Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Subretinal Transplantation af humane embryonale stamceller afledt retinal Pigment epitel celler ind i en stor-eyed Model af geografisk atrofi

Published: January 22, 2018 doi: 10.3791/56702
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 2, 1
1Clinical Neuroscience, Section for Ophtalmology and Vision, Karolinska Institutet, 2Clinical Sciences, Intervention and Technology, Division of Obstetrics and Gynecology, Karolinska Institutet
* These authors contributed equally

Summary

Retinale pigment epitel celler kunne fungere som en celle-substitutionsterapi for avancerede form af tørre aldersrelateret makuladegeneration. Denne protokol beskriver generation af en stor-eyed model af geografisk atrofi og subretinal transplantation af humane embryonale stamceller-afledt retinale pigment epitel celler ind i denne model af sygdom.

Abstract

Geografisk atrofi (GA), den sene fase af tørre aldersrelateret makuladegeneration er karakteriseret ved tab af retinale pigment epitel (ÅV) lag, hvilket fører til efterfølgende degeneration af vitale retinal strukturer (fx, fotoreceptorer) forårsager alvorlig synsnedsættelse. Ligeledes er ÅV-tab og nedgang i synsstyrke set i langsigtede følger op af patienter med avanceret våd aldersrelateret makuladegeneration (AMD) intravitreal anti-vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) behandling. Derfor, på den ene side det er grundlæggende at effektivt udlede ÅV celler fra en ubegrænset kilde, der kunne tjene som substitutionsterapi. På den anden side er det vigtigt at vurdere adfærd og integration af de afledte celler i en model af sygdom indebærer kirurgisk og Billeddannende metoder som tæt som muligt på dem, der anvendes i mennesker. Her, vi fremlægge en detaljeret protokol baseret på vores tidligere publikationer, der beskriver generation af prækliniske model af GA albino kaninøjne for evaluering af den menneskelige embryonale stamceller afledt retinale pigment epitel celler (menneskelige stamceller-RPE) i en klinisk relevante indstilling. Differentierede menneskelige stamceller-ÅV kan transplanteres ind i naive øjne eller øjne med NaIO3-induceret GA-lignende retinal degeneration ved hjælp af en 25 G transvitreal pars plana teknik. Evaluering af degenererede og transplanterede områder udføres af multimodale høj opløsning non-invasiv real-time imaging.

Introduction

Denne protokol beskriver generation af en stor-eyed prækliniske model af geografisk atrofi (GA), der giver mulighed for evaluering af integration af transplanterede menneskelige stamceller-RPE i subretinal plads. Metoderne beskrevet i detaljer her har været brugt i 3 seneste publikationer, der viser produktionen af en beriget, rene og funktionelle befolkning af ÅV celler fra menneskelige stamceller1, samt oprettelsen af ydre nethinde beskadige og en GA-lignende fænotype induceret af subretinal injektion af fysiologisk saltopløsninger (dvs., BSS og PBS) eller NaIO3 i kanin øje2,3. Vi viste yderligere, at sub retinal suspension transplantationer af menneskelige stamceller-ÅV danner omfattende funktionelle encellelag med fotoreceptor rednings kapacitet2.

Flere fordele ledsage brugen af kanin øje for generation af en GA model af sygdom. For det første størrelsen af kaninøjne, der er 70% volumen af en voksen menneskelige øje, giver klinisk meningsfulde transplantation ved hjælp af en celle tæthed, der er meget lavere end rutinemæssigt anvendes i små gnavere øjne (1000 celler/mikroliter vs 50.000 celler/µL)4 , 5. for det andet, kirurgi i gnavere er normalt transscleral gennem årehinden, som bringer den retinale barriere og potentielt udløser en inflammatorisk reaktion og en mulig afvisning6. Begge faktorer kan sammen føre til multilayering og sammenklumpning af transplanterede celler, og en generelt dårlig integration af de transplanterede celler i en forstyrret indfødte retinale væv. Men, den store-eyed kanin model giver mulighed for en kirurgisk teknik med instrumentation identisk med en klinisk indstilling. For det tredje tillader en stor-eyed model også høj opløsning i vivo billeddannelse og overvågning af de transplanterede celler og den overliggende nethinden gennem tid1,2,3. Dermed, vi beskriver en klinisk relevante og omkostningseffektive prækliniske model, der bør være et attraktivt alternativ til gnavere for alle med interesse for forskning af den normale og syge nethinde og sub retinal rummet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende protokol følger retningslinjerne dyrs pleje af Karolinska Instituet. Alle dyreforsøg ved hjælp af New Zealand albino kaniner (Tabel af materialer) er blevet godkendt af det regionale Dyreetik udvalg (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (tillade: dnr 56/15). Brugen af menneskelige stamceller (dnr 2011/745-31/3) og overførsel og manipulation af menneskelige stamceller-ÅV (dnr 2013/813-31/2) er også i overensstemmelse med svensk lovgivning og Karolinska Institutet forordninger, og er blevet godkendt af regionale menneskelige etiske udvalg ( Regionala Etikprövningsnämnden jeg Stockholm).

1. subretinal injektion af natrium Jodatoploesningen (NaIO3) i en stor-eyed dyremodel

  1. Bedøver dyr ved intramuskulær administration i låret med en blanding af 35 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin i saltvand ved hjælp af en 30 G sprøjte, og spile elever med aktuel øjendråber ved hjælp af en blanding af 0,75% cyclopentolate og 2,5% phenylephrin. Korrekt anesthetization bekræftes hvis dyret ikke reagerer på en hård knivspids af sin ryg ben.
  2. Placer kanin under kirurgisk mikroskop med hovedet vender kirurg (figur 1A). Bruge en låget retraktoren til at fjerne øjenlåg og nictitans membran med en steril klud til at minimere risikoen for kontaminering. Brug afbalanceret saltopløsning (BSS) at forhindre tørhed under anæstesi i begge øjne.
  3. Mikrokirurgi, brug en 2-port (eller valgfri 3-port) 25 G transvitreal pars plana teknik med ikke-ventil trocars for indsættelse af microsurgical instrumenter (figur 1B). Multifunktions vitrectomy maskine har porte til at forbinde en infusion kanyle, endoillumination, vitrector og endolaser. For subretinal injektioner er kun endoillumination obligatoriske, hvilket gør en 2-port set-up tilstrækkeligt. Indsætte endoillumation gennem den øverste venstre trokar og bruge den øverste højre trokar for subretinal injektion kanyle.
    1. For en 3-port set-up, bruge den lavere tidsmæssige trokar for BSS infusion kanyle. Hvis valgfrie instrumenter (f.eks. en vitrector) er brugt, indsætte dem gennem den øverste højre trokar.
    2. Sæt de øverste 2 trocars 1-2 mm fra limbus bruger jeg pincet til at fange og fortrænge conjunctiva overliggende indsættelsesstedet.
    3. Sørg for trocars er indsat transsclerally på en 30-45° limbus parallelle vinkel, og gå videre til midten af spidsen af trokar. Derefter vende trokar 90° og rykke ind i øjet, sigter den bageste pol af øjet. Denne procedure vil undgå post-operative lækage fra sclerotomies og også mindske risikoen for endophthalmitis (dvs. bakteriel infektion i øjet). Se også figur 2B for trokar positioner.
    4. Sætte en enkelt brug flade kontaktlinse på hornhinden at visualisere nethinden med syntetisk tårer som kontaktgel mellem øjet og kontaktlinse (figur 1A).
    5. Trække 500 µL af NaIO3 i en 1 mL sprøjte tilsluttet et forlængerrør (drives af assistenten) og en 38 G polytip kanyle (drives af kirurgen).
    6. Indsæt endoillumination sonde gennem den øverste venstre trokar og injektion kanyle gennem den øverste højre trokar og fremme kanyle gennem den glasagtige plads mod nethinden, satsning nemlig område lige under synsnerven hoved.
    7. Tillad spidsen af kanylen langsomt røre nethinden indtil en fokal tandblegning er synlige. Injektion, sig vil trænge ind i nethinden, giver mulighed for subretinal levering. Lad ikke kanylen trænge nethinden, da dette kan forårsage blødning.
    8. Injicér 50 µL af NaIO3 subretinally over en 5 s periode. Da der er en naturlig kavalergang fly mellem nethinden og de underliggende årehinden, bør et klart synlige halvtransparente bleb gradvist danne under injektionen.
    9. Under injektionen, langsomt trække nålen, men sørg for, at spidsen er fastholdt i bleb at minimere opstød.
    10. Efter fjernelse af endoillumation og injektion kanylen, fjerne de trocars bruger jeg pincet, og Anvend let tryk for 30 s til de selvstændige forsegling sutur-mindre sclerotomies ved hjælp af spidsen eller den stumpe ende af pincet.
  4. Post-surgically give 10 mL saltvand subkutant at undgå dehydrering. Giv ikke post-operative topikale steroider eller antibiotika. For analgetika give 0,5 mL af buprenorphin 0,3 mg/ml subcutant efter kirurgi, som dagen efter operationen.
  5. Efter brug, vaske alle instrumenter ved at nedsænke dem for et par sekunder først i 70% ethanol, for det andet i 45% ethanol, og endelig i destilleret vand. Tør dem ordentligt med et stykke køkkenrulle.
  6. Deltage i dyr, indtil de genvinde tilstrækkelig bevidsthed og placere dem alle enkelt encaged. Hvis påkrævet (f.eks.til Immunhistokemi formål), aflive dyr ved intravenøs injektion af 100 mg/kg pentobarbital (Se Tabel af materialer).
  7. Vente 7 dage til at gå videre med transplantation af menneskelige stamceller-ÅV celler.

2. subretinal Transplantation af menneskelige stamceller-ÅV celler i de behandlede dyr

  1. Administrere 2 mg (100 µL) af intravitreal triamcinolon i bedøvede dyr ved hjælp af en 30 g injektion nål indsættes 1-2 mm fra limbus i den lavere tidsmæssige quadrant 1 uge før transplantation af menneskelige stamceller-RPE og re administrere det hver 3 måneder. Sørg for at påpege spidsen mod den bageste pol af øjet til at undgå en linse indslag.
  2. Kultur en menneskelige stamceller-ÅV éncellelag som beskrevet tidligere1.
  3. Fjern celle differentiering medie (Se Tabel af materialer) af en 24-godt sammenflydende menneskelige stamceller-ÅV éncellelag og vaske hver godt med 500 µL af PBS uden Ca2 + og Mg2 +. Gentag denne handling igen for 2 vasker alt.
  4. Kassér supernatanten, tilsættes 500 µL af trypsin pr. brønd og Inkuber i 12 min. ved 37 ° C.
  5. VIP pladen og fjern forsigtigt trypsin (celler skal blive siddende på pladen). Indsamle celler i 800 µL af frisk 37 ° C forvarmet differentiering medier af blid pipettering, eller endda skrabe hvis nødvendig for at opnå en enkelt cellesuspension.
    Bemærk: Brug en 40 µm celle si hvis cellen klots observeres.
  6. Tælle celler i en hemocytometer afdeling med 0,2% Trypan blå, ifølge producentens anvisninger.
  7. Der tilsættes 5 mL af differentiering medier og centrifugeres cellerne ved stuetemperatur, 300 x g i 5 min.
  8. Kassér supernatanten og resuspend pellet i frisk filter-steriliseret PBS (passeret gennem en 25 mm sprøjte filter) til en endelig koncentration på 1000 celler/mikroliter.
  9. Alikvot den tidligere cellesuspension til 600 µL delprøver og holde på is indtil og under kirurgi.
  10. Bedøver dyr ved intramuskulær administration i låret med en blanding af 35 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin i saltvand ved hjælp af en 30 G sprøjte. Spile elever med aktuel øjendråber ved hjælp af amix på 0,75% cyclopentolate og 2,5% phenylephrin. Korrekt anesthetization bekræftes hvis dyret ikke reagerer på en hård knivspids i sin ryg ben.
  11. Placer kanin med hovedet over for kirurgen. Bruge en låget retraktoren til at fjerne øjenlåg og nictitans membran med en steril klud til at minimere risikoen for kontaminering. Brug BSS for at forhindre tørhed under anæstesi i begge øjne.
  12. Mikrokirurgi, brug en 2-port (eller valgfri 3-port) 25 G transvitreal pars plana teknik med trocars placeret i de samme holdninger som beskrevet i trin 1.3 og figur 2. Hvis de tidligere sclerotomies er synlige, udføre trokar indsætningspunktet lige ved siden af, men ikke gennem disse, at minimere risikoen for postoperative lækage.
    1. Sætte en enkelt brug flade kontaktlinse på hornhinden at visualisere nethinden med syntetisk tårer som kontaktgel mellem øjet og kontaktlinse (figur 1A).
    2. Efter korrekt tip positionering (Se trin 1.3.5 og 1.3.6), injiceres 50 µL af en forsigtigt blandet menneskelige stamceller-ÅV suspension (50.000 celler) subretinally. Målet for midten af området NaIO3 forbehandlet kendetegnet ved en karakteristisk "metallisk" endo-belysning refleks. Neurosensory nethinden bør adskille nemt skabe en tydeligt synlig bleb. Flush nålen med steril H2O i mellem kaniner/efter brug for at undgå nål tilstopning på grund af celle klumper. Ændre nålen når tilstopning er bemærket.
    3. Under injektionen, langsomt trække nålen men sørg for at spidsen opretholdes inden for bleb at minimere opstød.
    4. Efter fjernelse af endoillumation og injektion kanylen, fjerne de trocars bruger jeg pincet, og Anvend let tryk for 30 s til de selvstændige forsegling sutur-mindre sclerotomies ved hjælp af spidsen eller den stumpe ende af pincet.
  13. Post-surgically give 10 mL saltvand subkutant at undgå dehydrering. Giv ikke post-operative topikale steroider eller antibiotika. For analgetika give 0,5 mL af buprenorphin 0,3 mg/ml subcutant efter kirurgi, som dagen efter operationen.
  14. Efter brug, vaske alle instrumenter ved at nedsænke dem for et par sekunder, først i 70% ethanol, for det andet i 45% ethanol, og endelig i destilleret vand. Tør dem ordentligt med et stykke køkkenrulle.
  15. Deltage i dyr, indtil de genvinde tilstrækkelig bevidsthed og placere dem alle enkelt encaged. Hvis påkrævet (f.eks. til Immunhistokemi formål), aflive dyr ved intravenøs injektion af 100 mg/kg pentobarbital.

3. in Vivo Retinal og Subretinal Imaging

  1. Bruge en spektral domæne optisk kohærens tomografi (SD-OCT) enhed med den medfølgende software (se tabel af materialer) at opnå tværsnits b-scanninger af de behandlede dyr efter fabrikantens anvisninger. For at undgå billede sløring, Sørg for at holde hornhinden fugtig ved gennemskylning med aktuel saltvand hver 30-60 s.
    1. Placer de bedøvede og elev-forstørrede dyr (Se trin 1.1 og 2.10) i en justerbar mount til at opnå en uhindret sti fra lyskilden instrument til kanin nethinden.
    2. Få mindst 3 OCT scanninger med samtidige infrarød-Konfokal scanning laser oftalmoskopi (IR-cSLO) reflektans reference billeder der repræsenterer den øverste, centrale og nedre del af det injicerede område.
    3. Opnå en-face fundus billeder med cSLO blå, grøn, infrarød og flerfarvet laser Reflektionsgraden (dvs., flere samtidige laser farver), henholdsvis.
    4. Fange blå lys autofluorescence (BAF) billeder ved hjælp af blå-lys laser evne til SD-okt-enhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentant i vivo billeder af BAF, IR-cSLO og SD-okt af en normal albino kanin nethinden er vist i figur 2. Bemærk de forskellige retinal lag med deres karakteristiske niveauer af lysrefleksion fanget af SD-okt-instrument.

I tallene 1A og figur 1B, setup hen til oprette sub retinale blebs er illustreret: en låget retraktoren er placeret, underkaste øjenlåg for at tillade indsættelse af 3 trocars (figur 1B) 1-2 mm langt fra limbus, for at undgå en linse Tryk på, og på en 30-45 ˚c limbus parallelle vinkel. Trocars gør det muligt at indføre en valgfri infusion kanyle, ud over en lys og injektion nålen gennem sclera. Forstørrede elev sammen med en flad kontaktlinse vil lette en udsigt over øjet fundus og den sub retinal plads, mens den kirurgiske procedure er udført.

Efter injektion af 50 µL 1 mm NaIO3 løsning oprettes en bleb subretinal rummet, der vil løse og gradvis degenererede ydre nethinden, som vist i SD-okt billedet i figur 3A tre måneder efter injektion. Værdsætte udtynding af de yderste neuroretinal lag i SD-OLT og hypo-BAF områder, svarende til ÅV tab således genskabe en GA-lignende fænotype. Efter identifikation af området med skader er 50.000 menneskelige stamceller-RPE i en 50 µL volumen injiceres på ny til transplantation, at skabe en anden bleb, der løser som vist i BAF og multi-farve (MC) billeder i figur 3B. Genkende mild til moderat hyper-BAF områder med en fokal øget hyper-BAF inferiorly på grænsen af området med skader, vejledende af kronisk stress af de indfødte ÅV vist i SD-okt scanninger sammen med fraværet af pigmenterede områder i MC billede. Bleb svarende til injektion af 50 µL af menneskelige stamceller-ÅV (50.000 celler) i ikke-forbehandlet øjne viser pletter af pigmenterede celler (MC) billede og velbevarede retinal strukturer i SD-okt-scanning er vist for sammenligning (figur 3 c).

Kollektivt, tillader denne procedure og metode undersøgelse af integration af subretinal suspension transplantationer af menneskelige stamceller-RPE i en relevant model til GA.

Figure 1
Figur 1: injektion sat op. (A) billeder skildrer den kirurgiske set-up for sub retinal injektioner. Dyret er placeret under kirurgisk mikroskop (venstre) og kirurgen holder endoillumination sonden indsat gennem den venstre trokar i venstre hånd og intravitreal kirurgisk instrument (fx subretinal injektion kanyle) indsættes gennem den venstre trokar i højre hånd (i midten). En flad kontaktlinse placeret på hornhinden tillader en forstørret visning af fundus under den kirurgiske procedure (til højre). (B) tæt skematisk oversigt over albino kaninøjne med låget retraktor på plads og brystvorten fra trocars indsat 1-2 mm dybt fra limbus og en 30-45 ° parallelle vinkel, sammen med de trocars, som letter indførelsen af en valgfri infusion kanyle, en lys og nål til injektion. En flad kontaktlinse beliggende på toppen af eleven vil bidrage til at få et bedre overblik over øjet fundus under den kirurgiske procedure. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Normal albino kanin nethinden i vivo billeddannelse. In vivo BAF, IR-cSLO og SD-okt billeder der repræsenterer en normal albino kanin nethinden. Et slag op af SD-OLT med den tilsvarende mærkning af de forskellige lag, retinal ses i billedet for SD-okt: GCL (ganglion cellelag), IPL (inderste plexiform lag), INL (inderste nukleare lag), OPL (ydre plexiform lag), ger. (ydre nukleare lag), OLM (ydre begrænse membran), EZ (ellipsoide zone), OS (ydre segmenter), ÅV (retinale pigment epitel) og BM (Bruchs membran). Skalere barer = 1 mm (BAF og IR-cSLO billeder), 200 µm (SD-okt billeder). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Subretinal suspension injektioner i store-eyed kanin model. (A) BAF, MC og SD-okt billeder af subretinal injektion af 1 mM NaIO3 3 måneder efter skade induktion. Bemærk hypo-BAF omgivet af hyper-BAF områder svarende til bleb og den degenererede neuroretina i SD-oktober (B) BAF, MC, og SD-okt billeder af øjne forbehandlet med 1 mM NaIO3 for 1 uge efterfulgt af subretinal transplantation af 50.000 menneskelige stamceller-RPE i suspension og analyseret 3 måneder efter transplantation. Bemærk hyper-BAF områderne i BAF billede, manglen på integrerede pigmenteret celler i MC og de atrofisk neuroretina i SD-oktober (C) MC og SD-okt billeder svarende til ikke-forbehandlet naive øjne 3 måneder efter subretinal transplantation af menneskelige stamceller-RPE i suspension. Bemærk de pigmenterede områder på MC billede og bevarede neuroretinal struktur på SD-oktober SD-OCT Skan fly er markeret (grøn pil). Hvid pilespidser markere kanten af blebs i en-face og SD-okt billeder. Skalere barer = 1 mm (BAF og MC billeder), 200 µm (SD-okt billeder). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol, er generation af en stor-eyed model GA og dens prækliniske brug for evaluering af menneskelige stamceller-ÅV integration i vivo beskrevet.

For oversættelse af regenerative behandlinger for GA og beslægtede sygdomme til klinikken7er det vigtigt at udvikle og optimere metoder, der trofast fange de kliniske metoder til transplantation og billedbehandling. Kaninen er i dette attraktive aspekt: det har et forholdsvis stort øje, der tillader intraokulær kirurgi og brug af standard billedbehandling, og er billig og let opstaldet i forhold til andre store-eyed dyr.

Vi beskriver brug af standard transvitreal 25-gauge pars plana vitrectomy teknik for at skabe sub retinale blebs enten til at fremkalde sub nethinde beskadige eller at omplante menneskelige stamceller-ÅV. I begyndelsen brugte vi en 3-port set-up, som illustreret i figur 1B, med den hensigt at bruge havnens infusion (trokar), i tilfælde af en vitrectomy blev udført under proceduren. Men da vi ikke har fundet en vitrectomy at være nødvendige for at anvende sub retinal injektioner, infusion port er udeladt. Ikke desto mindre, den tredje port mulighed bør forblive hvis proceduren er yderligere tilpasset og en vitrectomy udføres.

Den store-eyed kanin er en veletableret okulær model med akkumulerede data om anatomi og fysiologi gennem seneste århundreder8. Derudover kaniner er nemme at håndtere og race, økonomisk attraktive (fx, Køb, bolig, og at holde), og let tilgængelige sammenlignet med andre store-eyed pattedyr modeller. En stor fordel ved en stor eyed-model er, at det muliggør brug af høj opløsning kliniske Billeddannende teknikker, som igen giver mulighed for sporing af transplanterede menneskelige stamceller-ÅV celler i den subretinal plads over tid. Men trods lagomorfer bliver Fylogenetisk tættere på mennesker end gnavere, skal det angives, at de besidder en merangiotic nethinden og en visuel streak, sammenlignet med en holangiotic nethinden og en fovea stede i primater9. Merangiotic nethinde betyder, at de fleste af blod levering af den indre nethinde er afledt fra choriocapillaris, en forskel, at man skal overveje, da det kan øge risikoen for læsion og blødning. En eksperimentel fordel er, at det giver mulighed for modellering tidligere stadier af GA efter subretinal blebs af fysiologisk løsninger alene, som det har været tidligere påviste1,3. Disse undersøgelser foreslog at en subretinal bleb forårsager tidsmæssige retinal hypoxi i merangiotic miljø kan være nok til at forårsage fotoreceptor død; men i denne sammenhæng ÅV tab har vist sig at højst sandsynligt blive genereret af sub retinal strømmen induceret ved hjælp af en 1 mL sprøjte og en 50 µL bleb volumen, et tilfældigt fænomen, som til gengæld potentiates neuro-retinal atrofi. Derfor kan bleb volumen have en direkte virkning på den retinale stretch skader, hvilket betyder, at jo større den forbrugte volumen (f.eks.100 µL, som er blevet brugt i andre undersøgelser10), jo mere skade det kan blive.

Et afgørende skridt til at sikre integrationen af de injicerede celler er at undgå tilbageløb af celler i glaslegemet mens indsprøjtning, og placeringen af nålen i den subretinal plads. Hvis placeres for dybt, den ydre retinal barriere/choroidea vil blive trængt og immunceller kan invadere de sub retinal plads, forårsager immun afvisning trods anvendelse af immunosuppression. Et andet vigtigt aspekt for transplantation succes er den glaslegemet. I den nuværende model, er vitrectomy ikke udført for at minimere opstød og kirurgisk traume. Det er blevet bemærket, at i nogle øjne det er svært at få en ordentlig tip stilling på nethinden som spidsen får fast i den pre-retinal glasagtige interphase fører til dannelse af små eller slet ingen blebs. Selv om det er en forholdsvis sjælden begivenhed, indikerer det, at variation af den glasagtige kanin skal tages i betragtning under kirurgi og post-operative analyse.

Derudover er korrekt injektion af triamcinolon afgørende for at undgå at tilsløre fundus af hvide steroid krystaller, som derefter vil hæmme kirurgi og post-operative fundus visualisering af SD-okt. For at minimere dette problem, skal injektion af triamcinolon gøres i de lavere tidsmæssige kvadrant. Ligeledes skal trocars placeres 1-2 mm fra limbus at undgå glaslegeme blødning fra ciliare og rørende unproportionally store kanin linse med nålen. En linse indslag vil forårsage en grå stær, der vil igen hindrer ordentlig visualisering af sub retinal rummet under postoperative tænkelig.

Steroider, herunder triamcinolon, kan selv forårsager grå stær over tid. Vi har ikke observeret dette, efter triamcinolon administration for op til 8 måneder. Det er imidlertid sandsynligt, at steroid-induceret grå stær vil udvikle hvis administrerer triamcinolon over omfattende perioder.

De beskrevne metoder kan bruges både til kirurgiske uddannelse og analyse af celle-integration og funktion som beskrevet her og i vores tidligere udgivelser. Metoden har også høj relevans for administration af sub retinal virale vektorer nu i kliniske forsøg for flere arvelige retinal dystrophies. Fremtidige ændringer kan omfatte transplantation af mere komplekse materialer såsom ark luftfartsselskaber og biogels. Som nye kliniske Billeddannende metoder dukker op, vil disse være let tilpasses til kaninøjne, eventuelt uden ændringer.

In conclusion, den store-eyed kanin model er vist sig for at være en relevant prækliniske model, der har flere fordele i forhold til gnavere modeller for i) recapitulating forskellige stadier af GA, ii) anvendelsen af patient-relevante kirurgisk og Billeddannende metoder, og iii ) evaluering af integration af donor celler skal bruges som celleudskiftnings til GA og relaterede lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen af forfatterne har konkurrerende interesser eller modstridende interesser.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Karolinska Institut, Kronprinsesse Margareta fundament for de svagsynede, Edwin Jordan Foundation for oftalmologisk forskning, den svenske øjet Foundation, Kong Gustav V Foundation, ARMEC Lindeberg Foundation, og Cronqvist Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  4. Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
  5. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
  6. Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
  7. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  8. Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
  9. Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
  10. Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).

Tags

Cellebiologi sag 131 Retinal Pigment epitel celler humane embryonale stamceller stor-eyed model geografisk atrofi Suspension Subretinal Transplantation optisk kohærens tomografi Transvitreal Pars Plana
Subretinal Transplantation af humane embryonale stamceller afledt retinal Pigment epitel celler ind i en stor-eyed Model af geografisk atrofi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H.,… More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter