Summary
Qui, descriviamo un dispositivo di laboratorio programmabile che può essere utilizzato per creare estratti di aerosol di sigaretta elettronica e fumo di sigaretta convenzionale. Questo metodo fornisce un utile strumento per effettuare confronti diretti tra sigarette convenzionali e sigarette elettroniche ed è un punto di ingresso accessibile in ricerca di sigaretta elettronica.
Abstract
Sigarette elettroniche sono il prodotto più popolare di tabacco tra medie e liceali e sono il prodotto di tabacco alternativi più popolare tra gli adulti. Alta qualità, ricerca riproducibile sulle conseguenze dell'uso della sigaretta elettronica è essenziale per la comprensione emergenti preoccupazioni di sanità pubblica e la lavorazione di prova basato su politica di regolamentazione. Mentre un numero crescente di documenti discutere sigarette elettroniche, c'è poca coerenza nei metodi attraverso gruppi e molto poco consenso sui risultati. Qui, descriviamo un dispositivo di laboratorio programmabile che può essere utilizzato per creare estratti di aerosol di sigaretta elettronica e fumo di sigaretta convenzionale. Questo protocollo dettagli istruzioni per il montaggio e il funzionamento di detto dispositivo e viene illustrato l'utilizzo dell'Estratto generato in due applicazioni di esempio: un'analisi di attuabilità in vitro delle cellule e la gas-cromatografia spettrometria di massa. Questo metodo fornisce uno strumento per effettuare confronti diretti tra sigarette convenzionali e sigarette elettroniche ed è un punto di ingresso accessibile in ricerca di sigaretta elettronica.
Introduction
Nonostante uno sforzo concentrato dalle organizzazioni di salute, l'uso del tabacco prodotto rimane la principale causa di morte prevenibile in tutto il mondo, con la maggior parte di questi decessi attribuiti a sigaretta fumatori1. Da quando è entrata sul mercato nel 2003, sigarette elettroniche stanno crescendo in popolarità tra gli utenti dei prodotti del tabacco. Attualmente, le sigarette elettroniche sono l'alternativa più popolare di sigarette convenzionali tra adulti americani (~ 5%)2 e il sistema di consegna di nicotina più popolare tra medio (~ 5,3%) e liceali (~ 16%)3. Se le tendenze attuali continuano, sigarette elettroniche possono essere previsto per sostituire sigarette convenzionali per le generazioni future. Tuttavia, le conseguenze sulla salute dell'uso della sigaretta elettronica rimangono poco chiare.
Ricerca sulle sigarette elettroniche non è stato avviato sul serio fino a quando la sigaretta elettronica popolarità è aumentato rapidamente nel 20133,4. Da quel momento, un numero di modelli differenti è stato impiegato per affrontare la questione della loro tossicità. Tuttavia, i risultati di molti studi sono contrastanti, e mentre sembra che le sigarette elettroniche sono generalmente meno tossiche rispetto alle sigarette convenzionali non c'è nessun consenso corrente relativo alle conseguenze di salute della sigaretta elettronica utilizza5, 6 , 7. la nostra ricerca precedente indica che le sigarette elettroniche sono significativamente meno tossiche per l'endotelio vascolare rispetto alle sigarette convenzionali, nonostante la loro capacità di causare danni al DNA e l'induzione della morte delle cellule e lo stress ossidativa8 . Tuttavia, più ricerca è necessaria prima che possiamo trarre conclusioni definitive circa le conseguenze sulla salute dell'uso della sigaretta elettronica.
Come le sigarette convenzionali sono delle cause principali di malattia vascolare prevenibile9, c'è un crescente interesse per il rischio di salute vascolare della sigaretta elettronica utilizza10,11,12. Al fine di studiare gli effetti delle sigarette elettroniche sul sistema vascolare, il nostro laboratorio ha sviluppato un microcontrollore operati fumatori/vaping dispositivo (Figura 1)8. Questo dispositivo è in grado di generare gli estratti liquidi di entrambi aerosol di fumo o elettronica sigaretta sigaretta convenzionale in solventi o acquose o organiche. Come flusso d'aria è controllato tramite la combinazione di un regolatore di flusso aria regolabile e un programma di temporizzazione PBASIC, il dispositivo può essere utilizzato per generare estratti secondo qualsiasi numero di protocolli definiti dall'utente. Qui dettagliamo il montaggio e il funzionamento di questo dispositivo, come pure due potenziali applicazioni: in vitro valutazione della vitalità cellulare e gas-cromatografia-spettrometria di massa.
Figura 1: dispositivo di fumatori/Vaping. Schema per il montaggio fisico del dispositivo fumatori/vaping sia la sigaretta come sigaretta elettronica (e-cig) configurazione (A) e la configurazione di sigaretta elettronica del serbatoio (B). Componente chiave: 1) porta di inalazione; 2) gorgogliatore insieme primario; 3) gorgogliatore overflow; 4) trappola per vuoto pallone Buchner; 5) elettrovalvola normalmente aperto; 6) BS1 microcontrollore; 7) regolatore di flusso aria; 8) 510 filettato serbatoio sigaretta elettronica base. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. montaggio del dispositivo
- Fissare un 100ml Buchner boccetta (Figura 1, #4) ad un anello in acciaio stand e creare una trappola vuoto riempiendolo con 50 g di cloruro di calcio per servire come diseccante. Tappare con un tappo di gomma attraverso-foro, avvolgere la giunzione di tappo con film di paraffina ed eseguire una pipetta attraverso il foro.
- Utilizzando la tubazione del vinile, collegare la pipetta che si estende dal tappo a un connettore del tubo flessibile di intersezione a t.
- Utilizzando la tubazione del vinile, collegare tra loro i due gorgogliatore (Figura 1, #2 e #3) e collegare l'uscita del gorgogliatore secondo per il connettore del tubo t-intersezione.
- Utilizzando la tubazione del vinile, collegare la porta di ingresso del gorgogliatore prima di servire come una porta di inalazione (Figura 1, #1).
- Tubazione del vinile, collegare il braccio laterale del pallone Buchner alla porta di ingresso di un regolatore di flusso d'aria (Figura 1, #7) e la porta di uscita del regolatore del flusso d'aria per una pompa a vuoto.
- Assemblare il circuito secondo lo schema in Figura 2A.
- Caricare il programma PBASIC SVL.bs1 (Figura 2B, disponibile anche presso https://github.com/ChastainAnderson/SVL) al microcontrollore BS1 (Figura 1, #6) per mezzo di un adattatore seriale e il software del produttore.
- Posto il 510 base filettata (Figura 1 #8) in un anello stand morsetto.
- Utilizzando la tubazione del vinile, collegare l'elettrovalvola (Figura 1, #5) all'estremità libera del connettore del tubo flessibile di intersezione a t.
Nota: Il dispositivo dovrebbe essere completo e pronto per il funzionamento, controllare tutti i giunti per assicurarsi che sono tenuta d'aria e applicare fascette e grasso per vuoto come necessario.
Figura 2: schema elettrico e il codice PBASIC. Figura 2A Mostra lo schema elettrico per il montaggio del circuito elettrico necessario attivare sia la valvola solenoide normalmente aperta e la serpentina di riscaldamento di pulsante attivato sigarette elettroniche (attraverso il 510 filettato elettronico carro armato della sigaretta base). I parametri elettrici della bobina di riscaldamento (p: potenza; R: resistenza; e I: corrente) sono proiettati e dovrebbe essere verificata empiricamente con un multimetro post montaggio. Figura 2B Visualizza il programma di temporizzazione PBASIC necessario per controllare il circuito in Figura 2A (anche disponibile a https://github.com/ChastainAnderson/SVL). Le costanti di temporizzazione SVT & IPT (#5 e #6) sono espressi in unità di ms e sono impostate per fornire un tempo di attivazione di 2 secondi e un tempo di inattività di 28 s. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. conservazione e preparazione del campione
- Conservare tutti i campioni di sigarette convenzionali ed elettronici non aperto al buio in sacchetti di plastica chiusi ermeticamente, a temperatura ambiente.
- Una volta aperto, conservare i campioni in sacchetti di plastica chiusi ermeticamente a 4 ° c, con un tovagliolo di carta per assorbire l'umidità in eccesso.
- Pre-equilibrare tutti i campioni in un humidor di temperatura ambiente a ~ 60% di umidità per almeno 30 minuti prima dell'uso.
3. generale funzionamento del dispositivo di estrazione di sigaretta sigaretta fumo/elettronica Aerosol
- Determinare la massa di ogni e-sigaretta cartomizer/serbatoio pre-vaping utilizzando una bilancia analitica. La differenza di peso di pre/post post vaping utilizzerà per determinare il dosaggio appropriato.
Nota: le sigarette di riferimento di 3R4F si suppone per contenere 0,7 mg di nicotina, e il contenuto di nicotina delle marche di sigarette commerciali può essere determinato da metodi analitici convenzionali13. - Per applicazione di esempio 1, riempire il serbatoio del gorgogliatore primario con 4,3 mL di terreno di coltura delle cellule endoteliali. Per applicazione di esempio 2, riempire il serbatoio con 5 mL di acetone.
-
Preparare la sigaretta elettronica o sigaretta convenzionale per l'estrazione:
- Se si utilizza una sigaretta convenzionale, applicare un pezzo di nastro adesivo trasparente intorno al filtro e mettere un segno facilmente visibile dove la carta delle sigarette si unisce il filtro.
- Se si utilizza una sigaretta come e-sigaretta, assicurarsi che la batteria sia ben carica e il cartomizer avvitato alla batteria.
- Se si utilizza un serbatoio di sigaretta elettronica, assicurarsi che un volume adeguato di liquido sigaretta elettronica viene caricato nel serbatoio e avvitare il serbatoio sulla base filettata 510.
- Inserire la punta della sigaretta convenzionale o elettronico nella porta di inalazione (Figura 1, #1) e fissarlo con una fascetta stringitubo.
- Accendere la pompa del vuoto.
- Regolare il misuratore di portata per tirare 1,65 L/minuto per garantire un soffio di 55 mL per 2 secondi.
- Accendere il microcontrollore. Se si utilizza una sigaretta convenzionale, accendere la sigaretta sulla prima boccata.
- Esegui fino a quando proiettato desiderata concentrazione (in parti per milione o % peso/volume) è raggiunto.
-
Determinare la massa di ogni e-sigaretta cartomizer/tank dopo vaporizzazione utilizzando una bilancia analitica. Confrontare questa misura alla misura presa nel passaggio 3.1 per determinare il totale massa consumato. Calcolare la concentrazione del consumato massa/volume di solvente. Utilizzare la concentrazione molare di nicotina consumata per normalizzare tra prodotti.
- Se una massa insufficiente è stata consumata, restituire la sigaretta elettronica al dispositivo e consumano ulteriormente.
- Se una massa sufficiente o in eccesso è stata consumata, procedere.
4. filtrazione e stoccaggio
- Se l'estratto è da utilizzarsi per la coltura cellulare, filtrare attraverso un filtro per siringa PES da 0,22 µm.
- Utilizzare gli estratti immediatamente o conservare a-80 ° c. Come parte della preparazione per Anderson, et al. 8, aerosol sigaretta elettronica è stato dimostrato di essere stabile per almeno due settimane, e la stabilità della sigaretta fumo fino a due anni è stata stabilita da truffatori, et al. 13.
5. pulizia del dispositivo
- Dopo ogni estrazione, sciacquare i tubi e serbatoi del dispositivo con etanolo al 70% ed acqua deionizzata per impedire riporto tra i campioni.
- Dopo il risciacquo, brevemente eseguire il dispositivo vuoto per consentire il flusso d'aria aiutare l'asciugatura delle linee.
6. applicazione esempio 1: Assorbimento rosso neutro analisi di attuabilità delle cellule
- Eseguire l'estratto come sopra in 4,3 mL di medium di crescita delle cellule endoteliali.
- Un giorno prima, semi di cellule endoteliali di vena ombelicale umana in 96 pozzetti ad una densità di 1 x 104 cellule/wellin 100 µ l di terreno di coltura delle cellule endoteliali.
- Trattare le cellule sostituendo il vecchio terreno di coltura delle cellule endoteliali con entrambi 100 µ l di terreno di coltura fresco delle cellule endoteliali per servire come un controllo o 75 µ l di terreno di crescita delle cellule endoteliali mescolato con 25 µ l di un Estratto di concentrazione di nicotina 2mm consumato (1,4 mg consumato nicotina nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali 4,3 mL) per una concentrazione finale di 500 µM per servire come trattamento.
- Come molti dei componenti di entrambi aerosol di sigaretta elettronica e fumo di sigaretta sono volatili, è possibile utilizzare un foglio di sigillatura per mantenere i pozzetti ermetico.
- Incubare la piastra 18 – 24 h a 37 ° C e 5% CO2.
-
Preparare la soluzione di colorazione di rosso neutro:
- Creare una soluzione stock rosso neutro 100 x sciogliendo 33 mg di colorante rosso neutro in 10 mL di soluzione salina tamponata.
- Poco prima dell'uso, diluire 100 x 1: 100 di soluzione madre in mezzo di coltura cellulare per creare 1 x rosso neutro, soluzione di colorazione.
- Incubare il rosso neutro macchiatura soluzione a 37 ° C per almeno 30 min prima dell'uso e utilizzare immediatamente.
Nota: È normale che alcuni cristalli di precipitare durante l'incubazione. Prestare la massima attenzione per evitare di applicare questi cristalli per i pozzi di cultura cellulare. Se necessario, un filtro,22 µm utilizzabile per filtrare il brodo di rosso neutro e soluzioni di colorazione.
- Rimuovere l'estratto e aggiungere 100 µ l di soluzione per bene, uso in eccesso per creare almeno tre pozzi in bianco per la corretta quantificazione di colorazione di rosso neutro.
- Incubare la piastra a 2 – 4 h a 37 ° C e 5% CO2.
- Rosso neutro, soluzione di macchiatura di rimuovere e lavare 3x da immersione in PBS.
- Applicare rosso neutro de-macchia soluzione (acqua deionizzato il 50%, 49% etanolo, acido acetico 1%).
- Incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione.
- Leggere l'assorbanza a 540 nm.
- Analizzare dati sottraendo il valore medio dei pozzetti bianchi e normalizzante per la media del valore vuoto controllo regolato bene.
7. esempio di applicazione 2: Gas cromatografia spettrometria di massa
- Eseguire l'estrazione come sopra in 5 mL di acetone.
- Eseguire il dispositivo per ottenere una concentrazione finale di ~ 100 parti per milione (peso del liquido consumato/volume di acetone) del vostro campione.
- Utilizzando una siringa di vetro di precisione, iniettare 1 µ l nell'iniettore di un dispositivo di GC-MS. Iniettare a 250 ° C con un 01:20 diviso il rapporto in un sistema di spettrometro gascromatografo accoppiato/quadrupolo equipaggiato con una colonna di ZB-5 con il seguente protocollo di forno: 1 min a 50 ° C; rampa di 10 ° C/min fino a 140 ° C; rampa di 20 ° C/min fino a 300 ° C e tenere premuto per 10 min.
- Una partita di spettri di massa risultanti alla libreria di destinazione per identificare i componenti di aerosol.
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Representative Results
Entro 24 ore dell'esposizione della vena ombelicale umana le cellule endoteliali a Estratto di fumo di sigaretta convenzionale (CSE) o aerosol sigaretta elettronica estrarre (EAE), vi è una significativa (controllo vs CSE P < 0,001; controllo vs EAE P < 0.01; n = 6) riduzione nell'attuabilità delle cellule (Figura 3A). Gli estratti sono stati generati con un profilo puffing di 2, 2 secondi, soffi di 55 mL al minuto e normalizzato basato sulla concentrazione molare di nicotina consumata dal dispositivo. Esposizione a 500 µM consumato nicotina equivalenti di CSE riduce drasticamente le cellule vitali al 11.06 ± 0,28% del controllo, e l'esposizione a 500 µM consumato nicotina equivalenti di EAE riduce cellule vitali a 86,65 ± 4,60% di controllo.
Figura 3B dimostra la separazione di volatilità basato di sigaretta elettronica componenti da una sigaretta elettronica commerciale mediante gascromatografia. I componenti sono poi stati individuati tramite spettrometria di massa quadrupolare. Componenti identificati, in ordine di volatilità, includono: glicole propilenico, acetile propionyl, clorobutanolo, glicerolo, nicotina e acido 3-nitropthalic. Di questi solo glicole propilenico, glicerolo e nicotina sono stati divulgati sull'etichetta di prodotto1.
Figura 3: applicazioni di esempio: cellula attuabilità e GC-MS. Figura 3A Visualizza i risultati di un'analisi di assorbimento rosso neutro eseguiti sulle cellule endoteliali di vena ombelicale umana esposte a 500 µM consumato equivalenti di nicotina o convenzionale di fumo di sigaretta da una sigaretta di riferimento di ricerca 3R4F (CSE) o aerosol di sigaretta elettronica da una sigaretta elettronica disponibile in commercio (EAE). Le barre sono media + /-deviazione standard. Significato determinato da due dalla coda, spaiati, t-test e i risultati hanno indicato da un asterisco: * * P < 0.01; P < 0,001; n = 6. Figura 3B vengono visualizzati i risultati di un gascromatografo di aerosol di sigaretta elettronica solubilizzato in acetone. Picchi rappresentano singoli composti ordinati dal tempo di ritenzione (volatilità) e sono stati identificati mediante spettrometria di massa quadrupolare. 1) glicole propilenico; 2) acetil propionyl; 3) Cloretone; 4) glicerolo; 5) nicotina; 6) 3-nitropthalic acido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Elementi più critici del presente protocollo sono garantendo che il dispositivo è pulito all'inizio e fine di ogni estrazione, e garantendo che tutte le guarnizioni sono mantenute così che il flusso di aria rimane coerenza. Se il dispositivo non è adeguatamente pulito, c'è un rischio di carry over tra i campioni. Inoltre, se il dispositivo viene lasciato sporco per un lungo periodo di aerosol condensato tempo ed asciugato solvente può bloccare il sistema. Nota che è normale per lì per essere una caduta di pressione quando sbuffando una sigaretta convenzionale e il flusso d'aria misuratore deve essere regolato per fornire il flusso d'aria desiderato durante il soffio, non mentre il dispositivo sta tirando l'aria della stanza. Una caratteristica fondamentale di questo metodo è la possibilità di essere adattato per tenere il passo con il progresso della tecnologia di sigaretta elettronica. Per esempio, molte sigarette elettroniche richiedono l'attivazione di premere pulsante della serpentina di riscaldamento. Questo dispositivo incorpora direttamente la serpentina di riscaldamento nel circuito di controllo (Figura 2A) che imita la pressione di un pulsante a intervalli programmati dall'utente. Le limitazioni principali di questo metodo derivano dalla mancanza di ben caratterizzate procedure operative standard per l'uso della sigaretta elettronica. Mentre possiamo usare una ricerca riferimento sigaretta14 e protocolli internazionali15,16 per sigarette convenzionali, ci sono semplicemente adattando questi metodi per sigarette elettroniche e non può garantire che esso in modo appropriato modelli di comportamento degli utenti di sigaretta elettronica. Inoltre, questo protocollo produce Estratto in un mezzo liquido. Mentre questo è appropriato per determinati tipi di cellule, quali le cellule endoteliali, altri tipi di cellule, quali le cellule delle vie aeree, possono essere meglio studiati attraverso l'esposizione diretta agli aerosol di sigaretta elettronica.
La natura di questo dispositivo permette di essere aggiornato come nuove procedure operative sono sviluppate. Diversi punti di modifica di presentano che potrebbe consentire al dispositivo di essere adattato a domande specifiche. Sigarette elettroniche più recenti comprendono una gamma superiore di potenza rispetto ai precedenti modelli di sigarette elettroniche17. Nello schema presentato in Figura 2A, entrambi il resistore adiacente la serpentina di riscaldamento e la serpentina di riscaldamento stesso poteva essere scambiato per componenti con valori di resistenza diversi (o resistenza anche variabile) per modulare la potenza finale utilizzata per compressores il liquido di sigaretta elettronica. Finali di potenza teorico nell'atomizzatore può essere calcolato con le equazioni di potenza convenzionale:
o
dove p: potenza; V: tensione; R: resistenza; e I: corrente.
Come non esiste una procedura di operativo standard internazionale ampiamente accettata per l'uso della sigaretta elettronica, e diversi gruppi potrebbero voler impiegare puffing profili e parametri diversi. Una comune standard la sigaretta elettronica è CORESTA CRM8118, anche se alcuni gruppi continuano a utilizzare versioni modificate dei protocolli di fumatori di sigarette convenzionali quali ISO 3088:201215 e chi TobLabNet SOP 116. Inoltre, molti laboratori continuano a utilizzare regimi specifici di laboratorio e/o istituzione. In questo caso, abbiamo impiegato un profilo di puff onda quadra composta da 2, 2 secondi, soffi di 55 mL / minuto; Tuttavia, la natura modulare, programmabile del dispositivo permette di essere adattato ad altri profili puffing come necessario. Volume di soffio può essere modificato direttamente regolando il misuratore di portata aria. Puff tempo e tempo di attivazione della bobina di riscaldamento può essere modificati modificando le costanti SVT e IPT nel programma SVL.bs1 (Figura 2B, #5 e #6). Se uno desidera de-sincronizzare il tempo puffing e il tempo di attivazione, questo potrebbe essere fatto suddividendo le costanti SVT e IPT, ad es. SVT1 che rappresenta il tempo tra l'attivazione del circuito di riscaldamento e il circuito valvola, SVT2 che rappresenta il tempo tra l'attivazione del circuito valvola e l'inattivazione del circuito di riscaldamento e SVT3 che rappresenta il tempo tra l'inattivazione del circuito di riscaldamento e l'inattivazione del circuito valvola e similarmente per IPT. Mentre la base filettata 510 è comune in molte sigarette elettroniche del carro armato, non è universale. Una base filettata in modo diverso può essere sostituita se l'utente richiede. Se non si desidera un profilo di onda quadra, è possibile sostituire il misuratore di portata aria o elettrovalvola con una componente continua programmabile per rimodellare il profilo di onda.
Come sigaretta elettronica ricerca progredisce, la disponibilità e l'accessibilità della sigaretta elettronica fumo dispositivi rimane un ostacolo. Macchine del fumo di sigaretta sono stati parte integrante della ricerca di prodotti di tabacco già come 1843 e oggi ci sono una varietà di fumatori disponibili in commercio macchine per sigarette convenzionali19,20. Non ci sono più consolidate procedure operative standard per fumatori di sigarette convenzionali21. Tuttavia, molti dispositivi di fumatori di sigarette convenzionali si dimostrò incapace di accuratamente fumare sigarette elettroniche a causa delle differenze di progettazione tra sigarette convenzionali ed elettroniche e le differenze all'interno di sigaretta elettronica marche e modelli, ad esempio: base di diametro, PSI requisiti e la necessità di sensore o pulsante attivazione17. Attualmente non esiste un campo commerciale eterogeneo delle macchine del fumo di sigaretta elettronica che include dispositivi compresi i dispositivi progettati per estrazione diretta aerosol, così come l'esposizione all'interfaccia liquida di aria (ad esempio Borgwalt22 e Vitrocell 22,23). Nonostante la disponibilità di opzioni commerciali, molti gruppi, continuare a utilizzare dispositivi fabbricati all'interno del proprio laboratorio per aerosol estrazione 10,11,12,24, 25 , 26. le motivazioni di questo sono molteplici. In alcuni casi, i ricercatori cercano di meglio modello comportamento umano10. Altri cercano di mantenere la continuità con gli studi precedentemente pubblicati di fumo di sigaretta12. Ancora altri citano direttamente l'inaccessibilità di alternative commerciali come motivazione per laboratorio fabbricazione24. Questi dispositivi assumere molte forme e, in molti casi, utilizzano specifici protocolli di laboratorio. Purtroppo, i meccanismi, l'efficacia e funzionalità di questi dispositivi e protocolli sono spesso sotto-riportati.
La prima delle due applicazioni di esempio presentato sopra (Figura 3A) illustra gli effetti di aerosol di sigaretta elettronica e fumo di sigaretta convenzionale su attuabilità delle cellule endoteliali. Come il fumo di sigaretta convenzionale è stato dimostrato a causa di morte e la disfunzione delle cellule endoteliali9, è ragionevole ipotizzare che la sigaretta elettronica aerosol avrebbe un effetto simile. Per eseguire questo test, abbiamo esposto le cellule endoteliali di vena ombelicale umana alla nicotina livelli equivalenti di Estratto di fumo di sigaretta convenzionale o aerosol sigaretta elettronica estrarre per 24 h. Mentre entrambi aerosol di sigaretta elettronica e fumo di sigaretta convenzionale causare riduzioni statisticamente significative nell'attuabilità delle cellule, la dimensione dell'effetto della sigaretta elettronica aerosol indotto riduzione è ~ 13% mentre la riduzione dopo convenzionale esposizione del fumo di sigaretta si avvicina al 90%. Questo supporta l'idea che le sigarette elettroniche sono meno dannose per il sistema vascolare rispetto alle sigarette tradizionali, ma sono ancora non sicuri. La seconda delle due applicazioni di esempio presentato sopra (Figura 3B) illustra che aerosol sigaretta elettronica estratta in solvente organico può essere separato nei suoi componenti e analizzati tramite spettrometria di massa. L'elenco di componente generato fornisce informazioni circa la precisione di etichettatura in sigaretta elettronica prodotti ed evidenzia alcune componenti potenzialmente dannosi come acetile propionyl (2,3-pentanedione)27. Mentre i componenti identificati in questo esperimento non sono stati quantificati, quantificazione può essere eseguita mediante tecniche analitiche convenzionali come quelli presentati in CORESTA CRM8428.
Qui, abbiamo presentato un dispositivo di laboratorio programmabile in grado di generare Estratto liquido dall'aerosol di fumo o elettronica sigaretta sigaretta convenzionale. Questo dispositivo può ospitare una vasta gamma di disegni di prodotto (ad esempio i marchi commerciali leader della sigaretta elettronica) e il processo di estrazione può essere personalizzato per le specifiche dell'utente. In questo caso specifico, abbiamo dimostrato l'uso dell'Estratto generato in un'analisi di attuabilità delle cellule endoteliali; Tuttavia, gli estratti generati da questo dispositivo potrebbero essere applicati a qualsiasi tipo di unica popolazione cellulare nonché co-coltura, espianto o altro modello in vitro . Questi estratti sono compatibili con un ampio numero di saggi biologici utilizzati frequentemente incluse rilevamento di specie reattive dell'ossigeno e le analisi di proliferazione delle cellule immuno-colorazione convenzionale. Inoltre, la capacità di abbattere la composizione dell'estratto di sigaretta elettronica tramite gas-cromatografia-spettrometria di massa fornisce un punto di partenza per studi dettagliati delle componenti individuali degli aerosol. Nel complesso, questo dispositivo fornisce un punto di ingresso accessibile alla ricerca di sigaretta elettronica.
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Disclosures
Il programma di tabacco prodotto normativo Science Research Fellowship amministrato dalla Tulane University è finanziato da Altria Client Services Regulatory Affairs.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono l'assistenza del Dr. Robert Dotson della Tulane University Dipartimento di cellula e biologia molecolare per la sua assistenza nella redazione del manoscritto e Dr. James Bollinger Tulane University Dipartimento di chimica per la sua assistenza con il progetto di protocollo di spettrometria di massa. Gli autori inoltre riconoscono la Tulane University Dipartimento di cellula e biologia molecolare e il dipartimento di chimica dell'Università di Tulane per il supporto e l'uso dello spazio e attrezzature. Questo lavoro è stato supportato da un tabacco prodotto normativo Science Research Fellowship a C. Anderson dalla Tulane University School of Science e ingegneria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 V AC/DC Wall Mount Adaptor | Digi-Key | T1099-P5P-ND | |
| 2.2 Ohm Resistors | Digi-Key | A105635-ND | Used in tandem to generate the 4.4 Ohm resistance in Figure 2A |
| 330 Ohm Resistors | Digi-Key | 330QBK-ND | |
| 510 Threaded Base | NJoy | N/A | Recovered by dismantalling a second generation NJoy electronic cigarette |
| Acetic Acid, Glacial | Sigma-Aldritch | A6283 | |
| Acetone (Chromatography Grade) | Sigma-Aldritch | 34850 | |
| Basic Stamp Project Board | Digi-Key | 27112-ND | This board contains the BS1 Microcontroller, serial adaptor, power switch, and a barrel pin connector for the AC/DC Wall Mount Adaptor |
| Basic Stamp USB to Serial Adapter | Digi-Key | 28030-ND | An optional component to allow the BS1 serial adaptor to communicate through USB |
| Buchner Flask (Vacuum Flask) 250 mL | VWR | 10545-854 | |
| Clear Tape | 3M | S-9783 | |
| Clear Vinyl Tubing, 3/8" ID | Watts | 443064 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Culture Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Flow Regulator | Dwyer | VFA-23-BV | |
| Gas Chromatograph | Varian | 450-GC | |
| Glass Syringe, 10 mL | Sigma-Aldritch | Z314552 | |
| Glass Syringe, 10 µL | Hamilton | 80300 | |
| High Vacuum Silicon Grease | Dow Corning | 146355D | |
| Hose Clamp | Precision Brand | 35125 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-013 | |
| Mass Spectrometer | Varian | 300-MS | |
| Midget Impinger | Chemglass | CG-1820-01 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldritch | N4638 | |
| Paraffin Film | 3M | PM-992 | |
| Plate Seal Roller | BioRad | MSR0001 | |
| Plate Seal; Foil | Thermo | 276014 | |
| Ring Stand 20" | American Educational Products | 7-G15-A | |
| Solenoid Valve (normally open) | US Solid | USS2-00081 | |
| Solid State Relay | Digi-Key | CLA279-ND | |
| Stand Clamp | Eisco | CH0688 | |
| Syringe Filter, PES, 0.22 um | Millipore | SLGP033RS | |
| Syringe, 10 mL | BD Syringe | 309604 | |
| Through Hole Stopper, Size 6 | VWR | 59581-287 | |
| Vacuum Pump | KNF Neuberger | N86KTP |
References
- World Health Organization. WHO Report on the Global Tobacco Epidemic, 2011. , Italy. (2011).
- Weaver, S. R., Majeed, B. A., Pechacek, T. F., Nyman, A. L., Gregory, K. R., Eriksen, M. P. Use of electronic nicotine delivery systems and other tobacco products among USA adults, 2014: results from a national survey. Int. J. Public Health. 61 (2), 177-188 (2016).
- Singh, T., et al. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011–2015. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 65 (14), 361-367 (2016).
- Corey, C. G., Ambrose, B. K., Apelberg, B. J., King, B. A. Flavored Tobacco Product Use Among Middle and High School Students--United States, 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 64 (38), 1066-1070 (2015).
- Pisinger, C., Døssing, M. A systematic review of health effects of electronic cigarettes. Prev. Med. 69, 248-260 (2014).
- Callahan-Lyon, P. Electronic cigarettes: human health effects. Tob. Control. 23 (Suppl 2), ii36-ii40 (2014).
- Dinakar, C., O'Connor, G. T. The Health Effects of Electronic Cigarettes. N. Engl. J. Med. 375 (14), 1372-1381 (2016).
- Anderson, C., Majeste, A., Hanus, J., Wang, S. E-cigarette aerosol exposure induces reactive oxygen species, DNA damage, and cell death in vascular endothelial cells. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. , (2016).
- U.S. Department of Health and Human Services. The Health Consequences of Smoking: 50 Years of Progress. A Report of the Surgeon General. , Atlanta, GA. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Chronic Disease Prevention and Health Promotion, Office on Smoking and Health (2014).
- Farsalinos, K., et al. Comparison of the Cytotoxic Potential of Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Vapour Extract on Cultured Myocardial Cells. Int. J. Environ. Res. Public. Health. 10 (10), 5146-5162 (2013).
- Schweitzer, K. S., et al. Endothelial disruptive proinflammatory effects of nicotine and e-cigarette vapor exposures. Am. J. Physiol. - Lung Cell. Mol. Physiol. 309 (2), L175-L187 (2015).
- Putzhammer, R., et al. Vapours of US and EU Market Leader Electronic Cigarette Brands and Liquids Are Cytotoxic for Human Vascular Endothelial Cells. PLOS ONE. 11 (6), e0157337 (2016).
- Crooks, I., Dillon, D. M., Scott, J. K., Ballantyne, M., Meredith, C. The effect of long term storage on tobacco smoke particulate matter in in vitro genotoxicity and cytotoxicity assays. Regul. Toxicol. Pharmacol. 65 (2), 196-200 (2013).
- Roemer, E., et al. Mainstream Smoke Chemistry and in Vitro and In Vivo Toxicity of the Reference Cigarettes 3R4F and 2R4F. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 25 (1), (2014).
- International Organization for Standards. ISO 3088:2012 Routine analytical cigarette smoking machine – Definitions and standard conditions. , (2012).
- World Health Organization. Standard Operating Procedure for Intense Smoking of Cigarettes. , (2012).
- Brown, C. J., Cheng, J. M. Electronic cigarettes: product characterisation and design considerations. Tob. Control. 23 (Suppl 2), ii4-ii10 (2014).
- Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco. CRM No. 81 - Routine Analytical Machine for E-Cigarette Aerosol Generation and Collection - Definitions and Standard Conditions. , (2015).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Exp. Toxicol. Pathol. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Klus, H., Boenke-Nimphius, B., Müller, L. Cigarette Mainstream Smoke: The Evolution of Methods and Devices for Generation, Exposure and Collection. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 27 (4), (2016).
- Baker, R. The Development and Significance of Standards for Smoking-Machine Methodology. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 20 (1), (2014).
- Thorne, D., Crooks, I., Hollings, M., Seymour, A., Meredith, C., Gaca, M. The mutagenic assessment of an electronic-cigarette and reference cigarette smoke using the Ames assay in strains TA98 and TA100. Mutat. Res. Toxicol. Environ. Mutagen. 812, 29-38 (2016).
- Thorne, D., Larard, S., Baxter, A., Meredith, C., Gaҫa, M. The comparative in vitro assessment of e-cigarette and cigarette smoke aerosols using the γH2AX assay and applied dose measurements. Toxicol. Lett. 265, 170-178 (2017).
- Herrington, J. S., Myers, C. Electronic cigarette solutions and resultant aerosol profiles. J. Chromatogr. A. 1418, 192-199 (2015).
- Yu, V., et al. Electronic cigarettes induce DNA strand breaks and cell death independently of nicotine in cell lines. Oral Oncol. 52, 58-65 (2016).
- Ji, E. H., et al. Characterization of Electronic Cigarette Aerosol and Its Induction of Oxidative Stress Response in Oral Keratinocytes. PLOS ONE. 11 (5), e0154447 (2016).
- Morgan, D. L., et al. Chemical Reactivity and Respiratory Toxicity of the -Diketone Flavoring Agents: 2,3-Butanedione, 2,3-Pentanedione, and 2,3-Hexanedione. Toxicol. Pathol. 44 (5), 763-783 (2016).
- Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco. CRM No. 84 - Determination of Glycerin, Propylene Glycol, Water, and Nicotine in the Aerosol of E-Cigarettes by Gas Chromatographic Analysis. , (2017).
