Summary
モデル漿添付ファイル、胎盤形成の最初のステップの in vitroアッセイについて述べる。プロトコルは、固定化 α4β1 インテグリンのマウス allantoides の郭清と植の文化を示しています。尿膜の添付ファイルは、あらかじめ決められた時点で病理組織学的に評価されます。
Abstract
胎盤は、成長と哺乳動物の胎児の開発のために不可欠です。このため、多数の遺伝子変異と胎盤の開発または機能を妨げる可能性が高いのも環境の侮辱が、マウスとヒトの妊娠初期の損失にあります。それにもかかわらず、画面の胎盤形成に対する潜在的な影響に簡単な生体外の試金が不足しています。ここでは、モデリングにおける胎盤絨毛膜に尿膜壁添付ファイルから成っている最初の重要なステップに焦点を当てます。Chorio 擬態の基板となる固定化 α4β1 インテグリンの尿外植片の添付ファイルを迅速に評価する方法について述べる。この体外アプローチにより、添付ファイルと異なる連続した時点で複数の尿膜外植体の挙動を拡散の定性的な評価です。プロトコルは、ターゲットを絞ったマウス突然変異、薬、または妊娠合併症や尿膜添付ファイル前のヴィヴォの胎児の損失にリンクされているさまざまな環境要因の効果を調べるために使えます。
Introduction
胎盤が子宮環境の胚の成長と開発のために不可欠です。それは内分泌と免疫器官としての酸素代謝物、胎児と母体の循環とも機能間の栄養交換のためのインターフェイスを構成します。胎盤発育を損なう内因性または外因性の侮辱は、子宮内胎児発育遅延、胎児の損失、または妊娠合併症、マウスと人間1の両方につながることができます。対象となるマウスを異常な胎盤の生理を引き起こす突然変異の数が 219 遺伝子多型のマウスのゲノム情報学 (MGI) ウェブサイトに現在表示されている2を増やす続けます (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology/MP:0010038)、これらの表現型の多くはよく機械論的視点から理解されていません。に加えて遺伝子変異、小分子薬、モノクローナル抗体、毒素、病原体、余分な代謝物や様々 な環境要因や影響を与える胎盤開発関数3,4,5,6,7します。 まだ、簡単な生体外モデル胎盤の開発で重要な手順が不足している試金。
(臍帯発達前駆体) 尿膜が絨毛膜8に向かって育つ芽として胚の後部の端から現れるとき、初期の経産婦でマウス胎盤の発育が開始されます。尿の芽の外側の層の Chorioadhesive セルは、添付ファイルおよび絨毛膜 (漿「融合」) の表面に尿膜の広がりを仲介します。絨毛膜はその後に尿膜壁血管成長迷路、栄養素と酸素が密接に並置母体血と胎児血管9 間交換される胎盤内層を形成する絨毛に折る ,10。
絨毛膜へ尿の付着迷宮形成の初期および重要なステップであり、このプロセスの欠陥は midgestation1胚性致死性の最も一般的な原因のうち。マウス突然変異体の数が、漿添付ファイル10が発生するが失敗し、MGI データベース現在異常な漿融合 (http:// によって特徴付けられる 108 マウスの突然変異体の一覧を記載されてwww.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824)、血管細胞接着分子 1 (VCAM 1、尿中胚葉に発現) と (は絨毛の中皮に表される α4β1 インテグリンの細胞間相互作用初期胚胚体外胚葉由来) 漿添付ファイルと融合11,12,13のため不可欠であることが表示されます。(E) 7.5 日約 VCAM 1 が尿の茎の遠位 3 分の 2 以内単位があることを示している全体マウント野生型胚の免疫組織化学的染色13 (1-4 体節期)、およびその発現状態のまま高漿の添付ファイルと - 融合11,12。絨毛膜尿愛着の障害は、通常、子宮の芽の組織学的解析による検出します。ただし、尿膜サイズはの間と同じ発達段階14リットル内でも高い生理学的変数であり、尿は、物理的な接触をするのに十分な大きさに達したときに絨毛膜にのみ添付できます。この自然の変動を反映して、漿添付が行われる間のいつか 〜 E 8.0 と 9.0 E子宮内、および組織によって、このプロセスの統計的信頼性の高い評価は大きい数の解析に依存したがって淘汰適切な発達段階で十分な検体を採取します。
ここでは、尿の添付ファイル子宮 ex少ない尿膜のサイズに依存している評価方法について述べる。妊娠マウスの子宮からマウス胚とその allantoides の郭清を紹介 〜 8 日のポストの coitum 定め(dpc; dpc 0.5 が膣にプラグインの検出を示す)、固定化 α4β1 の外植体尿膜の後続の文化とインテグリンです。このメソッドは、添付ファイルおよび複数並列で、異なる連続した時点で尿膜外植体の挙動を広がりの急速な機能評価できます。プロトコルを使用することがあります尿膜添付ファイル前のヴィヴォに及ぼすターゲット変異、薬、または様々 な環境要因の画面に。
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Protocol
マウス繁殖は Regierung Unterfranken によって承認された、すべてのドイツ語、欧州連合の法律、実験動物の管理と使用に関する規制に従い、すべての解析を行った。
1. コーティングのマイクロタイター プレート α4β1 インテグリンとEx 子宮尿膜培養
- 200 μ g/mL 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で凍結乾燥させたマウス α4β1 インテグリンを再構成します。予め温めておいた (37 ° C) PBS で 10 μ G/ml の最終濃度に希釈します。ピペット希釈 α4β1 インテグリン溶液 20 μ L/ウェルのマイクロ プレート (1 尿膜/井戸) の井戸の必要な数に。
注: は、マイクロ プレートのウェルをコーティングする際、気泡の形成を避けるため。 - 加湿の組織文化のインキュベーターでそれらを配置することによって 37 ° C で 60 分のマイクロタイター プレートを孵化させなさい。
- ピペットで上澄みを慎重に吸引します。穏やかな吸引を使用し、ピペット チップをウェル底面に触れることを避けるためにプレートを傾斜します。予め温めておいた (37 ° C) 培養液などダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、50 μ L を追加することで 2 回洗浄し、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。
- 重要なステップ: 無料サイトを 50 μ L/ウェル 0.1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) を追加することでバインド ブロック/DMEM 加湿組織文化のインキュベーターでマイクロタイター プレートを配置することによって ≥ 37 ° C で 30 分間インキュベートし、。
注: 尿膜外植体血清の存在下での様々 な面にアタッチできます。非特異的結合部位をブロックする必要したがって、コーティング後、インテグリンとの切り裂かれた尿膜を追加する前に井戸は、血清を含む文化を外植体中 (手順 4.4 を参照)。 - 4.4 の手順で必要になるまでの 37 ° C でブロッキング液でコーティングされた井戸を維持します。
2. 子宮解剖 Dpc 8 で妊娠マウスから
注: は、重量ゲイン差別15によって偽陽性妊娠率を減らします。
- 頚部転位によってマウスを犠牲に。腹部のコートを 70% (v/v) エタノールを噴霧して消毒します。
注: は、マウスを処理するとき、手袋を着用します。麻酔なしの頚部転位による安楽死は、尿膜添付ファイルを妨げる可能性があります尿膜の化学汚染を防ぎます。 - ハサミで正中線で小切開を行うことで腹部の皮膚を開きます。上と下の切開、皮膚を保持するために手袋をはめた指を使って、胸やマウスの尻尾に向かって皮膚を引き離します。
- 鉗子で腹膜を把握します。もう片方の手を前方から V 字切開は後方に向かって、はさみを使用して、離れて腹腔内を公開する組織を移動します。子宮へのアクセスを得るために 1 つの側面に腸をプッシュするのに鉗子を使用します。
- 2 つの子宮角を探します。鉗子で子宮頸部 (尾側のセグメント) を押しながら高級ハサミで靭帯をカットします。その後、はさみで卵管を切断することによって両方の子宮角をデタッチします。
- 部屋の温度 (RT) PBS 滅菌、滅菌 10 cm 皿含むに子宮を転送する鉗子を使用します。脂肪組織、血管、神経周囲の高級ピンセット、はさみ (図 1 a) と子宮角を削除します。
3. 胚解離
注: 8:1 ズーム範囲を備えた顕微鏡の下で次の手順に従います。
- はさみで、着床間に切断することによって胚を区切ります。鉗子で子宮芽の筋肉子宮内膜をつかんでそれを分解、脱落膜 (図 1 b) を公開します。
- RT PBS 滅菌、含んでいる新しい 10 cm 皿に子宮芽を転送鉗子を使用して、します。
- 鉗子の先端で胚の周り脱落膜を固定します。
- 微細鉗子 (図 1)、脱落膜の抗 mesometrial 側に切開をして、胚 (図 1) を公開するための鉗子で、脱落膜をはがします。
注: mesometrial ポール脱落膜の高い血管柄付きし、胚が含まれますされ、淡い反 mesometrial 部分より根元が広くできます。 - 鉗子 (図 1E, F) で胎児を解剖します。
- マイクロ スプーンを使用して、滅菌 3.5 cm 皿に含まれている滅菌 PBS のドロップに胚を転送します。
- マイクロ スプーンを使用して同じ 3.5 cm 皿の PBS の新鮮なドロップに胚を転送そして鉗子 (図 1, H) による卵黄嚢から胎児を解剖します。
- 必要に応じて、必要な場合 (例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による検出)、転送卵黄嚢生殖不能の管にそれを吸引によって ~ 大形オリフィス 200 μ L ピペット チップに 5 μ L の PBS。-20 ° C にてストア
注: 卵黄嚢準備を汚染する可能性が母体の組織 (すなわち、頭頂部の卵黄嚢ライヘルトの膜と胎盤のコーンなどを含む) は、誤ったジェノタイピングの結果につながります。これらの組織の除去は、卵黄嚢から胚解離の前に最も簡単です。
4. 尿膜解離と固定化 α4β1 インテグリンのEx 子宮文化
- 微細鉗子 (図 1 H) による胚の後部の端にその基底挿入部位から尿をカットします。
- 必要に応じて、発達のステージングが必要な場合は、段階の対照の光学と、5 ×、10 × 対物顕微鏡を用いた目視による胚の体節のペアをカウントします。
注: 胎児は体節を数えるための鉗子で拡張できます。漿の添付ファイルとの融合は ≥ 6 体節のペアを持つ胚で E 8.0 と 9.0 E の間発生します。6 8 体節のペアを持つ胚で回転を開始します。 - 10% (v/v) ウシ胎児血清、L-グルタミン、プレコート マイクロタイター プレート井戸 (セクション 1 を参照) の必要な数の抗生物質と DMEM のピペット 40 μ L/ウェル。
- それを吸引によってフローティング尿を収集 〜 200 μ L ピペット チップの大形オリフィスに 5 μ L の PBS。1 尿膜/ウェルを転送します。
- 例えば、加湿の組織文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO2) でマイクロタイター プレートを配置することによって、allantoides をインキュベート 6、12、24 h。尿膜の添付ファイルとの干渉を防ぐためにこれらの時間ポイントの間にマイクロタイター プレートを移動しないでください。
- 各時点でスコア尿膜添付ファイル (例えば、ない添付ファイル/フローティング尿膜部分的または完全にアタッチされた尿膜; 完全に広がり尿膜) 位相コントラストや微分干渉コントラスト光学系を搭載した顕微鏡を使用して、5 ×、10 × 目的 (図 2)。
注: 新鮮単離と完全に接続されている allantoides の代表的な例は図 2のとおりです。子宮 ex、野生型 c57bl/6 j マウスから分離した allantoides の遠位先端アタッチ (尿の部分的な添付ファイルとして呼ばれます) 4-6 時間、以内、全体の尿膜壁完全添付ファイルが可能です 〜 文化の 12 h。18-24 h 外植体が平坦化、CD31 陽性血管叢9,16(完全に広がった尿膜に呼ばれる) 円形の形状を想定します。
5 血管内皮細胞マーカー CD31 Explanted 尿膜壁験染色
- 完全に広がり外植片の培養培地を吸引し、4% (w/v) パラホルムアルデヒド/PBS の 40 μ L/ウェルを追加してセルを修正します。
注: パラホルムアルデヒドは有毒です。手袋、皮膚と眼との接触を避けるために安全ゴーグルを着用します。 - 常温では、10 分間インキュベートし、上清を吸引します。PBS の 40 μ L/ウェルを追加して 3 回を洗浄し、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。
- セルを permeabilize し PBS の 40 μ L/ウェルを追加することによって二度 0.1% (v/v) した洗浄で 30 分の PBS でトリトン X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) ヤギ血清の 40 μ L/ウェルを追加することで非特異的結合部位をブロックし、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。
注: プロトコルを一時停止できる一晩この時点で。 - 4 ° C で一晩に 20 μ L/ウェル主アンチ CD31 抗体の希釈 1:50 0.1% (w/v) BSA/PBS で追加することによって細胞を染色します。PBS の 40 μ L/ウェルを追加して 3 回を洗浄し、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。
- 暗い室内で 0.1% (w/v) BSA/PBS アルミホイルで包装することによって配置の光から保護したマイクロタイター プレートで 1 時間で蛍光標識した二次ヤギ抗ラット抗体希釈 1: 200 の 20 μ L/ウェルを追加することでバインドされた一次抗体を検出します。PBS の 40 μ L/ウェルを追加して 3 回を洗浄し、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。
- メディアをマウントの 20 μ L/ウェルを追加することによって細胞を埋め込みます。インキュベート 〜 RT 取付培地が固化するまでで 1 時間。マイクロタイター プレート常温または 4 ° c、光から保護を格納します。
- 5 ×、10 × 客観的かつ適切な蛍光フィルターを搭載した蛍光顕微鏡下で外植体画像尿膜壁血管叢
注: 完全普及尿膜の CD31 陽性血管叢の代表的なイメージは図 3のとおりです。Flk-1、Flt、に対して指示される抗体などの血管叢の他のマーカーとしてよく16ネクタイ 1 またはネクタイ 2 を使用できます。
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Representative Results
このプロトコルを特定しマウス allantoides前のヴィヴォ、外植体について述べるし、体内漿融合中 α4β1 インテグリンに尿膜添付ファイル、重要なプロセスの定性的な評価の詳細。図 1 a-Hに示す代表的な結果は、妊娠子宮から始まって尿膜分離の連続した手順を示します。脂肪組織と血管 (図 1 a) などの子宮角を囲む母体組織が削除され、胚は段階的に子宮内膜から筋子宮層 (図 1 b- 開放後解剖 E)。その後、頭頂部の卵黄嚢や胎盤円錐など他の母体組織が削除されます (図 1E, F)。図 1-Hテクニックに卵黄嚢、別の胚と高度に血管組織から胚の尿膜の解離が装備されていることを示しています。したがって、このプロトコルによると分離された allantoides、主に尿以外の母体または (余分な) 萌芽期ティッシュの汚染の無料。
図 2は、サイズと 1 つ 1 つのくずに新たに切り裂かれた胚から allantoides の形がかなり変わる14を示しています。E 8.5 で解剖した c57bl/6 j 野生型胚の allantoides は、図 2と図 1 Hで示すように、74% 例 (61 分析された胚の 45)、細長い形態を持っていた。ただし、15% で (9/61)、胚の allantoides が著しく小さくなった (参照14参照) より丸みと 11% (7/61) 胚の持っていたまだ形成していない表示されている尿膜郭清の時に。異種形状と尿膜の開始時点でのサイズにもかかわらず文化 (図 2パネル、-h)、尿膜添付ファイルを外植体し、すべての 12 h で観測されていた固定化 α4β1 インテグリンにおける拡散54 新鮮単離 allantoides の 7 リットルの胚から解剖します。それにもかかわらず、形や文化の 12 h 後外植片の大きさがやや異種 (図 2)、アッセイのスタート地点別尿形態を反映しました。
図 3に示す外植片が予想される9として、この時点で血管叢を詳述していたことを確認する、培養 24 時間後に完全に接続されている allantoides CD31 陽性血管内皮細胞の染色、免疫細胞化学,16.9の in vitro血管形成を研究するそのような尿膜付着性文化を使用ことができます。したがって、以前に同意して簡単に培養前のヴィヴォ、することができます提示方法利回り尿膜植は、実験的研究9,16を公開しました。
プロトコルは後 12 時間または 24 時間培養のよう、尿膜添付ファイルの顕微鏡観察に基づく評価のためのフレームワークをあらかじめ決められた時点で設定します。(部分/全添付ファイルまたは指定された時点で-はい/いいえ完全拡散) 質的な方法で結果を評価できます。同じ外植体を繰り返し可視化し、獲得することができます、のでこの分析は個々 の尿膜の特性は時間の経過とともに文化を外植体を反映します。さらに、固定およびステンド グラスの外植体における血管叢の形成をすることができます (図 3) を評価します。
図 1: 尿膜解剖の手順を代表します。分離の子宮角の (A) の詳細を表示します。星印が胚を含む子宮芽が付きます左側には、脂肪組織と血管周囲の子宮角を見られています。子宮の筋層を除去した後脱落膜 (子宮内膜) の (B) のビュー。高度に血管脱落膜の mesometrial ポールは左に向き、胚を含む反 mesometrial パーツ (星印) は、右へ。(C) 側を切り裂かれた反 mesometrial 極脱落膜 (星印) の表示します。矢印は、胎児の位置を示します。(D) 周辺の脱落膜の部分除去後頭頂葉の卵黄嚢に囲まれた受胎 (矢印) の平面図です。(E, F)胚 (矢印) の郭清の以降の手順の代表的な景色。矢印は、卵黄嚢を示します。(E) 胎盤円錐 (epc) が右側に表示されます。(G) 卵黄嚢 (矢印) から胚 (矢印) の部分的な郭清。尿には赤い星が付いています。尿膜 (赤い星) と (H) の分離胚の (矢印)。尿に胚の後部の端にその基底挿入部位からカットされます位置は、赤い破線で示されます。画像は、8:1 ズーム範囲と実体顕微鏡で撮影されました。すべてのスケール バーは、1 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: allantoides の異種の形そしてサイズ。8 allantoides (、-h) は 1 つ 1 つこみの胚から分離しました。左右パネル、郭清 (0 h) 後すぐに allantoides。右側のパネル、12 時間培養の後同じ allantoides。外植片がしっかりと接続されている、間葉系細胞が広がっています。植植のサイズを視覚化に囲んでいます。段階の対照の光学と 5 × (左側のパネル) または 10 × 目的 (右側のパネル) を搭載した顕微鏡で撮影を行った。すべてのスケール バーは、500 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3: 尿膜植文化における血管叢形成します。Allantoides は解剖され、この議定書に従って固定化 α4β1 インテグリンの仔します。植は、24 時間培養したし、反 CD31 一次抗体を用いて、蛍光標識した二次抗体染色血管叢における内皮細胞。血管内皮細胞は、緑色で表示されます。上の画像は、代表的な尿膜植中央地区全体の血管叢を示しています。蛍光光学系と 5 × 目標装備の顕微鏡撮影画像。スケール バー、500 μ m。下の 2 つのパネルは、解剖し、同じ条件下で培養した別の尿膜植の高倍率画像です。血管内皮細胞の血管のような構造は見られます。共焦点の顕微鏡撮影を行ったスケール バー、25 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
プロの接着細胞外マトリックス分子フィブロネクチンなどの豊富な源である血清の存在下で尿膜外植体は容易に様々 なプラスチックやガラス、フィルター表面9,16にアタッチされます。したがって、実行される分析の目的は、遺伝子組み換えの効果を具体的に検討する場合、尿膜の添付ファイルに他の処理固定化 α4β1 は、非特異的結合部位 (例えば、ウシ血清をブロックする重要です。アルブミン) インテグリンとの血清含有培養前に表面をコーティングした後メディア。
固定化 α4β1 インテグリンに尿膜外植片の初期の添付ファイルは非常に動きに敏感、組織培養プレートしたがってに委ねられること邪魔されず尿膜を採点する前に (例えば、12 h) 一定時間添付ファイル。分析されたマウス緊張または固定化 α4β1 インテグリンの濃度によって基質形成安定した接触のために必要な時間の異なるが場合があります注意してください。
細胞間 VCAM-1/α4β1-相互作用の漿尿融合の成功要件は確立された11,12,13です。さらに、細胞外マトリックス分子フィブロネクチン, コラーゲン及び興味の他の分子なども固定でき「chorio 擬態」の基板として使用します。
漿の添付ファイルは vcam-1, その結合パートナーのインテグリン α4β1 の細胞間相互作用に依存しています。子宮内、漿添付ファイルおよび後続の融合は、尿が十分にように延長するときにのみ発生、絨毛膜との接触。特定の発達段階で尿膜のサイズで生理的変動を与え、漿添付ファイルと融合間で行われるいつか E 8.0 と 9.0 E (範囲、E 7.5 E 9.25)14,16。尿膜絨毛プレート子宮内で生きたマウスに添付の非定常過程は入手されない研究具体的方法を提示します。むしろ、例の組織学的評価による漿融合の困難な決定を最も重視して分析、尿絨毛膜の表面で単一で迷路層の発達普及済み11,12,13,16の時点で。このエンドポイント分析尿膜壁絨毛膜と絨毛膜依存効果への愛着障害に対応するため、胚発育に固有の変動性によって限られ、尿は、欠陥の間で区別できません。サイズ。前述の代表の結果の下に、尿膜サイズの生理学的変動があります漿融合の相対遅延 〜 c57bl/6 j 野生型胚の 26%。統計的に言えば、ほぼ妊娠マウスを 2 つで 7 したがってあろう犠牲には早すぎる (61 から胚 7 リットル、平均くずサイズ 8.7)、実質的な物の余分な大規模な研究のための繁殖の必要性に変換します。興味深いことに、顕微鏡の実験は、1 体節組段階で尿と融合する能力が既に絨毛膜と尿が 3-5 体節のペア14胚における極大融合能力を示すことを明らかにしました。したがって、尿の chorioadhesive セル、形成され、実際漿添付ファイルin vivo前に有能な機能的。固定化リガンドに対する尿膜付着子宮 ex解析ここに示された与えられた尿膜サイズの比較的独立したためです。したがって、このメソッドの 1 つの利点はそれが尿膜伸長における欠陥をバイパスし、胎盤の形成、すなわち、chorioallantois 添付ファイルで次のステップに焦点を当ています。このアプローチは、尿膜伸長における欠陥とマウスの遺伝的変異の chorioallantois 添付ファイルを区別する従って使用場合があります。
16口ピペットを使用して胚に、アタッチメント ポイントから尿膜吸引の従来の方法とは異なり現在のプロトコルを使用して、手動切削アプローチと尿膜壁大形オリフィスのピペット チップを使用して処理後.尿膜吸引の重要な利点は、このメソッドは、直接組織処理を回避できることです。切断と尿を操作する尿の中皮の外側のシースに chorioadhesive 細胞を損傷があります。それにもかかわらず、尿を鉗子で切断使用されています前に pre-placental 組織17、体外培養と尿植添付ファイルの速度および植文化の形態で説明、本研究は、尿膜分離による吸引16パブリッシュされたデータに似ています。これらの調査結果は CD31 陽性の内皮細胞の形成によって示されているように、chorioadhesive 細胞は十分によく尿膜壁、手動切断時に保持され、その植の分化が著しく乱されていませんをお勧めします。直接のみ、上部 3 分の 2 尿膜壁 VCAM 113を表すを解剖する可能性を提供するまた尿膜壁切断といえるの卵黄嚢由来の細胞は、麓からトリミングする必要がありますと汚染が少なく、尿膜吸引18後尿膜。
尿植接着固定の子宮 ex解析, 組換え α4β1 インテグリン提供漿の融合、すなわち、細胞間の相互作用に必要な 1 つの重要な初期ステップの質的な読み出しVCAM 1 間、尿膜に発現、α4β1 インテグリン ローカライズ絨毛中皮、胚の中胚葉に由来します。それにもかかわらず、これらの 2 つの接着分子が漿融合で原則として選手として認識される 〜 VCAM 1 または α4 インテグリンの変異をホモ接合体ノックアウト胚の 50% は漿尿融合体内の11 を受ける、12,13。この不完全な浸透度を持ったのためは、この議定書に記載されている前のヴィヴォメソッドを漿融合の障害と遺伝的モデルでこれらの 2 つの接着分子のための要件を排除するのに十分なできない場合があります。
生理学的な条件の下で α4β1 インテグリン絨毛絨毛トロホブ ラスト細胞膜に埋め込まれているし、連携して細胞・細胞マトリックスの接着を調節する構造とシグナル伝達タンパク質の複雑なネットワークに組み込まれています。19. ほとんどの還元主義的アプローチ体外、絨毛の VCAM 1 バインディング インターフェイスの複雑さはのみによってモデルとして非常に限られた範囲で固定化 α4β1 インテグリンです。ほかに重要な構造または信号入力をこのシステムでそのまま絨毛膜から派生した他の潜在的な不足、それは剛、二次元の表面に固定されているインテグリンのほんの一部が、アクティブに存在する可能性が高いバインディング有能で、「オープン」の構造。
提案手法は初期の添付ファイルと, 絨毛膜に尿のステップを拡散近似し、尿血管叢血管形成9の分析と組み合わせれば開発報告ができます。しかし、現在のアプローチが尿の内皮細胞を介した血管新生によって絨毛膜の浸潤をモデル化しないもそれは漿尿の融合のための必要不可欠なプロセスである絨毛膜によって分岐の形態形成を反映して、胎盤迷路10の後続の開発。
画像解析の自動位相コントラストまたは微分干渉顕微鏡 (っぽい) と組み合わせて使用して、遅延や失敗尿添付ファイル体外の初期分析のため大規模なスクリーンの提示法が適用できます。マウス突然変異体の分析に加えて尿添付ファイルの薬、病原体、代謝物、または環境要因の効果を画面に関心のメソッドがあります。
多数マウス突然変異体、漿の添付ファイルは、通常開発するいると見えますが、尿膜と絨毛膜が発生する失敗します。さらに、通常漿添付ファイルの欠陥を示す変異体は、不完全な浸透度1,2,10を表示します。それは共通の分子経路および/または細胞プロセスこれらの機能的に明らかに非常に異なる遺伝子に影響を与えるかどうかを調査することが重要になります。マウス突然変異体から派生した尿膜外植片のライブ イメージングには、そのようなメカニズムを明らかにする可能性があります。イメージに切り裂かれた尿膜の外側のシース内のセルでした (DiI または DiO 脂溶性 carbocyanine トレーサー16,など18) 重要な蛍光染料と分類するたとえば、接着とイベントを拡散または細胞を追跡するにはリアルタイムで移行します。さらに、骨格や接着タンパク質を可視化する蛍光レポーターが有益であること証明するかもしれない。
最近、中古アタッチメント マウス allantoides と絨毛のため前のヴィヴォ共培養システムが記載されているし、このアプローチが迷路層などの漿添付後に発生したイベントを調べるために, 正常に形成17。様々 な (例えば、遺伝子組み換え) から分離した固定化した絨毛に尿膜添付ファイル効率の解析マウス モデルは分子選手との開発の早いステップを支配する経路に新たな洞察をもたらす可能性があります、マウス胎盤。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、(社) にドイツ研究振興協会 SFB688 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J wildtype mice | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| 70 % (v/v) Ethanol | VWR International | 930031006 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Forceps used to open the abdominal cavity. |
| Micro dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip. |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Straight blades. |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds. |
| Microspoon | Carl Roth | AT18.1 | 5 mm Spoon diameter. |
| Microtiter plates | ibidi | 81501 | We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic. |
| 10 cm dish | Nunc | 150350 | Sterile tissue culture dishes. |
| 3.5 cm dish | Nunc | 150288 | Sterile tissue culture dishes. |
| Large orifice pipette tips | Biozym | VT0140X | Low binding pipette tips, 200 µL. |
| α4β1 integrin | R&D Systems | 6054-A4 | Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-03600 | The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| L-Glutamine | PAN Biotech | P04-80100 | 100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C. |
| para-Formaldehyde | Carl Roth | 0335.2 | To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks. |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100. |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses. |
| α-CD31 Antibodies | BD Biosciences | 550274 | Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3. |
| Secondary goat anti-rat antibodies | Thermo Fisher | A-11006 | Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible. |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000 |
| Labovert | Leitz | Labovert | Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable. |
| M80 | Leica Microsystems | M80 | Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection. |
| DM4000B | Leica Microsystems | DM4000B | Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment. |
| Digital camera | JVC | KY-F75U | 3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective. |
References
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