Diseksiyon ve Explant kültür Allantoic eki Vitro analizi için fare Allantois ve

Summary

Biz bir vitro tahlil modeli chorioallantoic ekte, plasenta oluşumu ilk adımda açıklanmaktadır. Protokol immobilize α4β1 Integra üzerinde fare allantoides diseksiyon ve explant kültür gösterir. Allantois ek olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarda değerlendirilir.

Abstract

Plasenta büyüme ve memeli embriyo gelişimi için önemlidir. Bu nedenle, çok sayıda genetik değişiklikler ve plasenta geliştirme veya işlev rahatsız büyük olasılıkla aynı zamanda çevre hakaret erken gebelik kaybı fareler ve insanlar neden olabilir. Yine de, basit vitro deneyleri plasenta oluşumu üzerindeki olası etkileri için ekran için eksik vardır. Burada, allantois ekin için koryon oluşur plasenta oluşumu ilk ve önemli adımda modelleme ele. Biz hızla allantoic explants chorio mimetic substrat hizmet vermektedir immobilize α4β1 Integra üzerinde eki değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu vitro yaklaşım eki ve birden çok allantois explants farklı ardışık zaman noktalarda davranışını yayılan nitel bir değerlendirme sağlar. Protokol hedeflenen fare mutasyonlar, uyuşturucu veya gebelik komplikasyonları veya fetal kayıp allantois eki ex vivoolarak bağlı çeşitli çevresel faktörlerin etkisini araştırmak için kullanılır.

Introduction

Plasenta embriyonik gelişim ve rahim ortamı için vazgeçilmezdir. Endokrin ve bağışıklık organ oksijen, metaboliti ve maternal ve fetal dolaşım ve ayrıca işlevleri arasında besin alışverişini arabirimdeki oluşturmaktadır. Plasental geliştirme bozar endojen veya eksojen hakaret intrauterin büyüme geriliği, gebelik kaybı veya gebelik komplikasyonları, fareler ve insanlar¹yol açabilir. Anormal plasental Fizyoloji neden hedeflenen fare mutasyonlar sayısı ile şu anda fare genom Bilişim (MGI) Web sitesinde listelenen 219 genotip², artmaya devam ederken (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), bu fenotipleri birçoğu iyi mekanik açısından anlaşılmış değil. Genetik değişikliklere ek olarak, küçük molekül uyuşturucu, monoklonal antikorlar, toksinler, patojenler, aşırı metabolitleri veya çeşitli çevresel aracıları plasenta geliştirme ve işlev^3,4,5 etkileyebilir ^{, 6 , 7}. henüz, plasenta geliştirme modeli eleştirel adımları azdır basit vitro deneyleri.

Allantois (göbek kordonu gelişimsel habercisi) embriyo posterior ucundan doğru koryon⁸büyür bir tomurcuk olarak ortaya çıkıyor zaman fare plasental geliştirme erken midgestation içinde başlatılır. Allantoic tomurcuk dış tabakası hücrelerde Chorioadhesive eki ve allantois koryon (chorioallantoic "füzyon") yüzeyi ile yayılan aracılık. Koryon villus içine Labirent, besin ve oksijen anne kan yakından bitişik sinusoids ve embriyonik damarları^{9 arasında değişen nerede iç plasental katman oluşturmak üzere allantois damarlara büyür içine daha sonra pas geçiyor ,10}.

Allantois eki koryon için labirent oluşumu içinde belgili tanımlık ilk ve önemli adım, ve kusurları bu süreçte embriyonik ölümcül en sık karşılaşılan nedenleri arasında midgestation¹'. Her ne kadar bir dizi fare mutantlar var nerede chorioallantoic eki¹⁰gerçekleşmesi başarısız olur ve MGI veritabanı şu anda anormal chorioallantoic füzyon (http:// tarafından karakterize 108 fare mutantlar listeler tarif edilmiştir www.informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1, allantoic mesoderm ifade) ve (olan koryonik mesothelium ifade α4β1 integrin arasındaki hücreler arası etkileşimi extraembryonic mesoderm türetilmiş) chorioallantoic eki ve füzyon^11,12,13için vazgeçilmez gibi görünüyor. İmmunohistokimyasal bütün Dağı yaban tipi embriyoların boyama olduğunu göstermiştir VCAM-1 yaklaşık embriyonik gününde (E) 7.5 distal üçte içinde allantoic SAP ifade edilir¹³ (1-4 somite sahne) ve onun ifade yüksek kalır chorioallantoic eki ve füzyon^11,12sırasında-. Koryon allantoic eki başarısızlık genellikle rahim tomurcukları histolojik analizler tarafından algılanır. Ancak, allantois boyutları fizyolojik arasında ve aynı gelişimsel sahne¹⁴çöp içinde bile çok değişkendir ve fiziksel temas yapmak için yeterli bir boyuta ulaştığında allantois sadece için koryon ekleyebilirsiniz. Bu doğal değişkenlik yansıtan, chorioallantoic ek bir ara arasında gerçekleşir ~ E 8.0 ve E 9.0 rahim içindeve bu işlem Histoloji tarafından istatistiksel olarak güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi bağlıdır bu nedenle çok sayıda analizi conceptuses uygun gelişim aşamasında yeterli örnekler almak için.

Burada, biz daha az allantois boyutuna bağlıdır allantoic eki rahim değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz hamile fareler uteri fare embriyo ve onların allantoides diseksiyon göstermek ~ 8 gün coitum post (dpc; dpc 0,5 belirtir bir vajinal fiş tespiti), ve allantois sonraki kültür üzerinde immobilize α4β1 explants integrinler. Bu yöntem ekler ve birden çok allantois explants paralel ve farklı her başarılı zaman noktalarda davranışını yayılan bir hızlı, işlevsel değerlendirme sağlar. Protokol kullanılabilir için ekran allantois eki ex vivohedeflenen mutasyonlar, uyuşturucu veya çeşitli çevresel faktörlerin etkileri.

Protocol

Fare üreme Regierung Unterfranken tarafından kabul edildi ve tüm analizler tüm Alman ve Avrupa Birliği yasalara ve yönetmeliklere bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ile ilgili sıkı doğrultusunda gerçekleştirilmiştir.

1. Microtiter kaplama α4β1 Integrin ile Eski Utero Allantois Explant kültür için tabaklar

1. 200 µg/mL steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), fare α4β1 liyofilize integrin sulandırmak. Önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon oranında seyreltin. Pipet 20 µL/kuyu kuyu microtiter plaka (1 allantois/de) gerekli sayıda seyreltilmiş α4β1 integrin çözümde.
   Not: microtiter plaka kuyu kaplama hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek.
2. 37 ° C'de 60 dk microtiter plakaları bir oksijen doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirerek kuluçkaya.
3. Dikkatle süpernatant bir pipet ile Aspire edin. Pipet ucu iyi alt dokunmadan önlemek için plaka eğim ve yumuşak emici kullanın. İki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür ortamının gibi Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) 50 µL ekleyerek Wells yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.
4. Kritik adım: ücretsiz siteleri 50 µL/kuyu %0,1 (w/v) sığır serum albumin (BSA) ekleyerek bağlama blok / DMEM ve oksijen doku kültürü kuluçka makinesine microtiter plakaları yerleştirerek ≥ 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
   Not: Allantois explants varlığında serum çeşitli yüzeyler ekleyebilirsiniz. Bu nedenle non-spesifik bağlayıcı siteleri engellemek için şarttır, kaplama sonra kuyu integrin ile disseke allantois eklemeden önce serum içeren kültür explant orta (bkz. Adım 4.4).
5. Kaplamalı wells adım 4.4 gerekinceye kadar 37 ° C'de engelleme çözümde tutun.

2. rahim diseksiyon Dpc 8, hamile bir fareden

Not: ağırlık kazanç ayrımcılık¹⁵tarafından yanlış pozitif gebelik oranları azaltmak.

1. Fare tarafından servikal çıkığı kurban. Karın bölgesi kürkle % 70 (v/v) etanol ile püskürtülerek dezenfekte.
   Not: fareler işlerken eldiven. Ötenazi anestezi olmadan servikal çıkığı tarafından allantois eki ile girişime neden olabilir allantois kimyasal kirlenme engeller.
2. Karın deri makasla orta hat küçük bir kesi yaparak dosyayı açtı. Cilt kesi altında ve üstünde tutmak için eldivenli parmak kullanmak ve cilt göğüs ve fare kuyruğu doğru ayır.
3. Karın zarını Forseps ile kavramak. Diğer el ile yapmak bir V şeklinde kesi gelen ön arka doğru makas kullanarak ve karın boşluğu açıklamakla doku taşıyın. Forseps bağırsak rahim erişim kazanmak için bir kenara itmek için kullanırız.
4. İki rahim korna bulun. Forseps ile serviks (Kaudal kesim) tutun ve ligament iyi makasla kesme. Sonra her iki rahim boynuzları makasla oviducts kesilmesinin tarafından bağlantısını kesin.
5. Forseps oda sıcaklığında (RT) PBS içeren bir steril 10 cm çanak içine steril, rahim aktarmak için kullanın. Yağ dokusu, damarları ve sinirleri çevreleyen güzel forseps ve/veya makas (şekil 1A) ile rahim boynuzları kaldırın.

3. embriyo diseksiyon

Not: bir 8:1 zum mesafesi ile donatılmış bir stereomicroscope altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

1. Embriyo implantasyonu siteler arasında keserek makas ile ayırın. Kas rahim astarı rahim tomurcukları Forseps ile tutun ve decidua (şekil 1B) ortaya çıkarmak için ayrı çekin.
2. Forseps kullanarak, rahim tomurcukları RT PBS steril, içeren yeni bir 10 cm tabak içine aktarın.
3. Decidua embriyo çevresinde forseps ipuçları ile düzeltmek.
4. Bir kesik decidua anti-mesometrial tarafında iyi forseps (şekil 1 c) ile yapmak ve decidua peel away Forseps ile embriyo (şekil 1 d) ortaya çıkarmak için.
   Not: Decidua mesometrial pole son derece skarların ve embriyo içerir ve solgun görünür en anti-mesometrial kısmı, onun temel geniş olabilir.
5. Embriyo forseps (şekil 1E, F) ile incelemek.
6. Bir mikro-kaşık kullanarak, steril PBS bir steril 3.5 cm tabak içinde yer alan bir damla içine embriyo transfer.
7. PBS bir mikro-kaşık kullanarak aynı 3.5 cm tabak taze bir damla içine embriyo transfer ve embriyo forseps (şekil 1G, H) kullanarak sarısı sac dan incelemek.
8. İsteğe bağlı olarak, (örneğin, Genotipleme Polimeraz zincir reaksiyonu tarafından için) gerekirse, sarısı sac steril tüpe bununla aspirating tarafından transfer ~ 5 µL PBS büyük delik 200 µL pipet ucu içine. -20 ° C'de mağaza
   Not: sarısı sac hazırlama kontamine anne doku (Yani, parietal sarısı Reichert'ın membran ve ectoplacental koni gibi sac) hatalı Genotipleme sonuçlara yol açabilir. Bu doku kaldırılması embriyo diseksiyon sarısı sac dan önce en kolay yoldur.

4. allantois diseksiyon ve Eski Utero kültür immobilize α4β1 Integra üzerinde

1. Allantois iyi forseps (şekil 1 H) kullanarak embriyo posterior sonundaki Bazal ekleme sitesinden kesti.
2. İsteğe bağlı olarak, gelişimsel evreleme gerekiyorsa, embriyo somite çift faz kontrast optik ve 5 × ve 10 × amacı ile donatılmış bir mikroskop kullanarak görsel denetim tarafından saymak.
   Not: Embriyo somite sayma kolaylaştırmak için Forseps ile uzatılabilir. Chorioallantoic eki ve füzyon E 8.0 ve E 9.0 arasında embriyo ≥ 6 somite çiftleri ile oluşur. Dönüm embriyo 6-8 somite çiftleri ile başlar.
3. Pipet 40 µL/kuyu % 10 (v/v) fetal sığır serum, L-glutamine ve önceden kaplanmış microtiter plaka wells (bkz. Bölüm 1) gerekli sayıda antibiyotik ile takıma DMEM.
4. Bununla aspirating tarafından kayan allantois toplamak ~ 5 µL PBS 200 µL pipet ucu büyük bir delik içine. 1 allantois/iyi transfer.
5. Örneğiniçin bir oksijen doku kültürü kuluçka (37 ° C, % 5 CO₂) microtiter tabak koyarak allantoides kuluçkaya 6, 12 ve 24 h. Allantois eki ile etkilenmemesi için microtiter plakaları bu zaman puan arasında hareket.
6. Her zaman noktada allantois ek (örneğin, hiçbir eki/yüzer allantois kısmi veya tam olarak ekli allantois; tam yayılmış allantois) puan edinildi faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast optik ile donatılmış bir mikroskop kullanarak ve 5 × veya 10 × hedef (Şekil 2).
   Not: Taze izole ve tam olarak ekli allantoides temsilcisi örnekleri Şekil 2' de gösterilmiştir. Allantoides wildtype C57BL/6J fareler izole distal ucu rahim, verdiği 4-6 h (Bu adlandırılır allantois kısmi ek olarak) içinde ve tüm allantois tam eki içinde elde ~ kültür 12 h. Explant tarafından 18-24 h, basık ve dairesel bir şekil (tam olarak allantois yaymak için denir) ile bir CD31 pozitif vasküler pleksus^9,16kabul.

5. doğrulama Explanted Allantois endotel hücre işaretçisi CD31 için boyama

1. Tam yayılmış explants kültür orta Aspire edin ve hücreleri % 4 (w/v) paraformaldehyde/PBS 40 µL/kuyu ekleyerek düzeltmek.
   Not: Paraformaldehyde zehirlidir. Cilt ve göz teması önlemek için koruyucu gözlük ve eldiven giymek.
2. RT, 10 min için kuluçkaya sonra süpernatant Aspire edin. PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.
3. Hücreleri permeabilize ve non-spesifik bağlayıcı siteleri blok 40 µL/iyi % 0.1 (v/v) dik yıkama 30 dk için PBS içinde Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) normal keçi serum ekleyerek iki kez PBS 40 µL/kuyu ekleyerek ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.
   Not: Protokol gecede bu noktada duraklatılmış.
4. Hücreleri 20 µL/iyi birincil anti-CD31 antikorların 1:50 % 0,1 (w/v) BSA/PBS içinde seyreltilmiş ekleyerek gecede 4 ° C'de leke PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.
5. İlişkili birincil antikorlar %0,1 (w/v) BSA/PBS RT. koru microtiter plakaları ışık alüminyum folyo sarma veya yerleştirerek, 1 h için bir karanlık oda içinde ikincil keçi fluorescently etiketli Anti-sıçan antikorlar seyreltilmiş 1: 200 20 µL/kuyu ekleyerek algılamak. PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.
6. Hücreleri 20 µL/iyi montaj orta ekleyerek gömün. İçin kuluçkaya ~ 1 h montaj orta katılaşmış kadar RT olarak. Microtiter plakaları RT veya ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
7. Görüntü allantois vasküler pleksus 5 × veya 10 × objektif ve uygun floresan filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop altında explants.
   Not: Tam yayılmış allantois CD31 pozitif vasküler pleksus temsilcisi görüntülerini şekil 3' te gösterilmektedir. Diğer işaretler için antikorlar gibi vasküler pleksus Flk-1 karşı Flt, yönetmen kravat-1 veya kravat-2 iyi¹⁶olarak kullanılabilir.

Representative Results

Bu iletişim kuralı yalıtmak ve fare allantoides ex vivoexplant yöntemi açıklanır ve in vivo chorioallantoic füzyon sırasında α4β1 integrin allantois eki, kritik bir süreç değerlendirme nitel ayrıntıları. Şekil 1A-H temsilcisi sonuçlar allantois yalıtım hamile rahim başlayarak birbirini izleyen adımları göstermektedir. Rahim boynuzları, yağ dokusu ve gemiler (şekil 1A) gibi çevreleyen anne dokular kaldırılır ve embriyo endometrium step-wise bir moda dan sonra kas rahim Katmanı (şekil 1B- açılması disseke E). Daha sonra parietal sarısı sac ve ectoplacental koni gibi anne diğer dokulara kaldırıldı (şekil 1E, F). Şekil 1G - H teknik sarısı sac, başka bir extraembryonic ve son derece bozukluklarına doku uzak extraembryonic allantois diseksiyon oluşur gösterir. Böylece, bu protokole göre izole allantoides büyük ölçüde allantois dışında anne veya (ekstra) embriyonik doku bulaşıcı ücretsizdir.

Şekil 2 boyutunu ve şeklini allantoides bir tek çöp taze disseke embriyo üzerinden¹⁴önemli ölçüde değişebilir gösterir. Allantoides C57BL/6J wildtype embriyo E 8.5 disseke (45 61 analiz embriyo), vakaların % 74'Şekil 2 ve şekil 1 H' de gösterildiği gibi uzun bir kara delik vardı. Ancak, içinde % 15 (9/61) embriyo allantoides belirgin daha küçük ve daha fazla (bkz. başvuru¹⁴) yuvarlak ve % 11 (7/61) embriyo henüz görünür allantois diseksiyon anda oluşmuş değil. Türdeş olmayan şekil ve boyutlarda allantois başlangıç zaman noktasında rağmen kültür (Şekil 2, paneller bir-h), allantois eki explant ve tam immobilize α4β1 Integra üzerinde yayılan tüm 12 h içinde gözlenen 54 taze izole allantoides yedi çöp embriyo kesmiştim. Bununla birlikte, şekil ve boyutlarda explants kültürünün 12 h sonra biraz heterojen (Resim 2), kullanmıştır türleri farklı allantoic Morfoloji testin başlangıç noktasında yansıtan.

Şekil 3 explants bu zaman noktası olarak beklenen⁹ tarafından vasküler pleksus özenli doğruluyor explant kültürünün 24 saat sonra CD31 pozitif tam olarak ekli allantoides endotel hücrelerinde için boyama bir immunocytochemical gösterir ^{, 16}. böyle yapışık allantois kültürler damar oluşumu vitro⁹çalışma için kullanılabilir. Bu nedenle, kolayca kültürlü ex vivo, taleplere ile daha önce olabilir sunulan metodoloji verimleri allantois explants deneysel çalışmalar^9,16yayınlandı.

Protokol çerçevesinde allantois eki mikroskobu tabanlı değerlendirilmesi için önceden belirlenmiş zaman noktalarda, gibi sonra 12 saat veya 24 saat explant kültürünün ayarlar. Sonuçları nitel bir şekilde (kısmi/tam ek veya tam yayılan bir belirli zamanda noktada-Evet/Hayır) değerlendirilebilir. Bu yana aynı explant tekrar tekrar görüntülenir ve attı, bu analiz bireysel allantois özellikleri kültürleri zamanla explant yansıtır. Buna ek olarak, sabit ve lekeli explants içinde bir vasküler pleksus oluşumu olabilir (şekil 3) değerlendirildi.

Şekil 1: temsilcisi adımlar allantois diseksiyon. (A)ayrıntı görüntülemek izole bir rahim boynuzu. Embriyo içeren rahim tomurcukları yıldız tarafından işaretlenir; yağ dokusu ve rahim boynuz çevresindeki damarları sol tarafta görülür. (B) decidua (endometrium) rahim kas tabakası çıkarıldıktan sonra bir bakış. Son derece bozukluklarına, decidua, mesometrial pole sola odaklı, embriyo içeren anti-mesometrial bölümü (bir yıldız ile işaretlenmiş) sağa doğru aydınlatmaktadır. (C) yan görüntüleyin (bir yıldız ile işaretlenmiş) decidua disseke anti-mesometrial kutup. Ok embriyo konumunu gösterir. (D) çevreleyen decidua kısmi kaldırıldıktan sonra parietal sarısı sac tarafından çevrili conceptus (ok) Top görünümünü. (E, F) Sonraki adımlar (ok) embriyo diseksiyon temsilcisi sayısı. Önizlemedeki sarısı sac gösterir. (E), ectoplacental Koni (epc) sağ tarafta görünür. (G) üzerinden sarısı sac (ok) (ok) embriyo kısmi diseksiyon. Allantois kırmızı yıldızla işaretlenir. (H) izole embriyo (ok) allantois (Kızıl Yıldız) ile. Nerede allantois kendi Bazal ekleme site embriyo arka sonunda kesilir nokta kırmızı kırık çizgi ile belirtilmiş. Görüntüler üzerinde bir 8:1 zum mesafesine sahip bir stereomicroscope alınmıştır. Tüm ölçek çubukları 1 mm. olan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: farklı şekil ve boyutlarda allantoides. Sekiz allantoides (bir-h) bir tek çöp embriyo izole edildi. Paneli yaptı, allantoides hemen sonra diseksiyon (0 h). Doğru kapı aynası, explant kültür 12 h sonra aynı allantoides. Explants sıkıca bağlı ve Mezenkimal hücreler yayıldı. Explants explant boyutları görselleştirmek için çember. Görüntüleri faz kontrast optik ve 5 × (sol kapı aynası) veya 10 × amaç (doğru kapı aynası) ile donatılmış bir mikroskop üzerine alındı. Tüm ölçek çubukları 500 µm. çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: vasküler pleksus oluşumu allantois explant kültürlerde. Allantoides disseke ve mevcut protokolünde açıklandığı gibi immobilize α4β1 Integra üzerinde explanted. Explants 24 saat kültürlü ve endotel hücreleri vasküler pleksus içinde anti-CD31 birincil antikorları kullanarak ve fluorescently ikincil antikorlar etiketli lekeli. Endotel hücreleri yeşil görünür. Üst resim tüm vasküler pleksus temsilcisi allantois explant merkezi alanında gösterir. Görüntü üzerinde Floresans optik ve 5 × amacı ile donatılmış bir mikroskop atıldığını. Ölçek çubuğu, 500 µm. İki alt panel disseke ve aynı koşullar altında kültürlü başka bir allantois explant daha yüksek büyütme görüntülerdir. Gemi benzeri yapıları ve bireysel endotel hücreleri görülebilir. Görüntüleri confocal mikroskobunun alındı; ölçek çubukları, 25 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Yanlısı yapıştırıcı hücre dışı matriks moleküllerini fibronektin gibi zengin bir kaynağıdır, serum huzurunda allantois explants kolayca çeşitli plastik, cam veya filtre yüzeyler^9,16eklemek olacaktır. Böylece, gerçekleştirilen tahlil amacı özellikle bir genetik değişiklik etkisini araştırmak için veya başka bir tedavi allantois eki için immobilize α4β1 ise, non-spesifik bağlayıcı siteleri (örneğin, sığır serum ile engellemek için kritik Albümin) integrin ve serum içeren ile kuluçka önce yüzey kaplama sonra medya.

Allantois explants ilk eki için immobilize α4β1 integrin hareketi çok hassastır ve doku kültürü plakaları bu nedenle allantois puanlama önce (örneğin, 12 h için) bir önceden belirlenmiş zaman dönem için rahatsız edilmeden bırakılmalıdır Eki. Kararlı kişi için gereken süre belgili tanımlık substrate kurmasıyla analiz fare zorlanma veya immobilize α4β1 integrin yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir.

Sıkıca kurulan^11,12,13hücreler arası VCAM-1/α4β1-etkileşim için başarılı chorioallantoic füzyon gereksinimdir. Buna ek olarak, hücre dışı matriks moleküllerin fibronektin, collagens ve diğer moleküller ilgi Ayrıca immobilize ve "chorio mimetic" yüzeylerde kullanılır.

Chorioallantoic eki VCAM-1 ve onun bağlama ortak integrin α4β1 arasındaki hücreler arası etkileşimi bağlıdır. Rahim içindechorioallantoic eki ve sonraki fusion sadece oluşabilir allantois yeterince yapmak için genişlettiği zaman koryon ile temas. Fizyolojik değişkenliğine allantois boyutlarda belirli bir gelişim aşamasında göz önüne alındığında, chorioallantoic eki ve füzyon E 8.0 ve E 9.0 (Aralık, E 7.5-E 9,25) arasında yer almaktadır^14,16. Özellikle yaşam Mouse koryonik plaka rahim içinde allantois ek geçici sürecinin, hazır olmayan çalışma yöntemleri mevcut. Aksine, analizleri çoğunlukla örneğindeğerlendirilmesi histolojik tarafından chorioallantoic füzyon zahmetli belirlenmesi odaklandık, allantoic koryon yüzeyi ve tek bir labirent katmanında gelişimi yaymak, önceden belirlenen zaman noktası^11,12,13,16. Bu bitiş noktası analizi allantois Engelli eki koryon ve koryon bağımlı etkileri nedeniyle özellikle ve embriyo gelişim dönemleri doğal değişkenlik tarafından sınırlı ve allantoic kusurları arasında ayırımcılık değil boyutları. Temsilcisi sonuçlarıaltında açıklandığı gibi fizyolojik değişkenliğine allantois boyutlarda chorioallantoic erime içinde göreli bir gecikme neden olabilir ~ C57BL/6J wildtype embriyo, % 26. İstatistiklere göre neredeyse iki yedi hamile fareler bu nedenle kurban çok erken (61 embriyo üzerinden yedi çöp, ortalama çöp boyutu 8.7), hangi daha büyük ölçekli çalışmalar için aşırı yetiştiriciliği önemli bir gerekliliği anlamına olurdu. İlginçtir, mikrocerrahi deneyler koryon zaten allantois ile 1 somite çifti aşamada sigorta yetkili olduğunu ve allantois embriyo 3-5 somite çiftleri¹⁴ile maksimal füzyon kapasite sergileyen ortaya çıkardı. Bu nedenle, allantois hücrelerinin chorioadhesive kurulan ve işlevsel olarak yetkili gerçek chorioallantoic eki içinde vivoönce vardır. Rahim allantois eki immobilize ligandlar, burada anlatılan gibi bu nedenle verilen allantois boyutunu nispeten bağımsız analizidir. Bu nedenle, bu yöntemin bir avantajı bu allantois uzama hatalarını atlar ve plasenta oluşumu, Yani, chorioallantois eki sonraki adımda odaklanmaktadır olduğunu. Bu yaklaşım böylece allantois uzama kusur ve chorioallantois ek olarak genetik fare mutantlar arasında ayırt etmek için kullanılır.

Aksine onun eki noktadan allantois aspirasyon bir ağız pipet¹⁶kullanarak embriyo için geleneksel yöntem, geçerli iletişim kuralı el ile kesme yaklaşım kullanır ve allantois daha sonra büyük delik pipet ipuçlarını kullanarak ele alınır . Allantois aspirasyon önemli bir avantajı bu yöntemi doğrudan doku işleme engeller olduğunu. Kesme ve allantois manipüle allantoic mesothelium dış kılıf chorioadhesive hücrelere zarar verebilir. Yine de, allantois Forseps ile kesme başarıyla kullanılan önce ex vivo pre-placental doku¹⁷kültürlerde ve Kinetik allantoic explant ekin ve morfolojisi explant kültürlerin açıklanan Bu da çalışmanın üzerinde allantois yalıtım temel aspirasyon¹⁶tarafından yayımlanan verileri benzer. Bu bulgular CD31 pozitif endothelia oluşumu ile belirtildiği gibi chorioadhesive hücreleri yeterince iyi allantois el ile kesme üzerine korunur ve bu explant farklılaşma fena halde tedirgin değil, tavsiye ederim. Allantois Ayrıca kesme sadece üst VCAM-1¹³ifade üçte ikisi allantois incelemek imkanı sunuyor ve daha az kirlilik uzak tabanı kesildikten gerekebilir sarısı sac kaynaklı hücreler sağlar doğrudan allantois allantois aspirasyon¹⁸sonra.

Allantoic explant yapışma immobilize rahim analizi, rekombinant α4β1 integrin chorioallantoic füzyon, Yani, hücreler arası etkileşim için gerekli olan bir önemli, ilk adım bir nitel okuma sağlar. allantois üzerinde VCAM-1 arasında ifade ve α4β1 integrin extraembryonic mesoderm türetilmiştir koryonik mesothelium yerelleştirilmiş. Yine de, her ne kadar bu iki adezyon molekülleri chorioallantoic Fusion, ilke oyuncular kabul edilmektedir ~ embriyo VCAM-1 veya α4 integrin mutasyonların homozigoz nakavt ile % 50'si chorioallantoic füzyon vivo içinde^{11 geçmesi ,12,13}. Bu eksik alellerle nedeniyle mevcut iletişim kuralında tanımlanan ex vivo yöntemi chorioallantoic füzyon bu iki adezyon molekülleri bir hata ile genetik modelleri için bir gereklilik ekarte etmek yeterli olmayabilir.

Fizyolojik koşullarda α4β1 integrinler koryonik trophoblasts plazma zarı içinde gömülü ve hücre-hücre (ve hücre vuruşlu) yapışma düzenleyen işbirliği yapısal ve sinyal proteinleri karmaşık bir ağ içinde dahil edilmiştir ¹⁹. gibi çoğu indirgemeci vitro yaklaşımlar ile koryonik VCAM-1 bağlama arabirimi karmaşıklığı sadece çok sınırlı bir ölçüde immobilize α4β1 integrin tarafından modellenmiştir. Diğer önemli yapısal veya sinyal girdilerin sağlam koryon bu sistemde türetilmiş potansiyel eksikliği yanı sıra, katı, iki boyutlu bir yüzeye immobilize integrinler yalnızca bir kısmını etkin mevcut olasıdır, bağlama yetkili, "açık" uyum.

Sunulan yöntem erken eki ve allantois adım koryon için yayılan yaklasik ve -ebilmek da rapor allantoic vasküler pleksus damar oluşumu⁹analizi ile birleştirildiğinde geliştirilmesi. Ancak, mevcut yaklaşım koryon işgali allantoic endotel hücreleri tarafından aracılı angiogenez çimlenme tarafından model değil, ne de chorioallantoic füzyon için gerekli bir süreçtir koryon tarafından dallanma morfogenez yansıtacak ve plasental labirent¹⁰sonraki gelişimi.

Faz kontrast veya fark girişim mikroskobu (yarı-) ile birlikte kullanarak otomatik görüntü analizi, daha büyük ölçekli ekranlarda gecikmeli "veya" hatalı allantoic eki içinde vitroilk analizi için sunulan yöntem uygulanabilir. Fare mutantlar analiz yanı sıra, yöntem allantoic eki uyuşturucu, patojenler, metabolitleri veya çevre ajanlar etkileri ekran ilgi olabilir.

Allantois ve koryon normalde geliştirdik gibi görünmesine karşın çok sayıda fare mutantlar gerçekleşmesi, chorioallantoic ek başarısız olur. Ayrıca, genellikle chorioallantoic ek hataları gösteren mutantlar eksik alellerle^1,2,10ekran. Bu işlevsel olarak Görünüşe göre çok farklı genler ortak moleküler yolları ve/veya hücresel etkisi olup olmadığını araştırmak önemli olacaktır. Fare mutantlar türetilmiş allantois explants canlı görüntüleme böyle mekanizmaları aydınlatmak potansiyeline sahiptir. Örneğin, disseke allantois dış kılıf hücreleri (örneğin dıı veya DiO lipofilik carbocyanine izleyicileri^16,18) hayati floresan boyalar ile görüntü için denetimin etiketi olabilir yapışma ve olayları, yayılan veya hücre izlemek için gerçek zamanlı geçiş. Buna ek olarak, sitoiskeleti veya yapışma proteinler görselleştirmek floresan gazetecilere bilgilendirici olduğunu kanıtlayabilir.

Son zamanlarda, bir ex vivo ortak kültür sistemi ön eki fare allantoides ve chorions için açıklanan ve bu yaklaşım başarılı bir şekilde chorioallantoic eki, Labirent katman gibi sonra meydana gelen olayları araştırmak için kullanılan oluşumu¹⁷. Allantois eki verimliliği üzerinde immobilize chorions (genetiği değiştirilmiş çeşitliörneğin) izole analizini fare modelleri yeni yorumlara moleküler oyuncular ve gelişiminde ilk adımları yöneten yollar verim fare plasenta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
α4β1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
α-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.