Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Subretinal Transplantation av mänskliga embryonala stamceller härstammar-retinal Pigment epitelial celler till en stor-eyed modell av geografisk atrofi

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Retinal pigment epitelial celler skulle kunna tjäna som en cell-substitutionsterapi för den avancerade formen av torra åldersrelaterad makuladegeneration. Det här protokollet beskriver generationen av en stor-eyed modell av geografisk atrofi och subretinal transplantation av mänskliga embryonala stamceller-derived retinal pigment epitelceller i denna modell av sjukdom.

Abstract

Geografisk atrofi (GA), sent skede av torra åldersrelaterad makuladegeneration kännetecknas av förlust av retinal pigment epitel (RPE) lagret, vilket leder till efterföljande degeneration av vitala retinal strukturer (t.ex., fotoreceptorer) orsakar svår synnedsättning. Likaså ses RPE-förlust och minskning av synskärpan i långsiktiga följer upp av patienter med avancerad våt åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) som fick intravitreala anti vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Därför dels, är det grundläggande att effektivt härleda RPE-celler från en obegränsad källa som kan fungera som substitutionsterapi. Däremot, det är viktigt att bedöma om beteende och integrering av de härledda cellerna i en modell av den sjukdom som innebär kirurgisk och avbildningsmetoder som nära som möjligt till dem som tillämpas i människor. Här, vi ger ett detaljerat protokoll baserat på våra tidigare publikationer som beskriver generationen av en preklinisk modell av GA använda albino kanin ögat, för utvärdering av den mänskliga embryostamceller härrör retinal pigment epitelceller (hESC-RPE) i en kliniskt relevanta inställningen. Differentierade hESC-RPE transplanteras in i naiva ögon eller ögon med NaIO3-inducerad GA-liknande retinal degeneration med 25 G transvitreal pars plana teknik. Utvärdering av degenererade och transplanterade områden utförs av multimodal högupplösta noninvasiv realtid avbildning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det här protokollet beskriver generationen av en stor-eyed preklinisk modell av geografisk atrofi (GA) som möjliggör utvärdering av integration av transplanterade hESC-RPE i subretinalområdet. De metoder som beskrivs här har använts i 3 senaste publikationer som visar tillverkning av en berikad, ren och funktionell befolkning av RPE-celler från hESC1, samt skapandet av yttre skada på näthinnan och en GA-liknande fenotyp induceras av subretinal injektion av fysiologiska saltlösningar (dvs, BSS och PBS) eller NaIO3 i rabbit eye2,3. Vi visade vidare att sub retinal suspension transplantationer av hESC-RPE bildar omfattande funktionella enskiktslager med ljusmätare rädda kapacitet2.

Flera fördelar åtföljer användningen av kanin ögat för generering av en GA modell av sjukdom. För det första storleken av kanin ögat, som är 70% av en vuxen mänskliga ögat, kan kliniskt transplantation med hjälp av en cell densiteten som är mycket lägre än rutinmässigt används i små gnagare ögon (1 000 celler/µL vs. 50.000 celler/µL)4 , 5. för det andra, kirurgi hos gnagare är oftast transskleral genom åderhinnan, som äventyrar den retinal barriären och potentiellt utlöser en inflammatorisk reaktion och ett möjligt förkastande6. Både faktorer kan tillsammans leda till multilayering och klumpar av transplanterade celler och en allmänt dåliga integration av de transplanterade cellerna i en störd infödda retinala vävnaden. Stor-eyed kanin modellen tillåter dock utföra en kirurgisk teknik med instrumentering identisk klinisk miljö. För det tredje, en stor-eyed modell också tillåter högupplösta i vivo imaging och övervakning av de transplanterade cellerna och överliggande näthinnan genom tid1,2,3. Således beskriver vi en kliniskt relevanta och kostnadseffektiva preklinisk modell som bör vara ett attraktivt alternativ till gnagare för alla med intresse för forskning av normala och sjuka näthinnan och sub retinal utrymmet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Följande protokoll följer riktlinjer djurvård Karolinska Instituet. Alla djurförsök med nya Zeeland albino kaniner (Tabell för material) har godkänts av utskottet för regionala djurförsöksetiska (Stockholms Norra Djurförsöksetiska prokurator) (tillåta: dnr 56/15). Användning av hESC (dnr 2011/745-31/3) och överföring och manipulation av hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) är också enligt svensk lagstiftning och Karolinska Institutet förordningar och har godkänts av den regionala mänskliga etiska kommitté ( Mitten Etikprövningsnämnden i Stockholm).

1. subretinal injektion av natrium jodat (NaIO3) i en stor-eyed djurmodell

  1. Söva djur genom intramuskulär injektion i låret med en blandning av 35 mg/kg ketamin och 5 mg/kg xylazin i saltlösning med en 30 G spruta, och vidga eleverna med aktuell ögondroppar med en blandning av 0,75% cyklopentolat och 2,5% fenylefrin. Korrekt anesthetization bekräftas om djuret inte reagerar på en hård nypa dess bakre benet.
  2. Placera kaninen i kirurgiska Mikroskop med huvudet inför kirurgen (figur 1A). Använda ett lock upprullningsdon för att avlägsna ögonlock och nictitans membranet med en steril duk att minimera risken för kontaminering. Användning balanserad saltlösning (BSS) för att förhindra torrhet medan under narkos i båda ögonen.
  3. För mikrokirurgi, Använd en 2-port (eller valfri 3-port) 25 G transvitreal pars plana teknik med icke-ventil Trokar för införande av mikrokirurgiska instrument (figur 1B). Multifunktions vitrektomi maskinen har portar för att ansluta en infusion Kanyl, endoillumination, vitrector och endolaser. För subretinal injektioner är endast endoillumination obligatoriskt, vilket gör en 2-port set-up tillräckligt. Infoga endoillumation genom övre vänstra troakaren och Använd övre högra troakaren för subretinal injektion kanylen.
    1. För en 3-port set-up, använda lägre temporal troakaren för BSS infusion kanylen. Om valfria instrument (till exempel en vitrector) är används, infoga dem genom den övre högra troakaren.
    2. Sätt in de övre 2 Trokar 1-2 mm från limbus med kloförsedda pincett för att greppa och förskjuter bindhinnan överliggande insticksstället.
    3. Kontrollera Trokar är infogade transsclerally i 30-45° limbus parallell vinkel, och vidare till mitten av spetsen på troakaren. Sedan vända troakaren 90° och vidare in i ögat, som syftar till den bakre stolpen i ögat. Detta förfarande kommer att undvika postoperativ läckage från sclerotomies, och också minska risken för endoftalmit (dvs. bakteriell infektion i ögat). Se även figur 2B för troakar positioner.
    4. Sätta en engångsbruk platt kontaktlins på hornhinnan att visualisera näthinnan, med syntetiska tårar som kontakt gel mellan ögat och kontaktlins (figur 1A).
    5. Dra 500 µL av NaIO3 i en 1 mL spruta ansluten till ett förlängningsrör (drivs av assistenten) och en 38 G polytip kanyl (drivs av kirurgen).
    6. Infoga endoillumination sonden genom övre vänstra troakaren och injektion kanylen genom övre högra troakaren och avancera kanylen genom glaskroppen rymden mot näthinnan, sikte för området nedanför synnervspapillen.
    7. Låt spetsen på kanylen långsamt röra näthinnan tills en fokal vitare är synliga. Själva injektionen kommer att penetrera näthinnan, vilket möjliggör subretinal leverans. Låt inte kanylen som penetrerar näthinnan, eftersom detta kan orsaka blödning.
    8. Injicera 50 µL NaIO3 subretinally under en 5 s. Eftersom det finns en naturlig klyvning plan mellan näthinnan och underliggande åderhinnan, utgöra en klart synlig halvtransparent blåsa gradvis under injektionen.
    9. Under injektion, långsamt dra tillbaka nålen, men se till att spetsen upprätthålls inom den blåsa att minimera reflux.
    10. Efter avlägsnande av endoillumation och injektion kanylen, ta bort de Trokar använder kloförsedda pincett och applicera lätt tryck för 30 s till de självtätande sutur-mindre sclerotomies med spetsen eller den trubbiga änden av tången.
  4. Post-surgically ge 10 mL koksaltlösning subkutant för att förhindra uttorkning. Ge inte postoperativa topikala steroider eller antibiotika. För smärtstillande medel ge 0,5 mL av buprenorfin 0,3 mg/ml subkutant efter kirurgi, samt dagen efter operation.
  5. Efter användning, tvätta alla instrument genom att doppa dem för ett par sekunder först i 70% etanol, dels i 45% etanol, och slutligen i destillerat vatten. Torka dem ordentligt med en pappershandduk.
  6. Delta djur tills de återfår tillräcklig medvetandet och placera dem alla enkel räkenskapsuppfattningar. Om det behövs (t.ex., för immunohistokemi ändamål), avliva djur genom intravenös injektion av 100 mg/kg pentobarbital (se Tabell för material).
  7. Vänta 7 dagar för att fortsätta med transplantation av hESC-RPE-celler.

2. subretinal Transplantation av hESC-RPE-celler hos behandlade djur

  1. Administrera 2 mg (100 µL) av intravitrealt triamcinolon på sövda djur använder en 30 g injektionsnål in 1-2 mm från limbus i den nedre temporala kvadranten 1 vecka före transplantation av hESC-RPE och åter administrera det var 3 månader. Se till att rikta fjärrkontrollen mot den bakre stolpen av ögat för att undvika en objektiv touch.
  2. Kultur en hESC-RPE enskiktslager som tidigare beskrivits1.
  3. Ta bort cell differentiering media (se Tabell för material) av en 24-väl konfluenta hESC-RPE enskiktslager och tvätta vart bra med 500 µL av PBS utan Ca2 + och Mg2 +. Upprepa åtgärden en gång, för totalt 2 tvättar.
  4. Kassera supernatanten, tillsätt 500 µL av trypsin per brunn och Inkubera under 12 minuter vid 37 ° C.
  5. Luta plattan och ta försiktigt bort trypsin (celler bör sitta kvar på plattan). Samla in celler i 800 µL av färska 37 ° C förvärmd differentiering media genom skonsam pipettering, eller ens skrapa vid behov för att erhålla en enda cellsuspension.
    Obs: Använd en sil med 40 µm i cellen om cellen klumpar observeras.
  6. Räkna celler i hemocytometer avdelning med 0,2% Trypan blå, enligt tillverkarens instruktioner.
  7. Tillsätt 5 mL av differentiering media och centrifugera celler vid rumstemperatur, 300 x g i 5 min.
  8. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i fräscha filter-steriliseras PBS (passerade genom ett filter med 25 mm i sprutan) till en slutlig koncentration på 1 000 celler/µL.
  9. Alikvot tidigare cellsuspensionen i 600 µL portioner och hålla på is fram till och under operation.
  10. Söva djur genom intramuskulär injektion i låret med en blandning av 35 mg/kg ketamin och 5 mg/kg xylazin i saltlösning med en 30 G spruta. Vidga eleverna med aktuell ögondroppar använder ablandas av 0,75% cyklopentolat och 2,5% fenylefrin. Korrekt anesthetization bekräftas om djuret inte reagerar på en hård nypa i dess bakre benet.
  11. Placera kaninen med huvudet inför kirurgen. Använda ett lock upprullningsdon för att avlägsna ögonlock och nictitans membranet med en steril duk att minimera risken för kontaminering. Använda BSS för att förhindra torrhet medan under narkos i båda ögonen.
  12. För mikrokirurgi, Använd en 2-port (eller valfri 3-port) 25 G transvitreal pars plana teknik med Trokar placeras i samma positioner som beskrivs i steg 1.3 och figur 2. Om de tidigare sclerotomies är synliga, utföra troakar införande strax intill, men inte genom dessa, för att minimera risken för postoperative läckage.
    1. Sätta en engångsbruk platt kontaktlins på hornhinnan att visualisera näthinnan, med syntetiska tårar som kontakt gel mellan ögat och kontaktlins (figur 1A).
    2. Efter ordentlig tips positionering (se steg 1.3.5 och 1.3.6), injicera 50 µL av en försiktigt-blandade hESC-RPE suspension (50.000 celler) subretinally. Sikta på mitten av området NaIO3 förbehandlats kännetecknas av en karakteristisk ”metalliska” endo-belysning reflex. Sensorineural näthinnan bör separata enkelt skapa en klart synlig blåsa. Flush nålen med steril H2O i mellan kaniner/efter Använd för att undvika nål igensättning på grund av cell klumpar. Ändra nålen när igensättning är märkt.
    3. Under injektionen långsamt dra tillbaka nålen men se till att spetsen upprätthålls inom den blåsa att minimera reflux.
    4. Efter avlägsnande av endoillumation och injektion kanylen, ta bort de Trokar använder kloförsedda pincett och applicera lätt tryck för 30 s till de självtätande sutur-mindre sclerotomies med spetsen eller den trubbiga änden av tången.
  13. Post-surgically ge 10 mL koksaltlösning subkutant för att förhindra uttorkning. Ge inte postoperativa topikala steroider eller antibiotika. För smärtstillande medel ge 0,5 mL av buprenorfin 0,3 mg/ml subkutant efter kirurgi, samt dagen efter operation.
  14. Efter användning, tvätta alla instrument genom att doppa dem för ett par sekunder, för det första i 70% etanol, dels i 45% etanol, och slutligen i destillerat vatten. Torka dem ordentligt med en pappershandduk.
  15. Delta djur tills de återfår tillräcklig medvetandet och placera dem alla enkel räkenskapsuppfattningar. Om det behövs (t.ex. för immunohistokemi ändamål), avliva djur genom intravenös injektion av 100 mg/kg pentobarbital.

3. in Vivo Retinal och Subretinal Imaging

  1. Använda en spektrala domänen optisk koherens tomografi (SD-okt) enhet med den medföljande programvaran (se tabell för material) för att erhålla tvärsnittsdata b-skanningar av behandlade djur, enligt tillverkarens instruktioner. För att undvika bild oskärpa, se till att hålla hornhinnan fuktig genom att spola med aktuell koksaltlösning varje 30-60 s.
    1. Placera den sövda och elev-vidgade djur (se steg 1,1 och 2.10) i en justerbar fäste till få en fri väg från instrumentet ljuskällan på kanin näthinnan.
    2. Få minst 3 OCT skanningar med samtidiga IR-confocal scanning laser Oftalmoskopi (IR-cSLO) reflektans referensbilder som representerar den övre, central och nedre delen av det injicerade området.
    3. Få sv-face fundus bilder med cSLO blå, grön, infraröd och multicolor laser reflektans (dvs, flera samtidiga laser färger), respektive.
    4. Ta blå ljus autofluorescens (BAF) bilder med blå-ljus laser funktionen enhetens SD-okt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Representant i vivo bilder av BAF, IR-cSLO och SD-okt av en normal albino kanin näthinnan visas i figur 2. Notera de olika retinala lagren med sin distinkta nivåer av ljusreflektion som fångas av SD-okt instrumentet.

I figurerna 1A och figur 1B, inställningen för att skapa sub retinal blebs illustreras: upprullare och locket är placerad, att utsätta ögonlocken för att tillåta införandet av 3 Trokar (figur 1B) 1-2 mm långt från limbus, för att undvika en lins touch, och i 30-45 ˙ limbus parallell vinkel. Trokar kommer att möjliggöra införandet av ett valfritt infusion Kanyl, förutom ett ljus och injektionsnålen genom sklera. En vidgad elev tillsammans med en platt kontaktlins kommer att underlätta en vy av ögat fundus och sub retinal utrymmet medan det kirurgiska ingreppet utförs.

Efter injektionen av 50 µL av 1 mM NaIO3 lösning skapas en blåsa i subretinalområdet som kommer att lösa och successivt degenerera yttre näthinnan, som visas i SD-okt bilden i figur 3A tre månader efter injektionen. Uppskatta gallring av de yttersta neuroretinal lager i SD-ULT och hypo-BAF områden, motsvarande RPE förlust vilket åter skapar en GA-liknande fenotyp. Vid identifiering av området av skador är 50.000 hESC-RPE i en 50 µL volym åter injicerade för transplantation, att skapa en andra blåsa som löser som visas i BAF och flerfärgade (MC) bilder i figur 3B. Känner igen mild till måttlig hyper-BAF områden med en fokal ökad hyper-BAF inferiorly på gränsen till området av skador, tecken på kronisk stress av infödda RPE visas i SD-okt skanningar tillsammans med avsaknad av pigmenterade områden i bilden MC. Den blåsa som motsvarar injektion av 50 µL av hESC-RPE (50.000 celler) i icke-förbehandlats ögon visar fläckar av pigmenterade celler (MC) avbild och välbevarad retinal strukturer i SD-okt scan visas för jämförelse (figur 3 c).

Kollektivt, tillåter detta förfarande och metodik studier av integration av subretinal suspension transplantationer av hESC-RPE i en relevant modell för GA.

Figure 1
Figur 1: injektion ställa upp (A) bilder som skildrar den kirurgiska set-up för sub retinal injektioner. Djuret har placerats i kirurgiska Mikroskop (vänster) och kirurgen innehar endoillumination sonden in genom vänstra troakaren i vänster hand och intravitreal kirurgiska instrumentet (t.ex. subretinal injektion kanyl) införas genom vänstra troakaren i höger hand (mitten). En platt kontaktlins placeras på hornhinnan tillåter en förstorad bild av fundus under det kirurgiska ingreppet (höger). (B) nära Schematisk vy av albino kanin ögat med lock upprullningsdonet och bröstvårtan från de Trokar in 1-2 mm djup från limbus och i 30-45 ° parallell vinkel, tillsammans med de Trokar som underlättar införandet av en valfri infusion Kanyl, en ljus och nålen för injektion. En platt kontaktlins som ligger ovanpå eleven kommer för att få en bättre bild av öga fundus under det kirurgiska ingreppet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Normal albino kanin näthinnan i vivo imaging. In vivo BAF, IR-cSLO och SD-okt bilder som representerar en normal albino kanin näthinnan. Ett slag upp SD-ULT motsvarande märkning av de olika retinala lagrarna syns i bildens SD-okt: GCL (ganglion celllagrar), IPL (inre plexiform lagret), INL (inre nukleära lagret), OPL (yttre plexiform lagret), ONL (yttre nukleära lagret), OLM (yttre att begränsa membranet), EZ (ellipsoid zon), OS (yttre segment), RPE (pigmentepitelet) och BM (Bruchs membran). Skala barer = 1 mm (BAF och IR-cSLO bilder), 200 µm (SD-okt bilder). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Subretinal suspension injektioner i stor-eyed kanin modellen. (A) BAF, MC och SD-okt bilder av subretinal injektion av 1 mM NaIO3 3 månader efter skada induktion. Observera hypo-BAF omgiven av hyper-BAF områden motsvarande blåsa och den degenererade neuroretina i SD-okt (B), BAF, MC, och SD-okt bilder av ögon förbehandlats med 1 mM NaIO3 under 1 vecka följt av subretinal transplantation av 50.000 hESC-RPE i suspension och analyserade tre månader efter transplantation. Observera att hyper-BAF områden i bilden BAF, avsaknad av integrerade pigmenterade celler i MC och den atrofisk neuroretina SD-okt (C) MC och SD-okt bilderna motsvarar icke-förbehandlats naiva ögon 3 månader efter subretinal transplantation av hESC-RPE i suspension. De pigmenterade områdena på MC bilden och bevarade neuroretinal struktur på SD-OCT. SD-ULT Skanna flygplan är markerat (grön pil). Vita pilar markerar gränsen mellan blebs i sv-ansikte och SD-okt bilder. Skala barer = 1 mm (BAF och MC bilder), 200 µm (SD-okt bilder). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I detta protokoll beskrivs generationen av en stor-eyed modell GA och prekliniska användning för att utvärdera hESC-RPE integration i vivo .

För översättning av regenerativa behandlingar för GA och relaterade sjukdomar till den klinik7är det viktigt att utveckla och optimera metoder som troget fånga kliniska metoder för transplantation och imaging. Kaninen är i denna attraktiva aspekt: den har ett relativt stort öga som möjliggör intraokulär kirurgi och användning av standard imaging, och är billigt och enkelt inhysta jämfört med andra stora-eyed djur.

Vi beskriver användning av standard transvitreal 25 gauge pars plana vitrektomi teknik för skapandet av sub retinal blebs antingen att inducera sub retinal skador eller att transplantera hESC-RPE. Inledningsvis använde vi en 3-port set-up, som illustreras i figur 1B, med avsikt att använda hamnen infusion (troakar), om en vitrektomi utfördes under förfarandet. Men eftersom vi inte hittat en vitrektomi vara nödvändiga för att tillämpa sub retinal injektioner, har infusion hamnen utelämnats. Portalternativet tredje bör dock förbli om förfarandet är anpassas ytterligare och en vitrektomi utförs.

Stor-eyed kaninen är en väletablerad okulär modell med ackumulerade uppgifter om anatomi och fysiologi under senaste århundradena8. Dessutom kaniner är lätt att hantera och rasen, ekonomiskt attraktivt (t.ex., inköp, bostäder, och hålla), och lättillgängliga jämfört med andra stora-eyed däggdjur modeller. En stor fördel med en stor eyed-modell är att det möjliggör användning av högupplösta kliniska avbildningstekniker, som i sin tur möjliggör spårning av transplanterade hESC-RPE-celler i subretinalområdet över tid. Men trots hardjur är fylogenetiskt närmare släktet människor än gnagare, ska det konstateras att de besitter en merangiotic näthinnan och en visuell strimma, jämfört med en holangiotic retina och en fovea i primater9. Merangiotic näthinnan innebär att de flesta av blod leverans av inre näthinnan härleds från choriocapillaris, en skillnad som man måste överväga eftersom det kan öka risken för lesionen och blödning. En experimentell fördel är att det möjliggör modellering tidigare stadier av GA efter subretinal blebs fysiologiska lösningar ensam, som den har tidigare påvisat1,3. Dessa studier föreslog att en subretinal blåsa orsakar temporala retinala hypoxi i merangiotic miljö kan vara tillräckligt för att orsaka ljusmätare död; i detta sammanhang har dock RPE förlust visat troligen genereras av sub retinal flödet induceras genom att använda en 1 mL spruta och en 50 µL blåsa volym, ett slumpmässigt fenomen som i sin tur förstärker neuro-retinal atrofi. Därför kan blåsa volymen ha en direkt effekt på retinal stretch skador, vilket innebär att ju större volymen används (t.ex., 100 µL, som har använts i andra studier10), desto mer skadar det kan bli.

Ett kritiskt steg att säkerställa integrering av de injicerade cellerna är att undvika återflöde av celler i glaskroppen medan injicering och positionering av nålen i subretinalområdet. Om placerad alltför djupt, yttre retinal barriär/åderhinnan kommer att brytas och immunceller kan invadera sub retinal utrymmet, orsakar immun avslag trots användningen av immunsuppression. En annan viktig aspekt för transplantation framgång är tillståndet i glaskroppen. I den nuvarande modellen utförs vitrektomi inte för att minimera reflux och kirurgiskt trauma. Man har dock märkt att det är svårt att få en ordentlig tip position på näthinnan som spetsen fastnar i förväg retinal glaskroppen interphasen leder till bildandet av liten eller ingen blebs i vissa ögon. Även om det är en relativt sällsynt händelse, indikerar det att variabilitet av kaninen glaskroppen behöver beaktas under kirurgi och postoperativ analys.

Dessutom är korrekt injektion av triamcinolon avgörande för att undvika skymmer fundus av vita steroid kristaller, som sedan kommer att hämma kirurgi och postoperativ fundus visualisering av SD-okt. För att minimera detta problem, bör injektion av triamcinolon göras i den nedre temporala kvadranten. Likaså bör Trokar placeras 1-2 mm från limbus att undvika glaskroppshemorragi från ciliarkroppen och röra oproportionellt stora kanin linsen med nålen. En objektiv touch kommer att orsaka grå starr som kommer i sin tur hindrar korrekt visualisering av sub retinal utrymmet under postoperativ imaging.

Steroider, inklusive triamcinolon, kan själva orsaka grå starr över tid. Vi har inte observerat detta triamcinolon administrering under upp till 8 månader. Det är dock sannolikt att steroid-inducerad grå starr utvecklas om administrerar triamcinolon över omfattande tidsperioder.

De beskrivna metoderna kan användas både för kirurgisk träning och för analys av cell-integration och funktion som beskrivs här och i våra tidigare publikationer. Metoden har också hög relevans för administration av sub retinal virala vektorer nu i klinisk prövning för flera ärftliga retinala dystrofier. Framtida ändringar kan inkludera transplantation av mer komplexa material, såsom ark transportörer och biogels. När nya kliniska avbildningsmetoder dyker upp anpassas dessa enkelt till kanin ögat, eventuellt utan ändringar.

In Conclusion, stor-eyed kanin modellen visat sig vara en relevant preklinisk modell som har flera fördelar jämfört med gnagare modeller för (i) går igenom olika stadier av GA, ii) tillämpa patient-relevanta kirurgiska och bildgivande metoder, och iii ) utvärdera integration av givare celler som ska användas som cellen substitutionsterapi för GA och relaterade sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av författarna har konkurrerande intressen eller motstridiga intressen.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av bidrag från Karolinska Institutet, Kronprinsessan Margaretas stiftelse för synskadade, Edwin Jordan grunden för oftalmologisk forskning, Stiftelsen öga, kung Gustav V Foundation, ARMEC Lindeberg stiftelsen och stiftelsen Cronqvist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6, (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (2), 1314-1322 (2017).
  4. Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (8), 5431-5444 (2014).
  5. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, (3), 189-199 (2006).
  6. Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214, (2), 347-361 (2008).
  7. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, (9817), 713-720 (2012).
  8. Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12, (1), 123-138 (1972).
  9. Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (6), 2913-2920 (2012).
  10. Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130, (1), 65-75 (2012).
Subretinal Transplantation av mänskliga embryonala stamceller härstammar-retinal Pigment epitelial celler till en stor-eyed modell av geografisk atrofi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter