视网膜注射, 输液口已被省略。然而, 第三个港口的选择应保留, 如果该程序是进一步调整和玻璃体切除手术。

大眼兔是一个建立良好的眼模型, 在过去几个世纪的解剖学和生理学积累的数据8。此外, 兔子很容易处理和繁殖, 经济上有吸引力 (例如, 购买, 住房和饲养), 并随时可与其他大眼睛哺乳动物模型相比。大眼睛模型的一个主要优势是, 它能够使用高分辨率的临床成像技术, 这反过来又允许跟踪移植干细胞-RPE 细胞在视网膜空间随着时间的推移。然而, 尽管 lagomorphs 比啮齿目动物更接近人类, 但必须指出的是, 它们拥有 merangiotic 视网膜和视觉条纹, 与 holangiotic 视网膜和灵长类动物中的凹 phylogenetically 相比, 它们是9。Merangiotic 视网膜意味着视网膜内的大部分血液供应来自脉络, 这是一个需要考虑的差异, 因为它可以增加病变和出血的风险。一个实验的优势是, 它允许建模早期阶段的 GA 后视网膜泡单独的生理解决方案, 因为它已经证明了1,3。这些研究表明, 在 merangiotic 环境中引起颞叶视网膜缺氧的视网膜疱疹可能足以引起感光死亡;然而, 在这种情况下, 视网膜色素上皮的损失已被证明是最有可能是由使用1毫升注射器和50µL 滤泡体积, 一个随机的现象, 反过来加强神经-视网膜萎缩引起的亚网膜流产生。因此, 疱疹的体积可以直接影响视网膜的伸展损伤, 这意味着体积越大 (例如, 100 µL, 正如在其他研究中使用的10), 它就会变得更加有害。

确保注入细胞融合的关键步骤是, 在注射时避免细胞回流到玻璃体中, 并在视网膜空间中定位针。如果定位太深, 外部视网膜屏障/脉络膜将被侵入, 免疫细胞可能侵入亚视网膜空间, 造成免疫排斥, 尽管使用免疫抑制。移植成功的另一个重要方面是玻璃体的状态。在目前的模型, 不执行玻璃体切除术, 以减少回流和外科创伤。然而, 它已经注意到, 在一些眼睛很难得到适当的尖端位置在视网膜上的尖端卡住在前视网膜玻璃体间期导致小甚至没有泡的形成。虽然这是一个相对罕见的事件, 它表明, 在手术和手术后的分析需要考虑到兔玻璃体的变异性。

此外, 适当的注射 triamcinolon 是至关重要的, 以避免遮蔽的白色类固醇晶体眼底, 这将阻碍手术, 并在手术后眼底可视化 SD OCT。为了减少这个问题, triamcinolon 的注射应在下颞象限进行。同样, 套管应放置1-2 毫米从角膜缘, 以避免玻璃体出血从睫状体和触摸 unproportionally 大兔晶状体与针。晶状体接触会导致白内障, 反过来又会阻碍在术后影像中对亚视网膜空间的正确可视化。

类固醇, 包括曲安, 可能会导致白内障随着时间的推移。我们没有观察到这以下的曲安行政长达8月。然而, 很可能类固醇诱发的白内障将发展, 如果管理的曲安在广泛的时间段。

所描述的方法既可用于外科训练, 也可用于分析细胞整合和功能, 如这里和我们以前的出版物所述。该方法在临床试验中对几种遗传性视网膜营养的亚视网膜病毒载体的管理也有很高的相关性。未来的修改可能包括移植更复杂的材料, 如板料载体和 biogels。随着新的临床影像学方法的出现, 这将是很容易适应兔眼, 可能没有修改。

最后, 大眼兔模型被证明是一个相关的前临床模型, 有几个优势相比, 我的啮齿动物模型) 综述不同阶段的 GA, ii) 应用患者相关的手术和影像学方法, 和 iii。) 评估供体细胞的整合, 作为遗传和相关疾病的细胞替代治疗方法。

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Disclosures

没有一个作者有竞争利益或利益冲突。

Acknowledgments

这项研究得到了卡研究所、皇冠公主玛加丽塔·瓦尔斯特伦的视力受损基金会、埃德温∙乔丹基金会眼科研究、瑞典眼基金会、国王古斯塔夫五世基金会、ARMECLindeberg 基金会和 Cronqvist 基金会

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

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References

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Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

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