Summary
हम का वर्णन एक इन विट्रो परख मॉडल chorioallantoic लगाव करने के लिए, अपरा गठन में पहला कदम । यह प्रोटोकॉल murine allantoides के विच्छेदन और explant कल्चर को मैटीरियल α4β1 integrin पर प्रदर्शित करता है । Allantois अनुलग्नक पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर microscopically का मूल्यांकन किया जाता है.
Abstract
अपरा स्तनधारी भ्रूण की वृद्धि और विकास के लिए आवश्यक है । इस कारण से, कई आनुवंशिक परिवर्तन और संभावना भी पर्यावरणीय अपमान है कि अपरा विकास या समारोह परेशान चूहों और मनुष्यों में जल्दी गर्भावस्था हानि पैदा कर सकता है । फिर भी, अपरा गठन पर संभावित प्रभाव के लिए स्क्रीन करने के लिए इन विट्रो परख में सरल कमी कर रहे हैं । यहां, हम अपरा गठन में पहला और महत्वपूर्ण कदम मॉडलिंग पर ध्यान केंद्रित है, जो allantois के लगाव के होते है चोरियों के लिए । हम एक विधि का वर्णन तेजी से मैटीरियल α4β1 integrin, जो एक chorio-करनेवाला सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है पर allantoic explants के लगाव का आकलन करने के लिए । यह इन विट्रो दृष्टिकोण में सक्षम बनाता है एक गुणात्मक मूल्यांकन अनुलग्नक और विभिंन लगातार समय बिंदुओं पर एकाधिक allantois explants के व्यवहार के प्रसार । प्रोटोकॉल को लक्षित माउस उत्परिवर्तनों, दवाओं, या विभिंन पर्यावरणीय कारकों है कि गर्भावस्था जटिलताओं या allantois लगाव पर भ्रूण हानि के लिए जोड़ा गया है के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पूर्व vivo।
Introduction
अपरा गर्भाशय के वातावरण में भ्रूण विकास और विकास के लिए अपरिहार्य है । यह भ्रूण और मातृ संचलन के बीच ऑक्सीजन, metabolite, और पोषक तत्वों के आदान प्रदान के लिए इंटरफेस का गठन, और भी एक अंत-स्रावी और प्रतिरक्षा अंग के रूप में कार्य करता है. किसी भी अंतर्जात या exogenous अपमान है कि अपरा विकास बिगड़ा अंतर्गर्भाशयी विकास मंदता, भ्रूण हानि, या गर्भावस्था जटिलताओं, दोनों चूहों में और मनुष्यों में1के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । जबकि लक्षित माउस उत्परिवर्तनों कि असामांय अपरा शरीर क्रिया विज्ञान के कारण की संख्या को बढ़ाने के लिए जारी है2, २१९ पादी वर्तमान में माउस जीनोम सूचना विज्ञान (MGI) वेबसाइट पर सूचीबद्ध के साथ (http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/ MP: 0010038), इन phenotypes के कई एक यंत्रवत दृष्टिकोण से अच्छी तरह से नहीं समझ रहे हैं । आनुवंशिक परिवर्तन के अलावा, छोटे अणु दवाओं, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, विषाक्त पदार्थों, रोगजनकों, अतिरिक्त चयापचयों, या विभिंन पर्यावरणीय एजेंटों अपरा विकास और समारोह को प्रभावित कर सकते है3,4,5 , ६ , 7. फिर भी, सरल इन विट्रो परख है कि अपरा विकास में महत्वपूर्ण कदम दुर्लभ हैं ।
Murine अपरा विकास जल्दी midgestation में शुरू की है, जब allantois (गर्भनाल के विकास के अग्रदूत) एक कली है कि चोरियों की ओर बढ़ता है के रूप में भ्रूण के पीछे अंत से उभर8। allantoic कली की बाहरी परत में Chorioadhesive कोशिकाएं (chorioallantoic "फ्यूजन") चोरियों की सतह पर allantois के लगाव और प्रसार को मध्यस्थता । चोरियों के बाद विल्ली में जो allantois के vasculature के लिए भूलभुलैया फार्म, भीतरी अपरा परत जहां पोषक तत्वों और ऑक्सीजन बारीकी से झकझोरता मातृ रक्त sinusoids और भ्रूण वाहिकाओं 9 के बीच विमर्श कर रहे है बढ़ता में परतों ,10.
चोरियों के लिए allantois के लगाव भूलभुलैया गठन में प्रारंभिक और महत्वपूर्ण कदम है, और इस प्रक्रिया में दोष भ्रूण की मृत्यु के सबसे आम कारणों में से हैं midgestation1में । हालांकि माउस म्यूटेंट की संख्या वर्णित किया गया है जहां chorioallantoic अनुलग्नक10होने के लिए विफल रहता है, और MGI डेटाबेस वर्तमान में सूचियों १०८ माउस म्यूटेंट जो असामान्य chorioallantoic फ्यूजन द्वारा विशेषता है (http:// www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), संवहनी कोशिका आसंजन अणु के बीच पारस्परिक संपर्क-1 (VCAM-1, allantoic त्वक पर व्यक्त) और α4β1 integrin (chorionic mesothelium, जो है पर व्यक्त extraembryonic त्वक से व्युत्पंन) chorioallantoic लगाव और फ्यूजन11,12,13के लिए अपरिहार्य प्रतीत होता है । Immunohistochemical पूरे-माउंट जंगली प्रकार के भ्रूण के दाग से पता चला है कि VCAM-1 लगभग भ्रूण दिवस पर allantoic डंठल के बाहर के दो तिहाई के भीतर व्यक्त किया जाता है (E) ७.५13 (1-4 somite चरण), और है कि इसकी अभिव्यक्ति उच्च रहता है दौरान chorioallantoic लगाव व-फ्यूजन11,12. चोरियों के लिए allantoic लगाव की विफलता आमतौर पर गर्भाशय कलियों के ऊतकीय विश्लेषण से पता चला है । हालांकि, allantois आकार के बीच में शारीरिक रूप से अत्यधिक चर रहे है और यहां तक कि एक ही विकास के चरण14के कूड़े के भीतर, और allantois केवल चोरियों को संलग्न कर सकते है जब यह एक पर्याप्त आकार तक पहुंच गया है शारीरिक संपर्क बनाने के लिए । इस प्राकृतिक परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित करता है, chorioallantoic लगाव जगह लेता है कुछ समय के बीच ~ e ८.० और ई ९.० utero में, और इस प्रक्रिया के एक सांख्यिकीय विश्वसनीय मूल्यांकन प्रोटोकॉल द्वारा इसलिए की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण पर निर्भर है conceptuses उचित विकास के स्तर पर पर्याप्त नमूनों को प्राप्त करने के लिए ।
यहाँ, हम allantois आकार पर कम निर्भर है कि allantoic अनुलग्नक ex utero का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन करें । हम चूहे भ्रूण के विच्छेदन और उनके allantoides गर्भवती चूहों के uteri से प्रदर्शित करता है ~ 8 दिन पोस्ट coitum (डीपीसी; डीपीसी ०.५ एक योनि प्लग का पता लगाने के लिए नियत), और allantois explants के बाद संस्कृति मैटीरियल α4β1 पर integrins । इस विधि में सक्षम बनाता है एक तेजी से, संलग्नक के कार्यात्मक मूल्यांकन और प्रसार के व्यवहार में एकाधिक allantois explants के समानांतर और लगातार समय अंक पर अलग है । प्रोटोकॉल के लिए लक्षित उत्परिवर्तनों, दवाओं, या allantois लगाव पूर्व vivoपर विभिंन पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव के लिए स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
माउस प्रजनन Regierung Unterfranken द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सभी विश्लेषण सभी जर्मन और यूरोपीय संघ लागू कानूनों और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के विषय में नियमों के साथ सख्त अनुसार किया गया था ।
1. α4β1 Integrin के साथ Microtiter प्लेट्स की कोटिंग Ex Utero Allantois Explant कल्चर के लिए
- lyophilized murine α4β1 integrin पर २०० µ g/mL में बाँझ फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) का पुनर्गठन । पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) पंजाब में 10 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए पतला । पिपेट 20 µ l/अच्छी तरह से पतला α4β1 integrin एक microtiter प्लेट के कुओं की अपेक्षित संख्या में समाधान (1 allantois/
नोट: microtiter प्लेट के कुओं कोटिंग जब हवा बुलबुले के गठन से बचें. - उंहें एक humidified ऊतक संस्कृति मशीन में रखकर ३७ डिग्री सेल्सियस से कम ६० मिनट के लिए microtiter प्लेटें ।
- सावधानी से महाप्राण को supernatant से पिपेट । कोमल चूषण का प्रयोग करें और पिपेट टिप के साथ अच्छी तरह से नीचे छू से बचने के लिए थाली झुका । Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के रूप में पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) संस्कृति माध्यम के ५० µ एल जोड़ने के द्वारा दो बार कुओं धो, और कोमल चूषण द्वारा धोने के माध्यम से हटा दें ।
- महत्वपूर्ण कदम: ब्लॉक मुक्त बाध्यकारी साइटों को जोड़ने के द्वारा ५० µ l/०.१% (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)/DMEM और ≥ 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर microtiter प्लेटें एक humidified ऊतक संस्कृति मशीन में रखकर के लिए मशीन ।
नोट: Allantois explants सीरम की उपस्थिति में विभिन्न सतहों के लिए संलग्न कर सकते हैं. यह इसलिए गैर-विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करने के लिए अनिवार्य है, integrin के साथ कुओं कोटिंग के बाद, और सीरम युक्त माध्यम में explant संस्कृति के लिए विच्छेदित allantois जोड़ने से पहले (४.४ कदम देखें). - ३७ डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध समाधान में लेपित कुओं रखें जब तक ४.४ कदम में जरूरत है ।
2. एक गर्भवती माउस से 8 डीपीसी में गर्भाशय विच्छेदन
नोट: कम वजन के भेदभाव से झूठी-सकारात्मक गर्भावस्था दरों में कमी15।
- ग्रीवा विस्थापन द्वारा माउस बलिदान । यह ७०% (v/v) इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा उदर क्षेत्र में कोट को संक्रमित ।
नोट: चूहों को संभालते समय दस्ताने पहनें । निश्चेतक बिना गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा इच्छामृत्यु allantois के रासायनिक प्रदूषण को रोकता है, जो allantois लगाव के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । - कैंची के साथ midline पर एक छोटा सा चीरा बनाकर पेट की त्वचा को खोलें । उपयोग दस्ताने उंगलियों के ऊपर और नीचे चीरा त्वचा पकड़, और छाती और माउस की पूंछ की ओर त्वचा के अलावा खींच ।
- संदंश के साथ साथ आँख से पकड़ना । दूसरे हाथ के साथ, एक वी के आकार का चीरा पीछे की ओर से कैंची का उपयोग कर, और ऊतक चाल उदर गुहा बेनकाब करने के लिए दूर । गर्भाशय तक पहुंच प्राप्त करने के लिए आंतों को एक तरफ धकेलने के लिए संदंश का उपयोग करें ।
- दो गर्भाशय सींग का पता लगाएँ । संदंश के साथ गर्भाशय ग्रीवा (caudal खंड) पकड़ो और ठीक कैंची के साथ बंध काट । फिर दोनों गर्भाशय के सींग को कैंची से oviducts विच्छेद करके अलग करें ।
- एक बाँझ 10 सेमी पकवान युक्त बाँझ, कमरे के तापमान (आरटी) पंजाब में गर्भाशय स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें । वसा ऊतक, जहाजों, और ठीक संदंश और/या कैंची (आंकड़ा 1a) के साथ गर्भाशय सींग आसपास के नसों को हटा दें ।
3. भ्रूण विच्छेदन
नोट: एक 8:1 ज़ूम श्रेणी से सुसज्जित stereomicroscope के अंतर्गत निम्न चरणों का पालन करें ।
- कैंची के साथ प्रत्यारोपण साइटों के बीच में कटौती से भ्रूण अलग. संदंश के साथ गर्भाशय कलियों के मांसपेशियों की गर्भाशय अस्तर समझ और यह decidua (आंकड़ा 1b) को बेनकाब करने के लिए अलग खींच.
- संदंश का उपयोग करना, एक नया 10 सेमी बाँझ, आरटी पंजाब युक्त पकवान में गर्भाशय कलियों हस्तांतरण ।
- संदंश के सुझावों के साथ भ्रूण के चारों ओर decidua को ठीक करें ।
- विरोधी पर एक चीरा बनाओ ठीक संदंश के साथ decidua के mesometrial पक्ष (चित्रा 1C), और decidua दूर संदंश के साथ छील करने के लिए भ्रूण (चित्रा 1 डी) बेनकाब ।
नोट: decidua के mesometrial पोल अत्यधिक संवहनी है और विरोधी mesometrial हिस्सा है, जो भ्रूण शामिल है और paler प्रतीत होता है की तुलना में अपने आधार पर व्यापक हो सकता है । - भ्रूण को संदंश (figure 1E, F) के साथ टुकड़े ।
- एक माइक्रो चंमच का प्रयोग, बाँझ एक बाँझ ३.५ मुख्यमंत्री पकवान में निहित पंजाबियों की एक बूंद में भ्रूण हस्तांतरण ।
- एक ही ३.५ cm डिश में पंजाबियों की एक ताजा बूंद में भ्रूण स्थानांतरण एक माइक्रो चंमच का उपयोग कर, और संदंश का उपयोग करके जर्दी थैली से भ्रूण टुकड़े (चित्रा 1G, एच) ।
- वैकल्पिक रूप से, अगर जरूरतहै (जैसे, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा genotyping के लिए), एक बाँझ ट्यूब में जर्दी थैली एक बड़े छिद्र में ~ 5 µ l पंजाबियों के साथ aspirating द्वारा हस्तांतरण २०० µ l पिपेट टिप. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
नोट: मातृ ऊतक (यानी, रीचर्ट की झिल्ली और ectoplacental शंकु सहित पार्श्विका जर्दी थैली) कि जर्दी थैली तैयारी दूषित हो सकता है गलत genotyping परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इन ऊतकों को हटाने सबसे आसान है जर्दी थैली से भ्रूण विच्छेदन से पहले ।
4. Allantois विच्छेदन और माजी Utero कल्चर पर मैटीरियल α4β1 Integrin
- ठीक संदंश का उपयोग कर भ्रूण के पीछे के छोर पर अपनी बेसल सम्मिलन साइट से allantois कट (चित्राa) ।
- वैकल्पिक रूप से, यदि विकास मचान की आवश्यकता है, दृश्य निरीक्षण द्वारा भ्रूण के somite जोड़े गिनती एक खुर्दबीन का उपयोग चरण कंट्रास्ट प्रकाशिकी और एक 5 × और 10 × उद्देश्य से सुसज्जित ।
नोट: भ्रूण somite गिनती की सुविधा के लिए संदंश के साथ बढ़ाया जा सकता है । Chorioallantoic लगाव और फ्यूजन ई ८.० और ई ९.० ≥ 6 somite जोड़े के साथ भ्रूण में के बीच होते हैं । टर्निंग 6-8 somite जोड़े के साथ भ्रूण में शुरू होता है । - पिपेट ४० µ एल/DMEM के 10% (वी/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम, एल glutamine, और पूर्व लेपित microtiter प्लेट वेल्स की आवश्यक संख्या में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (1 अनुभाग देखें) ।
- यह एक २०० µ एल पिपेट टिप के एक बड़े छिद्र में ~ 5 µ l पंजाबियों के साथ aspirating द्वारा फ्लोटिंग allantois लीजिए. अंतरण 1 allantois/
- जैसे, 6, 12, और 24 एच के लिए एक humidified ऊतक संस्कृति मशीन (३७ ° c, 5% सह2) में microtiter प्लेट्स रखकर allantoides की मशीन । आदेश में allantois लगाव के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए, इन समय अंकों के बीच में microtiter प्लेटों हिलना मत करो ।
- प्रत्येक समय बिंदु पर, allantois अनुलग्नक स्कोर (उदा., कोई अनुलग्नक/फ़्लोटिंग allantois; आंशिक या पूरी तरह से अनुलग्न allantois; पूरी तरह से फैल allantois) एक चरण कंट्रास्ट या विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर और एक 5 × या 10 × उद्देश्य (चित्रा 2) ।
नोट: ताजा अलग और पूरी तरह से संलग्न allantoides के प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । पूर्व utero, wildtype C57BL/6J चूहों से पृथक allantoides के बाहर की नोक 4-6 घंटे के भीतर देता है (यह allantois के आंशिक लगाव के रूप में संदर्भित किया जाता है), और पूरे allantois के पूर्ण लगाव ~ संस्कृति के 12 ज के भीतर हासिल की है । द्वारा 18-24 ज, explant चपटा है और एक परिपत्र आकार ग्रहण (के रूप में पूरी तरह से फैल allantois) एक CD31 सकारात्मक संवहनी जाल के साथ9,16।
5. Endothelial सेल मार्कर CD31 के लिए Explanted Allantois के दाग पुष्टि
- महाप्राण के कल्चरल मीडियम को पूरी तरह फैला explants और जोड़कर कोशिकाओं को ठीक कर ४० µ l/4% (w/v) paraformaldehyde/
नोट: Paraformaldehyde विषाक्त है । त्वचा और आंख के संपर्क से बचने के लिए दस्ताने और सुरक्षा चश्मे पहनें । - आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन, तो supernatant महाप्राण । पंजाबियों के ४० µ l को जोड़कर तीन बार धो लें, और कोमल चूषण करके वाशिंग मीडियम को हटा दें ।
- Permeabilize की कोशिकाओं और ब्लॉक गैर विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को जोड़कर ४० µ l/०.१% (v/v) ट्राइटन X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) पंजाब में सामांय बकरी सीरम 30 मिनट के लिए RT पर । पंजाबियों के ४० µ l/चहेतों को जोड़कर दो बार धोएं, और कोमल चूषण करके वॉशिंग मीडियम को हटा दें ।
नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रातोंरात रोका जा सकता है । - प्राथमिक विरोधी CD31 एंटीबॉडी ०.१% (डब्ल्यू/वी) BSA/पंजाब में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस में पतला 1:50 के 20 µ l/ पंजाबियों के ४० µ l को जोड़कर तीन बार धो लें, और कोमल चूषण करके वाशिंग मीडियम को हटा दें ।
- 20 µ एल जोड़कर प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के/अच्छी तरह से, लेबल माध्यमिक बकरी विरोधी चूहा एंटीबॉडी ०.१% (डब्ल्यू/वी) BSA/पंजाब में 1 ज के लिए 1:200/प्रकाश से रक्षा एल्यूमीनियम पंनी में लपेटकर या एक अंधेरे कक्ष में रखकर से microtiter प्लेटों । पंजाबियों के ४० µ l को जोड़कर तीन बार धो लें, और कोमल चूषण करके वाशिंग मीडियम को हटा दें ।
- बढ़ते मध् यम के 20 µ l को जोड़कर कक्ष एंबेड करें । आरटी पर ~ 1 एच के लिए मशीन बढ़ते मध्यम जम गया है जब तक । आरटी पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर microtiter प्लेटों की दुकान, प्रकाश से सुरक्षित ।
- छवि एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत allantois explants के संवहनी जाल एक 5 × या 10 × उद्देश्य और उपयुक्त प्रतिदीप्ति फिल्टर के साथ सुसज्जित.
नोट: एक पूरी तरह से फैल allantois के CD31-सकारात्मक संवहनी जाल के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 3में दिखाया गया है । संवहनी जाल के लिए अन्य मार्करों, जैसे Flk के खिलाफ निर्देश एंटीबॉडी-1, Flt, टाई-1 या टाई-2 के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि को अलग करने और explant murine allantoides पूर्व vivo, और α4β1 integrin, vivo में chorioallantoic फ्यूजन के दौरान एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया allantois लगाव के गुणात्मक आकलन विवरण । चित्रा 1a-H में दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम गर्भवती गर्भाशय से शुरू अलगाव allantois के क्रमिक कदम का प्रदर्शन । ऐसे वसा ऊतक और जहाजों (चित्र 1a) के रूप में गर्भाशय के सींग, चारों ओर मातृ ऊतकों को हटा दिया जाता है, और भ्रूण पेशी गर्भाशय परत खोलने के बाद एक कदम वार फैशन में अंतर्गर्भाशयकला से विच्छेदित कर रहे हैं (चित्र 1b- ई) । बाद में, पार्श्विका जर्दी थैली और ectoplacental शंकु जैसे अंय मातृ ऊतकों (चित्रा 1E, एफ) हटा रहे हैं । चित्रा 1G - एच पता चलता है कि तकनीक extraembryonic allantois के विच्छेदन की जर्दी थैली, एक और extraembryonic और उच्च संवहनी ऊतक से दूर शामिल हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के अनुसार अलग allantoides मुख्यतः मातृ या (अतिरिक्त) भ्रूण allantois के अलावा अंय ऊतकों को दूषित करने से मुक्त हैं ।
चित्रा 2 दर्शाता है कि एक ही कूड़े में ताजा विच्छेदित भ्रूण से आकार और allantoides के आकार काफी भिंन हो सकते है14। Allantoides of C57BL/6J wildtype ई ८.५ में विच्छेदित भ्रूण के मामलों के ७४% में एक लंबी आकृति विज्ञान था (४५ ६१ भ्रूण का विश्लेषण), के रूप में चित्रा 2 और चित्रा1 में दिखाया गया है । हालांकि, भ्रूण के 15% (9/61) में, allantoides स्पष्ट रूप से छोटे और अधिक गोल थे (संदर्भ14देखें) और 11% भ्रूण के (7/61) अभी तक विच्छेदन के समय एक दृश्य allantois का गठन नहीं किया था । विषम आकृतियों और आकार के बावजूद allantois explant संस्कृति के प्रारंभिक समय बिंदु पर (चित्रा 2, पैनलों a-h), allantois लगाव और मैटीरियल α4β1 integrin पर पूर्ण प्रसार सभी में 12 ज के भीतर मनाया गया था ५४ के हौसले से पृथक allantoides सात कूड़े के भ्रूण से विच्छेदित । फिर भी, आकार और संस्कृति के 12 ज के बाद explants के आकार कुछ विषम थे (चित्रा 2), परख के प्रारंभिक बिंदु पर विभिंन allantoic morphologies को प्रतिबिंबित ।
चित्रा 3 CD31 के लिए एक immunocytochemical धुंधला से पता चलता है-सकारात्मक endothelial कोशिकाओं पूरी तरह से संलग्न allantoides में explant संस्कृति के 24 ज के बाद, जो पुष्टि करता है कि explants इस समय बिंदु से एक नाड़ी जाल सविस्तार था, के रूप में9 की उंमीद , 16. ऐसी अनुयाई allantois संस्कृतियों का प्रयोग इन विट्रो9में रक्त वाहिनियों के गठन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । इसलिए, प्रस्तुत पद्धति पैदावार allantois explants है कि आसानी से किया जा सकता है संस्कृति पूर्व vivo, समझौते में पहले प्रकाशित प्रयोगात्मक अध्ययन के साथ9,16।
प्रोटोकॉल पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर माइक्रोस्कोपी आधारित मूल्यांकन allantois लगाव के लिए रूपरेखा सेट, जैसे 12 के बाद या explant संस्कृति के एच 24 ज । परिणाम एक गुणात्मक तरीके से मूल्यांकन किया जा सकता है (आंशिक/पूर्ण लगाव या एक निश्चित समय बिंदु पर पूर्ण प्रसार-हां/ के बाद से एक ही explant बार visualized और रन बनाए जा सकते हैं, इस विश्लेषण समय के साथ व्यक्तिगत allantois explant संस्कृतियों की विशेषताओं को दर्शाता है । इसके अलावा, स्थिर और सना हुआ explants में एक संवहनी जाल के गठन (चित्रा 3) का मूल्यांकन किया जा सकता है ।
चित्र 1: allantois विच्छेदन में प्रतिनिधि चरण. (एक) एक अलग गर्भाशय सींग का विस्तार से देखते हैं । भ्रूण युक्त गर्भाशय कलियों सितारों द्वारा चिह्नित कर रहे हैं; वसा ऊतक और गर्भाशय सींग आसपास के जहाजों बाईं ओर देखा जाता है । (ख) गर्भाशय की मांसल परत को हटाने के बाद decidua (the अंतर्गर्भाशयकला) को देखें । उच्च संवहनी, mesometrial पोल decidua के बाईं ओर उन्मुख है, विरोधी mesometrial हिस्सा (एक स्टार के साथ चिह्नित) है कि भ्रूण शामिल सही करने के लिए उन्मुख है. (C) decidua के विच्छेदित anti-mesometrial ध्रुव का पक्ष दृश्य (एक सितारे के साथ चिह्नित) । तीर भ्रूण के स्थान को इंगित करता है । (D) conceptus के शीर्ष दृश्य (तीर) आसपास के decidua के आंशिक हटाने के बाद पार्श्विका जर्दी थैली से घिरा हुआ । (ङ, च) भ्रूण के विच्छेदन में बाद के चरणों के प्रतिनिधि विचार (तीर) । ऐरोहेड की जर्दी थैली को इंगित करता है । (ङ) में, ectoplacental कोन (ईपीसी) दाईं ओर दिखाई दे रहा है । (छ) भ्रूण की आंशिक विच्छेदन (तीर) की जर्दी थैली (ऐरोहेड) से । allantois लाल सितारा के साथ चिह्नित किया गया है । (एच) allantois (लाल सितारा) के साथ पृथक भ्रूण (तीर) । स्थिति जहां allantois भ्रूण के पीछे के अंत में अपनी बेसल सम्मिलन साइट से कट जाएगा एक लाल टूटी लाइन के साथ संकेत दिया है । छवियां एक 8:1 ज़ूम रेंज के साथ एक stereomicroscope पर ले जाया गया । सभी पैमाने सलाखों के 1 मिमी हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2: विषम आकार और allantoides के आकार. आठ allantoides (ए-एच) एक-एक कूड़े के भ्रूण से अलग-थलग थे. बायां फलक, विच्छेदन (0 h) के तुरंत बाद allantoides । दायां फलक, explant संस्कृति के 12 ज के बाद एक ही allantoides । explants मजबूती से जुड़े हैं, और mesenchymal कोशिकाओं फैल गया है । explants explant आकार कल्पना करने के लिए घेरे हैं । छवियां एक चरण कंट्रास्ट प्रकाशिकी और एक 5 × (बाएं पैनल) या एक 10 × उद्देश्य (सही पैनल) के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप पर ले जाया गया । सभी पैमाने सलाखों के ५०० µm हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3: allantois explant संस्कृतियों में संवहनी जाल गठन । Allantoides थे और वर्तमान प्रोटोकोल में बताए गए मैटीरियल α4β1 integrin पर explanted । Explants 24 एच के लिए प्रसंस्कृत थे, और संवहनी जाल में endothelial कोशिकाओं विरोधी CD31 प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल का उपयोग कर दाग थे. Endothelial कोशिकाओं हरे रंग में दिखाई देते हैं । ऊपरी छवि एक प्रतिनिधि allantois explant के मध्य क्षेत्र में पूरे संवहनी जाल से पता चलता है. छवि एक खुर्दबीन प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी और एक 5 × उद्देश्य से सुसज्जित पर लिया गया था । स्केल बार, ५०० µm । दो कम पैनलों एक और allantois explant विदारक और एक ही स्थिति के तहत संस्कृति के उच्च आवर्धन छवियों हैं । पोत की तरह संरचनाओं और व्यक्तिगत endothelial कोशिकाओं को देखा जा सकता है । छवियां एक फोकल माइक्रोस्कोप पर ले जाया गया; स्केल बार्स, 25 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
सीरम की उपस्थिति है, जो समर्थक चिपकने वाला extracellular मैट्रिक्स अणुओं की एक समृद्ध स्रोत है जैसे fibronectin, allantois explants आसानी से विभिंन प्लास्टिक, कांच, या फिल्टर9,16सतहों को संलग्न करेगा । इस प्रकार, यदि प्रदर्शन परख के उद्देश्य के लिए विशेष रूप से एक आनुवंशिक संशोधन या allantois लगाव पर किसी अंय उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए मैटीरियल α4β1, यह गैर विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करने के लिए महत्वपूर्ण है (उदा, गोजातीय सीरम के साथ एल्ब्युमिन) कोटिंग के बाद integrin के साथ सतहों और सीरम युक्त मीडिया के साथ मशीनीकरण से पहले.
allantois explants के प्रारंभिक लगाव को मैटीरियल α4β1 integrin करने के लिए आंदोलन के प्रति बहुत संवेदनशील है, और ऊतक संस्कृति प्लेटें इसलिए एक पूर्व निर्धारित समय अवधि (उदा, 12 ज के लिए) के लिए पहले से ही परेशान छोड़ दिया जाना चाहिए स्कोरिंग allantois अनुलग्नक. ध्यान दें कि सब्सट्रेट के साथ स्थिर संपर्क गठन के लिए आवश्यक समय विश्लेषण माउस तनाव या मैटीरियल α4β1 integrin की एकाग्रता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
सफल chorioallantoic फ्यूजन के लिए सेलुलर VCAM-1/α4β1-इंटरेक्शन की आवश्यकता मजबूती से11,12,13की स्थापना की है । इसके अलावा, extracellular मैट्रिक्स अणु जैसे fibronectin, कोलेजन और ब्याज के अन्य अणुओं को भी स्थिर किया जा सकता है और "chorio-करनेवाला" सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया.
Chorioallantoic अनुलग्नक VCAM-1 और इसके बाध्यकारी साझेदार integrin α4β1 के बीच के सेलुलर इंटरैक्शन पर निर्भर है । utero में, chorioallantoic लगाव और बाद में फ्यूजन ही हो सकता है जब allantois पर्याप्त चोरियों के साथ संपर्क बनाने के लिए बढ़ाया है । एक विशेष विकासात्मक चरण में allantois आकार में शारीरिक परिवर्तनशीलता को देखते हुए, chorioallantoic लगाव और संलयन ई ८.० और ई ९.० (रेंज, ई ७.५-ई ९.२५)14,16के बीच कुछ समय जगह ले । विशेष रूप से रहने वाले माउस में utero में chorionic प्लेट के लिए allantois लगाव की क्षणिक प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए तरीके वर्तमान में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं । बल्कि, विश्लेषण ज्यादातर ऊतकीय आकलन द्वारा chorioallantoic संलयन के श्रमसाध्य निर्धारण पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं उदा, allantoic की सतह पर फैलने और एक एकल, पूर्व निर्धारित पर भूलभुलैया परत के विकास समय बिंदु11,12,13,16। इस समापन बिंदु विश्लेषण दोष है कि विशेष रूप से allantois की चोरियों और चोरियों पर निर्भर प्रभाव के लिए बिगड़ा लगाव के कारण कर रहे है के बीच भेदभाव नहीं कर सकते, और भ्रूण विकास के चरणों और allantoic में निहित परिवर्तनशीलता द्वारा सीमित है आकार. के रूप में प्रतिनिधि परिणामके तहत चर्चा की, allantois आकार में शारीरिक परिवर्तनशीलता में chorioallantoic संलयन में एक रिश्तेदार देरी में परिणाम कर सकते है ~ C57BL के 26%/6J wildtype भ्रूण । सांख्यिकीय बोल रहा हूं, लगभग दो सात गर्भवती चूहों में इसलिए भी (सात कूड़े, औसत कूड़े का आकार ८.७) है, जो बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए एक पर्याप्त प्रजनन अतिरिक्त की आवश्यकता में तब्दील से ६१ भ्रूण बलिदान किया गया होगा । दिलचस्प है, microsurgical प्रयोगों से पता चला है कि चोरियों पहले से ही सक्षम है 1 somite जोड़ी मंच पर allantois के साथ फ्यूज, और है कि allantois 3-5 somite जोड़े14के साथ भ्रूण में अधिक से अधिक संलयन क्षमता दर्शाती है । इसलिए, allantois के chorioadhesive कोशिकाओं का गठन कर रहे है और कार्यात्मक vivo मेंवास्तविक chorioallantoic लगाव से पहले सक्षम । मैटीरियल लाइगैंडों को allantois लगाव का भूतपूर्व utero विश्लेषण, जैसा कि यहां प्रस्तुत किया गया है, इसलिए किसी दिए गए allantois आकार के अपेक्षाकृत स्वतंत्र है । इसलिए, इस विधि का एक लाभ यह है कि यह allantois बढ़ाव में दोषों को नजरअंदाज कर देता है, और अपरा गठन में अगले कदम पर केंद्रित है, अर्थात, chorioallantois लगाव । इस दृष्टिकोण इस प्रकार आनुवंशिक माउस म्यूटेंट में allantois बढ़ाव और chorioallantois लगाव में दोषों के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
अपने लगाव बिंदु से allantois आकांक्षा के पारंपरिक विधि के विपरीत एक मुंह का उपयोग कर भ्रूण को पिपेट16, वर्तमान प्रोटोकॉल एक मैनुअल काटने दृष्टिकोण का उपयोग करता है, और allantois बाद में बड़े छिद्र पिपेट युक्तियों का उपयोग कर संभाला है . allantois आकांक्षा का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इस विधि प्रत्यक्ष ऊतक हैंडलिंग से बचा जाता है । काटने और allantois से छेड़छाड़ allantoic mesothelium के बाहरी म्यान में chorioadhesive कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है । फिर भी, संदंश के साथ allantois काटने सफलतापूर्वक पूर्व अपरा ऊतकों के पूर्व vivo संस्कृतियों में पहले इस्तेमाल किया गया है17, और allantoic explant लगाव के कैनेटीक्स और explant में वर्णित संस्कृतियों की आकृति विज्ञान वर्तमान अध्ययन आकांक्षा16द्वारा allantois अलगाव के आधार पर प्रकाशित आंकड़ों के समान हैं । इन निष्कर्षों का सुझाव है कि chorioadhesive कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से अच्छी तरह से allantois के मैनुअल काटने पर संरक्षित कर रहे हैं, और है कि explant भेदभाव निहायत परेशान नहीं है, के रूप में CD31 के गठन के द्वारा संकेत-सकारात्मक endothelia । allantois का सीधा काटना भी allantois कि VCAM-113एक्सप्रेस के केवल ऊपरी दो तिहाई टुकड़े संभावना प्रदान करता है, और यह जर्दी थैली व्युत्पंन कोशिकाओं है, जो के आधार से दूर छंटनी की जा सकती है के साथ कम संक्रमण सुनिश्चित allantois बाद allantois आकांक्षा18.
allantoic explant आसंजन के पूर्व utero विश्लेषण, संयोजक α4β1 integrin एक महत्वपूर्ण, प्रारंभिक कदम है कि readout संलयन के लिए आवश्यक है की एक गुणात्मक chorioallantoic प्रदान करता है, यानी, सेलुलर संपर्क VCAM-1 के बीच allantois पर व्यक्त की, और α4β1 integrin स्थानीयकृत chorionic mesothelium, जो extraembryonic त्वक से व्युत्पंन है । फिर भी, हालांकि इन दो आसंजन अणुओं chorioallantoic संलयन में सिद्धांत खिलाड़ियों के रूप में मांयता प्राप्त कर रहे हैं, ~ VCAM में homozygous नॉकआउट उत्परिवर्तनों के साथ भ्रूण के ५०%-1 या α4 integrin क्या vivo मेंchorioallantoic फ्यूजन गुजरना11 ,12,13. इस अधूरी penetrance के कारण, पूर्व vivo वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित विधि chorioallantoic फ्यूजन की विफलता के साथ आनुवंशिक मॉडल में इन दो आसंजन अणुओं के लिए एक आवश्यकता को शासन करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है ।
शारीरिक स्थितियों के तहत, α4β1 integrins chorionic trophoblasts की प्लाज्मा झिल्ली में एंबेडेड हैं, और संरचनात्मक और संकेत प्रोटीन है कि सेल सेल (और सेल-मैट्रिक्स) आसंजन को विनियमित करने के लिए सहयोग की एक जटिल नेटवर्क में शामिल कर रहे है 19. इन विट्रो दृष्टिकोणों में सबसे अधिक गुटबंदी के साथ के रूप में, chorionic VCAM-1 बाइंडिंग इंटरफेस की जटिलता केवल मैटीरियल α4β1 integrin द्वारा एक बहुत ही सीमित सीमा तक मॉडलिंग की है । इस प्रणाली में विद्यमान चोरियों से प्राप्त अन्य महत्वपूर्ण संरचनात्मक या संकेतात्मक आदानों की संभावित कमी के अलावा, यह संभावना है कि integrins का केवल एक अंश जो एक कठोर, दो आयामी सतह पर स्थिर है, सक्रिय रूप से उपस्थित रहे, बाध्यकारी-सक्षम, "ओपन" अनुरूप ।
प्रस्तुत विधि जल्दी लगाव और चोरियों को allantois के कदम के प्रसार का अनुमान है, और भी allantoic संवहनी जाल के विकास पर रिपोर्ट कर सकते है जब पोत गठन9के विश्लेषण के साथ संयुक्त । हालांकि, वर्तमान दृष्टिकोण allantoic endothelial कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता angiogenesis अंकुरण द्वारा चोरियों के आक्रमण मॉडल नहीं है, न ही यह चोरियों, जो chorioallantoic फ्यूजन के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है द्वारा morphogenesis शाखाओं में दर्शाती है और अपरा भूलभुलैया के बाद के विकास10।
चरण कंट्रास्ट या विभेदक हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी (अर्द्ध) स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ संयुक्त का उपयोग कर, प्रस्तुत विधि में देरी या विफल allantoic लगाव के प्रारंभिक विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीन में लागू किया जा सकता इन विट्रो। माउस म्यूटेंट के विश्लेषण के अलावा, विधि ब्याज की दवाओं, रोगजनकों, चयापचयों, या allantoic लगाव पर पर्यावरण एजेंटों के प्रभाव को स्क्रीन करने के लिए हो सकता है ।
कई माउस म्यूटेंट में, chorioallantoic अनुलग्नक उत्पन्न करने के लिए विफल रहता है, हालांकि allantois और चोरियों सामान्य रूप से विकसित किया है दिखाई देते हैं । इसके अलावा, म्यूटेंट chorioallantoic अनुलग्नक दोष दिखाने के लिए आम तौर पर अपूर्ण penetrance1,2,10प्रदर्शित करते हैं । यह जांच महत्वपूर्ण है कि क्या इन कार्यात्मक जाहिरा तौर पर बहुत अलग जीन प्रभाव आम आणविक रास्ते और/ allantois explants माउस म्यूटेंट से व्युत्पंन की लाइव इमेजिंग के लिए इस तरह के तंत्र स्पष्ट क्षमता है । उदाहरण के लिए, विच्छेदित allantois के बाहरी म्यान में कोशिकाओं को महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों (जैसे दिी या दिो lipophilic carbocyanine अनुरेखकों16,18) के साथ छवि आसंजन और प्रसार की घटनाओं के साथ लेबल किया जा सकता है, या ट्रैक करने के लिए सेल वास्तविक समय में प्रवासन । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट पत्रकारों कि cytoskeleton या आसंजन प्रोटीन कल्पना को जानकारीपूर्ण साबित हो सकता है ।
हाल ही में, पूर्व-अनुलग्नक murine allantoides और चोरियों के लिए एक पूर्व विवो सह-संस्कृति प्रणाली का वर्णन किया गया है, और इस प्रकिया को chorioallantoic अटैचमेंट के बाद घटित होने वाली घटनाओं की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग में लिया गया था, जैसे कि भूलभुलैया परत 17का गठन । विभिंन (जैसे, आनुवंशिक रूप से संशोधित) माउस मॉडल से पृथक की गई मैटीरियल चोरियों पर allantois लगाव क्षमता का विश्लेषण आणविक खिलाड़ियों और रास्ते में नई अंतर्दृष्टि उपज सकता है कि के विकास में शीघ्र कदम सरकार murine अपरा ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft SFB688 (A.G. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J wildtype mice | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| 70 % (v/v) Ethanol | VWR International | 930031006 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Forceps used to open the abdominal cavity. |
| Micro dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip. |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Straight blades. |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds. |
| Microspoon | Carl Roth | AT18.1 | 5 mm Spoon diameter. |
| Microtiter plates | ibidi | 81501 | We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic. |
| 10 cm dish | Nunc | 150350 | Sterile tissue culture dishes. |
| 3.5 cm dish | Nunc | 150288 | Sterile tissue culture dishes. |
| Large orifice pipette tips | Biozym | VT0140X | Low binding pipette tips, 200 µL. |
| α4β1 integrin | R&D Systems | 6054-A4 | Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-03600 | The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| L-Glutamine | PAN Biotech | P04-80100 | 100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C. |
| para-Formaldehyde | Carl Roth | 0335.2 | To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks. |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100. |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses. |
| α-CD31 Antibodies | BD Biosciences | 550274 | Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3. |
| Secondary goat anti-rat antibodies | Thermo Fisher | A-11006 | Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible. |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000 |
| Labovert | Leitz | Labovert | Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable. |
| M80 | Leica Microsystems | M80 | Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection. |
| DM4000B | Leica Microsystems | DM4000B | Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment. |
| Digital camera | JVC | KY-F75U | 3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective. |
References
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
- Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160 (2016).
- Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
- Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
- Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
- Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
- Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
- Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
- Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
- Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
- Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
- Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
- Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
- Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
- Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
- Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
- Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).
