Dissectie en Explant cultuur van lymfkliertest Allantois voor de In Vitro analyse van allantoïs bijlage

Summary

We beschrijven een in vitro assay model chorion gehechtheid, de eerste stap in de vorming van de placenta. Het protocol blijkt de dissectie en explant cultuur van lymfkliertest allantoides op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine. Allantois bijlage wordt microscopisch beoordeeld op vooraf bepaalde tijdstippen.

Abstract

De placenta is essentieel voor de groei en ontwikkeling van zoogdieren embryo's. Om deze reden vele genetische veranderingen en waarschijnlijk ook milieu beledigingen die verstoren de ontwikkeling van de placenta of functie kunnen leiden tot vroege zwangerschap verlies bij muizen en mensen. Niettemin, is het eenvoudig in vitro testen om te screenen op de mogelijke gevolgen voor de vorming van de placenta ontbreken. Hier, concentreren we op het modelleren van de eerste en essentiële stap in de vorming van de placenta, die uit de gehechtheid van de allantois aan het chorion bestaat. Beschrijven we een methode om snel beoordelen van de gehechtheid van allantoïs explantaten op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine, die als een chorio-mimetische substraat fungeert. Deze aanpak in vitro kunnen een kwalitatieve evaluatie van de bijlage en het verspreiden van gedrag van meerdere allantois explantaten op verschillende opeenvolgende tijdstippen. Het protocol kan worden gebruikt voor het onderzoeken van het effect van gerichte muis mutaties, drugs of verschillende omgevingsfactoren die zijn gekoppeld aan de zwangerschapscomplicaties of foetus verlies op allantois bijlage ex vivo.

Introduction

De placenta is onmisbaar voor embryonale groei en ontwikkeling in de baarmoeder omgeving. Het vormt de interface voor zuurstof, metaboliet, en voedende gegevensuitwisseling tussen de foetale en maternale circulatie, en ook functies als endocriene en immunologisch orgaan. Een endogene of exogene belediging dat belemmert de ontwikkeling van de placenta kan leiden tot uteriene groei retardatie, foetale verlies of zwangerschapscomplicaties, zowel in mens¹in muizen. Terwijl het aantal gerichte muis mutaties die leiden abnormale placenta fysiologie tot blijft toenemen², met 219 genotypen momenteel vermeld op de website van de muis genoom informatica (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), veel van deze fenotypen zijn niet goed wordt begrepen vanuit een mechanistische oogpunt. Naast genetische veranderingen, klein molecuul drugs, monoklonale antilichamen, toxinen, ziekteverwekkers, overtollige metabolieten of verschillende milieu-agentia kunnen invloed op de ontwikkeling van de placenta en functie^{3,4,5 , 6 , 7}. toch eenvoudig in vitro testen dat model kritische stappen in de ontwikkeling van de placenta schaars zijn.

Lymfkliertest placenta ontwikkeling wordt gestart in de vroege midgestation, wanneer de allantois (de ontwikkelingstoxiciteit voorloper van de navelstreng) komt naar voren uit het posterieure einde van het embryo als een knop die naar de chorion-^{8 groeit}. Chorioadhesive cellen in de buitenste laag van de allantoïs kiem bemiddelen de gehechtheid en de verspreiding van de allantois op het oppervlak van het chorion (chorion "fusion"). De chorion vouwen vervolgens in villi waarin de therapieën van de allantois groeit om te vormen van het labyrint, de placenta binnenlaag waar voedingsstoffen en zuurstof uitgewisseld tussen dicht naast elkaar geplaatste moederlijk bloed sinusoïdes en embryonale vaartuigen^{9 ,10}.

De bevestiging van de allantois aan de chorion is de eerste en essentiële stap in labyrint vorming en gebreken in dit proces behoren tot de meest voorkomende oorzaken van embryonale letaliteit in midgestation¹. Hoewel een aantal mutanten muis hebben beschreven waar chorion gehechtheid mislukt optreden van¹⁰en de MGI-database bevat momenteel 108 muis mutanten die worden gekenmerkt door abnormale chorion fusion (http:// www.Informatics.Jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), de intercellulaire interactie tussen de vasculaire cel adhesie molecuul-1 (VCAM-1, uitgedrukt op het allantoïs mesoderm) en α4β1 integrine (uitgedrukt op de chorionic mesothelium, die is afgeleid van extraembryonic mesoderm) lijkt te zijn onmisbaar voor het chorion gehechtheid en fusion^11,12,13. Immunohistochemische kleuring van geheel-mount wild-type embryo's is gebleken dat VCAM-1 wordt uitgedrukt in de distale tweederde van de allantoïs stengel op ongeveer embryonale dag (E) 7,5¹³ (1-4 Somiet fase), en dat haar expressie hoog blijft tijdens het chorion gehechtheid en -fusion^11,12. Gebrek allantoïs gehechtheid aan het chorion wordt normaal gesproken gedetecteerd door histologische analyses van baarmoeder toppen. Echter, allantois maten zijn fysiologisch zeer variabel in tussen, en zelfs binnen de nesten van de dezelfde ontwikkelingsstadium¹⁴, en de allantois kunt alleen toevoegen aan de chorion wanneer het een voldoende omvang te maken van fysiek contact heeft bereikt. Als gevolg van deze natuurlijke variabiliteit, chorion bijlage vindt plaats ergens tussen ~ E 8.0 en 9.0 E in uteroen een statistisch betrouwbare evaluatie van dit proces door histologie is daarom afhankelijk van de analyse van een groot aantal conceptuses verkrijgen van voldoende exemplaren op de juiste ontwikkelingsstadium.

Hier beschrijven we een methode om te beoordelen allantoïs bijlage ex utero dat is minder afhankelijk van de grootte van de allantois. We tonen de dissectie van muis embryo's en hun allantoides uit de baarmoeders van zwangere muizen ~ 8 dagen post coitum (dpc; dpc 0,5 geeft de detectie van een vaginale plug), en de daaropvolgende cultuur van allantois explants op geïmmobiliseerdet α4β1 Integrins. Deze methode maakt een snelle, functionele evaluatie van de bijlage en het verspreiden van gedrag van meerdere allantois explantaten parallel en op verschillende opeenvolgende tijdstippen. Het protocol kan worden gebruikt aan het scherm voor de gevolgen van gerichte mutaties, drugs of verschillende omgevingsfactoren voor allantois bijlage ex vivo.

Protocol

Muis fokken werd goedgekeurd door de Regierung Unterfranken, en alle analyses werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met alle Duitse en Europese Unie geldende wetten en regelgeving inzake verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. coating van de microtiterplaat platen met α4β1 integrine voor Ex Utero Allantois Explant cultuur

1. Het reconstrueren van het gelyofiliseerd lymfkliertest α4β1 integrine bij 200 µg/mL in steriel-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verdun tot een eindconcentratie van 10 µg/mL in voorverwarmde (37 ° C) PBS. Pipetteer 20 µL per putje van de verdunde α4β1 integrine oplossing in het vereiste aantal putjes van de plaat van een microtiterplaat (1 allantois per putje).
   Opmerking: Vermijd de vorming van luchtbellen wanneer de putjes van de microtiterplaat plaat coating.
2. Incubeer de platen van de microtiterplaat gedurende 60 minuten bij 37 ° C door ze te plaatsen in een bevochtigde weefselkweek incubator.
3. Zorgvuldig gecombineerd het supernatant met een pipet. Gebruik zachte zuigkracht en helling van de plaat om te voorkomen dat de goed bodem met het puntje van de pipet aan te raken. Was de putjes goed tweemaal door het toevoegen van 50 µL voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium zoals Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM), en verwijder het medium wassen door zachte zuigkracht.
4. Kritieke stap: blok bindend gratis sites door toevoeging van 50 µL per putje van 0,1% (g/v) bovien serumalbumine (BSA) / DMEM en incubeer gedurende ≥ 30 minuten bij 37 ° C door het plaatsen van de microtiterplaat platen in een bevochtigde weefselkweek incubator.
   Opmerking: Allantois explantaten kunnen koppelen aan verschillende oppervlakken in aanwezigheid van serum. Het is daarom noodzakelijk om het blokkeren van aspecifieke bandplaatsen, na coating explant de putjes met integrine en voordat u toevoegt de ontleed allantois voor cultuur in het serum-bevattende medium (zie stap 4.4).
5. Houd de gecoate putjes in de blokkerende oplossing bij 37 ° C totdat nodig in stap 4.4.

2. baarmoeder dissectie van een zwangere muis op Dpc 8

Opmerking: Verminderen vals-positieve zwangerschapscijfers door gewicht winst discriminatie¹⁵.

1. Offeren de muis door cervicale dislocatie. Desinfecteer de vacht in de buikstreek door het spuiten met ethanol 70% (v/v).
   Opmerking: Draag handschoenen bij het verwerken van muizen. Euthanasie door cervicale dislocatie zonder verdoving voorkomt chemische verontreiniging van de allantois, die allantois bijlage kan verstoren.
2. Open de buikhuid doordat een kleine incisie in de schouderstreek met een schaar. Gehandschoende vingers gebruiken om te houden van de huid boven en onder de incisie, en trek de huid uit elkaar naar de borst en de staart van de muis.
3. Pak het buikvlies met een tang. Met de andere hand, maak een V-vormige insnijding van anterior naar posterior met behulp van schaar en verplaats het weefsel weg te bloot van de buikholte. Gebruik de verlostang om te duwen van de darmen aan de ene kant om toegang tot de baarmoeder te krijgen.
4. Zoek de twee baarmoeder horens. Houd de baarmoederhals (het caudal segment) met een tang en de ligamenten snijd met een fijn schaar. Los vervolgens beide baarmoeder horens door doorsnijden omvat de oviducts met een schaar.
5. Gebruik pincet overdracht van de baarmoeder in een steriele 10 cm schotel met steriel PBS kamertemperatuur (RT). Het verwijderen van het vetweefsel, de schepen en de zenuwen rondom de baarmoeder horens met fijne pincet en/of schaar (figuur 1A).

3. de embryo dissectie

Opmerking: Voer de volgende stappen uit onder een stereomicroscoop uitgerust met een zoombereik van 8:1.

1. Scheid de embryo's door te snijden tussen de implantatie-sites met een schaar. Begrijpen van de gespierde baarmoederslijmvlies van de baarmoeder-toppen met een tang en trek hem uit elkaar om de decidua (figuur 1B) bloot te stellen.
2. Met behulp van Tang, breng de baarmoeder knoppen in een nieuwe 10 cm schotel met steriele, RT PBS.
3. Fix de decidua rond het embryo met de uiteinden van het pincet.
4. Maken van een incisie aan de kant van de anti-mesometrial van de decidua met fijne pincet (Figuur 1 c), en schil de decidua weg met een tang aan het blootstellen van het embryo (Figuur 1 d).
   Opmerking: De pool van de mesometrial van de decidua is zeer gevacuoliseerd en kan verder op het basis dan het deel van de anti-mesometrial, die het embryo bevat en het lijkt bleker.
5. Het ontleden van het embryo met een tang (figuur 1E, F).
6. Met behulp van een micro-spoon, breng het embryo in een daling van steriele PBS vervat in een steriele 3,5 cm schotel.
7. Het embryo overboeken naar een verse daling van PBS in de dezelfde 3,5 cm schotel met behulp van een micro-spoon, en het ontleden van het embryo van de dooierzak met pincet (figuur 1G, H).
8. Optioneel, indien nodig (bijvoorbeeldvoor genotypering door de Kettingreactie van de polymerase), breng de dooierzak in een steriele buis door aspirating met ~ 5 µL PBS in een grote opening 200 µL pipette uiteinde. Winkel bij-20 ° C.
   Opmerking: Moederlijke weefsel (dat wil zeggen, de pariëtale dooierzak waaronder Reichert van membraan en de ectoplacental-kegel) dat de dooierzak voorbereiding besmetten kan kan leiden tot onjuiste genotypering resultaten. Verwijdering van deze weefsels is makkelijkste vóór de embryo dissectie van de dooierzak.

4. allantois dissectie en Ex Utero cultuur op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine

1. Snijd de allantois van de site van de basale invoeging posterieure eind van het embryo met fijne pincet (Figuur 1 H).
2. Optioneel, als ontwikkelings enscenering vereist is, tellen de Somiet paren van het embryo visuele inspectie met behulp van een Microscoop uitgerust met fase contrast optiek en een 5 × 10 × doelstelling.
   Opmerking: Het embryo kan worden uitgebreid met een tang om Somiet tellen. Chorion gehechtheid en fusie plaatsvinden tussen E 8.0 en 9.0 E in embryo's met ≥ 6 Somiet paren. Draaien begint in embryo's met 6-8 Somiet paren.
3. Pipetteer 40 µL per putje van DMEM aangevuld met 10% (v/v) foetale runderserum, L-glutamine en antibiotica in het vereiste aantal vooraf gecoate microtiterplaat plaat wells (zie paragraaf 1).
4. Verzamelen van de zwevende allantois door aspirating met ~ 5 µL PBS in een grote opening voor een 200 µL pipette uiteinde. Breng 1 allantois per putje.
5. Incubeer de allantoides door het plaatsen van de microtiterplaat platen in een bevochtigde weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO₂) voor bv6, 12 en 24 h. Ter vermijding van interferentie met allantois bijlage, Verplaats niet de microtiterplaat platen tussen de punten van deze tijd.
6. Score op elk tijdstip, allantois bijlage (b.v., geen bijlage/zwevend allantois gedeeltelijk of volledig aangesloten allantois; volledig verspreiding allantois) met behulp van een Microscoop uitgerust met fase contrast of differentieel interferentie contrast optiek en een 5 × of 10 × doelstelling (Figuur 2).
   Opmerking: Representatieve voorbeelden van vers geïsoleerd en volledig aangesloten allantoides staan in Figuur 2. Ex utero, hecht het distale uiteinde van allantoides geïsoleerd van wildtype C57BL/6J muizen binnen 4-6 uur (dit is bedoeld als gedeeltelijke bijlage van de allantois), en volledige bevestiging van het hele allantois wordt bereikt binnen ~ 12u van cultuur. Door 18-24 h, heeft de explant afgevlakt en een ronde vorm (bedoeld om uit te spreiden als volledig allantois) met een CD31-positief vasculaire plexus^9,16aangenomen.

5. confirmatieve kleuring van het transplanteren Allantois voor de CD31 van de Marker Endothelial cel

1. Gecombineerd het kweekmedium van volledig verspreiding explantaten en monteren van de cellen door 40 µL per putje van 4% (m/v) paraformaldehyde/PBS toe te voegen.
   Opmerking: Paraformaldehyde is giftig. Draag handschoenen en veiligheidsbril voor huid- en oogcontact vermijden.
2. Incubeer gedurende 10 min op RT, waarna het supernatant gecombineerd. Spoel driemaal door 40 µL per putje van PBS toe te voegen, en het wassen-medium verwijderen door zachte zuigkracht.
3. Permeabilize van de cellen en blokkeren van aspecifieke bandplaatsen door toevoeging van 40 µL per putje van 0,1% (v/v) serum van de normale geit Triton X-100/0.1% (m/v) BSA/10% (v/v) in PBS voor 30 min op RT. Wash tweemaal door het toevoegen van 40 µL per putje van PBS, en het wassen-medium verwijderen door zachte zuigkracht.
   Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd 's nachts op dit punt.
4. Vlekken van cellen door het toevoegen van 20 µL per putje van primaire anti-CD31 antilichamen verdund tot 1:50 in 0,1% (g/v) BSA/PBS's nachts bij 4 ° C. Spoel driemaal door 40 µL per putje van PBS toe te voegen, en het wassen-medium verwijderen door zachte zuigkracht.
5. Opsporing van afhankelijke primaire antilichamen door toevoeging van 20 µL per putje van secundaire geit fluorescently gelabelde antilichamen anti-rat verdunde 1:200 in 0,1% (g/v) BSA/PBS voor 1 h op RT. Protect microtiterplaat platen van licht door inwikkeling in aluminiumfolie of door het plaatsen in een donkere kamer. Spoel driemaal door 40 µL per putje van PBS toe te voegen, en het wassen-medium verwijderen door zachte zuigkracht.
6. Insluiten cellen door 20 µL per putje van montage medium toe te voegen. Incubeer gedurende ~ 1 h bij RT totdat het montage medium heeft verhard. Opslaan microtiterplaat platen op RT of bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
7. Beeld de vasculaire plexus van de allantois explants onder een fluorescentie Microscoop uitgerust met een 5 × of 10 × doelstelling en geschikt fluorescentie filters.
   Opmerking: Representatieve beelden van de CD31-positieve vasculaire plexus van een volledig verspreiding allantois zijn afgebeeld in Figuur 3. Andere markeringen voor de vasculaire plexus, zoals antilichamen gericht tegen Flk-1, Flt, Tie-1 of Tie-2 kan worden gebruikt als goed¹⁶.

Representative Results

Dit protocol beschrijft een methode om te isoleren en explant lymfkliertest allantoides ex vivo, en details van de kwalitatieve beoordeling van allantois gehechtheid aan α4β1 integrine, een kritische proces tijdens in vivo chorion fusion. De representatieve resultaten die worden weergegeven in figuur 1A-H tonen de opeenvolgende stappen van isolatie van de allantois vanaf de zwangere baarmoeder. Maternale weefsels die de baarmoeder horens, zoals adipeus weefsel en vaartuigen (figuur 1A omringen) zijn verwijderd, en embryo's van het endometrium stapsgewijs worden ontleed na opening van de gespierde uteriene laag (figuur 1B- E). Daarna, andere moeders weefsels zoals de pariëtale dooierzak en de kegel van ectoplacental zijn verwijderd (figuur 1E, F). Figuur 1G - H toont dat de techniek de dissectie van de extraembryonic allantois uit de buurt van de dooierzak, een andere extraembryonic en sterk gevacuoliseerd weefsel omvat. Allantoides geïsoleerd volgens dit protocol zijn dus grotendeels vrij zijn van contaminerende moeders of (extra) embryonale weefsels dan de allantois.

Figuur 2 toont aan dat de grootte en de vorm van allantoides uit vers ontleed embryo's in één enkele nest aanzienlijk^{14 verschillen kunnen}. Allantoides van C57BL/6J wildtype embryo's ontleed bij E 8.5 had een verlengde morfologie bij 74% van de gevallen (45 van 61 geanalyseerde embryo's), zoals aangegeven in Figuur 2 en Figuur 1 H. Echter, in 15% (9/61) van de embryo's, de allantoides aanmerkelijk kleiner waren en meer afgerond (zie referentie¹⁴) en 11% (7/61) van de embryo's had niet nog gevormd een zichtbare allantois op het moment van de dissectie. Ondanks de heterogene soorten en maten bij het beginpunt van de tijd van allantois explant cultuur (Figuur 2, panelen een-,h), allantois bijlage en volledige spreiding op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine werd waargenomen binnen 12 uur in totaal van de 54 vers geïsoleerde allantoides ontleed van embryo's van zeven nestjes. Niettemin, de soorten en de maten van de explantaten na 12u van cultuur waren enigszins heterogene (Figuur 2), als gevolg van de verschillende allantoïs morphologies op het beginpunt van de bepaling.

Figuur 3 toont een immunocytochemische kleuring voor de endotheliale cellen van de CD31-positieve in volledig aangesloten allantoides na 24 h van explant cultuur, die bevestigt dat de explantaten een vasculaire plexus had uitgewerkt door dit punt van tijd, als de verwachte^{9 , 16}. dergelijke aanhangend allantois culturen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van bloedvat vorming in vitro⁹. Vandaar, de voorgestelde methodologie opbrengsten allantois explantaten die gemakkelijk gekweekte ex vivo, in overeenstemming met eerder kunnen gepubliceerd experimentele studies^9,16.

Het protocol stelt het kader voor de evaluatie op basis van microscopie van allantois bijlage op vooraf bepaalde tijdstippen, zoals na 12 h of 24 h van explant cultuur. De resultaten kunnen worden geëvalueerd op een kwalitatieve manier (gedeeltelijk/volledig bijlage of volledige verspreiding op een bepaald tijdstip – Ja/Nee). Omdat het dezelfde explant kan herhaaldelijk worden gevisualiseerd en scoorde, weerspiegelt deze analyse dat de kenmerken van de individuele allantois explant culturen na verloop van tijd. Bovendien, de vorming van een vasculaire plexus in vaste en gebeitst explantaten kan worden beoordeeld (Figuur 3).

Figuur 1: vertegenwoordiger stappen in allantois dissectie. (A) Detail bekijken van een geïsoleerde uteriene hoorn. Baarmoeder-toppen met de embryo's worden gemarkeerd door de sterren; vetweefsel en schepen rond de baarmoeder hoorn worden gezien aan de linkerkant. (B) weergave van de decidua (het endometrium) na verwijdering van de gespierde laag van de baarmoeder. De zeer gevacuoliseerd, mesometrial pole voor de decidua is gericht op links, de anti-mesometrial deel (gemarkeerd met een ster) waarin het embryo is gericht aan de rechterkant. (C) kant bekijken van de rotatiepool ontleed anti-mesometrial de decidua (gemarkeerd met een ster). De pijl geeft de locatie van het embryo. (D) bovenaanzicht van het conceptus (pijl), omringd door de pariëtale dooierzak na gedeeltelijke verwijdering van de omliggende decidua. (E, F) Representatieve uitzicht op opeenvolgende stappen in de dissectie van het embryo (pijl). De pijlpunt geeft de dooierzak. (E) is de ectoplacental cone (epc) zichtbaar aan de rechterkant. (G) gedeeltelijke dissectie van het embryo (pijl) uit de dooierzak (pijlpunten). Het allantois is gemarkeerd met een rode ster te behalen. (H) geïsoleerde embryo (pijl) met allantois (rode ster). De positie waar de allantois zal worden gesneden van de basale invoeging site posterieure eind van het embryo wordt aangegeven met een rode gebroken lijn. Beelden werden genomen op een stereomicroscoop met een zoombereik van 8:1. Alle schaal bars zijn 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: heterogene vormen en maten van allantoides. Acht allantoides (een-h) werden geïsoleerd uit embryo's van één enkele nest. Links paneel, allantoides onmiddellijk na dissectie (0 h). Rechterdeel van het menude zelfde allantoides na 12u van explant cultuur. De explantaten zijn stevig en mesenchymale cellen zich hebben verspreid. De explantaten worden omcirkeld om te visualiseren explant maten. Beelden werden genomen op een Microscoop uitgerust met fase contrast optiek en een 5 × (linkerdeel) of een 10 × doelstelling (rechtervenster). Alle schaal bars zijn 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: vasculaire plexus vorming in allantois explant culturen. Allantoides werden ontleed en transplanteren op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine zoals beschreven in dit protocol. Explantaten werden gekweekt voor 24 h, en endotheliale cellen in de vasculaire plexus waren bevlekt met behulp van anti-CD31 primaire antilichamen en fluorescently label secundaire antilichamen. Endotheliale cellen worden weergegeven in het groen. De bovenste afbeelding toont de gehele vasculaire plexus in het centrale gedeelte van een representatieve allantois explant. Het beeld werd genomen op een Microscoop uitgerust met fluorescentie optica en een doelstelling 5 ×. Schaal bar, 500 µm. De twee onderste panelen zijn beelden met een hogere vergroting van een andere allantois explant ontleed en gekweekt onder dezelfde voorwaarden. Vaartuig-achtige structuren en afzonderlijke endotheliale cellen kunnen worden gezien. Beelden werden genomen op een confocal microscoop; schaal van bars, 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

In aanwezigheid van serum, die een rijke bron van Pro-lijm extracellulaire matrix moleculen zoals fibronectin is, zal allantois explantaten gemakkelijk hechten aan verschillende kunststof, glas of^9,16van de oppervlakken van de filter. Als het doel van de uitgevoerde test is te specifiek onderzoeken van het effect van een genetische modificatie of iedere andere behandeling op allantois gehechtheid aan geïmmobiliseerd α4β1, is het dus cruciaal voor het blokkeren van aspecifieke bandplaatsen (b.v.met boviene serum albumine) na coating het oppervlak met integrine en vóór het incuberen met serum-bevattende media.

De eerste gehechtheid van allantois explantaten aan geïmmobiliseerdet α4β1 integrine is zeer gevoelig voor beweging en de weefselkweek platen moeten daarom worden ongemoeid gelaten voor een vooraf bepaalde periode (bijvoorbeeldvoor 12u) vóór het scoren van allantois bijlage. Merk op dat de tijd die nodig is voor stabiel contact vorming met het substraat afhankelijk van de geanalyseerde muis stam of de concentratie van geïmmobiliseerdet α4β1 integrine variëren kan.

De eis van de intercellulaire VCAM-1/α4β1-interactie voor succesvolle chorion fusion is stevig gevestigde^11,12,13. Daarnaast kunnen extracellulaire matrix moleculen zoals fibronectin, collagens en andere moleculen van belang ook worden geïmmobiliseerd en gebruikt als "chorio-mimetische" substraten.

Chorion bijlage is afhankelijk van de intercellulaire interactie tussen VCAM-1 en haar bindende partner integrine-α4β1. In utero, chorion bijlage en latere fusion kunnen alleen plaatsvinden wanneer de allantois is voldoende uitgebreid om contact met het chorion. Gezien de fysiologische variabiliteit in allantois maten op een bepaald ontwikkelingsstadium, chorion gehechtheid en fusie plaatsvinden ergens tussen E 8.0 en 9.0 E (bereik, E 7.5-E 9,25)^14,16. Methoden om specifiek onderzoek het voorbijgaande proces van allantois gehechtheid aan de chorionic plaat in utero in de levende muis zijn niet beschikbaar op presenteren. Eerder, analyses zijn meestal gericht op de moeizame bepaling van chorion fusion door histologische beoordeling van bijvoorbeeld, allantoïs verspreiden op het oppervlak van de chorion en de ontwikkeling van de labyrint laag bij een honkslag, vooraf bepaalde tijd punt^11,12,13,16. De analyse van dit eindpunt kan niet discrimineren tussen gebreken die specifiek als gevolg van de verminderde bevestiging van de allantois aan de chorion en chorion-afhankelijke effecten, en is beperkt door de inherente variabiliteit in embryo ontwikkelingsstadia en allantoïs maten. Zoals besproken onder Vertegenwoordiger resultaten, de fysiologische variabiliteit in allantois maten kan resulteren in een relatieve vertraging in chorion fusie in ~ 26% van de C57BL/6J wildtype embryo's. Statistisch gezien, zou bijna twee op de zeven zwangere muizen daarom geweest beul te vroeg (61 embryo's uit zeven nesten, nest van gemiddelde grootte 8,7), wat zich vertaalt in de noodzaak van een aanzienlijke fokken overtollige voor grootschaliger studies. Interessant, hebben microchirurgische experimenten aangetoond dat de chorion al bevoegd om te fuseren met de allantois het stadium 1 Somiet paar is, en dat de allantois vertoont maximale fusion capaciteit in embryo's met 3-5 Somiet paren¹⁴. Vandaar, chorioadhesive cellen van de allantois worden gevormd en functioneel bevoegde voorafgaand aan de werkelijke chorion bijlage in vivo. De ex utero -analyse van allantois gehechtheid aan geïmmobiliseerdet liganden, is zoals hier gepresenteerd daarom relatief onafhankelijk van de grootte van een bepaalde allantois. Vandaar, een voordeel van deze methode is dat het rondweg van de defecten in de allantois rek, en richt zich op de volgende stap in de vorming van de placenta, dat wil zeggen, chorioallantois bijlage. Deze benadering kan dus worden gebruikt gebreken in de allantois rek en chorioallantois bijlage in genetische muis mutanten te onderscheiden.

In tegenstelling tot de traditionele methode van aspiratie van de allantois vanaf de punt van de bijlage aan het embryo met behulp van een pipet mond¹⁶, het huidige protocol gebruikt een handmatige aanpak en de allantois wordt vervolgens behandeld met behulp van grote opening Pipetteer tips . Een belangrijk voordeel van allantois streven is dat deze methode directe weefsel behandeling vermeden. Knippen en manipuleren van de allantois kunnen de chorioadhesive cellen in de buitenste omhulsel van de allantoïs mesothelium beschadigen. Echter de allantois snijden met een tang is met succes gebruikt voordat in ex vivo culturen van pre-placental weefsels¹⁷en de kinetiek van allantoïs explant gehechtheid en de morfologie van de explant culturen beschreven in de huidige studie zijn vergelijkbaar met de gepubliceerde gegevens gebaseerd op de allantois isolatie van aspiratie¹⁶. Deze bevindingen suggereren dat chorioadhesive cellen voldoende goed bewaard op handmatig snijden van de allantois gebleven zijn, en dat explant differentiatie is schromelijk niet verstoord, zoals aangegeven door de vorming van CD31-positieve endothelia. Direct snijden van de allantois ook biedt de mogelijkheid om alleen de bovenste twee derden van de allantois die uitdrukking geven aan VCAM-1¹³ontleden, en hierdoor minder verontreiniging met dooierzak-afgeleide cellen, die wellicht wilt bijsnijden uit de buurt van de basis van de allantois na allantois aspiratie¹⁸.

De ex utero analyse van allantoïs explant hechting op geïmmobiliseerd, recombinante α4β1 integrine biedt een kwalitatieve uitlezing van een belangrijke, eerste stap die vereist is voor het chorion fusion, dat wil zeggen, de intercellulaire interactie tussen VCAM-1 uitgedrukt op de allantois en een α4β1 integrine gelokaliseerde chorionic mesothelium, die wordt afgeleid uit extraembryonic mesoderm. Toch, hoewel deze twee celadhesie-moleculen worden herkend als beginsel spelers in chorion fusion, ~ 50% van de embryo's met homozygoot knockout mutaties in VCAM-1 of α4 integrine ondergaan chorion fusion in vivo^{11 ,12,},¹³. Vanwege dit onvolledige doordringendheid wellicht de ex vivo methode, beschreven in het huidige protocol volstaat niet uit een vereiste voor deze twee celadhesie-moleculen in genetische modellen met een mislukking van de chorion fusie te sluiten.

Onder fysiologische omstandigheden, α4β1 integrins in het plasma-membraan van chorionic trophoblasts worden ingebed, en zijn opgenomen in een ingewikkelde netwerk van structurele en signalering eiwitten die samenwerken om het reguleren van de cel (en cel-matrix) hechting ¹⁹. zoals met de meeste reductionistische in vitro benaderingen, is de complexiteit van de chorionic VCAM-1 bindende interface alleen gemodelleerd in zeer beperkte mate door geïmmobiliseerdet α4β1 integrine. Naast het mogelijke gebrek aan andere belangrijke structurele of signalering ingangen afgeleid van de intact chorion in dit systeem, is het waarschijnlijk dat slechts een fractie van de integrins die zijn geïmmobiliseerd op een rigide, twee-dimensionale oppervlak aanwezig zijn in de actieve bindende-bevoegde, "open" conformatie.

De onderhavige methode benadert de vroege gehechtheid en verspreiding van de stap van de allantois naar de chorion, en kan ook verslag over de ontwikkeling van het allantoïs vasculaire plexus in combinatie met de analyse van schip vorming⁹. Echter, de huidige aanpak is niet de invasie van de chorion model door het kiemen van de angiogenese gemedieerd door allantoïs endotheliale cellen, noch weerspiegelt het vertakkende morfogenese door het chorion, die een essentieel proces voor chorion fusion is en de verdere ontwikkeling van de placenta labyrint¹⁰.

Met fase contrast of differentiële interferentie microscopie in combinatie met (semi-) automatische beeldanalyse, de onderhavige methode kan worden toegepast in grotere schermen voor de eerste analyse van vertraagde of mislukte allantoïs bijlage in vitro. Naast de analyse van muis mutanten, kan de methode van belang om het scherm van de effecten van drugs, ziekteverwekkers, metabolieten of milieu-agentia op allantoïs bijlage zijn.

In talrijke muis mutanten verbroken chorion bijlage optreden, ondanks de allantois en het chorion lijken te hebben ontwikkeld normaal. Bovendien, mutanten die chorion bijlage gebreken meestal vertonen onvolledige doordringendheid^1,2,10weergeven Het is belangrijk om te onderzoeken of deze functioneel blijkbaar zeer verschillende genen gemeenschappelijk moleculaire trajecten en/of cellulaire processen beïnvloeden. Live beeldvorming van allantois explantaten afgeleid van muis mutanten heeft het potentieel om het verhelderen van dergelijke mechanismen. Bijvoorbeeld cellen in de buitenste omhulsel van de ontleed allantois kon worden aangeduid met vitale fluorescente kleurstoffen (zoals DiI of DiO lipofiele carbocyanine traceurs^16,18) naar afbeelding hechting en verspreiding van gebeurtenissen, of voor het bijhouden van de cel migratie in real-time. Bovendien, kunnen fluorescerende verslaggevers die visualiseren van het cytoskelet of adhesie-eiwitten blijken te zijn informatief.

Onlangs, een ex vivo co cultuur systeem voor pre bijlage lymfkliertest allantoides en chorions is beschreven, en deze aanpak werd met succes gebruikt om het onderzoeken van de gebeurtenissen die zich na chorion bijlage, zoals labyrint laag voordoen vorming¹⁷. De analyse van allantois bijlage efficiëntie op geïmmobiliseerdet chorions van verschillende (bijvoorbeeldgenetisch gemodificeerde) geïsoleerd Muismodellen kunnen opleveren van nieuwe inzichten in de moleculaire spelers en trajecten die gelden van de eerste stappen in de ontwikkeling van de lymfkliertest placenta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
α4β1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
α-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.