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Biology

भौगोलिक शोष की एक बड़ी आंखों मॉडल में मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न-रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के रेटिना प्रत्यारोपण

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं शुष्क उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन के उन्नत रूप के लिए एक सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के रूप में सेवा कर सकता है. इस प्रोटोकॉल की पीढ़ी का वर्णन एक बड़ी भौगोलिक शोष की आंखों मॉडल और मानव भ्रूण स्टेम कोशिका के रेटिना प्रत्यारोपण रोग के इस मॉडल में रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं व्युत्पंन ।

Abstract

भौगोलिक शोष (GA), शुष्क आयु से संबंधित धब्बेदार अध-पतन की देर चरण रेटिना वर्णक उपकला (RPE) परत की हानि की विशेषता है, जो महत्वपूर्ण रेटिना संरचनाओं के बाद के अध-पतन की ओर जाता है (उदा., photoreceptors) जिससे गंभीर दृष्टि हानि । इसी प्रकार, RPE-हानि और कम दृश्य तीक्ष्णता में देखा जाता है लंबी अवधि के साथ रोगियों का पालन उन्नत गीला उम्र से संबंधित धब्बेदार अध (AMD) प्राप्त intravitreal विरोधी संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) उपचार. इसलिए, एक तरफ, यह कुशलतापूर्वक एक असीमित स्रोत है कि प्रतिस्थापन थेरेपी के रूप में सेवा कर सकता से RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए मौलिक है । दूसरी ओर, यह व्यवहार और मानव में लागू उन लोगों के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में शल्य चिकित्सा और इमेजिंग तरीकों पर जोर देने रोग के एक मॉडल में व्युत्पन्न कोशिकाओं के एकीकरण का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहां, हम एक विस्तृत हमारे पिछले प्रकाशनों कि albino खरगोश आंख का उपयोग कर GA के एक पूर्व चिकित्सा मॉडल की पीढ़ी का वर्णन के आधार पर प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (hESC-RPE) के मूल्यांकन के लिए एक नैदानिक प्रासंगिक सेटिंग । विभेदित hESC-RPE नािो के साथ भोली आँखों या आँखों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं3-प्रेरित GA-रेटिना अध-पतन की तरह एक 25 ग्राम transvitreal पार्स प्लाना तकनीक का उपयोग कर. multimodal और प्रत्यारोपित क्षेत्रों का मूल्यांकन उच्च संकल्प गैर इनवेसिव वास्तविक समय इमेजिंग द्वारा किया जाता है ।

Introduction

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इस प्रोटोकॉल एक बड़ी भौगोलिक शोष (GA) कि प्रत्यारोपण hESC-रेटिना अंतरिक्ष में RPE के एकीकरण के मूल्यांकन की अनुमति देता है के नैदानिक मॉडल आंखों की पीढ़ी का वर्णन करता है । यहां विस्तार से वर्णित तरीके 3 हाल के प्रकाशनों में इस्तेमाल किया गया है कि एक समृद्ध, शुद्ध, और कार्यात्मक RPE कोशिकाओं के hESC से जनसंख्या के उत्पादन का प्रदर्शन1, साथ ही बाहरी रेटिना क्षति के निर्माण और एक GA-phenotype की तरह शारीरिक नमक समाधान (यानी, बीएसएस और पंजाबियों) या नािो3 खरगोश नेत्र2,3में से रेटिना इंजेक्शन द्वारा प्रेरित । हम आगे का प्रदर्शन किया है कि उप रेटिना निलंबन प्रत्यारोपण के hESC-RPE फार्म व्यापक कार्यात्मक monolayers के साथ photoreceptor बचाव क्षमता2.

कई फायदे रोग का एक GA मॉडल की पीढ़ी के लिए खरगोश आंख के उपयोग के साथ । सबसे पहले, खरगोश आंख के आकार, जो ७०% एक वयस्क मानव आंख की मात्रा है, नैदानिक सार्थक प्रत्यारोपण एक कोशिका घनत्व है कि नियमित रूप से बहुत कम है का उपयोग करने की अनुमति देता है छोटे चूहे की आंखों में इस्तेमाल किया (१,००० कोशिकाओं/µ l बनाम ५०,००० कोशिकाओं/µ l)4 , 5. दूसरे, कुतर में सर्जरी आमतौर पर रंजित के माध्यम से transscleral है, जो रेटिना बाधा समझौता और संभावित एक भड़काऊ प्रतिक्रिया और एक संभव अस्वीकृति6ट्रिगर । दोनों कारक एक साथ multilayering और प्रत्यारोपित कोशिकाओं के झुरमुट का नेतृत्व कर सकते हैं, और एक बाधित देशी रेटिना ऊतक में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के एक समग्र गरीब एकीकरण. हालांकि, बड़े खरगोश मॉडल आंखों एक नैदानिक सेटिंग के लिए समान इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ एक शल्य चिकित्सा तकनीक प्रदर्शन की अनुमति देता है । तीसरे, एक बड़े मॉडल आंखों भी vivo इमेजिंग और प्रत्यारोपित कोशिकाओं की निगरानी में उच्च संकल्प और समय1,2,3के माध्यम से भारी रेटिना की अनुमति देता है । इस प्रकार, हम एक नैदानिक प्रासंगिक और लागत कुशल नैदानिक मॉडल है कि एक सामांय और रोगग्रस्त रेटिना और उप रेटिना अंतरिक्ष के अनुसंधान में रुचि के साथ किसी के लिए कुतर के लिए एक आकर्षक विकल्प होना चाहिए का वर्णन ।

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Protocol

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निम्नलिखित प्रोटोकॉल कारोलिंस्का Instituet के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है । न्यूजीलैंड albino खरगोश (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर सभी पशु प्रयोगों क्षेत्रीय पशु नैतिकता समिति (स्टॉकहोम्स नौरा Djurförsöksetiska Nämnd) (परमिट: dnr 56/15) द्वारा अनुमोदित किया गया है । hESC (dnr 2011/745-31/3) का उपयोग और hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) के अंतरण और हेरफेर का प्रयोग स्वीडिश विधान और कारोलिंस्का Institutet विनियमों के अनुसार भी होता है, और क्षेत्रीय मानव नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित कर दिया गया है ( Regionala Etikprövningsnämnden i स्टॉकहोम) ।

1. एक बड़ी आंखों पशु मॉडल में सोडियम Iodate (नािो3) के उपरेटिना इंजेक्शन

  1. जांघ में इंट्रामस्क्युलर प्रशासन द्वारा Anesthetize पशुओं ३५ मिलीग्राम/किग्रा ketamine और 5 मिलीग्राम/खारा में xylazine एक 30 ग्राम सिरिंज का उपयोग कर, और सामयिक eyedrops के साथ विद्यार्थियों का विस्तार ०.७५% cyclopentolate और २.५% phenylephrine का मिश्रण का उपयोग कर । उचित anesthetization की पुष्टि की है अगर जानवर अपनी पीठ पैर की एक कठिन चुटकी के लिए प्रतिक्रिया नहीं करता है ।
  2. सर्जन (चित्र 1a) का सामना करना पड़ सिर के साथ सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत खरगोश प्लेस । दूषण के जोखिम को कम करने के लिए एक बाँझ कपड़े के साथ पलकें और nictitans झिल्ली को दूर करने के लिए एक ढक्कन रिट्रेक्टर का प्रयोग करें । दोनों आंखों में संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) का प्रयोग करें ।
  3. microsurgery के लिए, एक 2-पोर्ट का उपयोग करें (या वैकल्पिक 3-पोर्ट) 25 G transvitreal पार्स प्लाना तकनीक गैर-वाल्व्ड trocars के साथ microsurgical उपकरणों के सम्मिलन के लिए (चित्र 1b) । बहु-vitrectomy मशीन एक अर्क प्रवेशनी, endoillumination, vitrector, और endolaser कनेक्ट करने के लिए बंदरगाहों है । उप रेटिना इंजेक्शन के लिए, केवल endoillumination अनिवार्य है, जो एक 2-पोर्ट सेट-अप पर्याप्त बनाता है । ऊपरी बाएँ trocar के माध्यम से endoillumation डालें और उपरेटिना इंजेक्शन प्रवेशनी के लिए ऊपरी दाएँ trocar का उपयोग करें ।
    1. एक 3-पोर्ट सेट अप के लिए, बीएसएस अर्क प्रवेशनी के लिए कम लौकिक trocar का उपयोग करें । वैकल्पिक उपकरणों (जैसे एक vitrector) का उपयोग किया जाता है, तो ऊपरी दाएँ trocar के माध्यम से उन्हें सम्मिलित करें ।
    2. ऊपरी डालें 2 trocars 1-2 mm का उपयोग कर limbus से मारेंगे संदंश को हड़पने के लिए और विस्थापित कंजाक्तिवा संमिलन स्थल ।
    3. सुनिश्चित करें कि trocars एक 30-45 ° limbus समानांतर कोण पर transsclerally डाला जाता है, और trocar की नोक के बीच में आगे बढ़ना । तो trocar ९० ° बारी और आंख में अग्रिम, आंख के पीछे पोल पर लक्ष्य । यह प्रक्रिया sclerotomies से शल्य चिकित्सा रिसाव से बचने के लिए, और भी endophthalmitis के जोखिम में कमी (यानी, आंख में बैक्टीरियल संक्रमण) होगा । trocar पदों के लिए भी चित्रा b देखें ।
    4. एक एकल उपयोग कॉर्निया पर फ्लैट संपर्क लेंस रखो रेटिना कल्पना, आंख और संपर्क लेंस के बीच संपर्क जेल के रूप में सिंथेटिक आँसू के साथ (चित्र 1a) ।
    5. ड्रा ५०० एक 1 मिलीलीटर एक विस्तार ट्यूब (सहायक द्वारा संचालित) और एक ३८ जी polytip प्रवेशनी (सर्जन द्वारा संचालित) से जुड़े सिरिंज में नािो3 के µ एल ।
    6. ऊपरी बाईं trocar के माध्यम से endoillumination जांच डालें और इंजेक्शन प्रवेशनी ऊपरी दाएँ trocar के माध्यम से, और प्रवेशनी अंतरिक्ष के माध्यम से रेटिना की ओर अग्रिम अवलेह, बस ऑप्टिक तंत्रिका सिर के नीचे क्षेत्र के लिए लक्ष्य.
    7. प्रवेशनी के टिप की अनुमति देने के लिए धीरे से रेटिना को छूने के लिए एक फोकल whitening जब तक दिखाई देता है । इंजेक्शन ही रेटिना घुसना होगा, रेटिना वितरण के लिए अनुमति देता है । प्रवेशनी रेटिना घुसना मत करो, क्योंकि यह नकसीर के कारण हो सकता है ।
    8. एक 5 एस अवधि में ५० µ एल नािो के3 रेटिना इंजेक्षन । के बाद से वहां रेटिना और अंतर्निहित रंजित के बीच एक प्राकृतिक दरार विमान है, एक स्पष्ट रूप से दिखाई अल्पपारदर्शी bleb इंजेक्शन के दौरान धीरे से फार्म का होना चाहिए ।
    9. इंजेक्शन के दौरान, धीरे सुई वापस लेना, लेकिन सुनिश्चित करें कि टिप bleb के भीतर भाटा को कम करने के लिए बनाए रखा है ।
    10. endoillumation और इंजेक्शन प्रवेशनी को हटाने के बाद, trocars संदंश का उपयोग कर हटा दें, और 30 एस आत्म-सील सीवन-कम sclerotomies टिप या संदंश के कुंद अंत का उपयोग करने के लिए प्रकाश दबाव लागू होते हैं ।
  4. शल्य चिकित्सा के बाद निर्जलीकरण को रोकने के लिए नीचे खारा के 10 मिलीलीटर दे । शल्य चिकित्सा सामयिक स्टेरॉयड या एंटीबायोटिक दवाओं के बाद नहीं देते । एनाल्जेसिक के लिए सर्जरी के बाद buprenorphine ०.३ मिलीग्राम/मिलीलीटर के ०.५ मिलीलीटर दे, साथ ही सर्जरी के बाद दिन ।
  5. उपयोग के बाद, उंहें ७०% इथेनॉल में सबसे पहले सेकंड के एक जोड़े के लिए विसर्जित करके सभी उपकरणों को धो, दूसरे में ४५% इथेनॉल, और अंत में आसुत जल में । उंहें ठीक से एक कागज तौलिया के साथ सूखी ।
  6. पशुओं में भाग लेने जब तक वे पर्याप्त चेतना हासिल है और उंहें सभी एकल encaged जगह है । यदि आवश्यक हो (उदा., immunohistochemistry प्रयोजनों के लिए), १०० मिलीग्राम/kg pentobarbital के नसों के इंजेक्शन द्वारा euthanize जानवरों ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  7. hESC-RPE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के साथ आगे बढ़ने के लिए 7 दिनों तक प्रतीक्षा करें ।

2. उपचारित पशुओं में hESC-RPE कोशिकाओं के रेटिना प्रत्यारोपण

  1. प्रशासन 2 मिलीग्राम (१०० µ एल) anesthetized पशुओं में एक 30 जी इंजेक्शन सुई limbus से कम लौकिक वृत्त का चक्र 1 सप्ताह के hESC-RPE के प्रत्यारोपण से पहले डाला 1-2 मिमी का उपयोग कर, और यह हर 3 महीने फिर से प्रशासन । करने के लिए आंख के पीछे ध्रुव की ओर टिप बिंदु सुनिश्चित करने के लिए एक लेंस छूने से बचें ।
  2. पहले1के रूप में वर्णित कल्चर एक hESC-RPE monolayer ।
  3. सेल भेदभाव मीडिया निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें) के एक 24 अच्छी तरह से धाराप्रवाह hESC-RPE monolayer और एक अच्छी तरह से धोने के ५०० µ एल के साथ पंजाब के बिना सीए2 + और मिलीग्राम2 +। इस क्रिया को एक बार फिर दोहराएं, कुल 2 धुल के लिए ।
  4. supernatant त्यागें, trypsin के ५०० µ एल जोड़ने के प्रति अच्छी तरह से, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए मशीन ।
  5. थाली झुकाव और ध्यान से हटाने के trypsin (कोशिकाओं थाली से जुड़े रहना चाहिए) । कोमल pipetting, या यहां तक कि अगर जरूरत scraping द्वारा ताजा ३७ डिग्री सेल्सियस गर्म भेदभाव मीडिया के ८०० µ एल में कोशिकाओं को इकट्ठा एक भी सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: कक्ष के झुरमुट मनाया जाता है, तो एक ४० µm सेल छलनी का उपयोग करें ।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, ०.२% Trypan नीला का उपयोग करके किसी hemocytometer कक्ष में कक्षों की गणना करें ।
  7. भिंनता मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, 5 मिनट के लिए ३०० x जी ।
  8. supernatant त्यागें और हौसले से फिल्टर निष्फल पंजाब में गोली स्थगित (एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पारित) १,००० कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए/µ एल
  9. Aliquot पिछले सेल ६०० µ l aliquots में सस्पेंशन और जब तक और सर्जरी के दौरान बर्फ पर रखें ।
  10. इंट्रामस्क्युलर प्रशासन द्वारा Anesthetize पशुओं को जांघ में ३५ मिलीग्राम/किग्रा ketamine और 5 मिलीग्राम/एक 30 ग्राम सिरिंज का उपयोग कर खारा में xylazine । ०.७५% cyclopentolate और २.५% phenylephrine के amix का उपयोग सामयिक eyedrops के साथ विद्यार्थियों का फैलाव । उचित anesthetization की पुष्टि की है अगर जानवर अपनी पीठ पैर में एक कठिन चुटकी के लिए प्रतिक्रिया नहीं करता है ।
  11. खरगोश का सामना करना पड़ सिर के साथ जगह सर्जन । दूषण के जोखिम को कम करने के लिए एक बाँझ कपड़े के साथ पलकें और nictitans झिल्ली को दूर करने के लिए एक ढक्कन रिट्रेक्टर का प्रयोग करें । दोनों आंखों में संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए बीएसएस का प्रयोग करें ।
  12. microsurgery के लिए, 2-पोर्ट का उपयोग करें (या वैकल्पिक 3-पोर्ट) 25 G transvitreal पार्स प्लाना तकनीक trocars के साथ चरण १.३ और आकृति 2में वर्णित समान स्थितियों में रखा गया है । यदि पिछले sclerotomies दिखाई दे रहे हैं, trocar प्रविष्टि प्रदर्शन बस आसंन है, लेकिन इन के माध्यम से नहीं, पश्चात रिसाव के जोखिम को कम करने के लिए ।
    1. आंख और संपर्क लेंस (चित्र 1a) के बीच संपर्क जेल के रूप में सिंथेटिक आँसू के साथ रेटिना कल्पना करने के लिए कॉर्निया पर एक एकल उपयोग फ्लैट संपर्क लेंस रखो ।
    2. उचित टिप स्थिति के बाद (कदम 1.3.5 और 1.3.6 देखें), एक धीरे-मिश्रित hESC-RPE निलंबन (५०,००० कोशिकाओं) रेटिना के ५० µ एल सुई । नािो के केंद्र के लिए निशाना लगाओ3 एक विशेषता "धातु" इंडो-प्रदीप्ति पलटा द्वारा प्रतिष्ठित क्षेत्र का इलाज किया । neurosensory रेटिना को आसानी से स्पष्ट रूप से दृश्यमान bleb बनाने के लिए अलग करना चाहिए. कोशिका के झुरमुट के कारण सुई कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए उपयोग के बाद/खरगोशों के बीच में बाँझ एच2के साथ सुई फ्लश । सुई जब कॉलेस्ट्रॉल देखा है बदल जाते हैं ।
    3. इंजेक्शन के दौरान, धीरे सुई वापस लेना लेकिन सुनिश्चित करें कि टिप bleb के भीतर भाटा को कम करने के लिए बनाए रखा है ।
    4. endoillumation और इंजेक्शन प्रवेशनी को हटाने के बाद, trocars संदंश का उपयोग कर हटा दें, और 30 एस आत्म-सील सीवन-कम sclerotomies टिप या संदंश के कुंद अंत का उपयोग करने के लिए प्रकाश दबाव लागू होते हैं ।
  13. शल्य चिकित्सा के बाद निर्जलीकरण को रोकने के लिए नीचे खारा के 10 मिलीलीटर दे । शल्य चिकित्सा सामयिक स्टेरॉयड या एंटीबायोटिक दवाओं के बाद नहीं देते । एनाल्जेसिक के लिए सर्जरी के बाद buprenorphine ०.३ मिलीग्राम/मिलीलीटर के ०.५ मिलीलीटर दे, साथ ही सर्जरी के बाद दिन ।
  14. उपयोग के बाद, उंहें सेकंड के एक जोड़े के लिए विसर्जित करके सभी उपकरणों को धो, सबसे पहले ७०% इथेनॉल में, दूसरे में ४५% इथेनॉल, और अंत में आसुत जल में । उंहें ठीक से एक कागज तौलिया के साथ सूखी ।
  15. पशुओं में भाग लेने जब तक वे पर्याप्त चेतना हासिल है और उंहें सभी एकल encaged जगह है । यदि आवश्यक हो (जैसे immunohistochemistry प्रयोजनों के लिए), euthanize पशुओं के नसों में इंजेक्शन द्वारा १०० मिलीग्राम/kg pentobarbital ।

3. Vivo रेटिना और उपरेटिना इमेजिंग में

  1. के साथ सॉफ्टवेयर के साथ एक वर्णक्रमीय डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एसडी-OCT) डिवाइस का प्रयोग करें (सामग्री की मेज देखें) के इलाज जानवरों के पार अनुभागीय बी-स्कैन प्राप्त करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार, । छवि धुंधला से बचने के लिए, सामयिक खारा हर 30-60 एस के साथ निस्तब्धता द्वारा कॉर्निया नम रखने के लिए सुनिश्चित करें
    1. anesthetized और पुतली फैली हुई जानवरों (कदम १.१ और २.१०) एक समायोज्य माउंट में खरगोश रेटिना के लिए साधन प्रकाश स्रोत से एक अबाधित पथ प्राप्त करने के लिए देखें ।
    2. एक साथ अवरक्त-फोकल स्कैनिंग लेजर ophthalmoscopy (आईआर-cSLO) चिंतनशील संदर्भ छवियों के ऊपरी, केंद्रीय, और इंजेक्शन क्षेत्र के निचले हिस्से का प्रतिनिधित्व करने के साथ ंयूनतम 3 अक्टूबर स्कैन प्राप्त करें ।
    3. cSLO नीले, हरे, अवरक्त, और बहुरंगा लेजर चिंतनशील (यानी, कई एक साथ लेजर रंग), क्रमशः के साथ en-face fundus छवियाँ प्राप्त करें ।
    4. SD-OCT डिवाइस के ब्लू-लाइट लेज़र क्षमता का उपयोग करके ब्लू लाइट autofluorescence (बाफ) इमेज कैप्चर करे ।

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Representative Results

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विवो की छवियों में प्रतिनिधि, आईआर-cSLO, और एक सामान्य albino खरगोश रेटिना के एसडी OCT चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । प्रकाश प्रतिबिंब के अपने विशिष्ट स्तर एसडी अक्टूबर साधन द्वारा कब्जा कर लिया के साथ अलग रेटिना परतों ध्यान दें ।

आंकड़े 1a और आंकड़ा 1bमें, सेटअप उप-रेटिना blebs बनाने के लिए सचित्र है: एक ढक्कन रिट्रेक्टर तैनात है, आंख पलकों के अधीन करने के लिए अनुमति देने के लिए 3 trocars (आंकड़ा 1b) 1-2 mm से दूर limbus से, आदेश में एक लेंस से बचने के लिए स्पर्श, और एक 30-45 ˚ limbus समानांतर कोण पर । Trocars एक प्रकाश के अलावा, एक वैकल्पिक अर्क प्रवेशनी की शुरूआत, और श्वेतपटल के माध्यम से इंजेक्शन सुई सक्षम हो जाएगा । एक साथ एक फैली हुई पुतली एक फ्लैट संपर्क लेंस के साथ आंख fundus और उप रेटिना अंतरिक्ष के एक दृश्य की सुविधा है जबकि शल्य प्रक्रिया किया जाता है ।

1 मिमी नािो3 समाधान के ५० µ एल के इंजेक्शन के बाद, एक bleb रेटिना अंतरिक्ष में बनाया गया है कि संकल्प और उत्तरोत्तर बाहरी रेटिना पतित, के रूप में एसडी अक्टूबर छवि में दिखाया गया है चित्र 3 ए में इंजेक्शन के बाद तीन महीने. एसडी-OCT और hypo-बाफ क्षेत्रों में बाहरी neuroretinal परतों के thinning की सराहना करते हैं, इसी प्रकार पुनः एक GA-phenotype की तरह बनाने RPE नुकसान के लिए इसी । नुकसान के क्षेत्र की पहचान पर, एक ५० µ एल मात्रा में ५०,००० hESC-RPE फिर से प्रत्यारोपण के लिए इंजेक्शन है, एक दूसरे bleb है कि के रूप में का निराकरण बनाने के रूप में बाफ और बहु रंग में दिखाया गया है (MC) चित्र में चित्र बी. एक केंद्र के साथ हाइपर-बाफ क्षेत्रों उदारवादी हल्के पहचान को नुकसान के क्षेत्र की सीमा रेखा पर हाइपर-बाफ में वृद्धि हुई, मूल RPE के पुराने तनाव का संकेत एसडी में दिखाया-OCT एक साथ MC छवि में pigmented क्षेत्रों के अभाव के साथ स्कैन । bleb के ५० µ l के इंजेक्शन के लिए इसी hESC-RPE (५०,००० कोशिकाओं) गैर-इलाज में pigmented कोशिकाओं के पैच दिखा आंखों में (MC) छवि और अच्छी तरह से संरक्षित रेटिना संरचनाओं एसडी-OCT स्कैन में तुलना के लिए दिखाया गया है (चित्र 3सी) ।

सामूहिक रूप से, इस प्रक्रिया और पद्धति GA के लिए एक प्रासंगिक मॉडल में hESC-RPE के उप रेटिना निलंबन प्रत्यारोपण के एकीकरण के अध्ययन की अनुमति देते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: इंजेक्शन सेट अप. (A) उप-रेटिना इंजेक्शन के लिए सर्जिकल सेट-अप चित्रण चित्र । पशु शल्य माइक्रोस्कोप (बाएँ) के नीचे रखा गया है और सर्जन बाएँ हाथ में बाएँ trocar के माध्यम से डाला endoillumination जांच रखती है, और intravitreal शल्य चिकित्सा साधन (उदा. रेटिना इंजेक्शन प्रवेशनी) के माध्यम से डाला बाएं trocar दाहिने हाथ (मध्य) में । एक फ्लैट संपर्क कॉर्निया पर रखा लेंस शल्य प्रक्रिया (सही) के दौरान fundus के एक बढ़ाया देखने की अनुमति देता है । () जगह में ढक्कन रिट्रेक्टर के साथ albino खरगोश आंख के करीब योजनाबद्ध दृश्य और trocars से निप्पल limbus से 1-2 mm गहरी और एक 30-45 डिग्री समानांतर कोण पर डाला, trocars कि एक वैकल्पिक की शुरूआत की सुविधा के साथ एक साथ अर्क प्रवेशनी, एक प्रकाश, और इंजेक्शन के लिए सुई । एक फ्लैट संपर्क पुतली के शीर्ष पर स्थित लेंस शल्य प्रक्रिया के दौरान आंख fundus का एक बेहतर दृष्टिकोण प्राप्त करने में मदद मिलेगी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: vivo इमेजिंग में सामान्य albino खरगोश रेटिना. vivo में बाफ, IR-cSLO, और एक सामांय albino खरगोश रेटिना का प्रतिनिधित्व करने वाले SD-OCT छवियां । अलग रेटिना परतों के इसी लेबलिंग के साथ एसडी oct के एक झटका एसडी अक्टूबर छवि में देखा जाता है: GCL (नाड़ीग्रंथि सेल लेयर), आईपीएल (इनर plexiform लेयर), आईएनएल (इनर न्यूक्लियर लेयर), OPL (आउटर plexiform लेयर), केव (बाहरी न्यूक्लियर लेयर), OLM (आउटर झिल्ली सीमित), ईज़ी (ellipsoid जोन), ओएस (बाहरी क्षेत्रों), RPE (रेटिना वर्णक उपकला), और बीएम (Bruch की झिल्ली). स्केल बार्स = 1 mm (बाफ और IR-cSLO images), २०० µm (SD-OCT images) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: बड़ी आंखों वाले खरगोश मॉडल में उपरेटिना निलंबन इंजेक्शन. (एक) बाफ, एम सी, और एसडी-अक्टूबर 1 मिमी नािो के रेटिना इंजेक्शन की छवियों को नुकसान प्रेरण के बाद3 3 महीने । hypo-हाइपर-बाफ क्षेत्रों से घिरा bleb और एसडी-OCT में पतित neuroretina के लिए इसी पर ध्यान दें । () बाफ, एम सी, और एसडी-अक्टूबर 1 मिमी के साथ इलाज आंखों की छवियों-1 mM नािो3 ५०,००० के रेटिना प्रत्यारोपण के बाद सप्ताह के लिए hESC-निलंबन में RPE और प्रत्यारोपण के बाद 3 महीने का विश्लेषण किया । नोट अति-बाफ क्षेत्रों में बाफ छवि, एम सी में एकीकृत pigmented कोशिकाओं के अभाव और एट्रोफिक neuroretina में एसडी-oct. (C) mc और sd-oct के लिए संगत छवियों गैर-इलाज भोली आंखें 3 महीने के रेटिना प्रत्यारोपण के बाद hESC-RPE में सस्पेंशन. MC छवि पर pigmented क्षेत्रों और एसडी-oct. sd-oct स्कैन विमानों पर संरक्षित neuroretinal संरचना नोट (हरे तीर) चिह्नित कर रहे हैं । सफेद ऐरोहेड एन चेहरे और एसडी अक्टूबर छवियों में blebs की सीमा निशान । स्केल बार्स = 1 mm (बाफ और MC images), २०० µm (SD-OCT images) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल में, vivo में hESC-RPE एकीकरण का मूल्यांकन करने के लिए एक बड़ी आंखों के मॉडल GA और इसके नैदानिक उपयोग की पीढ़ी का वर्णन किया गया है ।

7क्लिनिक में GA और संबंधित रोगों के लिए अपक्षयी उपचारों के अनुवाद के लिए, यह महत्वपूर्ण है विकसित करने और तरीकों कि ईमानदारी से प्रत्यारोपण और इमेजिंग के लिए नैदानिक तरीकों पर कब्जा का अनुकूलन । खरगोश इस पहलू में आकर्षक है: यह एक अपेक्षाकृत बड़ी आंख है कि परमिट intraocular सर्जरी और मानक इमेजिंग का उपयोग किया है, और सस्ते और आसानी से अंय बड़े आंखों जानवरों की तुलना में स्थित है ।

हम उप-रेटिना blebs के निर्माण के लिए मानक transvitreal 25-गेज पार्स प्लाना vitrectomy तकनीक के उपयोग का वर्णन या तो उप-रेटिना क्षति को प्रेरित करने के लिए या hESC-RPE प्रत्यारोपण करने के लिए. शुरू में, हम एक 3-पोर्ट सेट अप का उपयोग किया, के रूप में चित्र 1bमें सचित्र, अर्क बंदरगाह (trocar) का उपयोग करने के इरादे से, मामले में एक vitrectomy प्रक्रिया के दौरान किया गया था । हालांकि, के बाद से हम एक vitrectomy उप रेटिना इंजेक्शन लागू करने के लिए आवश्यक होने के लिए नहीं मिला है, अर्क बंदरगाह छोड़ दिया गया है. फिर भी, तीसरे बंदरगाह विकल्प रहना चाहिए अगर प्रक्रिया आगे और अनुकूलित है एक vitrectomy किया जाता है ।

बड़ी आंखों खरगोश पिछले सदियों8से अधिक शरीर रचना विज्ञान और फिजियोलॉजी पर संचित डेटा के साथ एक अच्छी तरह से स्थापित नेत्र मॉडल है । इसके अलावा, खरगोश को संभाल और नस्ल, आर्थिक रूप से आकर्षक (जैसे, खरीद, आवास, और रखते हुए) आसान है, और आसानी से अंय बड़े स्तनधारियों मॉडल आंखों की तुलना में उपलब्ध हैं । एक बड़ी आंखों का एक प्रमुख लाभ-मॉडल है कि यह उच्च संकल्प नैदानिक इमेजिंग तकनीक है, जो बारी में समय के साथ उपरेटिना अंतरिक्ष में प्रत्यारोपित hESC-RPE कोशिकाओं की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देने के उपयोग में सक्षम बनाता है । हालांकि, lagomorphs के बावजूद phylogenetically जा रहा है कुतर से मनुष्यों के करीब है, यह कहा जाना चाहिए कि वे एक merangiotic रेटिना और एक दृश्य लकीर के अधिकारी, एक holangiotic रेटिना की तुलना में और एक fovea रहनुमाओं में मौजूद9। Merangiotic रेटिना का मतलब है कि भीतरी रेटिना के रक्त की आपूर्ति के अधिकांश choriocapillaris, एक अंतर है कि एक के बाद से यह घाव और नकसीर का खतरा बढ़ सकता है पर विचार करने की जरूरत से व्युत्पंन है । एक प्रयोगात्मक लाभ यह है कि यह पहले शारीरिक समाधान के बाद के उपरेटिना blebs GA के पहले चरण मॉडलिंग के लिए अनुमति देता है, के रूप में यह पूर्व1,3का प्रदर्शन किया गया है । इन अध्ययनों से सुझाव दिया कि एक उपरेटिना bleb merangiotic वातावरण में लौकिक रेटिना हाइपोक्सिया कारण photoreceptor मौत का कारण पर्याप्त हो सकता है; हालांकि, इस संदर्भ में, RPE हानि सबसे अधिक संभावना एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक ५० µ l bleb मात्रा, एक यादृच्छिक घटना है कि बारी potentiates न्यूरो रेटिना शोष का उपयोग करके प्रेरित उप रेटिना प्रवाह द्वारा उत्पन्न किया जा करने के लिए दिखाया गया है. इसलिए, bleb मात्रा रेटिना खिंचाव की वजह से नुकसान पर सीधा प्रभाव हो सकता है, जिसका अर्थ है कि बड़ी मात्रा में इस्तेमाल किया (जैसे, १०० µ एल, अन्य अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है के रूप में10), और अधिक हानिकारक यह बन सकता है.

इंजेक्शन कोशिकाओं के एकीकरण सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम अवलेह में कोशिकाओं के भाटा से बचने के लिए है, जबकि इंजेक्शन, और रेटिना अंतरिक्ष में सुई की स्थिति. यदि बहुत गहरी स्थिति में, बाहरी रेटिना बैरियर/रंजित प्रवेश किया जाएगा और प्रतिरक्षा कोशिकाओं उप रेटिना अंतरिक्ष पर आक्रमण कर सकते हैं, प्रतिरक्षादमन के उपयोग के बावजूद प्रतिरक्षा अस्वीकृति के कारण. प्रत्यारोपण सफलता के लिए एक अंय महत्वपूर्ण पहलू अवलेह की स्थिति है । वर्तमान मॉडल में, vitrectomy क्रम में भाटा और शल्य चिकित्सा आघात को कम करने के लिए नहीं किया जाता है । हालांकि, यह देखा गया है कि कुछ आंखों में यह रेटिना पर एक उचित टिप स्थिति पाने के लिए मुश्किल है के रूप में टिप पूर्व में अटक-रेटिना अवलेह छोटे या यहां तक कि कोई blebs के गठन के लिए अग्रणी चरण हो जाता है । हालांकि यह एक अपेक्षाकृत दुर्लभ घटना है, यह संकेत करता है कि खरगोश अवलेह की परिवर्तनशीलता के लिए शल्य चिकित्सा और शल्य चिकित्सा विश्लेषण के दौरान ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

इसके अतिरिक्त, triamcinolon के उचित इंजेक्शन के लिए सफेद स्टेरॉयड क्रिस्टल द्वारा fundus अस्पष्ट से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो तब सर्जरी में बाधा होगी, और बाद सर्जिकल fundus दृश्य एसडी द्वारा-OCT. इस समस्या को कम करने के लिए, triamcinolon के इंजेक्शन कम लौकिक चक्र में किया जाना चाहिए । इसी तरह, trocars को सिलिअरी शरीर से अवलेह नकसीर से बचने के लिए limbus से 1-2 mm रखा जाना चाहिए और सुई के साथ पैस बड़े खरगोश के लेंस को छू लेना चाहिए । एक लेंस स्पर्श एक मोतियाबिंद है कि बारी में होगा पश्चात इमेजिंग के दौरान उप रेटिना अंतरिक्ष के उचित दृश्य में बाधा पैदा करेगा ।

स्टेरॉयड, triamcinolone सहित, खुद को समय के साथ मोतियाबिंद हो सकता है. हम इस निंनलिखित triamcinolone प्रशासन के लिए 8 महीने के लिए नहीं मनाया है । हालांकि, यह संभावना है कि स्टेरॉयड प्रेरित मोतियाबिंद समय की व्यापक अवधि में triamcinolone प्रशासन अगर विकसित होगा.

वर्णित विधियों दोनों शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण के लिए और सेल के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एकीकरण और समारोह के रूप में यहां और हमारे पिछले प्रकाशनों में वर्णित है । विधि भी उप रेटिना वायरल वैक्टर के प्रशासन के लिए उच्च प्रासंगिकता है अब नैदानिक परीक्षण में कई वंशानुगत रेटिना dystrophies के लिए । भविष्य के संशोधनों में अधिक जटिल सामग्री की ट्रांसप्लांटेशन शामिल हो सकती है, जैसे शीट वाहक और जैल । के रूप में नए नैदानिक इमेजिंग तरीके उभरने, इन आसानी से खरगोश आंख के लिए अनुकूलित हो जाएगा, संशोधनों के बिना संभवतः ।

अंत में, बड़े खरगोश मॉडल आंखों के लिए एक प्रासंगिक पूर्व नैदानिक मॉडल है कि मैं के लिए कुतर मॉडलों की तुलना में कई फायदे है प्रदर्शन किया है) recapitulating GA के विभिंन चरणों, द्वितीय) रोगी-प्रासंगिक शल्य चिकित्सा और इमेजिंग तरीकों को लागू करने, और iii ) दाता कोशिकाओं के एकीकरण का मूल्यांकन करने के लिए GA और संबंधित विकारों के लिए सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।

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Disclosures

किसी भी लेखक के हितों या परस्पर विरोधी हितों की होड़ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन कारोलिंस्का संस्थान, क्राउन राजकुमारी Margareta के नेत्रहीनों के लिए फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, नेत्र अनुसंधान के लिए एडविन जॉर्डन फाउंडेशन, स्वीडिश नेत्र फाउंडेशन, राजा गुस्ताव वी फाउंडेशन, ARMEC Lindeberg फाउंडेशन, और Cronqvist फाउंडेशन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

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References

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भौगोलिक शोष की एक बड़ी आंखों मॉडल में मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न-रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के रेटिना प्रत्यारोपण
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Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

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