Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Dissektion og eksplantat kultur af Murine Allantois til In Vitro -analyse af allantois vedhæftet fil

Published: January 13, 2018 doi: 10.3791/56712

Summary

Vi beskriver en i vitro assay til model chorioallantoic vedhæftet fil, det første skridt i moderkagen dannelse. Protokollen viser murine allantoides på immobiliserede α4β1 integrin dissektion og eksplantat kultur. Allantois udlæg er evalueret mikroskopisk på forud fastsatte tidspunkter.

Abstract

Moderkagen er afgørende for vækst og udvikling af pattedyr embryoner. Af denne grund, kan mange genetiske ændringer og sandsynligvis også miljømæssige fornærmelser, som forstyrrer moderkagen udvikling eller funktion forårsage tidlig graviditet tab i mus og mennesker. Ikke desto mindre, simple in vitro- assays til at screene for potentielle virkninger på moderkagen dannelse mangler. Her fokuserer vi på modellering det første og afgørende skridt i moderkagen dannelse, som består af allantois tilknytning til chorion. Vi beskriver en metode til hurtigt at vurdere udlæg i allantois explants på immobiliserede α4β1 Integra, som fungerer som en chorio-mimetiske substrat. Denne in vitro- metode muliggør en kvalitativ vurdering af den vedhæftede fil og sprede adfærd af flere allantois explants på forskellige på hinanden følgende tidspunkter. Protokollen kan bruges til at undersøge effekten af målrettede mus mutationer, narkotika eller forskellige miljømæssige faktorer, der har været knyttet til graviditetskomplikationer eller føtal tab på allantois vedhæftet fil ex vivo.

Introduction

Moderkagen er uundværlige for embryonale vækst og udvikling i den uterine miljø. Det udgør grænsefladen for ilt, metabolit, og næringsstof udveksling mellem føtal og maternel omsætning, og også funktioner som en endokrine og immunologiske orgel. En endogen eller eksogen fornærmelse, der forringer placenta udvikling kan føre til intrauterin væksthæmning, føtal tab eller graviditetskomplikationer, både mus og mennesker1. Mens antallet af målrettede mus mutationer, der forårsager unormal placenta fysiologi fortsætter med at stige2, med 219 genotyper i øjeblikket opført på webstedet mus genom Informatik (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), mange af disse fænotyper er ikke velbeskrevet fra et mekanisk synspunkt. Ud over genetiske ændringer, lille molekyle narkotika, monoklonale antistoffer, toksiner, kan patogener, overskydende metabolitter eller forskellige miljømæssige agenter påvirke moderkagen udvikling og funktion3,4,5 , 6 , 7. endnu, enkel in vitro- undersøgelser, at model kritiske trin i moderkagen udvikling er knappe.

Murine placenta udvikling initieres i tidlige midgestation, når allantois (den udviklingsmæssige forløber for navlestrengen) opstår fra den bageste ende af fosteret som et bud, der vokser mod chorion8. Chorioadhesive celler i de yderste lag af allantois bud mægle den vedhæftede fil og spredning af allantois på overfladen af chorion (chorioallantoic "fusion"). Chorion folder efterfølgende i villi, hvori Vaskulaturen af allantois vokser til at danne labyrinten, den inderste placenta lag hvor næringsstoffer og ilt udveksles mellem tæt sidestillede maternelle blod sinusoids og embryonale fartøjer9 ,10.

Allantois tilknytning til chorion er det første og afgørende skridt i labyrint dannelse, og mangler i denne proces er blandt de mest almindelige årsager til embryonale dødelighed i midgestation1. Selv om en række mus mutanter har været beskrevet hvor chorioallantoic vedhæftet undlader at forekomme10, og MGI databasen i øjeblikket viser 108 mus mutanter, der er kendetegnet ved unormal chorioallantoic fusion (http:// www.Informatics.Jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), intercellulære samspillet mellem vaskulære celle vedhæftning molekyle-1 (VCAM-1, udtrykt på den allantois mesoderm) og α4β1 integrin (udtrykt på chorion mesothelium, som er afledt af extraembryonic mesoderm) synes at være uundværlig for chorioallantoic vedhæftet fil og fusion11,12,13. Immunhistokemisk farvning af hele-mount vildtype embryoner har vist at VCAM-1 er udtrykt i den distale totredjedele af allantois stokken på ca embryonale dag (E) 7,513 (1-4 somite fase), og at dens udtryk er stadig høj under chorioallantoic vedhæftet fil og -fusion11,12. Manglende allantois tilknytning til chorion er typisk opdaget af histologiske analyser af livmoderen knopper. Men allantois størrelser er fysiologisk meget varierende i mellem og selv inden for kuld af den samme udviklingsstadiet14, og allantois kan kun knytte til chorion når det har nået en tilstrækkelig størrelse til at gøre fysisk kontakt. Afspejler denne naturlige variabilitet, chorioallantoic udlæg finder sted engang imellem ~ E 8.0 og E 9.0 i uteroog en statistisk pålidelig evaluering af denne proces af histologi er derfor afhængige af analysen af et stort antal conceptuses at få nok prøver på den passende udviklingsstadiet.

Her, beskriver vi en metode til at vurdere allantois vedhæftede ex utero som er mindre afhængige af allantois størrelse. Vi demonstrere dissektion af musen embryoner og deres allantoides fra livmoder af gravide mus ~ 8 dage post coitum (dpc; dpc 0,5 udpeger påvisning af en vaginal plug), og den efterfølgende kultur af allantois explants på immobiliserede α4β1 integriner. Denne metode giver mulighed for en hurtig, funktionel evaluering af den vedhæftede fil og sprede adfærd af flere allantois explants parallelt og på forskellige successive tidspunkter. Protokollen kan anvendes til at screene for målrettede mutationer, narkotika eller forskellige miljøfaktorers indvirkning på allantois vedhæftet fil ex vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Musen avl blev godkendt af Regierung Unterfranken, og alle analyser blev udført i nøje overensstemmelse med alle tyske og Europæiske Union gældende love og bestemmelser vedrørende pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1. belægning af mikrotiter plader med α4β1 Integrin for Ex Utero Allantois eksplantat kultur

  1. Rekonstruere den frysetørrede murine α4β1 integrin på 200 µg/mL i sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Fortyndes til en slutkoncentration på 10 µg/mL i pre varmede (37 ° C) PBS. Med pipette overfoeres 20 µL/brønd af fortyndede α4β1 integrin løsning til det krævede antal brønde i et mikrotiter plade (1 allantois/brønd).
    Bemærk: Undgå dannelsen af luftbobler når belægning brønde i mikrotiter-pladen.
  2. Inkuber mikrotiter plader til 60 minutter ved 37 ° C ved at placere dem i en fugtig vævskultur inkubator.
  3. Omhyggeligt Aspirér supernatanten med en pipette. Brug blide suge og skråtstillet plade til at undgå at røre godt bunden med pipette spids. Vask wells to gange ved at tilføje 50 µL af pre varmede (37 ° C) næringssubstratet såsom Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM), og fjern vask medium af blide suge.
  4. Kritiske trin: blok gratis bindende websteder ved at tilføje 50 µL/brønd af 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) / DMEM og inkuberes i ≥ 30 minutter ved 37 ° C ved at placere mikrotiter plader i en fugtig vævskultur inkubator.
    Bemærk: Allantois explants kan vedhæfte forskellige overflader i serum. Det er derfor bydende nødvendigt at blokere ikke-specifikke bindingssteder, efter belægning brønde med Integra, og før du tilføjer den dissekeret allantois for explant kultur i serum-holdige medium (Se trin 4.4).
  5. Holde de coatede brønde i den blokerende løsning ved 37 ° C indtil det skal bruges i trin 4.4.

2. livmoderen dissektion fra en gravid mus på Dpc 8

Bemærk: Reducere falsk-positive graviditet satser af vægt gevinst forskelsbehandling15.

  1. Ofre musen ved cervikal dislokation. Desinficere frakke i abdominale område ved at sprøjte det med 70% (v/v) ethanol.
    Bemærk: Brug handsker når du håndterer mus. Eutanasi af cervikal dislokation uden anæstetika forhindrer kemiske forurening af allantois, som kan forstyrre allantois vedhæftet fil.
  2. Åbn den abdominale hud ved at lave et lille snit på midterlinjen med saks. Brug behandskede fingre til at holde huden over og under indsnittet, og trække huden fra hinanden mod brystet og hale af musen.
  3. Forstå bughinden med pincet. Med anden hånden, gør en V-formet incision fra anterior retning posterior ved hjælp af saks, og flytte væv væk til at afsløre i bughulen. Bruge pincet til at skubbe tarmen til den ene side for at få adgang til livmoderen.
  4. Find de to uterin horn. Hold livmoderhalsen (den caudale segment) med pincet og skære ledbånd med fine sakse. Derefter frigør begge uterin horn ved overskæring af æggelederne med saks.
  5. Bruge pincet overføre livmoderen i en steril 10 cm parabol der indeholder sterilt, stuetemperatur (RT) PBS. Fjern fedtvæv, fartøjer og nerver omkring de uterine horn med fine pincet og/eller saks (figur 1A).

3. embryo dissektion

Bemærk: Følg denne fremgangsmåde under et stereomikroskop udstyret med en 8:1 zoomområdet.

  1. Adskille embryoner ved skæring mellem implantation websteder med en saks. Forstå muskuløs livmoderen foring af livmoderen knopper med pincet og trække den fra hinanden for at udsætte decidua (figur 1B).
  2. Brug af pincet, overføre livmoderen knopper ind i en ny 10 cm parabol der indeholder sterilt, RT PBS.
  3. Fix decidua omkring fosteret med spidsen af pincet.
  4. Gøre et snit på anti-mesometrial siden af decidua med fine pincet (figur 1 c), og skræl decidua væk med pincet til at udsætte fosteret (fig. 1 d).
    Bemærk: Mesometrial pol på decidua er yderst vaskulariserede og kan være større på sin base end den anti-mesometrial del, som indeholder fosteret og synes lysere.
  5. Dissekere fosteret med pincet (figur 1E, F).
  6. Ved hjælp af en mikro-skeen, overføre embryonet til en dråbe af steril PBS indeholdt i en steril 3,5 cm parabol.
  7. Overføre embryonet til en frisk drop PBS i samme 3,5 cm parabol med en mikro-ske, og dissekere embryo fra blommesækken med pincet (figur 1 g, H).
  8. Valgfrit, hvis det er nødvendigt (f.eks.til genotypebestemmelse ved polymerase kæde reaktion), overføre blommesækken ind i en steril rør af sugning det med ~ 5 µL PBS til en stor blænde 200 µL pipette tip. Opbevares ved-20 ° C.
    Bemærk: Maternelle væv (dvs., parietal blommesækken herunder Reicherts membran og ectoplacental kegle), der kan forurene blommesækken forberedelse kan føre til fejlagtige genotypebestemmelse resultater. Fjernelse af disse væv er nemmeste før embryo dissektion fra blommesækken.

4. allantois dissektion og Ex Utero kultur på immobiliserede α4β1 Integrin

  1. Skær allantois fra sin basal indføringsstedet for posterior enden af embryoner ved hjælp af fine pincet (figur 1 H).
  2. Valgfrit, hvis udviklingsmæssige iscenesættelse er påkrævet, tælle somite par af fosteret ved visuel inspektion ved hjælp af et mikroskop udstyret med fase kontrast optik og en 5 × og 10 × mål.
    Bemærk: Fosteret kan udvides med pincet til at lette somite tælle. Chorioallantoic udlæg og fusion opstår mellem E 8.0 og E 9.0 i embryoner med ≥ 6 somite par. Drejning begynder i embryoner med 6-8 somite par.
  3. Pipette 40 µL/brønd af DMEM suppleret med 10% (v/v) føtal bovint serum, L-glutamin og antibiotika i det nødvendige antal præ-coatede mikrotiter plade wells (Se afsnit 1).
  4. Indsamle de flydende allantois ved sugning det med ~ 5 µL PBS til en stor blænde af en 200 µL pipette tip. Overføre 1 allantois/godt.
  5. Inkuber i allantoides ved at placere mikrotiter plader i befugtet vævskultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) for fx6, 12 og 24 h. For at undgå interferens med allantois vedhæftet fil, Flyt ikke mikrotiter plader i mellem disse tidspunkter.
  6. På hvert tidspunkt, score allantois vedhæftet fil (f.eks., ingen vedhæftet fil/flydende allantois helt eller delvist vedlagte allantois; fuldt spredning allantois) ved hjælp af et mikroskop udstyret med fase kontrast eller differential interferens kontrast optik og en 5 × eller 10 × mål (figur 2).
    Bemærk: Repræsentative eksempler på frisk isoleret og fuldt ud vedhæftede allantoides er vist i figur 2. Ex utero, den distale spidsen af allantoides isoleret fra vildtype C57BL/6J mus lægger inden for 4-6 h (dette kaldes delvis udlæg i allantois), og fuld udlæg i den hele allantois opnås inden for ~ 12 h af kultur. Af 18-24 h, har eksplantat fladtrykt og antog en cirkulær figur (kaldet som fuldt sprede allantois) med en CD31-positive vaskulære plexus9,16.

5. bekræftende farvning af det eksplanterede Allantois i Endothelial celle markør CD31

  1. Opsug næringssubstratet af fuldt opslag explants og lave cellerne ved at tilføje 40 µL/brønd 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD/PBS.
    Bemærk: PARAFORMALDEHYD er giftigt. Bære handsker og beskyttelsesbriller til at undgå hud- og øjenkontakt.
  2. Der inkuberes i 10 min. ved RT, så Aspirér supernatanten. Vaskes tre gange ved at tilføje 40 µL/brønd af PBS, og fjerne vask medium af blide suge.
  3. Permeabilize celler og blokere ikke-specifik binding websteder ved at tilføje 40 µL/brønd af 0,1% (v/v) Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) normal ged serum i PBS for 30 min på RT. Wash to gange ved at tilføje 40 µL/brønd af PBS, og fjerne vask medium af blide suge.
    Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt natten på dette punkt.
  4. Pletten celler ved at tilføje 20 µL/brønd af primære anti-CD31 antistoffer fortyndes 1:50 i 0,1% (w/v) BSA/PBS natten over ved 4 ° C. Vaskes tre gange ved at tilføje 40 µL/brønd af PBS, og fjerne vask medium af blide suge.
  5. Bundne primære antistoffer ved at tilføje 20 µL/brønd af fluorescently mærket sekundære ged anti-rotte antistoffer fortyndet 1:200 i 0,1% (w/v) BSA/PBS for 1 h på RT. Protect mikrotiter plader fra lys af indpakning i aluminiumsfolie eller ved at placere i et mørkt kammer. Vaskes tre gange ved at tilføje 40 µL/brønd af PBS, og fjerne vask medium af blide suge.
  6. Integrere celler ved at tilføje 20 µL/brønd af montering medium. Inkuber i ~ 1 h i RT indtil montering medium er størknet. Gemme mikrotiter plader på RT eller ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
  7. Billede af vaskulære plexus af allantois explants under et fluorescens mikroskop udstyret med en 5 × eller 10 × objektive og passende fluorescens filtre.
    Bemærk: Repræsentative billeder af den CD31-positive vaskulære plexus af en fuldt spredning allantois er vist i figur 3. Andre markører for den vaskulære plexus, såsom antistoffer rettet mod Flk-1, Flt, slips-1 eller Tie-2 kan bruges som godt16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver en metode til at isolere og explant murine allantoides ex vivo, og oplysninger om den kvalitative vurdering af allantois vedhæftet fil til α4β1 Integra, en kritisk proces under i vivo chorioallantoic fusion. Repræsentative resultaterne vist i figur 1A-H demonstrere de successive trin allantois isolation fra den gravide uterus. Maternelle væv, der omgiver den uterine horn, fedtvæv og fartøjer (figur 1A) er fjernet, og embryoner er dissekeret fra endometriet i en trinvis måde efter åbningen den muskulære uterin lag (figur 1B- E). Senere, andre maternelle væv såsom parietal blommesækken og ectoplacental kegle er fjernet (figur 1E, F). Figur 1 g - H viser, at teknikken består af dissektion af den extraembryonic allantois fra blommesækken, en anden extraembryonic og stærkt vaskulariserede væv. Således er allantoides isoleret efter denne protokol stort set fri for kontaminerende maternel eller (ekstra) embryonale væv end allantois.

Figur 2 viser, at størrelsen og formen af allantoides fra frisk dissekeret embryoner i et enkelt kuld kan variere betydeligt14. Allantoides af C57BL/6J vildtype embryoner dissekeret på E 8.5 havde et aflangt morfologi i 74% af tilfældene (45 61 analyseret embryoner), som vist i figur 2 og figur 1 H. Men i 15% (9/61) af embryoner, allantoides var markant mindre og mere afrundede (Se reference14) og 11% (7/61) af embryonerne havde endnu ikke dannet et synligt allantois på tidspunktet for dissektion. Trods forskelligartede former og størrelser på det udgangspunkt allantois-tid explant kultur (figur 2, bedømmelseskomite en-h), allantois vedhæftet fil og fuld spredning på immobiliserede α4β1 integrin blev observeret inden for 12 timer i alt af de 54 frisk isolerede allantoides dissekeret fra embryoner af syv kuld. Ikke desto mindre, former og størrelser af explants efter 12 h kultur var noget heterogene (figur 2), som afspejler de forskellige allantois morfologier på udgangspunktet for analysen.

Figur 3 viser en andre farvning for CD31-positive endotelceller i fuldt vedlagte allantoides efter 24 h af eksplantat kultur, som bekræfter, at explants havde udarbejdet en vaskulær plexus af dette tidspunkt, som forventede9 , 16. sådan vedhængende allantois kulturer kan bruges til at studere blodkar formation in vitro-9. Derfor offentliggjort præsenteres metode udbytter allantois explants, der kan være let kulturperler ex vivo, efter aftale med tidligere eksperimentelle undersøgelser9,16.

Protokollen opstiller rammerne for mikroskopi-baseret vurdering af allantois vedhæftet fil på forud fastsatte tidspunkter, som efter 12 timer eller 24 h af eksplantat kultur. Resultaterne kan evalueres på en kvalitativ måde (delvis/fuld vedhæftet fil eller fuld spredning på et givet tidspunkt-ja/nej). Da de samme eksplantat kan være gentagne gange visualiseret og scorede, afspejler denne analyse, Karakteristik af individuelle allantois explant kulturer over tid. Derudover dannelsen af en vaskulær plexus i faste og farves explants kan blive vurderet (figur 3).

Figure 1
Figur 1: repræsentant trin i allantois dissektion. (A) detaljer se af en isoleret uterin horn. Livmoderen knopper indeholdende embryonerne er præget af stjerner; fedtvæv og fartøjer omgiver den uterine horn ses i venstre side. (B) visning af decidua (endometriet) efter fjernelse af en muskuløs lag af livmoderen. Den stærkt vaskulariserede, mesometrial pol på decidua er orienteret mod venstre, den anti-mesometrial del (markeret med en stjerne), der indeholder fosteret er orienteret til højre. (C) Side Se af dissekerede anti-mesometrial pol af decidua (markeret med en stjerne). Pilen angiver placeringen af embryoet. (D) Top view af conceptus (pil) omgivet af parietal blommesækken efter delvis fjernelse af de omkringliggende decidua. (E, F) Repræsentant udsigt over efterfølgende trin i dissektion af embryo (pil). Pilespidsen angiver blommesækken. I (E) er ectoplacental kegle (epc) synligt til højre. (G) delvis dissektion af embryo (pil) fra blommesækken (pilespidser). Allantois er markeret med en rød stjerne. (H) isolerede embryo (pil) med allantois (rød stjerne). Den position, hvor allantois vil blive skåret fra sin basal indsættelsesstedet på den bageste ende af embryonet er angivet med en rød brudt linje. Billeder blev taget på et stereomikroskop med en 8:1 zoomområdet. Alle skala barer er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: heterogene former og størrelser af allantoides. Otte allantoides (en-h) blev isoleret fra embryoner fra et enkelt kuld. Venstre panel, allantoides straks efter dissektionen (0 h). Højre panel, de samme allantoides efter 12 h af eksplantat kultur. Explants er solidt fastgjort, og mesenchymale celler har spredt. Explants er cirkel for at visualisere eksplantat størrelser. Billeder blev taget på et mikroskop udstyret med fase kontrast optik og en 5 × (venstre panel) eller en 10 × mål (højre panel). Alle skala barer er 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: vaskulære plexus dannelse i allantois eksplantat kulturer. Allantoides var dissekeret og eksplanterede på immobiliserede α4β1 integrin som beskrevet i denne protokol. Explants var kulturperler i 24 timer, og endotelceller i vaskulære plexus var farves ved hjælp af anti-CD31 primære antistoffer og fluorescently mærket sekundære antistoffer. Endotelceller vises med grønt. Det øverste billede viser den hele vaskulære plexus i det centrale område af en repræsentativ allantois eksplantat. Billedet blev taget på et mikroskop udstyret med fluorescens optik og en 5 × mål. Skalalinjen, 500 µm. De to nederste paneler er højere forstørrelse billeder af en anden allantois eksplantat dissekeret og kulturperler på de samme betingelser. Fartøj-lignende strukturer og individuelle endotelceller kan ses. Billeder blev taget på en Konfokal mikroskop; skalere barer, 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I nærværelse af serum, der er en rig kilde af Pro selvklæbende ekstracellulære matrix molekyler såsom fibronektin, vil allantois explants let tillægger forskellige plast, glas eller filter overflader9,16. Derfor, hvis formålet med udføres analysen er specifikt undersøge effekten af en genetisk modifikation eller enhver anden behandling på allantois tilknytning til ubevaegeligt α4β1, er det kritisk at blokere ikke-specifik binding websteder (f.eks.med bovint serum albumin) efter overfladebehandling med Integra og før inkubere med serum-holdige medier.

Allantois explants indledende tillægger immobiliseret α4β1 integrin er meget følsomme over for bevægelse, og vævskultur plader bør derfor stå uforstyrret for en forud fastsat frist (f.eks.12 h) inden scoring allantois vedhæftet fil. Bemærk, at den tid, der kræves for stabil kontakt dannelse med substratet kan variere afhængigt af analyseret mouse stamme eller koncentrationen af immobiliserede α4β1 integrin.

Kravet om den intercellulære VCAM-1/α4β1-interaktion for succesfuld chorioallantoic fusion er veletableret11,12,13. Derudover kan ekstracellulære matrix molekyler såsom fibronektin, collagens og andre molekyler af interesse også immobiliserede og bruges som "chorio-mimetiske" substrater.

Chorioallantoic udlæg er afhængig af intercellulære samspillet mellem VCAM-1 og dets bindende partner integrin α4β1. In utero, chorioallantoic vedhæftet fil og efterfølgende fusion kan kun opstå, når allantois er tilstrækkeligt udbygget hen til gøre kontakt med chorion. Givet den fysiologiske variabilitet i allantois størrelser på et bestemt udviklingsmæssige stadie, chorioallantoic vedhæftet fil og fusion finde sted engang mellem E 8.0 og E 9.0 (range, E 7,5-E 9.25)14,16. Metoder til specifikt studie den forbigående proces af allantois vedhæftet fil til chorion plade i utero i levende mus ikke er umiddelbart tilgængelige på præsentere. Snarere, analyser er for det meste fokuserede på besværlige bestemmelse af chorioallantoic fusion af histologisk vurdering af fx, allantois spredning på overfladen af chorion og udviklingen af labyrinten lag på et enkelt, forudbestemt tid punkt11,12,13,16. Dette slutpunkt analyse kan ikke skelne mellem fejl, der er specifikt på grund af nedsat fastgørelse af allantois chorion og chorion-afhængige effekter, og er begrænset af den iboende variabilitet i embryo udviklingstrin og allantois størrelser. Som omtalt under Repræsentative resultater, den fysiologiske variation i allantois størrelser kan resultere i en relativ forsinkelse i chorioallantoic fusion i ~ 26% af C57BL/6J vildtype embryoner. Statistisk set, ville næsten to ud af syv gravide mus have derfor været ofret for tidligt (61 embryoner fra syv kuld, gennemsnitlige kuldstørrelse 8.7), som oversætter til nødvendigheden af en betydelig avl overskydende for større undersøgelser. Interessant, har microsurgical eksperimenter afsløret at chorion allerede er kompetente til at smelte med allantois på stadiet 1 somite par, og at allantois udstiller maksimal fusion kapacitet i embryoner med 3-5 somite par14. Derfor er chorioadhesive celler i allantois dannet og funktionelt kompetente forud for den faktiske chorioallantoic vedhæftet in vivo. Ex utero analyse af allantois tilknytning til immobiliseret ligander, er som præsenteres her, derfor relativt uafhængig af en given allantois størrelse. En fordel ved denne metode er derfor, at det omgår defekter i allantois strækforlængelse, og fokuserer på det næste trin i moderkagen dannelse, dvs., chorioallantois vedhæftet fil. Denne fremgangsmåde kan således anvendes til at skelne mellem defekter i allantois strækforlængelse og chorioallantois udlæg i genetiske mus mutanter.

I modsætning til den traditionelle metode til allantois aspiration fra sin vedhæftet fil point til fosteret ved hjælp af en mund pipette16, den nuværende protokol bruger en manuel skæring tilgang og allantois er efterfølgende håndteres ved hjælp af store blænde pipette tips . En vigtig fordel af allantois aspiration er, at denne metode undgår direkte væv håndtering. Skæring og manipulere allantois kan beskadige chorioadhesive cellerne i den ydre kappe af allantois mesothelium. Ikke desto mindre, skar allantois med pincet held har været anvendt før i ex vivo kulturer af pre-placental væv17, og kinetik af allantois eksplantat vedhæftet fil og morfologi af eksplantat kulturer er beskrevet i den foreliggende undersøgelse sammenlignes med offentliggjorte data baseret på allantois isolation af aspiration16. Disse resultater tyder at chorioadhesive celler er tilstrækkeligt velbevaret ved manuel skæring af allantois, og at eksplantat differentiering er ikke groft desorienterede, som angivet ved dannelsen af CD31-positive endothelia. Direkte opskæring af allantois også tilbyder muligheden for at dissekere kun de øverste to tredjedele af allantois der udtrykker VCAM-113, og det sikrer mindre forurening med blommesækken-afledte celler, som kan have til at være trimmet væk fra bunden af den allantois efter allantois aspiration18.

Ex utero analysen af allantois eksplantat adhæsion til immobiliseret, rekombinante α4β1 integrin giver en kvalitativ udlæsning af et vigtigt, indledende skridt, der er nødvendig for chorioallantoic fusion, dvs, intercellulære samspillet mellem VCAM-1 udtrykt på allantois, og α4β1 integrin lokaliseret chorion mesothelium, som er afledt af extraembryonic mesoderm. Ikke desto mindre, selv om disse to adhæsionsmolekyler genkendes som princippet spillere i chorioallantoic fusion, ~ 50% af fostre med homozygot knockout mutationer i VCAM-1 eller α4-integrin gennemgå chorioallantoic fusion i vivo11 ,12,13. På grund af denne ufuldstændig penetrans, ex vivo metode beskrevet i denne protokol muligvis ikke tilstrækkelig til at udelukke et krav om disse to adhæsionsmolekyler i genetiske modeller med et nederlag til chorioallantoic fusion.

Fysiologiske betingelser, α4β1 integriner er indlejret i plasma membranen af chorion trophoblasts, og er indarbejdet i et indviklet netværk af strukturelle og signalering proteiner, der samarbejder for at regulere celle-celle (og celle-matrix) friktion 19. som med de fleste reduktionistiske in vitro- metoder, kompleksiteten af grænsefladen chorion VCAM-1 bindende er kun modelleret i meget begrænset omfang af immobiliserede α4β1 integrin. Udover den mulige mangel på andre vigtige strukturelle eller signaling input stammer fra den intakte chorion i dette system, er det sandsynligt, at kun en brøkdel af den integriner der er immobiliseret på en stiv, to-dimensionelle overflade findes i aktive bindende-kompetente, "åben" kropsbygning.

Metoden præsenteres tilnærmer den tidlige tilknytning og sprede trin af allantois til chorion, og kan også betænkningen om udvikling af allantois vaskulære plexus når kombineret med analysen af fartoej formation9. Men den nuværende tilgang ikke model invasionen af chorion af spiring angiogenese medieret af allantois endotelceller, eller afspejler det forgrenede morfogenese af chorion, som er en vigtig proces for chorioallantoic fusion og den efterfølgende udvikling af placenta labyrint10.

Ved hjælp af fasekontrast eller differential interferens mikroskopi kombineret med (semi-) automatiseret billedanalyse, den præsenterede metode kunne anvendes i større skærme for den indledende analyse af forsinket eller mislykkede allantois vedhæftet in vitro. Ud over analysen af musen mutanter, kan metoden være af interesse at screene virkningerne af narkotika, patogener, metabolitter eller miljømæssige agenter på allantois vedhæftet fil.

I talrige mus mutanter undlader chorioallantoic vedhæftet at opstå, selv om allantois og chorion synes at have udviklet normalt. Derudover vise mutanter, der viser chorioallantoic vedhæftet fil mangler typisk ufuldstændig penetrans1,2,10. Det vil være vigtigt at undersøge, om disse funktionelt tilsyneladende meget forskellige gener påvirker fælles molekylære veje og/eller cellulære processer. Live imaging af allantois explants stammer fra mus mutanter har potentiale til at belyse sådanne mekanismer. For eksempel, celler i den ydre kappe af dissekerede allantois kunne mærkes med vitale fluorescerende farvestoffer (såsom DiI eller DiO lipofile carbocyanine røbestoffer16,18) til billedet vedhæftning og sprede begivenheder, eller til at spore celle overførsel i realtid. Derudover fluorescerende journalister, der visualiserer cytoskeleton eller vedhæftning proteiner kan vise sig for at være informativ.

For nylig en ex vivo co kultur system for forudgående udlæg murine allantoides og chorions er blevet beskrevet, og denne tilgang blev med succes brugt til at undersøge hændelser, der opstår efter chorioallantoic vedhæftet fil, såsom labyrint lag dannelsen17. Analyse af allantois vedhæftet fil effektivitet på immobiliserede chorions isoleret fra forskellige (f.eks.genmodificerede) musemodeller kan give ny indsigt i de molekylære spillere og veje, der styrer tidlige trin i udviklingen af den murine moderkagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (til A.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J wildtype mice The Jackson Laboratory Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol VWR International 930031006
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-12 Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps Fine Science Tools 11254-20 Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip. 
Fine scissors  Fine Science Tools 14094-11 Straight blades.
Spring scissors  Fine Science Tools 15012-12 Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon Carl Roth AT18.1 5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates ibidi 81501 We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic.
10 cm dish Nunc 150350 Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish Nunc 150288 Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips  Biozym VT0140X Low binding pipette tips, 200 µL.
α4β1 integrin R&D Systems 6054-A4 Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich D8537 Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) PAN Biotech P04-03600 The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin Gibco (ThermoFisher Scientific) 15140-122 100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine PAN Biotech P04-80100 100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum  Biochrom S 0115 We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A7030 We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde Carl Roth 0335.2 To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks. 
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum Sigma Aldrich G9023 To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
α-CD31 Antibodies BD Biosciences 550274 Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies Thermo Fisher A-11006 Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381 Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert  Leitz Labovert  Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.  
M80 Leica Microsystems M80 Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B Leica Microsystems DM4000B Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment. 
Digital camera JVC KY-F75U 3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope Leica Microsystems SP5 Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
  2. Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160 (2016).
  3. Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
  4. Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
  5. Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
  6. Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
  7. Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
  8. Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
  9. Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
  10. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
  11. Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
  12. Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
  13. Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
  14. Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
  15. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
  16. Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
  17. Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
  18. Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
  19. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).

Tags

Medicin sag 131 Allantois α4β1 chorioallantoic fusion chorion Integra labyrint placenta vaskulære celle vedhæftning molekyle-1 (VCAM-1)
Dissektion og eksplantat kultur af Murine Allantois til <em>In Vitro</em> -analyse af allantois vedhæftet fil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hadamek, K., Keller, A., Gohla, A.More

Hadamek, K., Keller, A., Gohla, A. Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment. J. Vis. Exp. (131), e56712, doi:10.3791/56712 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter