Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Een Microcontroller beheerd apparaat voor de generatie van vloeibare extracten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret Aerosol

doi: 10.3791/56709 Published: January 18, 2018

Summary

Hier beschrijven we een programmeerbare laboratorium-apparaat dat kan worden gebruikt voor het maken van extracten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret aërosol. Deze methode biedt een nuttig instrument voor het maken van directe vergelijkingen tussen conventionele sigaretten en elektronische sigaretten, en een toegankelijk toegangspoort tot elektronische sigaret onderzoek.

Abstract

Elektronische sigaretten zijn het meest populaire tabaksproduct onder Midden en hoge scholieren en de meest populaire alternatieve tabaksproduct onder volwassenen. Hoge kwaliteit, reproduceerbare onderzoek naar de gevolgen van gebruik van de elektronische sigaret is essentieel voor het begrip volksgezondheid zorgen opkomende en crafting bewijs op basis van regelgevingsbeleid. Terwijl een groeiend aantal papieren te elektronische sigaretten bespreken, is er weinig samenhang in methoden meerdere groepen en weinig consensus over resultaten. Hier beschrijven we een programmeerbare laboratorium-apparaat dat kan worden gebruikt voor het maken van extracten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret aërosol. Dit protocol gegevens instructies voor de montage en de werking van genoemde apparaat, en het gebruik van het gegenereerde extract in twee voorbeeldtoepassingen aantoont: een in vitro cel levensvatbaarheid assay en gaschromatografie massaspectrometrie. Deze methode biedt een instrument voor het maken van directe vergelijkingen tussen conventionele sigaretten en elektronische sigaretten, en een toegankelijk toegangspoort tot elektronische sigaret onderzoek.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ondanks een geconcentreerde inspanning door gezondheidsorganisaties blijft tabak product gebruik de belangrijkste oorzaak van vermijdbare dood wereldwijd, met de meerderheid van deze sterfgevallen toegeschreven aan sigaret roken1. Sinds het invoeren van de markt in 2003, zijn elektronische sigaretten gegroeid in populariteit onder de gebruikers van een product tabak. Op dit moment, zijn elektronische sigaretten het populairste alternatief voor conventionele sigaretten onder Amerikaanse volwassenen (~ 5%)2 en de meest populaire nicotine leveringssysteem onder Midden (~ 5,3%) en middelbare scholieren (~ 16%)3. Als de huidige trends zich doorzetten, kunnen elektronische sigaretten worden verwacht ter vervanging van conventionele sigaretten voor toekomstige generaties. De gevolgen voor de gezondheid van het gebruik van de elektronische sigaret blijven echter onduidelijk.

Onderzoek naar elektronische sigaretten begon niet serieus totdat de populariteit van de elektronische sigaret is snel toegenomen in 20133,4. Sinds die tijd, hebben een aantal verschillende modellen gewerkt aan de kwestie van hun toxiciteit. Echter, de resultaten van veel studies zijn tegenstrijdig, en hoewel het lijkt dat elektronische sigaretten zijn over het algemeen minder giftig dan conventionele sigaretten, er is geen huidige consensus over de gevolgen voor de gezondheid van elektronische sigaret gebruiken5, 6 , 7. onze vorige onderzoek wijst uit dat elektronische sigaretten aanzienlijk minder giftig voor het vasculaire endotheel dan conventionele sigaretten, ondanks hun vermogen zijn tot DNA-beschadiging en de inductie van oxidatieve stress en cel dood8 . Meer onderzoek is echter noodzakelijk voordat wij definitieve conclusies over de gevolgen voor de gezondheid van het gebruik van de elektronische sigaret kunt tekenen.

Als conventionele sigaretten een belangrijke oorzaak van vermijdbare vaatziekten9 zijn, er is een groeiende interesse in het vasculaire gezondheidsrisico van elektronische sigaret gebruik10,11,12. Ons lab ontwikkeld om te bestuderen van de effecten van elektronische sigaretten op het vasculaire systeem, een microcontroller geëxploiteerd roken/vaping apparaat (Figuur 1)8. Dit apparaat is geschikt voor het genereren van vloeibare extracten van beide conventionele sigaret rook of elektronische sigaret aërosol in waterige of organische oplosmiddelen. Zoals luchtstroom wordt geregeld door de combinatie van een regelbare stroom regelgever en een PBASIC timing programma, kan het apparaat worden gebruikt voor het genereren van extracten volgens een willekeurig aantal door de gebruiker gedefinieerde protocollen. Hier we detail de vergadering en de werking van dit apparaat, alsmede twee mogelijke toepassingen: in vitro cel levensvatbaarheidsbeoordeling en gaschromatografie massaspectrometrie.

Figure 1
Figuur 1: roken/Vaping apparaat. Schema voor de fysieke montage van het roken/vaping-apparaat in zowel de sigaret/sigaret zoals elektronische sigaret (e-cig) configuratie (A) als de tank elektronische sigaret configuratie (B). Component Key: 1) inademing haven; 2) primaire collectie impinger; 3) overloop impinger; 4) Buchner kolf vacuüm val; 5) Maakcontact magneetventiel; 6) BS1 microcontroller; 7) lucht stroom regelaar; 8) 510 threaded elektronische sigaret tank basis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. montage van het apparaat

  1. Veilig een 100 mL Buchner kolf (Figuur 1, #4) een stalen ring staan en maak een vacuüm val door het te vullen met 50 g van calciumchloride om te dienen als een droogmiddel. Zegel van de kolf met een rubberstop via holes, wikkel de stopper kruising met paraffine film en het uitvoeren van een pipet door het gat.
  2. Gebruikt vinyl buizen, sluit de Pipet van de stop uit te breiden tot een t-splitsing slang aansluiting.
  3. Gebruikt vinyl buis, de twee impinger (afbeelding 1, #2 en #3) met elkaar verbinden en sluit de uitgang van de tweede impinger aan op de t-splitsing slang aansluiting.
  4. Gebruikt vinyl buizen, sluit de invoerpoort van de eerste impinger om te dienen als een inademing poort (Figuur 1, #1).
  5. Met behulp van vinyl buis, de zijarm van de kolf Buchner verbinding te maken met de invoerpoort van een luchtstroom regulator (Figuur 1, #7) en de uitlaatopening van de regulator van de luchtstroom naar een vacuümpomp.
  6. Monteren van het circuit volgens het schema in figuur 2A.
  7. Upload de PBASIC programma SVL.bs1 (figuur 2B, ook beschikbaar op https://github.com/ChastainAnderson/SVL) de BS1 microcontroller (Figuur 1, #6) door middel van een seriële adapter en software van de fabrikant.
  8. Plaats de 510 schroefdraad base (Figuur 1 #8) in een ring staan klem.
  9. Gebruikt vinyl buis, de magneetklep (Figuur 1, #5) verbinding te maken met het vrije uiteinde van de t-splitsing slang aansluiting.
    Opmerking: Het apparaat moet worden compleet en gebruiksklaar, check alle gewrichten om ervoor te zorgen dat ze luchtdicht zijn en slangklemmen en vacuüm vet als nodig van toepassing.

Figure 2
Figuur 2: elektrische schema en PBASIC Code. Figuur 2A toont het elektrische schema voor het samenstellen van het elektrisch circuit moet zowel de normaal open magneetventiel activeren en de spoel van de verwarming van de knop geactiveerd elektronische sigaretten (via de 510 threaded elektronische sigaret tank base). De elektrische parameters van de verwarming spoel (m: volmacht; R: weerstand; en I: stroomsterkte) worden geprojecteerd en empirisch gecontroleerd moet worden of met een multimeter post vergadering. Figuur 2B toont de PBASIC timing programma nodig om te controleren van het circuit in figuur 2A (ook beschikbaar op https://github.com/ChastainAnderson/SVL). De constanten van de timing SVT & IPT (#5 en #6) zijn in eenheden van ms en zijn ingesteld op het bieden van een tijd van de activering van 2 seconden en een uitval van 28 s. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. opslag en voorbereiding van de proeven

  1. Bewaar alle ongeopende conventionele en elektronische sigaret monsters in het donker in luchtdichte plastic zakken bij kamertemperatuur.
  2. Eenmaal geopend, slaat u monsters in luchtdichte plastic zakken bij 4 ° c, met een papieren handdoek om overtollig vocht te absorberen.
  3. Vooraf alle monsters in een humidor kamertemperatuur op ~ 60% vochtigheid equilibreer gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan gebruik.

3. algemene werking van de sigaret rook/elektronische sigaret Aerosol extractie apparaat

  1. De massa van elke e-sigaret cartomizer/tank pre-vaping met behulp van een analytische balans vast. Het verschil in pre/post na vaping gewicht worden gebruikt voor het bepalen van de juiste dosering.
    Opmerking: 3R4F referentie sigaretten worden verondersteld te 0.7 mg nicotine bevatten, en het nicotinegehalte van commerciële sigaret merken kan worden bepaald door conventionele analysemethoden13.
  2. Voor de voorbeeldtoepassing 1, vul het reservoir van de primaire impinger met 4.3 mL endothelial cel kweekmedium. Voor de voorbeeldtoepassing 2, vul het reservoir met 5 mL aceton.
  3. Prep de elektronische sigaret of conventionele sigaret voor extractie:
    1. Als met behulp van een conventionele sigaret, plak een stukje duidelijk tape rond de filter en zet een goed zichtbare mark waar de sigarettenpapier sluit zich aan bij het filter.
    2. Als een sigaret als e-sigaret gebruikt, zorg ervoor dat de accu goed is opgeladen en de cartomizer geschroefd strak aan de accu.
    3. Als met behulp van een elektronische sigaret tank, ervoor te zorgen dat een juiste hoeveelheid elektronische sigaret vloeistof in de tank is geladen en schroef de tank op de 510 schroefdraad base.
  4. Breng de tip van de conventionele of elektronische sigaret in de inademing poort (Figuur 1, #1) en veilig met een slangklem.
  5. Zet de vacuümpomp aan.
  6. Aanpassen van de flowmeter te trekken 1.65 L/minuut om ervoor te zorgen een trekje 55 mL ruim 2 seconden.
  7. Inschakelen van de microcontroller. Als met behulp van een conventionele sigaret, licht de sigaret op het eerste bladerdeeg.
  8. Run totdat geprojecteerd gewenste concentratie (in delen per miljoen of % gewicht/volume) wordt bereikt.
  9. De massa van elke e-sigaret cartomizer/tank na verdamping via een analytische balans vast. Vergelijk deze meting aan het meten in stap 3.1 genomen om te bepalen van de totale massa verbruikt. Bereken de concentratie van de verbruikte massa/hoeveelheid oplosmiddel. Gebruik de molaire concentratie van verbruikte nicotine te normaliseren tussen producten.
    1. Als een onvoldoende massa werd geconsumeerd, de elektronische sigaret terug te keren naar het apparaat en verder verbruiken.
    2. Als een voldoende of teveel massa was verbruikt, gaat u verder.

4. de filtratie en opslag

  1. Als het extract wordt gebruikt voor de celcultuur, filtreer door een 0,22 µm PES spuit filter.
  2. De extracten onmiddellijk gebruik of Bewaar bij-80 ºC. Als onderdeel van de voorbereiding van Anderson, et al.. 8, elektronische sigaret aërosol bleek stabiel te zijn voor ten minste twee weken, en de stabiliteit van sigarettenrook voor maximaal twee jaar is opgericht door oplichters, et al.. 13.

5. reiniging van het apparaat

  1. Na elke extractie, spoel de leidingen en reservoirs van het apparaat met 70% ethanol en gedeïoniseerd water om te voorkomen dat die worden overgedragen tussen de monsters.
  2. Volgende spoelen, kort draaien de lege apparaat zodat de luchtstroom bij het drogen van de lijnen.

6. voorbeeldtoepassing 1: Neutraal rode opname cel levensvatbaarheid Assay

  1. Uitvoeren van uittreksel zoals hierboven in 4.3 mL endothelial cel groeimedium.
  2. Een dag voorafgaand, seed menselijke navelstreng ader endotheliale cellen in 96 goed platen bij een dichtheid van 1 x 104 cellen/wellin 100 µL van endothelial cel groeimedium.
  3. De cellen te behandelen door vervanging van het oude endothelial cel-kweekmedium met ofwel 100 µL cultuurmedium verse endothelial cel om te dienen als een besturingselement of 75 µL van endothelial cel groeimedium gemengd met 25 µL van een 2 mM verbruikt nicotine concentratie extract (1,4 mg nicotine verbruikt in 4.3 mL endothelial cel groeimedium) voor een eindconcentratie van 500 µM om te dienen als behandeling.
  4. Zoals velen van de componenten van beide sigaret rook en elektronische sigaret aërosol vluchtige, gebruiken een folie afdichting om de putten luchtdicht.
  5. De plaat 18 – 24 h Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
  6. Neutraalrood kleurstofoplossing voor te bereiden:
    1. Maak een 100 x neutrale rode stamoplossing door ontbinding van 33 mg van neutrale rode kleurstof in 10 mL gebufferde zoutoplossing.
    2. Kort vóór gebruik, Verdun 100 x stockoplossing 1:100 in cel kweekmedium maken 1 x neutraalrood kleurstofoplossing.
    3. Incubeer neutraalrood kleurstofoplossing bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik en het gebruik onmiddellijk.
      Opmerking: Het is normaal dat enkele kristallen te precipiteren tijdens de incubatie. Zorg moet worden genomen om te voorkomen dat deze kristallen op de cel cultuur putten toe te passen. Indien nodig, kan een.22 µm filter worden gebruikt voor het filteren van de neutrale rode voorraad en kleuring oplossingen.
  7. Verwijder extract en voeg 100 µL van neutraalrood kleurstofoplossing per goed, gebruik overmaat maken ten minste drie lege putten voor juiste kwantificering.
  8. Incubeer de plaat duikt met 2-4 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
  9. Verwijder neutraalrood kleurstofoplossing en 3 x wassen door onderdompeling in PBS.
  10. Toepassen van neutraalrood-vlek oplossing (50% gedeïoniseerd water, 49% ethanol, azijnzuur 1%).
  11. Incubeer ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur met schudden.
  12. Lees de absorptie bij 540 nm.
  13. Gegevens analyseren door af te trekken uit de gemiddelde waarde van de blanco putten en normaliseren van het gemiddelde van de gecorrigeerde blancocontrole goed waarde.

7. voorbeeldtoepassing 2: gaschromatografie-massaspectrometrie

  1. Extractie als hierboven in 5 mL aceton uitvoeren
  2. Uitvoeren van het apparaat om een eindconcentratie van ~ 100 delen per miljoen (gewicht van de e-liquid verbruikt/hoeveelheid aceton) van uw monster.
  3. Met behulp van een precisie glas spuit, injecteert 1 µL in de injector van een GC-MS-apparaat. Injecteren op 250 ° C met een 1:20 verhouding gesplitst in een gekoppelde gaschromatograaf/vierpolige spectrometer systeem uitgerust met een kolom ZB-5 met het volgende protocol van de oven: 1 min bij 50 ° C; helling 10 ° C/min. tot 140 ° C; helling van 20 ° C/min. tot 300 ° C ingedrukt voor 10 min.
  4. Overeenkomen met de resulterende massaspectra aan target bibliotheek om aërosol onderdelen te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Binnen 24 uur na de blootstelling van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen conventionele sigarettenrook extract (CSE) of elektronische sigaret aërosol extract (EAE), er is een significante (controle vs. CSE P < 0.001; controle vs. EAE P < 0,01; n = 6) vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen (figuur 3A). Extracten werden gegenereerd met een puffende Profiel van 2, 2 seconden, 55 mL soezen per minuut en genormaliseerd op basis van Molaire concentratie van nicotine verbruikt door het apparaat. Blootstelling aan 500 µM verbruikt nicotine equivalenten van CSE vermindert dramatisch levensvatbare cellen om 11.06 ± 0,28% controle, en blootstelling aan 500 µM verbruikt nicotine equivalenten van EAE vermindert levensvatbare cellen tot 86.65 ± 4,60% van besturingselement.

Figuur 3B toont de scheiding van de volatiliteit op basis van elektronische sigaret onderdelen van een commerciële elektronische sigaret met behulp van gaschromatografie. De onderdelen werden vervolgens geïdentificeerd met behulp van de Spectrometrie van de massa van de vierpolige. Geïdentificeerde onderdelen, in volgorde van volatiliteit, zijn onder meer: propyleenglycol, acetyl propionyl, chlorobutanol, glycerol, nicotine en 3-nitropthalic zuur. Deze enige propyleenglycol, glycerol en nicotine werden bekend gemaakt op het product label1.

Figure 3
Figuur 3: voorbeeld van toepassingen: cel levensvatbaarheid en GC-MS. Figuur 3A geeft de resultaten van een neutrale rode opname-test uitgevoerd op menselijke navelstreng ader endotheliale cellen blootgesteld aan 500 µM verbruikt nicotine equivalenten van beide conventionele sigaret rook uit een 3R4F onderzoek referentie sigaret (CSE) of elektronische sigaret aërosol van een commercieel beschikbare elektronische sigaret (EAE). Bars zijn gemiddelde +/-standaarddeviatie. Betekenis bepaald door twee tailed, ongepaarde, t-test en de resultaten aangegeven door sterretjes: ** P < 0,01; P < 0,001; n = 6. Figuur 3B bevat de resultaten van een gaschromatograaf elektronische sigaret aerosol ontbindend in aceton. Pieken vertegenwoordigen afzonderlijke verbindingen gerangschikt retentietijd (volatiliteit) en werden geïdentificeerd door vierpolige massaspectrometrie. 1) propyleenglycol; 2) acetyl propionyl; 3) chlorobutanol; 4) glycerol; 5) nicotine; 6) 3-nitropthalic zuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De meest kritische elementen van dit protocol zijn om ervoor te zorgen het apparaat schoon aan het begin en eind van elke extractie en ervoor te zorgen dat alle zeehonden zo worden gehandhaafd die luchtstroom blijft gelijk. Als het apparaat niet goed schoongemaakt is, is er een risico van carry over tussen de monsters. Bovendien, als het apparaat is onrein voor een langere periode van tijd verkorte aërosol verliet en gedroogd kunt oplosmiddel blokkeren het systeem. Opmerking dat het normaal is, want er om een daling van de druk wanneer puffend een conventionele sigaret en de luchtstroom meter moet worden aangepast om te zorgen voor de gewenste luchtstroom tijdens het bladerdeeg, niet terwijl het apparaat is kamer lucht trekken. Een belangrijk kenmerk van deze methode is de mogelijkheid om te worden aangepast om gelijke tred houden met de vooruitgang van de technologie van de elektronische sigaret. Bijvoorbeeld, vereisen veel elektronische sigaretten knop druk op activering van de spoel van de verwarming. Dit apparaat neemt direct de spoel van de verwarming in het controle-circuit (figuur 2A) nabootsen van een druk op de knop gebruiker geprogrammeerde intervallen. De primaire beperkingen van deze methode vloeien voort uit het gebrek aan goed gekarakteriseerd operationele standaardprocedures voor gebruik van de elektronische sigaret. Terwijl we een onderzoek referentie sigaret14 en internationale protocollen15,16 voor conventionele sigaretten gebruiken kunnen, we zijn alleen de aanpassing van deze methoden voor elektronische sigaretten en kan niet garanderen dat het op de juiste manier modellen van het gedrag van de gebruiker van elektronische sigaret. Daarnaast produceert dit protocol extract in een vloeibaar medium. Terwijl dit geschikt is kunnen voor bepaalde celtypen, zoals endotheliale cellen, andere celtypen, zoals de cellen van de luchtwegen, beter bestudeerd worden door rechtstreekse blootstelling aan de elektronische sigaret aërosol.

De aard van dit apparaat kan worden bijgewerkt als nieuwe operationele standaardprocedures worden ontwikkeld. Verscheidene punten van wijziging presenteren zich dat kan leiden tot het apparaat worden afgestemd op de specifieke vragen. Nieuwere elektronische sigaretten omvatten een hoger bereik van vermogen dan eerdere modellen van de elektronische sigaretten17. In het schema in figuur 2Agepresenteerd, kan beide de weerstand grenzend aan de spoel van de verwarming en de spoel van de verwarming zelf worden verwisseld voor onderdelen met verschillende weerstand waarden (of zelfs variabele weerstand) voor het moduleren van het finale energieverbruik te aerosolize van de elektronische sigaret vloeistof. Laatste theoretische kracht in de verstuiver kan worden berekend met de conventionele macht vergelijkingen:

Equation 1ofEquation 2
waar m: volmacht; V: de spanning; R: weerstand; en I: stroomsterkte.

Zo er is geen breed geaccepteerde internationale standard operating procedure voor gebruik van de elektronische sigaret, en verschillende groepen kunnen willen gebruiken verschillende parameters en puffende profielen. Een gemeenschappelijke elektronische sigaret standaard is CORESTA CRM8118, hoewel sommige groepen blijven gebruiken van aangepaste versies van de conventionele sigaret roken protocollen zoals ISO 3088:201215 en die TobLabNet SOP 116. Bovendien blijven veel laboratoria gebruiken laboratorium en/of instelling specifieke regimes. In dit geval we gebruikt een blokgolf bladerdeeg profiel bestaande uit 2, 2 seconden, 55 mL soezen per minuut; echter kan de modulaire, programmeerbare aard van het apparaat worden aangepast aan andere puffende profielen zoals nodig. Bladerdeeg volume kan rechtstreeks door de luchtstroommeter aan te passen worden gewijzigd. Bladerdeeg tijd en spoel activering opwarmtijd kunnen worden gewijzigd door het veranderen van de constanten van het SVT en IPT in het programma SVL.bs1 (figuur 2B, #5 en #6). Als men wil-synchroniseren de puffende tijd en de tijd van de activering, kan dit gebeuren door het splitsen van de constanten van SVT en IPT, bijvoorbeeld SVT1 vertegenwoordigen de tijd tussen de activering van de verwarming circuit en het ventiel circuit, SVT2 de tijd tussen de activering van het ventiel circuit en de inactivering van de verwarming circuit, en SVT3 vertegenwoordigen de tijd tussen de inactivering van het circuit van de verwarming en de inactivering van het ventiel circuit, en eveneens voor IPT vertegenwoordigen. Terwijl de 510 schroefdraad base gemeenschappelijk in vele tank elektronische sigaretten is, is het niet universeel. Een verschillend schroefdraad base kan worden vervangen als de gebruiker vereist. Als een blokgolf-profiel niet gewenst is, vervangen door de luchtstroommeter of magneetventiel een continue programable component aan het omvormen van het Golf-profiel.

Elektronische sigaret onderzoek vordert, de beschikbaarheid en de toegankelijkheid van elektronische sigaret blijft roken apparaten een hindernis. Sigaret roken machines hebben een integraal onderdeel geweest van tabak productonderzoek zo vroeg als 1843 en vandaag zijn er een scala aan verkrijgbare Rookvrije machines voor conventionele sigaretten19,20. Er zijn meerdere gevestigde operationele standaardprocedures voor conventionele sigaret roken21. Veel conventionele sigaret roken apparaten bleek echter niet in staat om nauwkeurig roken elektronische sigaretten vanwege de ontwerp verschillen tussen conventionele en elektronische sigaretten en verschillen binnen de elektronische sigaret merken en modellen, zoals: diameter, PSI eisen, en de noodzaak van sensor of knop op basis van activering17. Momenteel is er een heterogene commerciële gebied van de elektronische sigaret roken machines waarin apparaten met inbegrip van de inrichtingen die zijn ontworpen voor directe aërosol extractie evenals lucht vloeibare interface blootstelling (zoals Borgwalt22 en Vitrocell 22,23). Ondanks de beschikbaarheid van commerciële opties blijven vele groepen, gebruiken van de apparaten vervaardigd binnen hun eigen laboratorium voor aërosol extractie 10,11,12,24, 25 , 26. de beweegredenen hiervoor zijn gevarieerd. In sommige gevallen willen onderzoekers beter model menselijk gedrag10. Anderen trachten te continuïteit met eerder gepubliceerde studies van sigarettenrook12. Nog steeds noemen anderen direct de ontoegankelijkheid van commerciële alternatieven als een motivatie voor in laboratorium fabricage24. Deze apparaten vele vormen aannemen en, in veel gevallen, laboratorium specifieke protocollen gebruiken. Helaas, de mechanismen, werkzaamheid en mogelijkheden van deze apparaten en protocollen zijn vaak onder-gerapporteerd.

De eerste van de twee voorbeeldtoepassingen bovenstaande (figuur 3A) demonstreert de effecten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret aërosol op de levensvatbaarheid van de endotheliale cellen. Zoals conventionele sigarettenrook is aangetoond te veroorzaken endothelial cel dood en dysfunctie9, het is redelijk te veronderstellen dat elektronische sigaret aërosol zou hebben een vergelijkbaar effect. Om dit te testen, blootgesteld we menselijke navelstreng ader endotheliale cellen aan gelijkwaardige niveaus van conventionele sigarettenrook extract of elektronische sigaret aërosol uittreksel gedurende 24 uur nicotine. Hoewel beide conventionele sigaret rook en elektronische sigaret aërosol veroorzaken statistisch significante vermindering in de levensvatbaarheid van de cellen, de grootte van het effect van de vermindering van de aërosol geïnduceerde elektronische sigaret is ~ 13% terwijl de vermindering na conventionele sigarettenrook blootstelling nadert 90%. Hoewel dit het idee ondersteunt dat elektronische sigaretten minder schadelijk voor het vasculaire systeem dan conventionele sigaretten zijn, zijn ze nog steeds niet veilig. De tweede van de twee voorbeeldtoepassingen bovenstaande (figuur 3B) toont aan dat elektronische sigaret aërosol uitgepakt in organisch oplosmiddel kan worden gescheiden in zijn componenten en geanalyseerd via massaspectrometrie. De component lijst gegenereerd vindt u informatie over de nauwkeurigheid van labeling in elektronische sigaret producten en belicht bepaalde potentieel schadelijke componenten zoals acetyl propionyl (2,3-pentanedione)27. Terwijl de componenten geïdentificeerd in dit experiment waren niet gekwantificeerd, kan kwantificering worden uitgevoerd door conventionele analytische technieken zoals die worden beschreven in CORESTA CRM8428.

Hier hebben wij een programmeerbare laboratorium apparaat geschikt voor het genereren van vloeibaar extract van de conventionele sigaret rook of elektronische sigaret aërosol gepresenteerd. Dit apparaat is geschikt voor een veelzijdige productontwerpen (zoals de leidende commerciële merken van elektronische sigaret) en het extractieproces kan worden aangepast aan de specificaties van de gebruiker. In dit specifieke geval, we hebben laten zien het gebruik voor gegenereerde extract in een endothelial cel levensvatbaarheid bepaling; de extracten gegenereerd door dit apparaat kunnen echter worden toegepast op elk type van eencellige bevolking evenals co cultuur, explant of andere in vitro model. Deze uittreksels zijn compatibel met een groot aantal veelgebruikte biologische tests met inbegrip van reactieve zuurstof soorten detectie, cel proliferatie testen en conventionele immuno-kleuring. Bovendien, de mogelijkheid om te breken met de samenstelling van de elektronische sigaret uittreksel via gaschromatografie massaspectrometrie vormt een uitgangspunt voor gedetailleerde studies van individuele aërosol componenten. Globaal, dit apparaat biedt een toegankelijk item tot elektronische sigaret onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De tabak Product regelgevende Science Research Fellowship-programma wordt beheerd door Tulane University wordt gefinancierd door Altria Client Services Regulatory Affairs.

Acknowledgments

De auteurs erkennen de hulp van Dr. Robert Dotson van de Tulane Universiteit departement van cel- en moleculaire biologie voor zijn hulp bij het bewerken van het manuscript en Dr. James Bollinger van de Tulane University Department of Chemistry voor zijn hulp met massaspectrometrie protocol design. De auteurs verder erkennen de Tulane Universiteit departement van cel- en moleculaire biologie en de Tulane University Department of Chemistry voor hun steun en het gebruik van de ruimte en apparatuur. Dit werk werd gesteund door een tabak Product regelgevende Science Research Fellowship aan C. Anderson uit het Tulane University School of Science and Engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 V AC/DC Wall Mount Adaptor Digi-Key T1099-P5P-ND
2.2 Ohm Resistors Digi-Key A105635-ND Used in tandem to generate the 4.4 Ohm resistance in Figure 2A
330 Ohm Resistors Digi-Key 330QBK-ND
510 Threaded Base NJoy N/A Recovered by dismantalling a second generation NJoy electronic cigarette
Acetic Acid, Glacial Sigma-Aldritch A6283
Acetone (Chromatography Grade) Sigma-Aldritch 34850
Basic Stamp Project Board Digi-Key 27112-ND This board contains the BS1 Microcontroller, serial adaptor, power switch, and a barrel pin connector for the AC/DC Wall Mount Adaptor
Basic Stamp USB to Serial Adapter Digi-Key 28030-ND An optional component to allow the BS1 serial adaptor to communicate through USB
Buchner Flask (Vacuum Flask) 250 mL VWR 10545-854
Clear Tape 3M S-9783
Clear Vinyl Tubing, 3/8" ID Watts 443064
EGM-2 Endothelial Cell Culture Medium Lonza CC-3162
Ethanol Pharmco-Aaper 111000200
Flow Regulator Dwyer VFA-23-BV
Gas Chromatograph Varian 450-GC
Glass Syringe, 10 mL Sigma-Aldritch Z314552
Glass Syringe, 10 µL Hamilton 80300
High Vacuum Silicon Grease Dow Corning 146355D
Hose Clamp Precision Brand 35125
Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC PCS-100-013 
Mass Spectrometer Varian 300-MS
Midget Impinger Chemglass CG-1820-01
Neutral Red Sigma-Aldritch N4638
Paraffin Film 3M PM-992
Plate Seal Roller BioRad MSR0001
Plate Seal; Foil Thermo 276014
Ring Stand 20" American Educational Products 7-G15-A
Solenoid Valve (normally open) US Solid USS2-00081
Solid State Relay Digi-Key CLA279-ND
Stand Clamp Eisco CH0688
Syringe Filter, PES, 0.22 um Millipore SLGP033RS
Syringe, 10 mL BD Syringe 309604
Through Hole Stopper, Size 6 VWR 59581-287
Vacuum Pump KNF Neuberger N86KTP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. WHO Report on the Global Tobacco Epidemic, 2011. Italy. (2011).
  2. Weaver, S. R., Majeed, B. A., Pechacek, T. F., Nyman, A. L., Gregory, K. R., Eriksen, M. P. Use of electronic nicotine delivery systems and other tobacco products among USA adults, 2014: results from a national survey. Int. J. Public Health. 61, (2), 177-188 (2016).
  3. Singh, T., et al. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011–2015. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 65, (14), 361-367 (2016).
  4. Corey, C. G., Ambrose, B. K., Apelberg, B. J., King, B. A. Flavored Tobacco Product Use Among Middle and High School Students--United States, 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 64, (38), 1066-1070 (2015).
  5. Pisinger, C., Døssing, M. A systematic review of health effects of electronic cigarettes. Prev. Med. 69, 248-260 (2014).
  6. Callahan-Lyon, P. Electronic cigarettes: human health effects. Tob. Control. 23, (Suppl 2), ii36-ii40 (2014).
  7. Dinakar, C., O'Connor, G. T. The Health Effects of Electronic Cigarettes. N. Engl. J. Med. 375, (14), 1372-1381 (2016).
  8. Anderson, C., Majeste, A., Hanus, J., Wang, S. E-cigarette aerosol exposure induces reactive oxygen species, DNA damage, and cell death in vascular endothelial cells. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. (2016).
  9. U.S. Department of Health and Human Services. The Health Consequences of Smoking: 50 Years of Progress. A Report of the Surgeon General. Atlanta, GA. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Chronic Disease Prevention and Health Promotion, Office on Smoking and Health (2014).
  10. Farsalinos, K., et al. Comparison of the Cytotoxic Potential of Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Vapour Extract on Cultured Myocardial Cells. Int. J. Environ. Res. Public. Health. 10, (10), 5146-5162 (2013).
  11. Schweitzer, K. S., et al. Endothelial disruptive proinflammatory effects of nicotine and e-cigarette vapor exposures. Am. J. Physiol. - Lung Cell. Mol. Physiol. 309, (2), L175-L187 (2015).
  12. Putzhammer, R., et al. Vapours of US and EU Market Leader Electronic Cigarette Brands and Liquids Are Cytotoxic for Human Vascular Endothelial Cells. PLOS ONE. 11, (6), e0157337 (2016).
  13. Crooks, I., Dillon, D. M., Scott, J. K., Ballantyne, M., Meredith, C. The effect of long term storage on tobacco smoke particulate matter in in vitro genotoxicity and cytotoxicity assays. Regul. Toxicol. Pharmacol. 65, (2), 196-200 (2013).
  14. Roemer, E., et al. Mainstream Smoke Chemistry and in Vitro and In Vivo Toxicity of the Reference Cigarettes 3R4F and 2R4F. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 25, (1), (2014).
  15. International Organization for Standards. ISO 3088:2012 Routine analytical cigarette smoking machine – Definitions and standard conditions. (2012).
  16. World Health Organization. Standard Operating Procedure for Intense Smoking of Cigarettes. (2012).
  17. Brown, C. J., Cheng, J. M. Electronic cigarettes: product characterisation and design considerations. Tob. Control. 23, (Suppl 2), ii4-ii10 (2014).
  18. Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco. CRM No. 81 - Routine Analytical Machine for E-Cigarette Aerosol Generation and Collection - Definitions and Standard Conditions. (2015).
  19. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Exp. Toxicol. Pathol. 65, (7-8), 1183-1193 (2013).
  20. Klus, H., Boenke-Nimphius, B., Müller, L. Cigarette Mainstream Smoke: The Evolution of Methods and Devices for Generation, Exposure and Collection. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 27, (4), (2016).
  21. Baker, R. The Development and Significance of Standards for Smoking-Machine Methodology. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 20, (1), (2014).
  22. Thorne, D., Crooks, I., Hollings, M., Seymour, A., Meredith, C., Gaca, M. The mutagenic assessment of an electronic-cigarette and reference cigarette smoke using the Ames assay in strains TA98 and TA100. Mutat. Res. Toxicol. Environ. Mutagen. 812, 29-38 (2016).
  23. Thorne, D., Larard, S., Baxter, A., Meredith, C., Gaҫa, M. The comparative in vitro assessment of e-cigarette and cigarette smoke aerosols using the γH2AX assay and applied dose measurements. Toxicol. Lett. 265, 170-178 (2017).
  24. Herrington, J. S., Myers, C. Electronic cigarette solutions and resultant aerosol profiles. J. Chromatogr. A. 1418, 192-199 (2015).
  25. Yu, V., et al. Electronic cigarettes induce DNA strand breaks and cell death independently of nicotine in cell lines. Oral Oncol. 52, 58-65 (2016).
  26. Ji, E. H., et al. Characterization of Electronic Cigarette Aerosol and Its Induction of Oxidative Stress Response in Oral Keratinocytes. PLOS ONE. 11, (5), e0154447 (2016).
  27. Morgan, D. L., et al. Chemical Reactivity and Respiratory Toxicity of the -Diketone Flavoring Agents: 2,3-Butanedione, 2,3-Pentanedione, and 2,3-Hexanedione. Toxicol. Pathol. 44, (5), 763-783 (2016).
  28. Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco. CRM No. 84 - Determination of Glycerin, Propylene Glycol, Water, and Nicotine in the Aerosol of E-Cigarettes by Gas Chromatographic Analysis. (2017).
Een Microcontroller beheerd apparaat voor de generatie van vloeibare extracten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret Aerosol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, C. A., Bokota, R. E., Majeste, A. E., Murfee, W. L., Wang, S. A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol. J. Vis. Exp. (131), e56709, doi:10.3791/56709 (2018).More

Anderson, C. A., Bokota, R. E., Majeste, A. E., Murfee, W. L., Wang, S. A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol. J. Vis. Exp. (131), e56709, doi:10.3791/56709 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter