Summary
이 연구는 Candida glabrata에 항진균 약물 저항을 부여 하는 유전자에 돌연변이의 분석을 위한 전체 게놈 시퀀싱을 구현. C. glabrata 격리 저항 echinocandins, azoles 및 5-flucytosine 하는 방법론을 설명 하기 위해 시퀀싱 했다. 유전자의 특정 돌연변이 패턴의 존재 여부와 상관 하는 격리의 민감성 프로필.
Abstract
Candida glabrata 신속 하 게 될 약물 저항, 특히 azoles 및 echinocandins 돌연변이 수집할 수 있습니다. 유전자 변이의 식별, 필수적 이다 저항 체 외에서 수 자주와 상관 될 임상 실패 감지. 우리는 항진균 약물 저항 C. glabrata의 게놈 넓은 분석에 대 한 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)를 사용 하 여의 타당성을 검사 합니다. 목표는 torecognize enablers와 장벽을 WGS 구현에서 되었고 그 효과 측정. 이 문서는 주요 품질 관리 검사점 및 항진균 요원 민감성 감소와 관련 되었던 유전자 표시를 조사 WGS 방법론의 필수 구성 요소를 설명 합니다. 그것은 또한 데이터 분석의 정확도 테스트 시간 주위 차례 견적.
12 임상, phenotypic 민감성과 C. glabrata 의 한 ATCC 스트레인 항진균 민감도 테스트를 통해 결정 되었다. 이 포함된 3 쌍, 3 환자, 마약 최소 억제 농도 상승 개발에서 격리. 두 쌍에서 두 번째의 각 쌍 개발 저항 echinocandins 격리 합니다. 3 쌍의 두 번째 분리 5 flucytosine에 저항을 개발 했다. 나머지 구성 취약 azole 내성 격리. Echinocandin, azole 5 flucytosine 저항에 연결 하는 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)는 WGS 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 통해 저항 격리에서 확인 되었다. FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 및 FCY2 같은 유전자 발견 했다 항진균 저항 비 동의어 Snp. 전반적으로, 약 75-fold 읽기 깊이 범위와 참조 게놈에 매핑된 C. glabrata 격리의 WGS 읽기의 98%의 평균. 처리 시간 및 비용 생어 비교 했다 순서.
결론적으로, C. glabrata 의 WGS 다중 PCR/DNA 연속 반응에 대 한 필요 없이 다른 항진균 약물 클래스에 저항에 관련 된 임상적으로 중요 한 유전자 돌연변이 공개에서 가능 했다. 이 항진균 성 부여 대체의 동시 검출에 대 한 임상 실험에서 샷건 시퀀싱 기능 설정으로 긍정적인 단계를 나타냅니다.
Introduction
Candida glabrata 는 azoles 뿐만 아니라 최근에, echinocandins,12,3저항을 전시 하는 종족으로 중요도 점점 발생된 병원 체 이다. 2 중 C. albicans, 달리 C. glabrata 의 단일 게놈 돌연변이 획득 하 고 보다 쉽게 다중 약물 저항을 개발 하도록 허용할 수 있습니다. 공동 저항에 두 약물 클래스 되었습니다 보고4. 따라서, 항진균 민감성의 초기 평가 및 C. glabrata 에서 약물 내성의 검출은 항균 성 저항1 의 드라이버 제한 항진균 집사의 직의 맥락에서 뿐만 아니라 정확 하 고, 타겟 치료에 대 한 중요 한 , 5 , 6. 빠르게 감지 저항 격리 바이오 마커의 저항에 연결 하는 확실 한 돌연변이의 존재는 또한 처방을 개선 하기 위해 도움이 결정 하는 효율적인 워크플로 및 임상 결과 설정.
항진균 민감성은 일반적으로 최소 억제 농도 (MIC) 마약 없는 성장의 저것과 비교 된 미생물의 성장에 있는 뜻깊은 감소에 있는 결과 낮은 약물 농도로 정의 되는 측정 하 여 평가 제어 합니다. 임상 실험실 표준 협회 (CLSI)와 유럽 위원회 항균 민감성 테스트 (EUCAST)를에 마이크 결정 수 있도록 메서드를 테스트 하는 민감성 표준화 더 정확 하 고 일관 된7, 8. 그러나, 항진균 마이크의 유틸리티 남아 있다 echinocandins, 특히 제한 특히 inter-laboratory 비교에 관해서는 다양 한 방법론 및 조건 있는 사용된9. Echinocandin 처리와 WT를 구별 하는 무 능력에 대 한 응답으로 마이크의 불확 실한 상관 관계 있다 (또는 취약) FKS 돌연변이 (echinocandin 내성 변종)10,11은닉에서 격리. 확실 한 단일 유전자 PCRs 생어의 가용성에도 불구 하 고 항진균 저항 마커의 시퀀싱, 결과의 실현은 종종 지연 인해 여러 저항 마커5,12의 동시 탐지의 부족. 따라서, 전체 게놈 시퀀싱 기반 분석을 사용 하도록 설정한 게놈에서 서로 다른 위치에 저항을 부여 돌연변이의 동시 검출 현재 접근에 비해 상당한 이점을 제공 합니다.
전체 게놈 시퀀싱 (WGS)는 발생 동안 질병 전송 게놈 넓은 위험 평가 약물 저항 박테리아와 바이러스13에서 테스트에 대 한 접근 추적을 성공적으로 구현 되었습니다. 핵 산 시퀀싱 기술의 최근 발전 만들었습니다 전체 게놈 시퀀싱을 (WGS) 병원 균의 임상 실용적인 차례-주위-시간에 기술적으로 그리고 경제적으로 가능. DNA 시퀀싱 병원 체 식별 및 미생물학 실험실14,,1516에 특성의 다른 방법에 비해 중요 한 장점을 제공 합니다. 첫째, 그것은 높은 처리량, 속도와 품질 범용 솔루션을 제공합니다. 시퀀싱은 미생물에 적용 될 수 있습니다 하 고 로컬 또는 지역 연구소에서 규모의 경제를 있습니다. 둘째, 국내 및 국제 수준에서 비교 의무가 ' 미래-증거 ' 형식으로 데이터를에서 생성합니다. 마지막으로, 의학에 WGS의 잠재적인 유틸리티가 추가 임상 및 역학 메타 데이터17 를 포함 하는 해당 데이터 베이스에 연결할 수 있는 참조 게놈을 포함 하는 공용 데이터 기지의 급속 한 성장에 의해 확장 되었습니다. 18.
최근 연구는 Candida spp의 임상 격리에서 항진균 저항 마커의 식별 WGS의 유틸리티를 증명 하고있다. 10 , 19 , 20.이 높은 처리량 벤치탑 시퀀서, 설립된 생물 정보학 파이프라인 및 시퀀싱21,22의 비용 감소의 가용성 때문입니다. 생어 시퀀싱은 WGS 단일 실행에 여러 게놈의 연속을 허용을 통해 곰 팡이 WGS의 장점. 또한, Candida 게놈의 WGS 약물 목표에서 새로운 돌연변이 식별 수, 유전 진화 및 임상 관련 시퀀스 형식을20,,2223의 출현을 추적. 가장 중요 한 것은, 경우에 본질적인 multidrug 저항, WGS 치료 선택22,24이전 저항 부여 돌연변이의 조기 발견에 지원할 수 있습니다.
여기, 우리는 약물 저항 antifungal 에이전트의 다른 클래스와 관련 된 돌연변이 대 한 심사 WGS 사용의 타당성 검사. 우리는 최종 사용자와 진단 균 학 실험실 관점에서 샷건 시퀀싱의 구현에 대 한 방법론을 제시. 우리는 3 세 별도 임상 사례는 생체 외에서 echinocandins와 5 flucytosine 항진균 치료 다음과 같은 시간이 지남에 개발에서 경작 하는 쌍을 분리 하는이 분석에 포함.
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Protocol
윤리적인 승인을이 연구를 위해 필요 했다.
1. 서브 컬쳐와 inoculum Candida glabrata 에 대 한 준비
- 또한 적어도 하나의 C. glabrata 미국 유형 문화 수집 (ATCC) 알려진된 민감성 패턴을 포함 해야 공부를 해야 C.glabrata 분리의 패널을 선택 합니다.
- Subculture 단일 식민지 만져 격리 멸 균 일회용 플라스틱 루프를 사용 하 여 및 Sabouraud의 포도 당 한 천 (SDA)에 줄무늬 접시8.
- 좋은 성장 분리의 순수한 문화에 대 한 35 ° C에서 24-48 h SDA 플레이트를 품 어.
2입니다. 항진균 자화 율의 결정
- SDA 접시에 갓 subcultured C. glabrata 에서 약 1 m m 직경의 4 ~ 5 식민지를 선택 살 균 일회용 플라스틱 루프 격리를 사용 합니다. 3 mL의 멸 균 증류수에 resuspend. 균일 한 현 탁 액을 얻기 위해 부드러운 pipetting으로 잘 섞는다.
- 1 x 106 8농도계 사용 하 여 5 x 106 셀/mL에 0.5 맥 팔 랜드에 셀 밀도 조정 합니다.
- 민감성 상업 분석 결과 사용 하 여 테스트 수행 (테이블의 재료 및 시 약 참조) 모든 C. glabrata 에 제조업체의 지침에 따라 분리. CLSI 지침에 따라 항진균 약물의 결과 마이크에 따라 격리의 민감도 해석 하 고 보고서 (표 1)8.
3. 시퀀싱에 대 한 게놈 DNA 추출
- 1.5 mL 튜브에 50 mM EDTA의 300 µ L에서 갓 자란된 SDA 접시에서 식민지의 loopful를 resuspend.
- Zymolyase (10 mg/mL)의 40 µ L를 추가 정지, 그리고 부드럽게 피펫으로 5 번까지 현 탁 액이 균일 합니다.
- 세포 벽을 소화 하기 위해 1-2 h 37 ° C에서 샘플을 품 어. 5 분 동안 실내 온도에 냉각 하십시오.
- 원심 2 분 14000 × g 에서 정지 하 고 신중 하 게는 상쾌한 제거.
- DNA 추출 키트 지침 (재료의 표 참조)에 따라 genomic DNA를 추출 합니다.
- Resuspend 50 µ L 10 mM Tris 버퍼 (pH 7.5-8.5)는 키트에 제공 된 차입 버퍼 대신의 펠 릿 DNA를 추출.
- 260/280 nm25에 광학 밀도 (O.D) 측정 하 여 DNA의 순도 확인 하십시오.
4. 게놈 DNA 정량화
- 트리 스 EDTA (테) 버퍼 형광 분석 결과 대 한 제조업체의 지침에 따라 분석 결과 키트에 제공 된 x 1을 준비 (재료의 표 참조).
- 테 분석 결과 버퍼 (100 µ L, 희석 비율 1시 50분의 최종 볼륨) 일회용 96 잘 접시에서 x 1의 98 µ L를 2 µ L을 추가 하 여 DNA 샘플을 희석. 또한 수동으로 사용 하 여 멀티 채널 피 펫이 희석 단계를 수행할 수 있습니다 또는 워크스테이션을 처리 하는 자동화 된 액체에 의해.
- 람다 DNA를 diluting 하 여 표준의 범위를 준비 (100 µ g/mL) 형광 분석 결과 키트 (표 2)에서 제공 하 고 측정 샘플 함께 포함.
- 100 µ L 100 µ L 형광 염료의 희석 DNA 샘플과 반응에 대 한 기준을 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 제조업체의 지침에 따라 모든 샘플의 형광을 측정 합니다.
- 형광 신호를 사용 하 여 표준 곡선을 플롯 하 고 DNA 샘플의 원래 농도 계산.
- DNA 농도 0.2 ng / µ L를 조정에 추가 될 DNA와 10 mM Tris 버퍼 (pH 8)의 볼륨을 결정 합니다.
- 워크스테이션을 처리 하는 자동화 된 액체를 사용 하 여 DNA 희석을 수행 합니다. 이 단계는 또한 수동으로 pipetting으로 얻을 수 있습니다.
5. DNA 라이브러리 준비
참고: 라이브러리 준비 및 시퀀싱의 프로토콜 및 회사 (그림 1A)에 의해 제공 된 지침에 따라 수행 했다 (재료의 표 참조).
- Tagmentation 및 PCR 증폭
- 새로운 96-잘 단단한 얇은 벽 플레이트를 레이블을 지정 합니다.
- 0.2 ng / µ L에서 정량된 입력 DNA의 5 µ L를 추가 (1 총에서 ng) 접시의 각 샘플을.
- 각 잘 포함 dna tagmentation 버퍼의 10 µ L 및 증폭 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 플라스틱. 접착성 판 도장 접시를 봉인.
- 열 cycler에 접시를 놓고 다음 PCR 프로그램 실행: 5 분, 그리고 10 ° c.에 보류에 대 한 55 ° C 샘플 10 ° C를 도달 하는 때, 즉시 중화를 진행 합니다.
- Amplicon 반응, 중화를 접시에 중화 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합 플라스틱. 접시를 봉인 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 샘플을 PCR mastermix 인덱싱의 15 µ L를 추가 합니다.
- 96 잘 접시 형식 설정 사용할 수 있는 인덱스 뇌관 튜브의 상자를 사용 하 여 각 샘플 인덱스 템플릿 (표 3)에 따라 인덱스의 독특한 조합을 가져옵니다 있도록.
- 인덱스 뇌관 튜브 인덱스 플레이트 랙 (그림 1B)에서 표 3에 서식 파일에서 제공 하는 순서를 사용 하 여 정렬 하 고 서식 파일에서 인덱스의 위치를 기록 합니다.
- 순서로 인덱스 튜브와 인덱스 플레이트 선반에 추가 PCR mastermix로 tagmentation 접시를 놓습니다.
- 인덱스 선반에 수평 배열에서 수직 배열에서 인덱스 뇌관 1 튜브 및 인덱스 뇌관 2 튜브를 넣어. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 추가할 인덱스 뇌관의 5 µ L 각 샘플.
- 인덱스 사이 상호 오염을 피하기 위해 새로운 모자에 인덱스 튜브의 오래 된 모자를 바꿉니다.
- 분명 96 잘 접시 포경을 사용 하 여 접시를 밀봉 하 고 다음과 같이 두 번째 PCR을 수행: 95 ° C 30에 대 한 s, 10 95 ° C의 12 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s와 5 분 동안 72 ° C.
- PCR 정리
- 깊은 잘 격판덮개 tagmentation 판에서 PCR-정리, PCR 제품을 전송 (재료의 표 참조).
- 소용돌이 상업 자석 구슬 솔루션 (재료의 표 참조) 제조업체의 지침에 따라 하 고 깊은 잘 격판덮개에 각 PCR 제품을 구슬의 30 µ L를 추가 합니다.
- 2 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어 하 고 5 분 동안 흔들어 하지 않고 실 온에서 품 어.
- 상쾌한이 맑게 될 때까지 2 분 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다.
- 마그네틱 스탠드에 여전히 접시와 함께 신중 하 게 상쾌한을 삭제 합니다.
- 마그네틱 스탠드에는 접시와 함께 갓된 80% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.
- 30 대 한 마그네틱 스탠드에 접시를 품 어 s 신중 하 게 제거 하 고 구슬을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.
- 세척 단계를 다시 반복 하 고 구슬 있는 경우 15 분 제거 초과 에탄올에 대 한 건조를 허용 합니다.
- 마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 구슬에 물의 resuspension 버퍼의 52.5 µ L를 추가 합니다.
- 2 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어 하 고 동요 하지 않고 2 분 동안 실 온에서 품 어.
- 마그네틱 스탠드에 접시를 놓고 취소 상쾌한 허용 합니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 전송 50 µ L는 상쾌한의 정리 판에서 새로운 단단한 격판덮개.
- 라이브러리 정규화
- (재료의 표 참조) 제조 업체의 지침에 따라 라이브러리 정규화 시 약 녹여
- 정리 판에서 새로운 깊은 잘 격판덮개는 상쾌한의 20 µ L를 전송.
- 마그네틱 비드 현 탁 액의 45 µ L을 추가 하 고 접시 마감재와 접시를 봉인.
- 30 분 1800 rpm에서 미 판 통에 접시를 흔들어. 이 보육 시간 중요 한 이며 초과할 수 없습니다.
- 2 분 동안 마그네틱 스탠드에 접시를 놓고 확인 하는 상쾌한 (그림 1B)를 허가 했다.
- 제거 하 고 상쾌한 마그네틱 스탠드에 여전히 접시와 함께 적절 한 유해 폐기물 용기에 폐기.
- 마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 세척 45 µ L 워시 버퍼와 구슬.
- 5 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 워시 버퍼와 플레이트를 흔들어.
- 분명 때 2 분 및 폐기 상쾌한 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다.
- 마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 다시 워시 버퍼와 세척을 반복.
- 마그네틱 스탠드에서 접시를 제거 하 고 0.1 N NaOH의 30 µ L를 추가 합니다.
- 5 분 동안 1800 rpm에서 미 판 통에 0.1 N NaOH와 플레이트를 흔들어 하 고 마그네틱 스탠드 2 분 또는 때까지 액체 분명 하다에 접시를 놓습니다.
- 새로운 96-잘 단단한 얇은 벽 최종 정규화 된 라이브러리 플레이트의 각 우물에 차입 버퍼의 30 µ L를 추가 합니다.
- 마지막 볼륨 60 µ L을 최종 정규화 된 라이브러리 접시에 정규화 접시에서 상쾌한의 30 µ L를 전송. 라이브러리 이제 시퀀싱 할 준비가 되어 있습니다.
- 정량에 의해 DNA 도서관 농도의 결정
- 녹여 mastermix, 뇌관 및 표준 (재료의 표 참조) 제조 업체의 지침에 따라 정량 키트에 제공 된.
- PCR 시 약 mastermix와 제조업체의 지침에 따라 정량 키트에 제공 된 뇌관 결합 하 고 aliquots는-20 ° c.에 저장 될 수 있다
- DNA 라이브러리 농도 확인 하려면 1:80 희석 (2 µ L 1: 100에서 158 µ L Tris 버퍼에) 다음 1: 100 희석 (1.5 µ L DNA 라이브러리 148.5 µ L Tris 버퍼)를 수행 하 여 10 mM Tris 버퍼 (pH 8)를 사용 하 여 DNA 라이브러리의 1/8000 희석을 확인 합니다.
- 적어도 1 분 동안 700 rpm에서 희석 플레이트를 흔들어 하 고 1 분 동안 14000 × g 에서 원심.
- 희석된 DNA 라이브러리 또는 DNA 표준의 4 µ L mastermix의 16 µ L를 혼합 하 여 최종 PCR 반응의 20 µ L를 준비 합니다.
- 다음 제조 업체의 설정을 thermocycler에서 PCR을 수행: 5 분, 95의 35 주기 동안 95 ° C 45 s, 및 마지막 65 ° C ~ + 95 ° C 용융 곡선 분석을 위한 30 s 및 60 ° C에 ° C.
- 정량 Pcr thermocycler에서 샘플 DNA 라이브러리 및 표준의 Ct 값을 가져옵니다.
- (그림 2) 표준의 Ct 값에서 표준 곡선을 생성 합니다. 3 주기 평균에서 ± 하 여 상위 및 하위 QC 범위를 정의 합니다. 예를 들어 평균 Ct 값은 13 주기 하는 경우 다음 QC 범위는 16과 10 주기 사이.
- 표준 곡선 및 Ct 값에서 개인 및 평균 라이브러리 농도 (ALC)을 결정 합니다.
- 대상 라이브러리 농도 사이 1.4-8 오후 1 고려 최종 시퀀싱에 대 한 아래에 주어진 계산을 기반으로 총 풀링된 라이브러리 (PAL) 사용할 수의 볼륨을 결정 합니다.
참고: 라이브러리 농도 정량에서 얻은 평균 ALC; = 총 풀링된 라이브러리 (PAL) ALC = / 2; PAL (DAL) 변성 PAL = * 0.666
버퍼와 혼합 되어 달의 볼륨에 따라 흐름 셀에 추가할 라이브러리의 농도가 이다. 예를 들어 라이브러리의 65 µ L 버퍼의 835 µ L에 추가 됩니다, 다음이 희석 (Dil 1) 195에서에서 추가 됩니다 1300 µ L의 총 볼륨: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = 최종 농도 (사이 1.4-8 오후 1 이어야 함)
6. 도서관 풀링 및 벤치탑 시퀀서에서 Initiating 시퀀싱
- 해 동 시 약 카트리지 제조 업체의 지침에 따라입니다. 4 ° C 저장소에서 패키지에서 새로운 흐름 세포 밖으로가 고 실 온 이어야 시퀀싱 전에 30 분을. 버퍼 카트리지 및 prechill 시퀀싱 버퍼 사용 하기 전에 밖으로 데리고 (재료의 표 참조).
- 컨트롤 라이브러리 라이브러리의 5 µ L를 혼합 하 여 준비 (1 nM)와 0.2 N NaOH의 5 µ L. 짧게 소용돌이 컨트롤 라이브러리를 단일 가닥으로 변성을 실 온에서 5 분 동안 품 어 고.
- 200 mM Tris HCl, pH 7 및 소용돌이의 5 µ L를 추가 합니다. 235 µ L prechilled 시퀀싱 버퍼를 추가 하 고 부드럽게 혼합. 총 볼륨은 컨트롤 라이브러리 최종 농도 20 250 µ L 오후.
- 각 샘플 라이브러리 단일 낮은 바인딩 1.5 mL 튜브에 최종 표준된 라이브러리 접시에서 시퀀스의 5 µ L를 전송 하 여 풀 DNA 라이브러리.
- 30 µ L의 풀링된 라이브러리 및 라이브러리 다른 낮은 바인딩 튜브에 변성을 0.2 N NaOH의 30 µ L를 추가 합니다.
- 소용돌이 낮은 바인딩 튜브 및 단일 가닥으로 라이브러리를 변성을 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 200 mM Tris HCl, 중화 반응에 변성된 라이브러리와 튜브를 pH 7의 30 µ L를 추가 합니다.
- 중화 변성된 라이브러리 현 탁 액의 65 µ L 미리 냉장된 시퀀싱 버퍼와 잘 혼합 하는 소용돌이의 835 µ L를 추가 합니다.
- 최종 낮은 바인딩 튜브에서 다음 결합: 중화 변성된 라이브러리, 컨트롤 라이브러리 및 시퀀싱 버퍼의 1103.70 µ L의 1.30 µ L에서 195 µ L. 제대로 믹스.
- 시 약 카트리지에 지정 된 장소로 최종 라이브러리 믹스 (1300 µ L)를 로드 합니다.
- 시퀀싱 Sequencer에서 프로젝트 및 샘플 세부 정보를 입력 하 여 실행 설정 지정 지침에 따라 웹사이트.
- 시작 시퀀스 지침입니다. 흐름 세포, 라이브러리와 시 약 카트리지 및 벤치탑 시퀀서에서 버퍼 카트리지를 로드.
- 모든 시 약 키트 및 시퀀싱에 사용 되는 카트리지 일괄 처리 번호를 기록 합니다.
7. 데이터 시퀀싱 웹사이트에서 다운로드
- 웹사이트에서 제공 하는 제조업체의 지침에 따라 FASTQ 파일을 다운로드 합니다.
- 좋은 품질 검사 실행에 대 한 170-280 K/m m2 와 사이 Q30 비율 ≥ 75%와 클러스터 밀도 200-210 K/m m2 (표 4)에 최적.
8. 시퀀싱 데이터 분석
- 데이터 분석 통합된 소프트웨어 패키지로 시퀀스 샘플의 FASTQ 파일 가져오기 (재료의 표 참조).
- 참조 (선택 참조 게놈) 매핑, 지방 재배치와 변형 분석그림 3(A) 설정을 사용 하 여 표 5에 나열 된, 즉 트리밍 목록에서 기능을 추가 하 여 소프트웨어에서 시퀀싱 워크플로 만듭니다.
- 한 샘플 또는 샘플 FASTQ 파일의 배치를 선택 하 여 워크플로 실행 하 고 지정 된 샘플 폴더에서 출력 파일을 저장 합니다.
- 게놈 (그림 3B)에 시퀀스 범위 깊이, 매핑된 영역 및 구조 이체의 목록에 대 한 보고서를 생성 합니다.
- 목록 구조 이체의를 사용 하 여 동의어 아닌 단일 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 유전자 부여 저항 및 독성에에서 대 한 검색.
- SNP 위치, 유전자, 및 저항 또는 취약 격리 (표 6)의 수를 나열 하 여 보고서를 준비 합니다.
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Representative Results
C. glabrata (CMRL12에 CMRL1 격리) 임상 균 학 참조 실험실에서 C. glabrata ATCC 90030 및 12 격리 구성, 웨스트 미드 병원, 시드니 공부 했다 13 (표 1). 이러한 CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 CMRL-5/CMRL-6 얻은 그들 사이의 역학 링크와 항진균 치료 전후 격리의 3 개 쌍을 포함 24 (표 1).
마이크 CLSI 해석 중단점을 사용 하 여 9 항진균 요원 즉, 암포 (AMB), Anidulafungin (애니), Micafungin (MIF)에 대 한 결정 했다 Caspofungin (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), Voriconazole (VRC), Itraconazole ( ITR) 및 Fluconazole (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019와 Candida krusei ATCC 6258 품질 관리 종자로 사용 되었다. 격리 쌍, CMRL 1, CMRL-2, 가운데 두 번째 격리 CMRL-2 caspofungin (마이크 8 0.12 mg/L, 표 1 대)에 저항 했다. CMRL-2는 또한 anidulafungin 및 micafungin의 마이크에 비슷한 비례 증가 했다 (≥ 0.5 mg/L) 저항 체 외에 모든 3 개의 echinocandins24에 결과. 마찬가지로, 격리 CMRL-4 (표 1) 격리 CMRL-3 보다 echinocandin 저항을 개발 했다. 세 번째 쌍 사이 격리 CMRL-6 5-flucytosine 마이크 했다 (> 0.06 m g/L 대 64)24. 이 두 격리 쌍 취약/야생-타입 (WT) 다른 antifungal 에이전트 테스트 했다. 격리 CMRL-6, CMRL-12 모든 azoles 저항 또는 비-WT 수 발견 됐다. CMRL-7 fluconazole을 비-WT voriconazole (표 1)에 저항 했다. C. glabrata ATCC 90030와 격리 CMRL-8 CMRL-11 취약 취약/WT 모든 antifungal 에이전트24했다.
13 격리의 WGS 벤치탑 시퀀서를 사용 하 여 수행 되었다. 평균에, 중간 출력 시퀀싱 실행 오류 율 0.5-1.4 사이 27-40 기가바이트 데이터 주위 굴복 %. Q30 얻은 평균 비율 일반적으로 약 80-85% 이었다. 흐름 세포 클러스터 밀도 (K/m m2) 200-250 (표 4) 사이 였다. 이 연구에서 원시 시퀀스 데이터 프로젝트 번호 PRJNA310057에서 NCBI 시퀀스 읽기 아카이브 (SRA)에서 입금 했습니다. 시퀀싱의 98% C. glabrata 참조 게놈 (스트레인 CBS138) 분석 통합된 데이터 분석 소프트웨어를 통해 매핑된 읽습니다. 평균 깊이 범위는 읽기 143-bp. 구조 변형 탐지의 발견 보다 더 50, 000 Snp 격리 당 길이 평균 75 x 읽기. 특히, CMRL1/CMRL-2, 각 격리에 총 Snp CMRL-3/CMRL-4, 79000 주위 했다 스트레인 쌍을 분석할 때 60000 주위와 CBS13824에 비해 56000 이상 CMRL-5/CMRL-6에 대 한 Snp의 총 수가 있었다. SNP 차이 분리 변형 쌍에서 사이 비교 했을 때 25 미만 이었다.
FKS1, FKS2 및 FKS3 (echinocandin 저항), FCY1 및 FCY2 (5-알려진 저항 생체 분석24, 특히, 선택 했다 격리의 자화 율 프로 파일에 따라 flucytosine 저항), 그리고 ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 및 CgFLR1 (azole 저항). 유전자는 알려진된 돌연변이 및 SNP 발생의 주파수에 대 한 확인 했다. 유전자를 비 동의어 Snp 읽을 ≥20의 깊이 범위 즉, 높은-품질 Snp (본사-Snp) 구체적으로 공부 했다.
특히, FKS 돌연변이 모두 echinocandin 저항 격리24의 게놈에서 확인 되었다. 처음 두 쌍, echinocandin 저항 격리 CMRL-2 숨겨 단일 FKS2 돌연변이 S629P, 및 CMRL-4, FKS2 돌연변이 S663P (표 6). 3 쌍의 FCY2 (Ala237Thr)에서 SNP는 CMRL-5 (5-flucytosine 취약)와 CMRL-6 (저항) (표 6)에서 발견 되었다. 그러나, FCY2 에 Snp 또한 다른 phenotypically WT 격리 (CMRL-1, CMRL 2, CMRL-10)24에서 발견 됐다. 격리 CMRL-6, CMRL-12 그들의 팬 azole 내성/비에 대 한 주목할 만한 되었다-WT 문자 CgCDR1 (인코딩 azole 경과 펌프) 및 CgPDR1 (인코딩 경과 펌프 통제 녹음 방송 요인) Snp를 했다 (표 6)26 ,27. 다른 경과 펌프 유전자에 돌연변이의 존재, CgFLR1 두 azole 감염 및 azole 내성 격리26,28에서 발생 했습니다. ERG9 (코딩 스쿠알렌 synthase) 내의 Snp에 대 한 조사는 돌연변이 공개 하지만 아무 돌연변이 ERG1124에 확인.
WGS 분석은 또한 칸디 다 세포 벽 접착 유전자 즉, EPA1, EPA6, PWP2 및 PWP5에 여러 비 동의어 Snp를 밝혔다. EPA6 돌연변이 9/12 격리에 참석 했다. PWP2 및 PWP5 Snp 또한 격리 CMRL-1 및 CMRL-1124제외 하 고 거의 모든 격리에 존재 했다.
| 격리 | 자녀 | 애니 | MIF | CA | 5 FC | 포스 | VRC | ITR | FLC | 항진균 민감성의 해석 | 샷건 시퀀싱에 의해 식별 저항을 부여 하는 유전자 | ||
| CMRL-1 | 0.5 | 0.03 | < 0.008 | 0.12 | < 0.06 | 0.5 | 0.12 | 0.25 | 8 | 모두에 취약 | - | ||
| CMRL-2 | 0.5 | 1 | 1 | 8 | < 0.06 | 0.25 | 0.06 | 0.12 | 4 | 모든 echinocandins만에 저항 | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0.25 | 0.015 | 0.015 | 0.12 | < 0.06 | 1 | 0.25 | 0.5 | 8 | 모두에 취약 | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0.06 | 0.5 | 0.12 | 0.25 | 8 | 모든 echinocandins만에 저항 | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0.12 | 0.015 | 0.12 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | 모두에 취약 | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0.06 | 0.015 | 0.06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | 5 FC 및 azoles | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0.25 | 0.06 | 0.015 | 0.25 | < 0.06 | 1 | 8 | 0.5 | 256 | 모든 azoles만에 저항 | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0.5 | 0.03 | 0.008 | 0.06 | < 0.06 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 4 | 모두에 취약 | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0.03 | 0.015 | 0.25 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 1 | 16 | 모두에 취약 | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0.03 | < 0.008 | 0.5 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | 모두에 취약 | - | ||
| CMRL-11 | 0.5 | 0.03 | < 0.008 | 0.03 | < 0.06 | 0.5 | 0.25 | 0.5 | 8 | 모두에 취약 | - | ||
| CMRL-12 | 0.5 | 0.03 | 0.015 | 0.06 | < 0.06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | 모든 azoles만에 저항 | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0.03 | 0.015 | 0.06 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 8 | 모두에 취약 | - | ||
| 약어: 마이크, 최소 억제 농도; AMB, 암포 B; 애니, anidulafungin; CA, caspofungin; FLC, fluconazole; ITR itraconazole; MIF, micafungin; POS, posaconazole; VRC, voriconazole; 5 FC 5-flucytosine입니다. | |||||||||||||
표 1. 13의 감수 성을 생체 외에서 Candida glabrata CMRL-1/CMRL-2를 포함 하 여 분리, CMRL-3/CMRL-4, CMRL-5/CMRL-6 분리 항진균 치료 전후를 얻은 쌍
| 표준 | DNA 표준 볼륨 (μ) | 1 X 테 버퍼 | 시 약 (μ) | 총 96 잘 접시 (μ) | 최종 DNA 농도 (ng/mL) |
| 성병-피코 1 | 8 (표준 DNA 튜브 100 µ g/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| 성병-피코 2 | (에서 성병-피코 1) 10 | 90 | 100 | 200 | 100 |
| 성병-피코 3 | (성병-피코 1)에서 5 | 95 | 100 | 200 | 50 |
| 성병-피코 4 | (성병-피코 1)에서 2 | 198 | 100 | 200 | 10 |
| 성병-피코 5 | 10 (성병-피코 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| 빈 | - | 100 | 100 | 200 | 빈 |
표 2. DNA 정량화에 대 한 표준 곡선 생성에 대 한 표준을 준비 하기 위한 프로토콜
그림 1 . 시퀀싱 워크플로: (A) 라이브러리 준비 및 벤치탑 sequencer에서 시퀀싱에 대 한 주요 분석 단계에 대 한 개요. (B) 오른쪽 (왼쪽)와 같은 DNA 도서관 준비를 위한 중요 한 구성 요소 인덱스 인덱싱 중 인덱스의 배열 위한 접시 랙 및 마그네틱 자석 구슬에 대 한 깊은 96 잘 접시 랙 기반 DNA 라이브러리의 정리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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| 인덱스 세트 A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 | 샘플 6 | 샘플 7 | 샘플 8 | 샘플 9 | 샘플 10 | 샘플 11 | 샘플 12 |
| B | S503 | 샘플 13 | 샘플 14 | 샘플 15 | 샘플 16 | 샘플 17 | 샘플 18 | 샘플 19 | 샘플 20 | 샘플 21 | 샘플 22 | 샘플 23 | 샘플 24 |
| C | S505 | 샘플 25 | 샘플 26 | 샘플 27 | 샘플 28 | 샘플 29 | 샘플 30 | 예제 31 | 샘플 32 | 샘플 33 | 샘플 34 | 샘플 35 | 샘플 36 |
| D | S506 | 샘플 37 | 샘플 38 | 샘플 39 | 샘플 40 | 샘플 41 | 샘플 42 | 샘플 43 | 샘플 44 | 샘플 45 | 샘플 46 | 샘플 47 | 샘플 48 |
| E | S507 | 샘플 49 | 샘플 50 | 샘플 51 | 샘플 52 | 샘플 53 | 샘플 54 | 샘플 55 | 샘플 56 | 샘플 57 | 샘플 58 | 샘플 59 | 샘플 60 |
| F | S508 | 샘플 61 | 샘플 62 | 샘플 63 | 샘플 64 | 샘플 65 | 샘플 66 | 샘플 67 | 샘플 68 | 샘플 69 | 샘플 70 | 샘플 71 | 샘플 72 |
| G | S510 | 샘플 73 | 샘플 74 | 샘플 75 | 샘플 76 | 샘플 77 | 샘플 78 | 샘플 79 | 샘플 80 | 샘플 81 | 샘플 82 | 샘플 83 | 샘플 84 |
| H | S511 | 샘플 85 | 샘플 86 | 샘플 87 | 샘플 88 | 샘플 89 | 샘플 90 | 샘플 91 | 샘플 92 | 샘플 93 | 샘플 94 | 샘플 95 | 샘플 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| 색인 세트 B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 | 샘플 6 | 샘플 7 | 샘플 8 | 샘플 9 | 샘플 10 | 샘플 11 | 샘플 12 |
| B | S503 | 샘플 13 | 샘플 14 | 샘플 15 | 샘플 16 | 샘플 17 | 샘플 18 | 샘플 19 | 샘플 20 | 샘플 21 | 샘플 22 | 샘플 23 | 샘플 24 |
| C | S505 | 샘플 25 | 샘플 26 | 샘플 27 | 샘플 28 | 샘플 29 | 샘플 30 | 예제 31 | 샘플 32 | 샘플 33 | 샘플 34 | 샘플 35 | 샘플 36 |
| D | S506 | 샘플 37 | 샘플 38 | 샘플 39 | 샘플 40 | 샘플 41 | 샘플 42 | 샘플 43 | 샘플 44 | 샘플 45 | 샘플 46 | 샘플 47 | 샘플 48 |
| E | S507 | 샘플 49 | 샘플 50 | 샘플 51 | 샘플 52 | 샘플 53 | 샘플 54 | 샘플 55 | 샘플 56 | 샘플 57 | 샘플 58 | 샘플 59 | 샘플 60 |
| F | S508 | 샘플 61 | 샘플 62 | 샘플 63 | 샘플 64 | 샘플 65 | 샘플 66 | 샘플 67 | 샘플 68 | 샘플 69 | 샘플 70 | 샘플 71 | 샘플 72 |
| G | S510 | 샘플 73 | 샘플 74 | 샘플 75 | 샘플 76 | 샘플 77 | 샘플 78 | 샘플 79 | 샘플 80 | 샘플 81 | 샘플 82 | 샘플 83 | 샘플 84 |
| H | S511 | 샘플 85 | 샘플 86 | 샘플 87 | 샘플 88 | 샘플 89 | 샘플 90 | 샘플 91 | 샘플 92 | 샘플 93 | 샘플 94 | 샘플 95 | 샘플 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| 색인 세트 C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 | 샘플 6 | 샘플 7 | 샘플 8 | 샘플 9 | 샘플 10 | 샘플 11 | 샘플 12 |
| B | S515 | 샘플 13 | 샘플 14 | 샘플 15 | 샘플 16 | 샘플 17 | 샘플 18 | 샘플 19 | 샘플 20 | 샘플 21 | 샘플 22 | 샘플 23 | 샘플 24 |
| C | S516 | 샘플 25 | 샘플 26 | 샘플 27 | 샘플 28 | 샘플 29 | 샘플 30 | 예제 31 | 샘플 32 | 샘플 33 | 샘플 34 | 샘플 35 | 샘플 36 |
| D | S517 | 샘플 37 | 샘플 38 | 샘플 39 | 샘플 40 | 샘플 41 | 샘플 42 | 샘플 43 | 샘플 44 | 샘플 45 | 샘플 46 | 샘플 47 | 샘플 48 |
| E | S518 | 샘플 49 | 샘플 50 | 샘플 51 | 샘플 52 | 샘플 53 | 샘플 54 | 샘플 55 | 샘플 56 | 샘플 57 | 샘플 58 | 샘플 59 | 샘플 60 |
| F | S520 | 샘플 61 | 샘플 62 | 샘플 63 | 샘플 64 | 샘플 65 | 샘플 66 | 샘플 67 | 샘플 68 | 샘플 69 | 샘플 70 | 샘플 71 | 샘플 72 |
| G | S521 | 샘플 73 | 샘플 74 | 샘플 75 | 샘플 76 | 샘플 77 | 샘플 78 | 샘플 79 | 샘플 80 | 샘플 81 | 샘플 82 | 샘플 83 | 샘플 84 |
| H | S522 | 샘플 85 | 샘플 86 | 샘플 87 | 샘플 88 | 샘플 89 | 샘플 90 | 샘플 91 | 샘플 92 | 샘플 93 | 샘플 94 | 샘플 95 | 샘플 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| 색인 세트 D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 | 샘플 6 | 샘플 7 | 샘플 8 | 샘플 9 | 샘플 10 | 샘플 11 | 샘플 12 |
| B | S515 | 샘플 13 | 샘플 14 | 샘플 15 | 샘플 16 | 샘플 17 | 샘플 18 | 샘플 19 | 샘플 20 | 샘플 21 | 샘플 22 | 샘플 23 | 샘플 24 |
| C | S516 | 샘플 25 | 샘플 26 | 샘플 27 | 샘플 28 | 샘플 29 | 샘플 30 | 예제 31 | 샘플 32 | 샘플 33 | 샘플 34 | 샘플 35 | 샘플 36 |
| D | S517 | 샘플 37 | 샘플 38 | 샘플 39 | 샘플 40 | 샘플 41 | 샘플 42 | 샘플 43 | 샘플 44 | 샘플 45 | 샘플 46 | 샘플 47 | 샘플 48 |
| E | S518 | 샘플 49 | 샘플 50 | 샘플 51 | 샘플 52 | 샘플 53 | 샘플 54 | 샘플 55 | 샘플 56 | 샘플 57 | 샘플 58 | 샘플 59 | 샘플 60 |
| F | S520 | 샘플 61 | 샘플 62 | 샘플 63 | 샘플 64 | 샘플 65 | 샘플 66 | 샘플 67 | 샘플 68 | 샘플 69 | 샘플 70 | 샘플 71 | 샘플 72 |
| G | S521 | 샘플 73 | 샘플 74 | 샘플 75 | 샘플 76 | 샘플 77 | 샘플 78 | 샘플 79 | 샘플 80 | 샘플 81 | 샘플 82 | 샘플 83 | 샘플 84 |
| H | S522 | 샘플 85 | 샘플 86 | 샘플 87 | 샘플 88 | 샘플 89 | 샘플 90 | 샘플 91 | 샘플 92 | 샘플 93 | 샘플 94 | 샘플 95 | 샘플 96 |
표 3. 다른 인덱스 배열의 서식 파일
그림 2 : 표준의 Ct 값으로 생성 된 표준 그래프. 중복에 샘플 라이브러리의 Ct 값에서 평균 라이브러리 농도 결정 하는 표준 곡선 절편과 기울기 값을 사용 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 통계 | 표준 값 | 가져온 값 (평균) |
| 항복 | 32.5 중간 출력-50 기가바이트 | 중간 출력 42 Gb |
| 고 출력에 대 한 100-130 Gb | 고 출력에 대 한 백이 십 기가바이트 | |
| 백분율 Q30 | ≥ 75% | 80% |
| 클러스터 밀도 | 170-230 K/m m2, 200 K/m m2 에 최적의 | 210 K/m m2. |
| 필터를 통과 하는 클러스터 | > 70% | 89.09% |
| 사이클에 의해 강도 | Flowcell에서 각 타일에 대 한 1000 위 | Flowcell에서 각 타일에 대 한 1500 이상 |
| 오류 평가 | 1.5 below | 1.4 |
표 4. 벤치탑 시퀀서에서 실행 하는 표준 시퀀싱에 대 한 통계
그림 3 : 시퀀싱 데이터 분석 소프트웨어. (A) 시퀀스 트리밍 등 원하는 워크플로 만들기, 매핑 및 품질을 기반으로 변형 탐지. (개별 또는 일괄 처리에서 여러 개의 샘플) 샘플 FASTQ 파일을 선택 하 여 워크플로 실행 합니다. (B) 참조 위치, 범위, 뉴클레오티드 변화 및 샘플 시퀀스의 분석을 위해 얻은 아미노산 변화를 보여주는 구조 변종의 목록입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 1. 트림 시퀀스 | 설정 사용 |
| 기초 손질 | 기본 설정 |
| 읽기에 뉴클레오티드의 최대 수와 길이에 필터링 | 1000 |
| 읽기에 최소한 뉴클레오티드의 길이에 필터링 | 50 |
| 2. 매핑 참조에 | |
| 참조 선택 | CBS138 |
| 모드를 마스킹로 참조 마스킹 | 아니 마스킹 |
| 매핑 옵션 | 기본 설정 |
| 3. 지방 재배치 | |
| 맞춤 설정 | 기본 설정 |
| 4. 품질 기반의 변형 탐지 | |
| 이웃 반경 | 5 |
| 최소 간격과 일치 하지 수 | 2 |
| 최소 이웃 품질 | 15 |
| 최소 중앙 품질 | 20 |
| 읽기 필터 | 기본 설정 |
| 최소 범위 | 4 |
| 최소 변형 주파수 (%) | 75 |
| 변형 필터 | 기본 설정 |
| 최대 예상된 대립 (Ploidy) | 2 |
| 유전자 코드 | 표준 |
표 5. 워크플로 매개 변수 및 설정 소프트웨어에
| 구조 변형 뉴클레오티드 위치 | 유전자 | 나타나는데 | 발견 수 격리 |
저항 분리 | 취약 격리 | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CA, 애니, MIF | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CA, 애니, MIF | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5 FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5 FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL 2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
표 6. 구조 변형 위치 C. glabrata 의 격리 수 있는 항진균 약물 저항에 연결 하는 유전자의 보고서
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Discussion
이 연구는 타당성, 대략적인 일정 및 C. glabrata에서 약물 저항의 WGS 기반 검출의 정밀도 결정 했다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대 한 처리 시간 (TAT) 4 일 되었고 분석된 결과 1-2 일의 보고. 이것은 적어도 비슷한 금액으로 문신 문화 접시와 Sanger에서 민감도 분석에 대 한 비교 시퀀싱 샘플의 상당히 높은 수. 약 30-90 C. glabrata 게놈 시퀀싱 흐름 셀 용량, 80-100% 연속 범위에 따라 시퀀싱 할 수 있습니다. 이 연구의 비용/리소스 요구 사항을 생어의 현재 비용을 해당 되었다 있기 때문에 시퀀싱 사내 WGS 실험실 설치에서 수행 되었다, 시퀀싱 및 프로브 기반 분석 샘플 당 AUD 80-100의 예상 비용. 모든 격리의 감수 성은 시각적으로 읽기 미러를 사용 하 여 읽어온 상업 시험 키트에 의해 결정 되었다. 문화 성장 변화 블루 색도계 성장 표시기에 의해 표시 되었다 분홍색. 마이크 읽 었는 데 잘 첫 블루로 핑크 (성장)의 시리즈 즉, 우물 후 실질적으로 성장 억제 antifungal 에이전트의 낮은 농도. WGS, genomic DNA 라이브러리 라이브러리 준비 키트를 사용 하 여 준비 했다. 격리 라이브러리 정량에 의해 정량 했다. 정량된 라이브러리는 최종 시퀀싱 벤치탑 sequencer에서 수행 실행 함께 풀링된 했다.
우리의 분석에 격리에 저항을 부여 하는 유전자에 Snp의 존재는 높은 생체 외에서 마이크는 마약에 대해와 잘 상관 된다. FKS2 식별에 돌연변이FKS1에서 S629P 및 S663P echinocandins 저항와 명확 하 게 관련 되었다. 두 돌연변이 phenotypic 저항29,30을 수 여 하는 유명 하다. 동시 게놈 넓은 시퀀싱 또한 활성화를 통해 저항와 관련 된 5-flucytosine (유전자 FCY2)과 azole 저항 (CgPDR1, CgCDR1 및 CgFLR1)에 연결 하는 유전자에 돌연변이 공개 / overexpression 경과 펌프26,,2728. 그러나, azole 5 flucytosine 저항31 요구를 추가 기능에 연결 하는 유전자에 돌연변이의 효력 유전자 식 수준 평가 분석 합니다. 흥미롭게도, 많은 수의 Snp 또한 모든 격리 된 것32,33에서 세포 벽 adhesins에 발견 됐다. 접착 유전자 EPA6, biofilm 형성, 인코딩하는 돌연변이33비교적 자주 발생. 또한, 격리 CMRL-3 CMRL 4, CMRL-8 azole 내성 유전자에 돌연변이 부족된 EPA1 와 EPA624,34에 아무 문서화 된 Snp을 했다. 그러나, 전반적으로, adhesins 및 마약 마이크에 Snp 간의 구체적인 연관 테스트 격리 포함의 낮은 수 찾아낼 수 있었다.
임상 균 학에 WGS의 구현을 강력한 품질 관리 시스템의 구현이 필요합니다. 높은 품질 genomic DNA 및 품질 관리 검사점 실험에서 각 단계를 동반 하는 좋은 샷건 시퀀싱 결과 대 한 필수적입니다. C. glabrata 샘플 DNA의 순도 UV 흡 광도 메서드를 사용 하 여 라이브러리 준비를 확인 수 있습니다에 대 한 제출 (260/280에서 흡 광도 및 260/230 nm25. 우리의 경험에서는, C. glabrata DNA에 대 한 260/280으로 예상 된다 2 2.2 사이 260/230 1.8-2의 권장된 범위 내. DNA 추출 이러한 품질 요구 사항을 충족 하지 못하면, 에탄올 강 수에 의해 추가적인 정화를 수행할 수 있습니다. Tagmentation는 독특한 바 코드 시퀀스 라는 인덱스 뇌관 (멀티플렉싱)을 시퀀싱 하는 동안 여러 샘플의 차별화를 가능 하 게 그렇게 추가의 필수 단계입니다. 따라서, 인덱싱 과정에서 여분의 주의 인덱스의 고유성을 유지 하기 위해 인덱스 튜브 및 샘플 사이의 상호 오염을 방지로 이동 해야 합니다. 정상화 시퀀싱 시퀀싱 데이터에서 편견을 소개 수 있습니다 샘플 DNA 라이브러리에서 발생 하는 차이 제거 됩니다 보장 합니다. 정규화 단계 사용 하 여 기반으로 비드 깨끗 한-최대 일반적으로 라이브러리 준비 하는 동안 발생할 수 있는 라이브러리 크기 초과 DNA 도서관 파편과 변이의 제거 수 있습니다. 따라서 30 분 보육은 최적의 클러스터 밀도 중요 합니다. 클러스터 밀도 영향 데이터 품질을 시퀀싱 하는 동안 거 대 한 확대에 의해 생성 된 샘플 라이브러리의 클론 클러스터의 밀도 같은 Q30 점수와 총 데이터 출력. Underclustering 높은 데이터 품질을 제공할 수, 그것은 또한 낮은 Q30 점수 overclustering 반면 출력 낮은 데이터 발생 합니다. DNA 라이브러리는 시퀀싱 데이터 품질을 방해할 수 있는 PCR 정리 및으로 정규화 하는 동안 자석 구슬 잔류물의 무료 되어야 합니다. 정량은 적어도 몇 가지 대표적인 샘플 라이브러리 참조 스트레인을 포함 하 여 인덱스의 특정 세트에서 긍정적인 컨트롤 (ATCC의 변형 C. glabrata 이 경우)에 수행 되어야 한다. 평균 Ct 값은 15-18 주기 사이 이어야 합니다. 이 범위 내의 모든 샘플 시퀀싱 실행에 대 한 허용으로 간주 됩니다. 그러나, Ct 값이이 범위를 벗어난 경우는 정량 반복 한다. 샘플은 라이브러리 준비 하는 동안 때로는 정량 중 낮은 품질 입력된 DNA 또는 오류를 실패할 수 있습니다. 긍정적인 통제에서 계산을 바탕으로, 좋은 순서 데이터를 생성 하는 라이브러리의 최소 농도 설립 해야한다. 정량 Pcr에서 가져온 라이브러리의 평균 농도 사용 하 여 시퀀싱에 대 한 추가 될 최종 라이브러리의 볼륨을 계산할 수 있습니다. 이 권장된 최종 라이브러리 농도 사이 1.4-8 오후 1 생산 한다. C. glabrata 라이브러리에 대 한 C. glabrata ATCC 격리를 사용 하 여 기존된 Ct 범위는 300-500의 평균 라이브러리 농도 범위 16-18 주기 사이 오후. 풀링된 변성된 DNA 라이브러리의 해당 볼륨 클러스터 밀도 범위 200-250/m m2에 대 한 60-65 µ L의 범위 안에 이었다.
시퀀스 데이터 파일 추가 분석 하기 전에 demultiplexed 합니다. 이 자리를 차지 하는 시퀀싱 후 그들의 바 코드를 사용 하 여 그들의 각각 라이브러리에 정렬 하 여 얻을 수 있습니다. FASTQ 파일의 품질 조정의 단계는 선택적 데이터 분석 전에 수행할 수 있습니다. WGS에서 분리의 순서 읽기 표준 소프트웨어 패키지에서 만든 사용자 지정 워크플로 사용 하 여 분석 했다. 이 낮은-품질 읽기의 정돈 하 고 다음 참조 Candida 게놈에 매핑 허용. 참조 게놈, CBS138, Candida 게놈 데이터베이스 (CGD)에서 다운로드 했다 고 분석 전에 워크플로에 연결. Candida 게놈에서 DNA의 반복 (예를 들어 adhesin 유전자는 DNA 반복) 짧은 읽기 시퀀스 및 SNP 전화의 맞춤 복잡 하 게 만들 수 있습니다. 이 매핑된 시퀀스의 추가 로컬 재배치에 의해 향상 될 수 있습니다. 워크플로에서 출력 비 동의어 동의어 SNP 위치 및 범위와 함께 주석이 달린된 유전자를 제공 하는 구조적 변형 목록 이었다. 이 유전자의 Snp를 식별 하 고 격리 (표 6)에 대 한 최종 분석 보고서를 준비 하는 사용 되었다.
우리의 연구와 접근의 약간의 한계를 인정 한다. 격리의 작은 숫자에 따라 우리의 보고 그리고 임상 균 학에 대 한 표준 균 resistome 데이터베이스가 없습니다. 생어 DNA 시퀀싱 현재 더 임상 실험실에 액세스할 수 있지만, 그것 동시에 약물 저항 칸디 다 종에 부여 하는 여러 유전자 돌연변이 감지 하는 능력을 제한 했다 (> 20 FKS 돌연변이 대 한 echinocandin 저항 혼자)입니다. 병 리 서비스 및 감소 시퀀싱 비용, 생어 WGS 사용의 실용성의 통합으로 시퀀싱, 증가 가능성이 높습니다. 그러나, 중요 한 고려 사항은 초기 실험실 설치 및 WGS 악기 구현 비용 뿐만 아니라 실험실의 최종 사용자 교육입니다. 긴 기간 비용은 본질적으로, 조달 시퀀싱 시 약 키트 및 액세서리 포함 됩니다. 추가 비용 및 높은 문신 WGS 악기 사내 없으면 예상 되어야 한다. 또한, 게놈 DNA 반복 시퀀스의 존재 복잡 하 게 하는 짧은 읽기 시퀀스 및 SNP 전화의 맞춤 수 있습니다. 높은-품질 참조 게놈 시퀀스 사용 하 여 가용성 긴-읽기 기술을 SNP의 품질을 유지 하기 위해 도움이 될 것입니다.
미래에 WGS 빠른 추적 보고 시간 진단 설정에 쉽게 액세스할 수 하 고 임상20,22에 의해 해석 하 여 임상 치료에서 향상 된 기능을가지고 것으로 예상. 이 소설과 항진균 저항 유추 확실 한 돌연변이의 큐레이터 및 최신 WGS 항진균 약물 저항 데이터베이스의 개발 달성 될 수 있다. 으로 알려진된 phenotypic 약물 민감성의 임상으로 관련 된 효 모에의 더 많은 유전자 분석에 사용할 수 있는, 새로운 마커 및 항진균 약물 저항 메커니즘 발견 될 가능성이 있다. 이러한 발전 다중 약물 내성 및 약물 독성으로 인 한 치료 실패의 위험을 줄일 것입니다. 결론적으로, 적절 한 품질 관리 프로토콜 다음 세대 시퀀싱 phenotypic 균 학 연구소에서 테스트 하는 것을 증가 수 있습니다 Candida glabrata 에 저항을 부여 하는 변이의 게놈 넓은 탐지 수 있습니다. 임상으로 관련 된 Candida spp 의 급속 한 게놈 시퀀싱에서 제공 하는 통찰력 antifungal 에이전트의 다른 클래스에 저항 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 변경 하 고 침략을 가진 환자의 관리를 개선 근본적으로 수 있습니다. 버섯 모양 질병입니다.
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Disclosures
저자 있고 아무 경쟁 금융 관심사 없이 상충 공개.
Acknowledgments
이 작품 전염병 및 미생물학, 보건 센터에 의해 지원 되었다. 저자는 어떤 다른 자금 조달이 연구에 대 한 받지. 저자는 그들의 전문가 조언 및 지원 전체 게놈 시퀀싱 실험에 대 한 Drs 엘리샤 Arnott, 네이 선 Bachmann 및 Ranjeeta Menon을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
