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Bioengineering

Ein Mikrocontroller betrieben Gerät zur Erzeugung von flüssige Extrakte aus herkömmlichen Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol

doi: 10.3791/56709 Published: January 18, 2018

Summary

Hier beschreiben wir eine programmierbare Laborgerät, das verwendet werden kann, um Auszüge der herkömmlichen Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol zu erstellen. Diese Methode bietet ein nützliches Werkzeug, um direkte Vergleiche zwischen herkömmlichen Zigaretten und e-Zigaretten und ist zugänglich Einstiegspunkt in die elektronische Zigarette-Forschung.

Abstract

Elektronische Zigaretten sind das beliebteste Tabakprodukt unter Mittel- und Oberschüler und das beliebteste alternative Tabakprodukt unter Erwachsenen. Hohe Qualität, reproduzierbare Forschung über die Folgen der Nutzung der elektronischen Zigarette ist unerlässlich für Verständnis entstehen öffentliche Gesundheit und crafting-Beweise Regulierungspolitik basiert. Während eine wachsende Anzahl von Papieren elektronische Zigaretten diskutieren, gibt es wenig Übereinstimmung in Methoden über Gruppen und sehr wenig Konsens über die Ergebnisse. Hier beschreiben wir eine programmierbare Laborgerät, das verwendet werden kann, um Auszüge der herkömmlichen Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol zu erstellen. Dieses Protokoll beschreibt Anweisungen für den Zusammenbau und Betrieb des besagten Gerät und veranschaulicht die Verwendung des generierten Extraktes in zwei Beispielanwendungen: eine in-vitro- Zelle Lebensfähigkeit Assay und Gaschromatographie Massenspektrometrie. Diese Methode ist ein Werkzeug für direkte Vergleiche zwischen herkömmlichen Zigaretten und e-Zigaretten und ist zugänglich Einstiegspunkt in die elektronische Zigarette-Forschung.

Introduction

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Tabakkonsum Produkt bleibt trotz Bemühungen von Organisationen des Gesundheitswesens die Hauptursache für vermeidbare Todesfälle weltweit, die meisten dieser Todesfälle zugeschrieben Zigarette rauchen1. Seit dem Markteintritt im Jahr 2003, sind elektronische Zigaretten in der Popularität unter Tabakkonsumenten Produkt gewachsen. Elektronische Zigaretten sind derzeit die beliebteste Alternative zu herkömmlichen Zigaretten unter amerikanischen Erwachsenen (~ 5 %)2 und die beliebtesten Nikotin-Delivery-System unter Mitte (~ 5,3 %) und Oberschüler (~ 16 %)3. Wenn der gegenwärtige Trend anhält, können elektronische Zigaretten voraussichtlich herkömmliche Zigaretten für künftige Generationen zu ersetzen. Die gesundheitlichen Folgen der Verwendung der elektronischen Zigarette bleiben jedoch unklar.

Forschung auf elektronische Zigaretten begann nicht im Ernst, bis elektronische Zigarette Popularität schnell in 20133,4erhöht. Seit dieser Zeit haben eine Reihe von verschiedenen Modellen eingesetzt, um die Frage der Toxizität. Jedoch die Ergebnisse vieler Studien sind widersprüchlich, und während es scheint, dass elektronische Zigaretten sind in der Regel weniger toxisch als herkömmliche Zigaretten gibt es keine aktuellen Konsens über die gesundheitlichen Folgen der elektronischen Zigarette verwenden5, 6 , 7. unserer bisherigen Forschung zeigt, dass elektronische Zigaretten wesentlich weniger toxisch für das vaskuläre Endothel als herkömmliche Zigaretten, trotz ihrer Fähigkeit sind, DNA-Schäden und die Induktion von oxidativem Stress und Zelle Tod8 verursachen . Jedoch ist mehr Forschung notwendig, bevor wir Schlussfolgerungen über die gesundheitlichen Folgen der Nutzung der elektronischen Zigarette ziehen können.

Wie herkömmliche Zigaretten eine Hauptursache für vermeidbare arterielle Verschlusskrankheit9 sind, gibt es ein wachsendes Interesse an der vaskulären Gesundheitsgefährdung der elektronischen Zigarette verwenden10,11,12. Zur Untersuchung der Auswirkungen von e-Zigaretten auf das Gefäßsystem entwickelt unser Labor ein Mikrocontroller betrieben Rauchen/dampfen Gerät (Abbildung 1)8. Dieses Gerät ist in der Lage, flüssige Extrakte entweder herkömmliche Zigarette Rauch oder elektronische Zigarette Aerosol in wässrigen oder organischen Lösungsmitteln zu erzeugen. Da Luftstrom durch die Kombination von eine verstellbare Durchflussregler und ein PBASIC Zeitprogramm gesteuert wird, ist das Gerät einsetzbar, Extrakte nach einer beliebigen Anzahl von benutzerdefinierten Protokolle zu generieren. Hier wir ausführlich, Montage und Betrieb dieses Gerätes sowie zwei Anwendungsmöglichkeiten: in-vitro- Zelle Lebensfähigkeit Bewertung und Gaschromatographie Massenspektrometrie.

Figure 1
Abbildung 1: Rauchen/dampfen Gerät. Schaltplan für die physische Montage des Gerätes in die Zigarette/Zigarette wie elektronische Zigarette (e-Cig)-Konfiguration (A) und der Tank-elektronische Zigarette-Konfiguration (B) Rauchen/dampfen. Komponente-Taste: 1) Inhalation Port; (2) primäre Sammlung Ausbeute; (3) Überlauf Ausbeute; (4) Buchner Kolben Vakuum Falle; (5) Schließer Magnetventil; (6) BS1 Mikrocontroller; (7) Luft Durchflussregler; (8) 510 Gewinde elektronische Zigarette Tank Basis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protocol

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1. Montage des Gerätes

  1. Sichern Sie eine 100 mL Buchner Kolben (Abbildung 1, #4) zu einem Stahlring stehen und schaffen eine Vakuum Falle durch füllen mit 50 g Kalzium-Chlorid als ein Trockenmittel dienen. Die Küvette mit Durchgangsbohrung Gummistopfen verschließen, wickeln Sie die Stopper Kreuzung mit Paraffin Film und Ausführen einer Pipette durch das Loch.
  2. Mit Vinyl-Schlauch verbinden Sie die Pipette erstreckt sich von der Stopper zu einer t-Kreuzung Schlauchanschluss.
  3. Mit Vinyl-Schlauch, verbinden Sie der zwei Ausbeute (Abbildung 1, #2 und #3) miteinander und verbinden Sie den Ausgang des zweiten Ausbeute an der t-Kreuzung Schlauchanschluss.
  4. Mit Vinyl-Schlauch verbinden Sie den Eingangs-Port der ersten Ausbeute, als Inhalation Hafen (Abbildung 1, #1) zu dienen.
  5. Vinyl Schlauch mit Seitenarm des Kolbens Buchner an den Eingang von einem Luftstrom-Regler (Abbildung 1, #7) anschließen und die Ausgangsöffnung des Reglers Luftstrom mit einer Vakuumpumpe.
  6. Montieren Sie die Schaltung nach dem Schaltplan in Abbildung 2A.
  7. Laden Sie die PBASIC Programm SVL.bs1 (Abb. 2 b, auch bei https://github.com/ChastainAnderson/SVL erhältlich) an den BS1 Mikrocontroller (Abbildung 1, #6) mittels eines seriellen Adapter und die Software des Herstellers.
  8. Ort der 510 Gewinde Basis (Abbildung 1 #8) in einem Ring stehen Klemme.
  9. Mit Vinyl-Schlauch, schließen Sie das Magnetventil (Abbildung 1, #5) an das freie Ende des t-Kreuzung-Schlauchanschluss.
    Hinweis: Sollte das Gerät vollständig und betriebsbereit sein, überprüfen Sie alle Verbindungen, um sicherzustellen, dass sie luftdicht sind und Schlauchschellen und Vakuum Fett nach Bedarf anwenden.

Figure 2
Abbildung 2: Schaltplan und PBASIC Code. Abbildung 2A zeigt den Schaltplan für die Montage der elektrischen Schaltung erforderlich, beide Schließer Magnetventil zu aktivieren und die Heizwendel Knopfdruck aktiviert elektronische Zigaretten (durch den 510 Gewinde elektronische Zigarette Tank Basis). Die elektrischen Parameter der Heizwendel (P: macht; R: Widerstand; und I: Current) werden projiziert und mit einem multimeter-Pfosten-Montage empirisch überprüft werden. Abbildung 2 b zeigt die PBASIC Zeitprogramm notwendig, um die Schaltung in Abb. 2A (auch abrufbar unter https://github.com/ChastainAnderson/SVL) zu steuern. Die Timing-konstanten SVT & IPT (#5 und #6) sind in Einheiten von ms und werden eine Einschaltzeit von 2 Sekunden und eine Ausfallzeit von 28 s. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

2. Probieren Sie Lagerung und Zubereitung

  1. Speichern Sie alle ungeöffneten konventionelle und elektronische Zigarette Proben in der Dunkelheit in luftdichten Plastikbeutel bei Raumtemperatur.
  2. Nach dem Öffnen Speichern Sie Proben in luftdichten Plastiktüten bei 4 ° c, mit einem Papiertuch, überschüssige Feuchtigkeit aufzunehmen.
  3. Pre-equilibrate alle Proben im Humidor bei ~ 60 % Luftfeuchtigkeit Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten vor dem Gebrauch.

3. Allgemeine Bedienung der Zigarette Rauch/elektronische Zigarette Aerosol Absaugvorrichtung

  1. Bestimmen Sie die Masse der einzelnen e-Zigarette Cartomizer/Tank Pre-Dampfen mit Hilfe einer Analysenwaage. Der Gewichtsunterschied Pre/post post dampfen werden zur entsprechenden Dosierung zu bestimmen.
    Hinweis: 3R4F Referenz Zigaretten wird angenommen, dass 0,7 mg Nikotin enthalten und der Nikotingehalt von kommerziellen Zigarettenmarken von konventionellen Analysemethoden13ermittelt werden.
  2. Beispielanwendung 1 füllen Sie das Reservoir an die primäre Ausbeute mit 4,3 mL Kulturmedium Endothelzellen. Beispielanwendung 2 füllen Sie das Reservoir mit 5 mL Aceton.
  3. Vorbereitung der elektronischen Zigarette oder herkömmliche Zigarette für Extraktion:
    1. Bei einer herkömmlichen Zigarette ein Stück durchsichtigem Klebeband um den Filter und setzen eine gut sichtbare Markierung wo das Zigarettenpapier verbindet den Filter.
    2. Wenn Sie eine Zigarette wie e-Zigarette verwenden, stellen Sie sicher der Akku ist gut und die Cartomizer fest verschraubt an der Batterie.
    3. Wenn einen elektronische Zigarette Tank verwenden, stellen Sie sicher, dass eine entsprechende Volumen der elektronischen Zigarette Flüssigkeit im Behälter geladen wird und Schrauben Sie den Tank auf 510 Gewinde.
  4. Stecken Sie die Spitze der konventionellen oder elektronischen Zigarette in die Inhalation Anschluss (Abbildung 1, #1) und mit einer Schlauchschelle sichern.
  5. Schalten Sie die Vakuumpumpe.
  6. Passen Sie den Durchflussmesser ziehen 1,65 L/Minute, um einen Zug 55 mL über 2 Sekunden zu gewährleisten.
  7. Schalten Sie den Mikrocontroller. Bei Verwendung eine herkömmliche Zigarette anzünden Sie die Zigarette auf dem ersten Zug.
  8. Läuft-bis-projiziert auf Wunsch Konzentration (in Teilen pro Million oder % Gewicht/Volumen) ist erreicht.
  9. Ermitteln Sie die Masse der einzelnen e-Zigarette Cartomizer/Tank nach Verdampfung mit Hilfe einer Analysenwaage. Vergleichen Sie dieses Maß auf die Messung im Schritt 3.1 zu bestimmen, die gesamte Masse verbraucht. Berechnen Sie die Konzentration der verbrauchte Masse/Volumen des Lösungsmittels. Verwenden Sie die molare Konzentration der verbrauchten Nikotin zwischen Produkten zu normalisieren.
    1. Wenn eine unzureichende Masse verbraucht wurde, die elektronische Zigarette an das Gerät zurück und weiter konsumieren.
    2. Wenn eine ausreichende oder überschüssige Masse verbraucht wurde, fahren Sie fort.

4. Filterung und Lagerung

  1. Wenn Extrakt für die Zellkultur verwendet werden soll, durch einen 0,22 µm PES Spritze Filter filtern.
  2. Verwenden Sie die Extrakte sofort oder bei-80 ° c lagern. Als Teil der Vorbereitung für Anderson, Et al. 8, elektronische Zigarette Aerosol zeigte sich für mindestens zwei Wochen stabil zu sein, und die Stabilität von Zigarettenrauch bis zu zwei Jahre lang wurde von Gauner, Et al. 13.

5. Reinigung des Gerätes

  1. Nach jeder Extraktion spülen Sie den Schlauch und Stauseen des Gerätes mit 70 % Ethanol und deionisiertes Wasser zu verhindern, dass Übertrag zwischen Proben.
  2. Im Anschluss spülen, kurz laufen die leere Gerät um Luftstrom zu unterstützen, die Trocknung der Linien zu ermöglichen.

6. Beispielanwendung 1: Neutrale rote Aufnahme Zelle Lebensfähigkeit Assay

  1. Durchführen Sie Extrakt in 4,3 mL Endothelzellen Wachstumsmedium wie oben beschrieben.
  2. Samen Sie eines Tages vor, menschlichen Nabelader Endothelzellen in 96-well-Platten bei einer Dichte von 1 x 104 Zellen/Naturfreunde 100 µL der Endothelzellen Wachstumsmedium.
  3. Behandeln Sie die Zellen durch das Ersetzen der alten Endothelzellen Kulturmedium mit entweder 100 µL frische Endothelzellen Kulturmedium als Kontrolle dienen oder 75 µL Endothelzellen Wachstumsmedium gemischt mit 25 µL ein 2 mM konsumiert Nikotin Konzentration Extrakt (1,4 mg Nikotin in 4,3 mL Endothelzellen Wachstumsmedium verbraucht) für eine Endkonzentration von 500 µM als Behandlung dienen.
  4. Da viele Komponenten der beiden Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol flüchtig sind, verwenden Sie ein Folienversiegelung, um die Brunnen luftdicht zu halten.
  5. Platte 18 – 24 h Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
  6. Bereiten Sie neutral rot Färbelösung:
    1. Erstellen einer 100 X neutral rot Vorratslösung durch 33 mg des neutralen roten Farbstoff in 10 mL gepufferte Salzlösung auflösen.
    2. Kurz vor Gebrauch verdünnen Sie 100 x-Stammlösung 1: 100 im Zellkulturmedium, 1 x neutral rot Färbelösung zu schaffen.
    3. Inkubieren Sie neutral rot Färbelösung bei 37 ° C für mindestens 30 min vor Gebrauch und Verwendung sofort.
      Hinweis: Es ist normal, dass einige Kristalle, während der Inkubation auszufällen. Darauf sollte geachtet werden, um zu vermeiden, diese Kristalle auf die Zelle Kultur Brunnen anwenden. Bei Bedarf kann ein.22 µm-Filter zum Filtern der neutralen roten Lager und befleckenden Lösungen verwendet werden.
  7. Entfernen Sie Auszug zu und fügen Sie 100 µL neutral rot Färbelösung pro darüber hinaus Verwendung Überschuss um mindestens drei leere Brunnen für korrekte Quantifizierung zu erstellen hinzu.
  8. Inkubieren Sie die Platte auf 2 – 4 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
  9. Entfernen Sie neutral rot Färbelösung und waschen Sie 3 X durch Untertauchen in PBS.
  10. Gelten neutral rot de-färben Lösung (50 % entionisiertem Wasser, 49 % Ethanol, 1 % Essigsäure).
  11. Inkubieren Sie mindestens 10 min bei Raumtemperatur mit schütteln.
  12. Lesen Sie die Extinktion bei 540 nm.
  13. Analysieren von Daten durch Subtrahieren, der durchschnittliche Wert der leeren Brunnen und dem Durchschnitt der leere bereinigte gut Kontrollwert normalisieren.

(7) Beispielanwendung 2: Gaschromatographie-Massenspektrometrie

  1. Führen Sie die Extraktion als oben in 5 mL Aceton.
  2. Führen Sie das Gerät um eine Endkonzentration von ~ 100 ppm zu erreichen Millionen (Gewicht der e-Flüssigkeit verbraucht/Volumen Aceton) Ihrer Probe.
  3. Mit einer Präzision Glasspritze, 1 µL injizieren Sie in den Injektor eines GC-MS-Gerätes. Spritzen bei 250 ° C mit einer 01:20 ein gekoppelter Gaschromatographen/Quadrupol Spektrometer System ausgestattet mit einer ZB-5 Spalte mit dem folgenden Ofen Protokoll Verhältnis aufgeteilt: 1 min bei 50 ° C; Rampe 10 ° C/min auf 140 ° C; Rampe 20 ° C/min bis 300 ° C und 10 min warten.
  4. Übereinstimmen Sie, daraus resultierende Massenspektren, Zielbibliothek, Aerosol-Komponenten zu identifizieren.

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Representative Results

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Innerhalb von 24 Stunden nach der Exposition des menschlichen Nabelader Endothelzellen zu konventionellen Zigarettenrauch Extrakt (CSE) oder elektronische Zigarette Aerosol extrahieren (EAE), gibt es eine erhebliche (Kontrolle vs. CSE P < 0,001; Kontrolle vs. EAE P < 0,01; n = 6) Reduktion im Zellviabilität (Abb. 3A). Auszüge mit einem puffing Profil von 2, 2 Sekunden, 55 mL Züge pro Minute erzeugt wurden und normalisiert basierend auf molare Konzentration von Nikotin durch das Gerät verbraucht. 500 µM konsumiert Nikotin Entsprechungen von CSE drastisch reduziert lebensfähige Zellen auf 11.06 ± 0,28 % der Kontrolle, und 500 µM konsumiert Nikotin Entsprechungen der EAE reduziert lebensfähige Zellen auf 86,65 ± 4,60 % der Kontrolle.

Abbildung 3 b zeigt die Volatilität basierte Trennung von Komponenten der elektronischen Zigarette eine kommerzielle elektronische Zigarette durch Gaschromatographie. Die Komponenten wurden dann über Quadrupol-Massenspektrometrie identifiziert. Identifizierten Komponenten in der Reihenfolge der Volatilität, umfassen: Propylenglykol, Acetyl Propionyl, Chlorbutanol, Glycerin, Nikotin und 3-Nitropthalic-Säure. Von diesen nur Propylenglykol, Glycerin und Nikotin wurden auf dem Produkt-Etikett1bekannt gegeben.

Figure 3
Abbildung 3: Probieren Sie Anwendungen: Handy-Lebensfähigkeit und GC-MS. Abbildung 3A zeigt die Ergebnisse eines neutralen roten Aufnahme-Assays auf menschliche Nabelader endothelial Zellen ausgesetzt bis 500 µM durchgeführt konsumiert Nikotin Entsprechungen von entweder konventionelle Zigarettenrauch aus einer 3R4F Forschung Referenz Zigarette (CSE) oder elektronische Zigarette Aerosol aus einem handelsüblichen elektronische Zigarette (EAE). Bars sind Mittelwert +/-Standardabweichung. Bedeutung von zwei tailed, bestimmt ungepaarte, t-Test und Ergebnisse durch Sternchen angezeigt: ** P < 0,01; P < 0,001; n = 6. Abbildung 3 b zeigt die Ergebnisse der einen Gaschromatographen der elektronischen Zigarette Aerosol solubilisiert in Aceton. Spitzen Einzelverbindungen sortiert nach Verweilzeit (Volatilität) dar, die durch Quadrupol-Massenspektrometrie identifiziert wurden. (1) Propylenglykol; (2) Acetyl Propionyl; (3) Chlorbutanol; (4) Glycerin; (5) Nikotin; (6) 3-Nitropthalic-Säure. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Die wichtigsten Elemente dieses Protokolls sind, sicherzustellen ist das Gerät sauber zu Beginn und Ende jeder Extraktion, und sicherstellen, dass alle Dichtungen sind so gewährleistet, dass Luftstrom konsistent. Wenn das Gerät nicht richtig gereinigt wird, gibt es ein Risiko tragen über zwischen Proben. Außerdem, wenn das Gerät ist über einen längeren Zeitraum der Zeit verkürzte Aerosol unrein und getrocknet kann Lösungsmittel das System blockieren. Beachten Sie, dass es normal ist, denn es um einen Druckabfall zu sein, als eine herkömmliche Zigarette und der Luftstrom schnaufend Meter angepasst werden sollten um den gewünschten Luftstrom während der Blätterteig zu bieten, nicht, während das Gerät der Raumluft zieht. Ein wesentliches Merkmal dieser Methode ist die Fähigkeit, angepasst werden, dass um mit der Weiterentwicklung der elektronischen Zigarette Technologie Schritt zu halten. Beispielsweise erfordern viele elektronische Zigaretten Taste drücken Aktivierung der Heizwendel. Dieses Gerät enthält direkt die Heizwendel in den Steuerstromkreis (Abbildung 2A) imitiert einen Knopfdruck Abständen Benutzer programmiert. Die primäre Grenzen dieser Methode ergeben sich aus dem Mangel an gut charakterisierten Standardarbeitsanweisungen für die elektronische Zigarette Verwendung. Während wir eine Forschung Referenz Zigarette14 und internationale Protokolle15,16 für herkömmliche Zigaretten verwenden können, passen nur diese Methoden zu elektronischen Zigaretten und wir können nicht garantieren, daß es angemessen elektronische Zigarette Nutzerverhalten-Modelle. Darüber hinaus produziert dieses Protokolls Extrakt in einem flüssigen Medium. Während dies angemessen ist möglicherweise für bestimmte Zelltypen, wie Endothelzellen, andere Zelltypen, wie Zellen der Atemwege, besser durch direkten Kontakt mit dem elektronischen Zigarette Aerosol untersucht werden.

Die Natur dieses Gerätes ermöglicht es, aktualisiert, sobald neue Standardverfahren entwickelt werden. Einige Punkte der Änderung präsentieren, die für das Gerät auf spezifische Fragen zugeschnitten werden können. Neuere elektronische Zigaretten umfassen eine höhere Reichweite der Leistung als frühere Modelle der e-Zigaretten17. Im Schaltplan dargestellt in Abbildung 2Akönnte sowohl der Widerstand angrenzend an das Heizregister und die Heizwendel selbst für Bauteile mit unterschiedlichen Widerstandswerte (oder sogar Variablen Widerstand) zu modulieren, die Endenergie verwendet um ausgetauscht werden die elektronische Zigarette Flüssigkeit vernebeln-. Theoretischen Endenergie in den Zerstäuber kann mit konventionellen Kraftwerken Gleichungen berechnet werden:

Equation 1oderEquation 2
wo P: macht; V: Spannung; R: Widerstand; und I: Current.

Da gibt es keine allgemein akzeptierten internationalen Betriebsanweisung für die elektronische Zigarette Verwendung, und verschiedene Gruppen verschiedene Parameter und puffing Profile einzusetzen können. Eine gemeinsame elektronische Zigarette standard ist POROSITÄT CRM8118, obwohl einige Gruppen weiterhin modifizierte Versionen der herkömmlichen Zigarette rauchen Protokolle wie ISO 3088:201215 und wer beschäftigen SOP 116verwenden. Viele Laboratorien weiterhin zusätzlich Labor und/oder Institution spezielle Regelungen zu verwenden. In diesem Fall haben wir ein Rechtecksignal Blätterteig Profil bestehend aus 2, 2 Sekunden, 55 mL Züge pro Minute beschäftigt; die modulare, programmierbare Natur des Geräts ermöglicht jedoch an andere puffing Profile angepasst werden, je nach Bedarf. Blätterteig-Lautstärke kann direkt durch die Anpassung der Air-Flow-Meter geändert werden. Blätterteig-Zeit und Heizung Spule Aktivierungszeit können durch Ändern der SVT und IPT konstanten im Programm SVL.bs1 (Abb. 2 b, #5 und #6) verändert werden. Würde man die puffing Zeit und die Aktivierungszeit de synchronisieren möchten, könnte dies durch die Aufspaltung der SVT und IPT konstanten, z. B. SVT1 repräsentieren die Zeit zwischen der Aktivierung des Heizkreises und Ventilschaltung, SVT2 stellvertretend für die Zeit zwischen der Aktivierung der Ventil-Schaltung und die Inaktivierung der Heizkreis und SVT3 , die Zeit zwischen der Inaktivierung des Heizkreises und die Inaktivierung der Ventil-Schaltung, und ebenso für IPT darstellt. Während die 510 Gewinde Basis in vielen Tank elektronische Zigaretten üblich ist, ist es nicht universell. Eine anders Gewinde Basis kann ersetzt werden, wenn der Benutzer benötigt. Wenn ein Rechtecksignal Profil nicht gewünscht wird, ersetzen Sie die Air-Flow-Meter oder Magnetventil mit einer kontinuierlichen Stahlkasten Komponente, das Wellenprofil neu zu gestalten.

Als elektronische Zigarette Forschung fortschreitet, die Verfügbarkeit und Zugänglichkeit der elektronischen Zigarette bleibt Rauchen Geräte eine Hürde. Zigarette rauchen Maschinen wurden Bestandteil der Tabak Produktforschung bereits 1843 und heute gibt es eine Vielzahl von im Handel erhältlichen Rauchen Maschinen für herkömmliche Zigaretten19,20. Es gibt mehrere etablierte Standardverfahren für herkömmliche Zigarette rauchen21. Allerdings erwies sich viele herkömmliche Zigarette rauchen Geräte nicht in der Lage präzise elektronische Zigaretten durch die Design-Unterschiede zwischen konventioneller und elektronischer Zigaretten und Unterschiede innerhalb der elektronischen Zigarettenmarken und Modelle, wie z. B.: Durchmesser, PSI-Anforderungen und die Notwendigkeit für Sensor oder Schaltfläche basierte Aktivierung17. Derzeit gibt es eine heterogene kaufmännischen Bereich elektronische Zigarette rauchen Maschinen, die Geräte, einschließlich Geräte für die direkte Aerosol Gewinnung sowie Luft flüssigen Schnittstelle Exposition (z. B. Borgwalt22 und Vitrocell enthält 22,23). Trotz der Verfügbarkeit von kommerziellen Optionen weiterhin viele Gruppen Geräte hergestellt im eigenen Labor für Aerosol Extraktion 10,11,12,24, 25 , 26. die Gründe dafür sind vielfältig. In einigen Fällen versuchen Forscher, besseres Modell menschlichen Verhaltens10. Andere versuchen, mit bisher veröffentlichten Studien von Zigarettenrauch12Kontinuität. Andere zitieren noch direkt die Unzugänglichkeit der kommerziellen Alternativen als Motivation für im Labor Herstellung24. Diese Geräte sehr unterschiedliche Formen annehmen und in vielen Fällen verwenden Sie spezifische Laborprotokolle. Leider, die Mechanismen, die Wirksamkeit und die Funktionen dieser Geräte und Protokolle werden oft unter-gemeldet.

Die erste der zwei Beispielanwendungen oben (Abbildung 3A) zeigt die Auswirkungen der herkömmlichen Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol auf Endothelzellen Lebensfähigkeit. Wie konventionelle Zigarettenrauch nachgewiesen, um Endothelzellen Tod und Dysfunktion9zu verursachen, ist es vernünftig um zu vermuten, dass elektronische Zigarette Aerosol eine ähnliche Wirkung haben würde. Um dies zu testen, ausgesetzt wir menschliche Nabelader Endothelzellen, Nikotin, die gleichwertigen konventionellen Zigarettenrauch Extrakt oder elektronische Zigarette Aerosol für 24 h zu extrahieren. Während sowohl herkömmliche Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol verursachen statistisch signifikante Reduktionen im Zellviabilität, die Effektgröße der elektronischen Zigarette Aerosol induzierte Reduktion ist ~ 13 %, während die Reduktion nach konventionellen Zigarettenrauch Exposition nähert sich 90 %. Während dies die Idee unterstützt, dass elektronische Zigaretten weniger schädlich für das Gefäßsystem als herkömmliche Zigaretten sind, sind sie noch nicht sicher. Die zweite der beiden Beispielanwendungen oben (Abb. 3 b) zeigt, dass elektronische Zigarette Aerosol in organischen Lösungsmittel extrahiert in seine Bestandteile getrennt und per Massenspektrometrie analysiert werden kann. Die Komponentenliste generiert informiert über die Genauigkeit der Kennzeichnung in elektronische Zigarette Produkte und highlights bestimmte potenziell schädlichen Komponenten wie Acetyl Propionyl (2,3-Pentanedione)27. Während die Komponenten identifiziert in diesem Experiment nicht quantifiziert wurden, kann durch konventionelle analytische Techniken wie die POROSITÄT CRM8428präsentiert Quantifizierung durchgeführt werden.

Hier haben wir eine programmierbare Laborgerät erzeugen Flüssigextrakt von der herkömmlichen Zigarette Rauch oder elektronische Zigarette Aerosol präsentiert. Dieses Gerät bietet Platz für eine Vielzahl von Produkt-Designs (z. B. der führenden Handelsmarken der elektronischen Zigarette) und die Extraktion kann Benutzer Vorgaben angepasst werden. In diesem speziellen Fall haben wir die Verwendung des generierten Extrakt in einem Endothelzellen Lebensfähigkeit Assay gezeigt; jedoch könnte die Extrakte, die durch dieses Gerät erzeugt für jede Art von einzelnen Zellenbevölkerung sowie Kokultur, Explant oder andere in-vitro- Modell gelten. Diese Extrakte sind kompatibel mit einer Vielzahl von häufig verwendeten biologischen Proben einschließlich reaktiven Sauerstoff-Spezies-Erkennung, Zelle Verbreitung Assays und konventionellen Immuno-Färbung. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, brechen die Zusammensetzung der elektronischen Zigarette Auszug per Gaschromatographie Massenspektrometrie einen Ausgangspunkt für detaillierte Untersuchungen der einzelnen Aerosol-Komponenten. Insgesamt bietet dieses Gerät zugänglich Einstiegspunkt für die elektronische Zigarette-Forschung.

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Disclosures

Der Tabak Produkt Regulatory Science Research Fellowship-Programm von Tulane University verwaltet wird von Altria Client Services Regulatory Affairs finanziert.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen die Hilfe von Dr. Robert Dotson der Tulane Universität Institut für Zell- und Molekularbiologie für seine Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts und Dr. James Bollinger an der Tulane Universität Fakultät für Chemie für seine Unterstützung mit Massenspektrometrie-Protokoll-Design. Die Autoren weiter erkennen Tulane Universität Institut für Zell- und Molekularbiologie und der Tulane Universität Fakultät für Chemie für ihre Unterstützung und die Nutzung des Weltraums und Ausrüstung. Diese Arbeit wurde von einem Tabak Produkt Regulatory Science Research Fellowship C. Anderson von der Tulane University School of Science and Engineering unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 V AC/DC Wall Mount Adaptor Digi-Key T1099-P5P-ND
2.2 Ohm Resistors Digi-Key A105635-ND Used in tandem to generate the 4.4 Ohm resistance in Figure 2A
330 Ohm Resistors Digi-Key 330QBK-ND
510 Threaded Base NJoy N/A Recovered by dismantalling a second generation NJoy electronic cigarette
Acetic Acid, Glacial Sigma-Aldritch A6283
Acetone (Chromatography Grade) Sigma-Aldritch 34850
Basic Stamp Project Board Digi-Key 27112-ND This board contains the BS1 Microcontroller, serial adaptor, power switch, and a barrel pin connector for the AC/DC Wall Mount Adaptor
Basic Stamp USB to Serial Adapter Digi-Key 28030-ND An optional component to allow the BS1 serial adaptor to communicate through USB
Buchner Flask (Vacuum Flask) 250 mL VWR 10545-854
Clear Tape 3M S-9783
Clear Vinyl Tubing, 3/8" ID Watts 443064
EGM-2 Endothelial Cell Culture Medium Lonza CC-3162
Ethanol Pharmco-Aaper 111000200
Flow Regulator Dwyer VFA-23-BV
Gas Chromatograph Varian 450-GC
Glass Syringe, 10 mL Sigma-Aldritch Z314552
Glass Syringe, 10 µL Hamilton 80300
High Vacuum Silicon Grease Dow Corning 146355D
Hose Clamp Precision Brand 35125
Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC PCS-100-013 
Mass Spectrometer Varian 300-MS
Midget Impinger Chemglass CG-1820-01
Neutral Red Sigma-Aldritch N4638
Paraffin Film 3M PM-992
Plate Seal Roller BioRad MSR0001
Plate Seal; Foil Thermo 276014
Ring Stand 20" American Educational Products 7-G15-A
Solenoid Valve (normally open) US Solid USS2-00081
Solid State Relay Digi-Key CLA279-ND
Stand Clamp Eisco CH0688
Syringe Filter, PES, 0.22 um Millipore SLGP033RS
Syringe, 10 mL BD Syringe 309604
Through Hole Stopper, Size 6 VWR 59581-287
Vacuum Pump KNF Neuberger N86KTP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ein Mikrocontroller betrieben Gerät zur Erzeugung von flüssige Extrakte aus herkömmlichen Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol
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Anderson, C. A., Bokota, R. E., Majeste, A. E., Murfee, W. L., Wang, S. A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol. J. Vis. Exp. (131), e56709, doi:10.3791/56709 (2018).More

Anderson, C. A., Bokota, R. E., Majeste, A. E., Murfee, W. L., Wang, S. A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol. J. Vis. Exp. (131), e56709, doi:10.3791/56709 (2018).

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