Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Hele genomet sekvensering av Candida glabrata for gjenkjenning av markører av soppdrepende resistens

Published: December 28, 2017 doi: 10.3791/56714
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4,5, 6, 7, 1,3, 1,2,3
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, 2Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, 3Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, 4Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, 5Infection Management Services, Australian National University Medical School, 6Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, 7Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre
* These authors contributed equally

Summary

Denne studien implementert hele genomet sekvenser for analyse av mutasjoner i gener overdragelse soppdrepende resistens i Candida glabrata. C. glabrata isolerer motstandsdyktig mot echinocandins, azoles og 5-flucytosine, ble rekkefølge for å illustrere metodikken. Mottakelighet profiler isolert korrelert med tilstedeværelse eller fravær av spesifikke mutasjonen mønstre i gener.

Abstract

Candida glabrata kan raskt skaffe mutasjoner som fører til resistens, spesielt til azoles og echinocandins. Identifikasjon av genetiske mutasjoner er viktig, som motstand oppdaget i vitro kan ofte være korrelert med klinisk svikt. Vi undersøkte muligheten for å bruke hele genomet sekvensering (WGS) for genomet hele analyse av soppdrepende resistens i C. glabrata. Målet var torecognize enablers og barrierer i gjennomføringen WGS og måle effektiviteten. Dette dokumentet beskriver viktige kvalitetskontroll kontrollpunkter og viktige komponenter i WGS metodikk undersøke genetiske markører knyttet til redusert mottakelighet for soppdrepende midler. Det anslår også nøyaktigheten av dataanalyse og turn-rundt-tid testing.

Fenotypiske mottakelighet av 12 kliniske og en ATCC stammen av C. glabrata identifiserte gjennom soppdrepende mottakelighet testing. Disse inkluderte tre isolere par, fra tre pasienter, som utviklet økning i narkotika minimum hemmende konsentrasjoner. I to par isolere andre av hver par utviklet motstand mot echinocandins. Den andre isolere av tredje par utviklet resistens mot 5-flucytosine. De resterende består av utsatt og azole motstandsdyktig isolater. Single nukleotid (SNPer) i gener knyttet til echinocandin, azole og 5-flucytosine ble bekreftet i motstandsdyktig isolerer gjennom WGS bruker den neste generasjons sekvensering.  Ikke-synonymt SNPs i soppdrepende motstand gener som FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 og FCY2 ble identifisert. Samlet, gjennomsnittlig 98% av WGS leser av C. glabrata isolerer tilordnet referanse genomet med ca 75-fold Les dybde dekning. Den behandlingstid og kostnad var sammenlignes med Sanger sekvensering.

Avslutningsvis var WGS av C. glabrata mulig i avslørende klinisk signifikant genet mutasjoner i motstand mot ulike soppdrepende narkotika klasser uten behov for flere PCR/DNA sekvensering reaksjoner. Dette representerer et positivt skritt mot etablering WGS evne i kliniske laboratoriet samtidige deteksjon av soppdrepende motstand overdragelse erstatninger.

Introduction

Candida glabrata er en stadig fant patogen med betydning som en art som viser motstand til azoles og mer nylig, den echinocandins1,2,3. I motsetning til den diploide C. albicanskan haploid genomet av C. glabrata det å erverve mutasjoner og utvikle flere resistens lettere. Co motstand til begge narkotika klasser har også vært rapportert4. Derfor er tidlig evaluering av soppdrepende mottakelighet og påvisning av resistens i C. glabrata avgjørende for riktig, målrettet terapi i sammenheng med soppdrepende forvaltning å begrense drivere på resistensutvikling1 , 5 , 6. å etablere en effektiv arbeidsflyt raskt oppdage tilstedeværelsen av bekreftende mutasjoner knyttet til motstand biomarkers i motstandsdyktig isolerer vil også bidra til å forbedre forskrivning beslutninger og kliniske utfall.

Soppdrepende mottakelighet vurderes vanligvis ved å måle minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) som er definert som den laveste narkotika konsentrasjonen som resulterer i en betydelig reduksjon i veksten av en microorganism forhold til en medikamentfri vekst kontroll. De kliniske og Laboratory Standards Institute (CLSI) og europeiske komité på antimikrobielle mottakelighet Testing (EUCAST) har standardisert mottakelighet teste metoder for å gjøre MIC besluttsomhet mer nøyaktig og konsekvent7, 8. Nytten av soppdrepende MIC imidlertid begrenset spesielt for echinocandins, spesielt med hensyn til inter-laboratory sammenligninger der ulike metoder og betingelser er brukt9. Det er også usikker korrelasjon mikrofoner med respons på echinocandin behandling og manglende evne til å skille WT (eller utsatt) isolerer fra de skjuler FKS mutasjoner (echinocandin-resistente stammer)10,11. Til tross for tilgjengelighet for bekreftende single-genet PCRene og Sanger sekvensering av soppdrepende motstand markører, realisering av resultatene er ofte forsinket på grunn av samtidige påvisning av flere motstand markører5,12. Derfor tilbyr samtidige påvisning av motstand-overdragelse mutasjoner på forskjellige steder i genomet, aktiveres av hele genomet sekvensering-basert analyse, betydelige fordeler fremfor gjeldende tilnærminger.

Hele genomet sekvensering (WGS) har blitt implementert for å spore smitteoverføring under utbrudd samt tilnærming for genomet hele risiko vurdering og narkotika testing i bakterier og virus13. Nylige fremskritt innen nukleinsyre sekvensering teknologi har gjort den hele genom sekvensering (WGS) av patogener i en klinisk praktisk turn-rundt-tid både teknisk og økonomisk gjennomførbar. DNA sekvensering har viktige fordeler over andre metoder for patogen identifikasjon og karakterisering ansatt i mikrobiologi laboratorier14,15,16. Først, gir det en universell løsning med høy gjennomstrømning, hastighet og kvalitet. Kan brukes på noen av mikroorganismer og lar stordriftsfordeler på lokalt eller regionalt laboratorier. Andre produserer i et "fremtidssikret" format mottakelig for sammenligning på nasjonale og internasjonale nivåer. Til slutt, potensielle nytten av WGS i medisin har blitt utvidet med den raske veksten av offentlige databaser som inneholder referanse genomer, som kan knyttes til tilsvarende databaser som inneholder flere kliniske og epidemiologisk metadata17 ,18.

Nyere studier har vist nytten av WGS for identifikasjon av soppdrepende motstand markører fra kliniske isolater av Candida spp. 10 , 19 , 20. Dette er hovedsakelig på grunn av tilgjengeligheten av høy gjennomstrømming Borstemmaskin sequencere, etablerte bioinformatikk rørledninger og redusere kostnadene for sekvensering21,22. Fordelen med sopp WGS over Sanger sekvensering er at WGS tillater sekvensering av flere genomer på enkelt kjøre. I tillegg kan WGS av Candida genomer identifisere romanen mutasjoner i narkotika mål, spore genetisk evolusjon og fremveksten av klinisk relevante sekvens-typer20,22,23. Viktigst, i tilfeller av iboende multidrug motstand kan WGS hjelpe tidlig deteksjon av motstand-overdragelse mutasjoner før behandling utvalg22,24.

Her undersøkt vi muligheten for WGS-aktiverte screening for mutasjoner forbundet med resistens til ulike klasser av soppdrepende midler. Vi presenterer en metode for implementering av WGS fra sluttbruker og diagnostiske mykologi laboratorium perspektiver. Vi inkludert i denne analysen tre isolere par kultivert fra tre separate kliniske tilfeller i som i vitro echinocandins og 5-flucytosine utviklet over tid etter soppdrepende behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ingen etiske godkjenning var nødvendig for denne studien.

1. subkultur og inoculum forberedelse til Candida glabrata

  1. Velg et panel av C.glabrata isolerer studier som bør også inneholde minst én C. glabrata amerikansk Type kultur samling (ATCC) med kjente mottakelighet mønster.
  2. Subkultur en isolere ved å berøre en enkelt koloni bruker en steril engangs plast loop og striper på en Sabouraud druesukker agar (SDA) plate8.
  3. Inkuber SDA platen i 24-48 h ved 35 ° C i ren kulturen i isolat med god vekst.

2. fastsettelse av soppdrepende mottakelighet

  1. Bruk en steril engangs plast loop å plukke 4-5 kolonier av ca 1 mm diameter fra en fersk subcultured C. glabrata isolere på SDA plate. Resuspend i 3 mL steril destillert vann. Bland godt av mild pipettering for å få jevn suspensjon.
  2. Justere celle tettheten til 0,5 McFarland som tilsvarer 1 x 106 5 x 106 celler/mL med et densitometer 8.
  3. Utføre mottakelighet testing ved bruk av kommersiell analyse (se tabell av materialer og reagenser) på alle C. glabrata isolerer følg produsentens instruksjoner. Tolke mottakelighet av isolerer basert på resulterende mikrofoner soppdrepende stoffer i henhold CLSI retningslinjer og utarbeide rapporten (tabell 1)8.

3. genomic DNA extraction sekvensering

  1. Resuspend en loopful av kolonier fra en fersk vokst SDA plate i 300 µL 50 mm EDTA i en 1,5 mL tube.
  2. Legge 40 µL av zymolyase (10 mg/mL) til suspensjon og forsiktig Pipetter 5 ganger til suspensjon er ensartet.
  3. Inkuber prøven ved 37 ° C i 1-2 h å fordøye cellen vegg. Cool ved romtemperatur for 5 min.
  4. Sentrifuge suspensjon 14.000 × g i 2 minutter og deretter Fjern forsiktig nedbryting.
  5. Ekstra genomisk DNA følgende DNA utvinning kit retningslinjer (se tabell for materiale).
  6. Resuspend utdraget DNA pellet i 50 µL av 10 mM Tris Buffer (pH 7.5 8.5) i stedet for elueringsbufferen i pakken.
  7. Sjekk renheten av DNA ved måling av optisk tetthet (O.D) på 260/280 nm25.

4. genomic DNA kvantifisering

  1. Forberede en 1 x Tris EDTA (TE)-databufferen som er gitt i analysen kit basert på produsentens retningslinjer for fluorescens analysen (se tabell for materiale).
  2. Fortynne DNA-prøve ved å legge til 2 µL 98 µL av 1 x TE analysebuffer (siste volum av 100 µL, fortynning faktor 1:50) i en engangs 96 godt plate. Dette fortynning trinnet kan utføres enten manuelt ved hjelp av en flerkanals pipette eller automatisert væske håndtering arbeidsstasjon.
  3. Forberede en rekke standarder fortynne lambda DNA (100 µg/mL) gitt i fluorescens analysen kit (tabell 2) og inkluderer for måling med eksempler.
  4. Legg 100 µL av fluorescerende fargestoff til 100 µL utvannet DNA-prøver og standarder for reaksjonen. Inkuber i 5 min i romtemperatur, beskyttet mot lyset.
  5. Måle fluorescens av alle prøver basert på produsentens retningslinjer.
  6. Plot standardkurven bruker fluorescens målinger og beregne den opprinnelige konsentrasjonen av DNA-prøvene.
  7. Bestem volumet av DNA og 10 mM Tris buffer (pH 8) legges til justere DNA konsentrasjonen til 0,2 ng/µL.
  8. Utføre DNA fortynninger med automatisert flytende håndtering arbeidsstasjon. Dette trinnet kan også oppnås ved manuell pipettering.

5. DNA biblioteket forberedelse

Merk: Biblioteket forberedelse og sekvensering ble utført etter produsentens protokoller og retningslinjene gitt av selskapet (figur 1A) (se tabell for materiale).

  1. Tagmentation og PCR forsterkning
    1. Merke en ny 96-brønns solide tynn vegg plate.
    2. Legge til 5 µL kvantifisert inngang DNA på 0,2 ng/µL (1 ng totalt) hvert utvalg godt fra platen.
    3. Legg til 10 µL tagmentation bufferen og 5 µL forsterkning bufferen til hver godt med DNA og Pipetter forsiktig for å blande. Forsegle platen med en selvklebende plate segl.
    4. Plasser platen i en termisk cycler og kjøre programmet for følgende PCR: 55 ° C i 5 minutter, og hold på 10 ° C. Når prøven når 10 ° C, Fortsett umiddelbart å nøytralisere.
    5. Legg 5 µL nøytralisering bufferen til plate å nøytralisere amplicon reaksjonen, og Pipetter forsiktig blanding. Seal platen og ruge ved romtemperatur for 5 min.
    6. Legge til 15 µL av indeksering PCR-mastermix til prøvene.
    7. Bruke en boks av indeks primer rør tilgjengelig for en installasjon av 96-brønns plate format slik at hvert utvalg får en unik kombinasjon av indekser basert på hovedindeksen mal (tabell 3).
    8. Ordne indeks primer rør i indeksen plate rack (figur 1B) bruke rekkefølgen i malen på tabell 3 og fortegnelse posisjonen i indekser på malen.
    9. Plass tagmentation platen med ekstra PCR-mastermix på indeksen plate stativet med indeks rør i rekkefølge.
    10. Sette indeks primer 1 rør i loddrett arrangement, og indeksen primer 2 rør i vannrett arrangement på stikkordregister racket. Bruker en flerkanals pipette, nøye legge til 5 µL av indeks primere i hver prøve.
    11. Erstatte gamle caps indeks rør med nye caps å unngå kryss-kontaminering mellom indekser.
    12. Forsegle platen med 96-brønns klart plate selfangere og utføre andre PCR som følger: 95 ° C for 30 s, 12 sykluser av 95 ° C for 10 s, 55 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s og 72 ° C i 5 minutter.
  2. PCR opprydding
    1. Overføre PCR produktet for PCR-opprydding, fra tagmentation plate til en dyptgående brønn plate (se tabell for materiale).
    2. Vortex kommersielle magnetiske perler løsningen (se tabell for materiale) basert på produsentens instruksjoner og legge til 30 µL av perler i hvert PCR produkt i dyptgående brønn plate.
    3. Riste platen på en microplate shaker på 1800 rpm i 2 minutter og ruge ved romtemperatur uten risting i 5 min.
    4. Plass platen på en magnetisk stå i 2 minutter til nedbryting avklart.
    5. Kast nedbryting med plate fortsatt magnetiske standen.
    6. Legge til 200 µL av nylagde 80% etanol med platen på magnetiske stand.
    7. Inkuber platen på magnetiske står for 30 s og nøye fjerne og slette nedbryting uten å forstyrre perler.
    8. Gjenta trinnet vask igjen og la perler å air-dry til 15 min. Fjern overflødig etanol eventuell.
    9. Fjerne platen fra magnetiske stå og legge 52.5 µL rørets bufferen til perler.
    10. Riste platen på en microplate shaker på 1800 rpm i 2 minutter og ruge ved romtemperatur i 2 minutter uten risting.
    11. Plasser platen på magnetiske stand og tillate nedbryting å fjerne.
    12. Bruke en flerkanals pipette, nøye overføre 50 µL nedbryting av fra opprydding plate til en ny solide plate.
  3. Biblioteket normalisering
    1. Tine biblioteket normalisering reagenser i henhold til produsentens retningslinjer (se tabell for materiale).
    2. Overføring 20 µL nedbryting av fra opprydding plate til en ny dyptgående brønn plate.
    3. Legg til 45 µL av magnetiske perle suspensjon og forsegle platen med en plate sealer.
    4. Riste platen på en microplate shaker på 1800 rpm i 30 min. Inkubasjon nå er kritisk, og bør ikke overskrides.
    5. Plasser platen på en magnetisk stå i 2 minutter, og Bekreft at nedbryting avklart (figur 1B).
    6. Fjerne og slette nedbryting i en passende spesialavfall beholder med plate fortsatt magnetiske standen.
    7. Fjerne platen fra magnetiske stativet og vask perler med 45 µL vaskebuffer.
    8. Riste platen med vaskebuffer på en microplate shaker på 1800 rpm for 5 min.
    9. Plasser platen på magnetiske står for 2 min og Forkast nedbryting når det blir klart.
    10. Fjerne platen fra magnetiske stativet gjenta vask med vaskebuffer igjen.
    11. Fjern platen fra magnetiske stativet og legge 30 µL av 0,1 N NaOH.
    12. Riste platen med 0,1 N NaOH på en microplate shaker på 1800 rpm for 5 min og Plasser platen på magnetiske står i 2 minutter eller til væsken er klar.
    13. Legge til 30 µL av elueringsbufferen i hver brønn av en ny 96-brønns solide tynn vegg siste normalisert biblioteket plate.
    14. Overføring 30 µL av nedbryting fra normalisering plate til siste normalisert biblioteket plate å gjøre endelige volumet 60 µL. Bibliotekene er nå klar til å være sekvensielt.
  4. Fastsettelse av DNA biblioteket konsentrasjonen av qPCR
    1. Tine mastermix, primere og standardene i qPCR kit i henhold til produsentens retningslinjer (se tabell for materiale).
    2. Kombiner PCR reagens mastermix og primer gitt i qPCR kit følg produsentens instruksjoner og dele kan lagres på 20 ° C.
    3. For å bestemme DNA biblioteket konsentrasjonen, gjør en 1/8000 fortynning av DNA biblioteker med 10 mM Tris buffer (pH 8) ved å utføre en 1: 100 fortynning (1,5 µL DNA biblioteket til 148.5 µL Tris bufferen) etterfulgt av en 1:80 fortynning (2 µL fra 1: 100 til 158 µL Tris buffer).
    4. Riste fortynning platen på 700 rpm for minst 1 min og deretter virvel 14000 × g for 1 min.
    5. Forberede 20 µL av siste PCR reaksjon ved å blande 4 µL utvannet DNA bibliotek eller DNA standarder og 16 µL av mastermix.
    6. Utføre PCR produsentens innstillinger i thermocycler: 95 ° C i 5 min, 35 sykluser av 95 ° C for 30 s og 60 ° C for 45 s og siste 65 ° C til 95 ° C for smelte curve analyse.
    7. Få Ct verdiene for eksempel DNA biblioteker og standarder fra qPCR thermocycler.
    8. Generere en standardkurve fra Ct verdien av (figur 2). Define øvre og nedre QC området av ± 3 sykluser fra middelverdien. For eksempel hvis gjennomsnittet Ct verdi er 13 sykluser er QC området mellom 16 og 10 sykluser.
    9. Bestemme de personlige og gjennomsnittlige konsentrasjonene (ALC) fra standardkurve og Ct verdier.
    10. Bestemme antall totale gruppert biblioteker (PAL) som skal brukes basert på beregning gitt nedenfor for siste sekvensering vurderer at målet biblioteket konsentrasjon er mellom 1,4 - 1:8 pM.
      Merk: Gjennomsnittlig biblioteket konsentrasjon fra qPCR = ALC; Totalt antall grupperte biblioteker (PAL) = ALC / 2; Denaturert PAL (DAL) = PAL * 0.666
      Avhengig av DAL som er blandet med buffer, er konsentrasjonen av biblioteket legges til flyt-cellen. For eksempel hvis 65 µL av biblioteket legges til 835 µL av buffer, deretter fra dette fortynning (Dil 1) 195 legges til et totalt volum på 1300 µL: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = siste konsentrasjon (bør være mellom 1,4 - 1:8 pM)

6. biblioteket pooling og Initiating sekvenser i Borstemmaskin Sequencer

  1. Tine påreagenskassetten i henhold til produsentens retningslinjer. Ta ut en ny flyt celle fra pakken fra 4 ° C lagring og bringe til romtemperatur minst 30 min før sekvensering. Ta ut buffer kassetten og prechill sekvensering buffer før bruk (se tabell for materiale).
  2. Forberede en kontroll-biblioteket ved å blande 5 µL av biblioteket (1 nM) og 5 µL av 0,2 N NaOH. Vortex kort og Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur å denature kontroll biblioteket i singelen tråder.
  3. Legge til 5 µL av 200 mM Tris-HCl, pH 7 og vortex. Legg 235 µL prechilled sekvensering buffer og bland forsiktig. Det totale volumet er 250 µL med kontroll biblioteket siste konsentrasjon på 20 pM.
  4. Bassenget DNA biblioteker ved å overføre 5 µL av hvert utvalg bibliotek som ble sekvensert fra siste normalisert biblioteket platen i en enkelt lav-binde 1,5 mL tube.
  5. Legge til 30 µL av grupperte bibliotek og 30 µL av 0,2 N NaOH til denature biblioteker i en annen lav bind rør.
  6. Vortex lav-binde rør og Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur å denature biblioteker i singelen tråder.
  7. Legge til 30 µL av 200 mM Tris-HCl, pH 7 til tube med denaturert biblioteker å nøytralisere reaksjonen.
  8. Legge til 65 µL av men denaturert biblioteker suspensjon og 835 µL av pre kjølt sekvensering buffer og vortex å bland godt.
  9. I et siste lav bind rør kombinere følgende: 195 µL fra men denaturert biblioteker, 1,30 µL av kontroll biblioteket og 1103.70 µL sekvensering bufferen. Bland riktig.
  10. Legg siste biblioteket mix (1300 µL) i det angitte stedet på påreagenskassetten.
  11. Oppsett sekvensering av prosjektet og prøven inn sequenceren eget nettsted følgende retningslinjer.
  12. Initiere sekvensering følgende retningslinjer. Laste flyt cell, påreagenskassetten med biblioteker og buffer patron i Borstemmaskin sequencer.
  13. Registrere partinummeret for alt reagens kits og kassetter brukes i rekkefølgen.

7. data dataoverføre sekvensering Website

  1. Laste ned FASTQ filer følg produsentens instruksjoner på nettstedet.
  2. For en god kjøre sjekk at prosentandelen Q30 er ≥ 75% og cluster tetthet er mellom 170-280 K/mm2 med optimal ved 200-210 K/mm2 (tabell 4).

8. sekvensering dataanalyse

  1. Importere FASTQ filer av sekvensert prøver i data analyse integrert programvarepakke (se tabell for materiale).
  2. Opprette en sekvensering arbeidsflyt programvare ved å legge til funksjoner fra listen nemlig trimming, tilordne til referanse (Velg referanse genomet), lokale omstilling og variant analyse (Figur 3A) bruke innstillinger oppført i tabell 5.
  3. Kjøre arbeidsflyten ved å velge et enkelt utvalg eller en gruppe med FASTQ eksempelfiler og lagre utdatafiler i utpekte eksempel mapper.
  4. Generere rapport for sekvensen dekning dybde, tilordnede områder og liste over strukturelle varianter i genomet (Figur 3B).
  5. Bruk listen over strukturelle varianter for å søke for ikke-synonymt single nukleotid (SNPer) i gener overdragelse motstand og virulens.
  6. Klargjør rapport av SNP plassering, gene, og antall motstandsdyktig eller utsatt isolerer (tabell 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tretten C. glabrata bestående av C. glabrata ATCC 90030 og 12 isolerer fra klinisk mykologi referanse laboratoriet (isolerer CMRL1 til CMRL12), Westmead Hospital, Sydney ble studert (tabell 1). Disse inkluderer tre par isolerer CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 og CMRL-5/CMRL-6 innhentet før og etter soppdrepende terapi med ingen epidemiologisk koblinger mellom dem 24 (tabell 1).

Mikrofoner var bestemt bruker CLSI fortolkende stoppunkt for ni soppdrepende midler nemlig amfotericin AMB (), Anidulafungin (ANI), Micafungin (MIF), Caspofungin (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), vorikonazol (VRC), itrakonazol ( ITR) og Fluconazole (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 og Candida krusei ATCC 6258 ble brukt som kvalitetskontroll stammer. Blant isolere paret, CMRL-1 og CMRL-2, var den andre isolere CMRL-2 resistente mot caspofungin (MIC 8 vs 0,12 mg/L, tabell 1). CMRL-2 hadde også tilsvarende proporsjonal økninger i mikrofoner av anidulafungin og micafungin (≥ 0,5 mg/L) resulterer i i vitro motstand mot alle tre echinocandins24. Likeledes, isolere CMRL-4 hadde utviklet echinocandin motstand enn isolere CMRL-3 (tabell 1). Mellom den tredje, isolere CMRL-6 hadde en 5-flucytosine mikrofon (> 64 vs 0,06 mg/L)24. Begge disse isolere par ble utsatt/vill-type (WT) andre soppdrepende midler testet. Isolere CMRL-6 og CMRL-12 ble funnet for å være resistente eller ikke-WT til alle azoles. CMRL-7 var motstandsdyktig mot fluconazole og ikke WT til vorikonazol (tabell 1). C. glabrata ATCC 90030 og isolerer CMRL-8 til CMRL-11 var utsatt utsatt/WT til alle soppdrepende midler24.

WGS av 13 isolerer ble utført Borstemmaskin sequenceren. En gjennomsnittlig, en midt utgang sekvensering kjøre, gitt rundt 27-40 GB data med en feil mellom 0,5-1.4%. Den gjennomsnittlige prosentandelen Q30 innhentet var vanligvis rundt 80-85%. Flyt-celle-klynge tetthet (K/mm2) varierte mellom 200-250 (tabell 4). Rå sekvens data fra denne studien har blitt satt på NCBI rekkefølge lese arkiv (SRA) under prosjektnummeret PRJNA310057. 98% av sekvensering leser tilordnet C. glabrata referanse genomet (belastning CBS138) gjennom analyse i integrerte data analyseprogramvare. Gjennomsnittlig lese dybde dekningen var 75 x med gjennomsnittlig lese lengden på 143-bp. strukturelle variant oppdagelsen identifisert mer enn 50, 000 SNPs per isolere. Spesielt når du analyserer belastning parene CMRL1/CMRL-2, totalt SNPs på hver isolere var rundt 79,000, for CMRL-3/CMRL-4, var antall SNPs rundt 60.000 og for CMRL-5/CMRL-6, mer enn 56.000 sammenlignet med CBS13824. SNP forskjellen i forhold mellom isolerer belastning verdilisten var mindre enn 25.

Basert på mottakelighet profilen isolert, kjent motstand biomarkers ble valgt for analyse24, spesielt, FKS1, FKS2 og FKS3 (echinocandin motstand), FCY1 og FCY2 (5- flucytosine motstand), og ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 og CgFLR1 (azole motstand). Genene ble sjekket for kjente mutasjoner og hyppigheten av SNP forekomster. Bare ikke-synonymt SNPs i gener med lese dybde dekning av ≥20 dvs, var spesielt høy kvalitet SNPs (hq-SNPer) studerte.

Spesielt ble FKS mutasjoner identifisert i genomet av både echinocandin-resistente isolerer24. Av de to første, echinocandin motstandsdyktig isolert, CMRL-2 næret en enkelt FKS2 mutasjon S629P og CMRL-4, FKS2 mutasjon S663P (tabell 6). Av tredje par, ble en SNP i FCY2 (Ala237Thr) funnet i både CMRL-5 (5-flucytosine utsatt) og CMRL-6 (motstandsdyktig) (tabell 6). Imidlertid ble SNPs i FCY2 også funnet i andre svært-WT isolerer (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. Isolerer CMRL-6 og CMRL-12 var bemerkelsesverdig for sine pan-azole motstandsdyktig/non-WT karakter og hadde SNPs i både CgCDR1 (koding azole middelklasseinnbyggere pumper) og CgPDR1 (koding transkripsjon faktoren regulere middelklasseinnbyggere pumpene) (tabell 6)26 ,27. Tilstedeværelsen av mutasjoner i et annet middelklasseinnbyggere pumpe gen, CgFLR1 oppstod i begge azole-utsatt, og azole-resistente isolerer26,28. Undersøkelser for SNPs i ERG9 (koding squalene syntase) avslørte mutasjoner, men det var ingen mutasjoner i ERG1124.

WGS analyse avslørte også flere ikke-synonymt SNPs i Candida cellevegg vedheft gener nemlig EPA1, EPA6, PWP2 og PWP5. EPA6 mutasjoner var tilstede i 9/12 isolater. SNPs i PWP2 og PWP5 var også til stede i nesten alle isolert, unntatt isolerer CMRL-1 og CMRL-11-24.

Isolere AMB ANI MIF CAS 5-FC POS VRC ITR FLC Tolkning av soppdrepende mottakelighet Gener overdragelse motstand identifisert av WGS
CMRL-1 0,5 0,03 < 0.008 0,12 < 0,06 0,5 0,12 0,25 8 Utsatt for alle -
CMRL-2 0,5 1 1 8 < 0,06 0,25 0,06 0,12 4 Motstandsdyktig mot alle echinocandins bare FKS1
CMRL-3 0,25 0.015 0.015 0,12 < 0,06 1 0,25 0,5 8 Utsatt for alle -
CMRL-4 2 1 1 > 8 < 0,06 0,5 0,12 0,25 8 Motstandsdyktig mot alle echinocandins bare FKS2
CMRL-5 1 0,12 0.015 0,12 < 0,06 1 0,5 0,5 16 Utsatt for alle -
CMRL-6 1 0,06 0.015 0,06 > 64 > 8 8 > 16 256 Motstandsdyktig mot 5-FC og azoles FCY2, CgPDR1, CgCDR1
CMRL-7 0,25 0,06 0.015 0,25 < 0,06 1 8 0,5 256 Motstandsdyktig mot alle azoles bare CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1
CMRL-8 0,5 0,03 0.008 0,06 < 0,06 0,5 0,25 0,25 4 Utsatt for alle -
CMRL-9 1 0,03 0.015 0,25 < 0,06 1 0,5 1 16 Utsatt for alle -
CMRL-10 1 0,03 < 0.008 0,5 < 0,06 1 0,5 0,5 16 Utsatt for alle -
CMRL-11 0,5 0,03 < 0.008 0,03 < 0,06 0,5 0,25 0,5 8 Utsatt for alle -
CMRL-12 0,5 0,03 0.015 0,06 < 0,06 > 8 2 8 128 Motstandsdyktig mot alle azoles bare CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1
ATCC 90030 1 0,03 0.015 0,06 < 0,06 1 0,5 0,5 8 Utsatt for alle -
Forkortelser: MIC, minimum inhibitoriske konsentrasjon. AMB, amfotericin B; ANI, anidulafungin; CAS, caspofungin; FLC, flukonazol; ITR, itrakonazol; MIF, micafungin; POS, posaconazole; VRC, vorikonazol; 5-FC, 5-flucytosine.

Tabell 1. In vitro mottakelighet av 13 Candida glabrata isolerer inkludert CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 og CMRL-5/CMRL-6 isolere parene før og etter soppdrepende terapi

Standarder DNA standardvolum (μL) 1 X TE buffer Reagens (μL) Totalt i 96-brønnen plate (μL) Siste DNA konsentrasjonen (ng/mL)
STD-Pico 1 8 (standard DNA tube 100 µg/mL) 1992 100 200 1000
STD-Pico 2 10 (fra Std-Pico 1) 90 100 200 100
STD - Pico 3 5 (fra Std-Pico 1) 95 100 200 50
STD-Pico 4 2 (fra Std-Pico 1) 198 100 200 10
STD-Pico 5 10 (Std-Pico 4) 90 100 200 1
Tomme - 100 100 200 Tomme

Tabell 2. Protokollen for å klargjøre standarder for standardkurve generasjon for DNA kvantifisering

Figure 1
Figur 1 . Sekvensering arbeidsflyt: (A) en disposisjon av analytiske hovedtrinn for biblioteket forberedelse og sekvensering på en Borstemmaskin sequencer. (B) viktige komponenter for DNA biblioteket forberedelse som (venstre til høyre) indeksen stenger for arrangement av indekser under indeksering og magnetiske rack med dypt 96-brønns plate for magnetisk perle basert opprydding av DNA biblioteker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Indeks
Satte		 N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715
A S502 Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3 Eksempel 4 Eksempel 5 Eksempel 6 Eksempel 7 Eksempel 8 Eksempel 9 Eksempel 10 Eksempel 11 Eksempel 12
B S503 Eksempel 13 Eksempel 14 Eksempel 15 Eksempel 16 Eksempel 17 Eksempel 18 Eksempel 19 Prøve 20 Eksempel 21 Eksempel 22 Eksempel 23 Eksempel 24
C S505 Eksempel 25 Eksempel 26 Eksempel 27 Eksempel 28 Eksempel 29 Eksempel 30 Eksempel 31 Eksempel 32 Eksempel 33 Eksempel 34 Eksempel 35 Eksempel 36
D S506 Eksempel 37 Eksempel 38 Eksempel 39 Eksempel 40 Eksempel 41 Eksempel 42 Eksempel 43 Eksempel 44 Eksempel 45 Eksempel 46 Eksempel 47 Eksempel 48
E S507 Eksempel 49 Eksempel 50 Eksempel 51 Eksempel 52 Eksempel 53 Eksempel 54 Eksempel 55 Eksempel 56 Eksempel 57 Eksempel 58 Eksempel 59 Eksempel 60
F S508 Eksempel 61 Eksempel 62 Eksempel 63 Eksempel 64 Eksempel 65 Eksempel 66 Eksempel 67 Eksempel 68 Eksempel 69 Eksempel 70 Eksempel 71 Eksempel 72
G S510 Eksempel 73 Eksempel 74 Eksempel 75 Eksempel 76 Eksempel 77 Eksempel 78 Eksempel 79 Eksempel 80 Eksempel 81 Eksempel 82 Eksempel 83 Eksempel 84
H S511 Eksempel 85 Eksempel 86 Eksempel 87 Eksempel 88 Eksempel 89 Eksempel 90 Eksempel 91 Eksempel 92 Eksempel 93 Eksempel 94 Eksempel 95 Eksempel 96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Indeksere sett B N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729
A S502 Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3 Eksempel 4 Eksempel 5 Eksempel 6 Eksempel 7 Eksempel 8 Eksempel 9 Eksempel 10 Eksempel 11 Eksempel 12
B S503 Eksempel 13 Eksempel 14 Eksempel 15 Eksempel 16 Eksempel 17 Eksempel 18 Eksempel 19 Prøve 20 Eksempel 21 Eksempel 22 Eksempel 23 Eksempel 24
C S505 Eksempel 25 Eksempel 26 Eksempel 27 Eksempel 28 Eksempel 29 Eksempel 30 Eksempel 31 Eksempel 32 Eksempel 33 Eksempel 34 Eksempel 35 Eksempel 36
D S506 Eksempel 37 Eksempel 38 Eksempel 39 Eksempel 40 Eksempel 41 Eksempel 42 Eksempel 43 Eksempel 44 Eksempel 45 Eksempel 46 Eksempel 47 Eksempel 48
E S507 Eksempel 49 Eksempel 50 Eksempel 51 Eksempel 52 Eksempel 53 Eksempel 54 Eksempel 55 Eksempel 56 Eksempel 57 Eksempel 58 Eksempel 59 Eksempel 60
F S508 Eksempel 61 Eksempel 62 Eksempel 63 Eksempel 64 Eksempel 65 Eksempel 66 Eksempel 67 Eksempel 68 Eksempel 69 Eksempel 70 Eksempel 71 Eksempel 72
G S510 Eksempel 73 Eksempel 74 Eksempel 75 Eksempel 76 Eksempel 77 Eksempel 78 Eksempel 79 Eksempel 80 Eksempel 81 Eksempel 82 Eksempel 83 Eksempel 84
H S511 Eksempel 85 Eksempel 86 Eksempel 87 Eksempel 88 Eksempel 89 Eksempel 90 Eksempel 91 Eksempel 92 Eksempel 93 Eksempel 94 Eksempel 95 Eksempel 96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Indeksere sett C N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715
A S513 Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3 Eksempel 4 Eksempel 5 Eksempel 6 Eksempel 7 Eksempel 8 Eksempel 9 Eksempel 10 Eksempel 11 Eksempel 12
B S515 Eksempel 13 Eksempel 14 Eksempel 15 Eksempel 16 Eksempel 17 Eksempel 18 Eksempel 19 Prøve 20 Eksempel 21 Eksempel 22 Eksempel 23 Eksempel 24
C S516 Eksempel 25 Eksempel 26 Eksempel 27 Eksempel 28 Eksempel 29 Eksempel 30 Eksempel 31 Eksempel 32 Eksempel 33 Eksempel 34 Eksempel 35 Eksempel 36
D S517 Eksempel 37 Eksempel 38 Eksempel 39 Eksempel 40 Eksempel 41 Eksempel 42 Eksempel 43 Eksempel 44 Eksempel 45 Eksempel 46 Eksempel 47 Eksempel 48
E S518 Eksempel 49 Eksempel 50 Eksempel 51 Eksempel 52 Eksempel 53 Eksempel 54 Eksempel 55 Eksempel 56 Eksempel 57 Eksempel 58 Eksempel 59 Eksempel 60
F S520 Eksempel 61 Eksempel 62 Eksempel 63 Eksempel 64 Eksempel 65 Eksempel 66 Eksempel 67 Eksempel 68 Eksempel 69 Eksempel 70 Eksempel 71 Eksempel 72
G S521 Eksempel 73 Eksempel 74 Eksempel 75 Eksempel 76 Eksempel 77 Eksempel 78 Eksempel 79 Eksempel 80 Eksempel 81 Eksempel 82 Eksempel 83 Eksempel 84
H S522 Eksempel 85 Eksempel 86 Eksempel 87 Eksempel 88 Eksempel 89 Eksempel 90 Eksempel 91 Eksempel 92 Eksempel 93 Eksempel 94 Eksempel 95 Eksempel 96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Indeksere sett D N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729
A S513 Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3 Eksempel 4 Eksempel 5 Eksempel 6 Eksempel 7 Eksempel 8 Eksempel 9 Eksempel 10 Eksempel 11 Eksempel 12
B S515 Eksempel 13 Eksempel 14 Eksempel 15 Eksempel 16 Eksempel 17 Eksempel 18 Eksempel 19 Prøve 20 Eksempel 21 Eksempel 22 Eksempel 23 Eksempel 24
C S516 Eksempel 25 Eksempel 26 Eksempel 27 Eksempel 28 Eksempel 29 Eksempel 30 Eksempel 31 Eksempel 32 Eksempel 33 Eksempel 34 Eksempel 35 Eksempel 36
D S517 Eksempel 37 Eksempel 38 Eksempel 39 Eksempel 40 Eksempel 41 Eksempel 42 Eksempel 43 Eksempel 44 Eksempel 45 Eksempel 46 Eksempel 47 Eksempel 48
E S518 Eksempel 49 Eksempel 50 Eksempel 51 Eksempel 52 Eksempel 53 Eksempel 54 Eksempel 55 Eksempel 56 Eksempel 57 Eksempel 58 Eksempel 59 Eksempel 60
F S520 Eksempel 61 Eksempel 62 Eksempel 63 Eksempel 64 Eksempel 65 Eksempel 66 Eksempel 67 Eksempel 68 Eksempel 69 Eksempel 70 Eksempel 71 Eksempel 72
G S521 Eksempel 73 Eksempel 74 Eksempel 75 Eksempel 76 Eksempel 77 Eksempel 78 Eksempel 79 Eksempel 80 Eksempel 81 Eksempel 82 Eksempel 83 Eksempel 84
H S522 Eksempel 85 Eksempel 86 Eksempel 87 Eksempel 88 Eksempel 89 Eksempel 90 Eksempel 91 Eksempel 92 Eksempel 93 Eksempel 94 Eksempel 95 Eksempel 96

Tabell 3. Mal for annen indeks Arrangement

Figure 2
Figur 2 : En standard graf generert av Ct verdiene til standarder. Bruke standardkurve skjæringspunkt og STIGNINGSTALL verdier for å bestemme gjennomsnittlig biblioteket konsentrasjonen fra Ct verdien av prøven biblioteker duplikater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Beregninger Standardverdier Verdier Hentet (gjennomsnitt)
Avkastning 32,5-50 Gb for midt-utgang 42 Gb for midt-utgang
100-130 Gb for høy effekt 120 Gb for høy effekt
Prosentandel Q30 ≥ 75% 80%
Klynge tetthet 170-230 K/mm2, Optimal ved 200 K/mm2 210 K/mm2.
Klynger passerer filtre > 70% 89.09%
Intensiteten av syklus Over 1000 for hver i flowcell Over 1500 for hver i flowcell
Feil Under 1.5 1.4

Tabell 4. Beregningene for en standard sekvenser i Borstemmaskin Sequencer

Figure 3
Figur 3 : Sekvensering dataanalyse programvare. (A) opprette en ønsket arbeidsflyt inkludert sekvens trimming, tilordning til referanse og kvalitet basert variant gjenkjenning. Kjøre arbeidsflyten ved å velge FASTQ eksempelfiler (enkelte eller flere eksempler i batch). (B) liste over strukturelle varianter viser referanse posisjon, dekning, nukleotid endring og aminosyre endring innhentet for analyse av prøven sekvenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. trim sekvenser Innstillingen for
Trimme baser Standardinnstillingene
Filtrere på lengde med maksimalt antall nucleotide i leser 1000
Filtrere på lengde med minimalt antall nucleotide i leser 50
2. kartlegging leser referanse
Referanse valgt CBS138
Referanse maskering med maskering modus Ingen maskering
Kartlegging alternativer Standardinnstillingene
3. lokale omstilling
Justeringsinnstillinger Standardinnstillingene
4. kvaliteten basert Variant gjenkjenning
Nabolaget radius 5
Minimum gap og feil antall 2
Minimum nabolaget kvalitet 15
Sentrale kvalitet 20
Les filtre Standardinnstillingene
Minimum dekning 4
Variant minimumsfrekvens (%) 75
Variant-filtre Standardinnstillingene
Maksimal forventet alleler (Ploidy) 2
Genetisk kode Standard

Tabell 5. Arbeidsflyt parametere og innstillinger på programvare

Strukturelle Variant Nucleotide posisjon Gene Medikament Funnet i
Antall
Isolerer		 Motstandsdyktig isolerer Utsatt isolerer
SNP_Cg_95352_S629P_fks1 CgFKS1 CAS, ANI, MIF 1 CMRL-2 -
SNP_Cg_375361_S633P_fk2 CgFKS2 CAS, ANI, MIF 1 CMRL-4 -
SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 CgFCY2 5-FC 2 CMRL-6 CMRL-5
SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 CgFCY2 5-FC 2 0 CMRL-1, CMRL-2
SNP_Cg_720995_C128F_erg9 CgERG9 FLC, POS, VRC, ITR 3 CMRL-6 CMRL-5, CMRL-10
SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 CgPDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-6 -
SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 CgPDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 CgPDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 0 CMRL-11
SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 CgPDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-12 -
SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 CgCDR1 FLC, POS, VRC, ITR 5 CMRL-6, CMRL-12 CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11
SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 CgCDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 CgCDR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-7 -
SNP_Cg_589884_I116V_flr1 CgFLR1 FLC, POS, VRC, ITR 4 CMRL-7 CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9
SNP_Cg_589470_V254I_flr1 CgFLR1 FLC, POS, VRC, ITR 1 CMRL-12 -

Tabell 6. Rapport av strukturell variant posisjon i gener knyttet til soppdrepende resistens i antall isolater av C. glabrata

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien fastsatt gjennomførbarhet, omtrentlig tidslinjer og presisjon av WGS-guidede deteksjon av resistens i C. glabrata. Tiden (TAT) bibliotek og sekvensering var fire dager og rapportering av analysert resultatene en til to dager. Dette sammenligner med minst like mye TAT for mottakelighet analyser fra kultur plater og Sanger sekvensering med betydelig høyere antallet eksempler. Rundt 30-90 C. glabrata genomer kan være sekvensert basert på sekvensering flyt-celle kapasitet, med 80-100% sekvensering dekning. Siden sekvensering ble utført på et internt WGS laboratorium setup, kostnader/ressurskravene i denne studien var tilsvarende kostnader av Sanger sekvensering og sonde-baserte analyser med en estimert kostnad på AUD 80-100 per prøve. Mottakelighet av alle isolerer var bestemt av en kommersiell analyse kit som ble lest visuelt ved hjelp av en leser speil. Kultur vekst ble angitt med endring i kolorimetrisk vekst indikator fra blått til rosa. MIC ble lest som den første blå godt etter en rekke rosa (vekst) brønner dvs den laveste konsentrasjonen av soppdrepende middel som vesentlig hemmer vekst. WGS, var genomisk DNA biblioteker forberedt ved hjelp av biblioteket forberedelse kit. Isolere bibliotekene kvantifisert ved qPCR. Kvantifisert bibliotekene ble samlet sammen for den endelige sekvensering kjøre utført i Borstemmaskin sequenceren.

I vår analyse, tilstedeværelsen av SNPs i gener overdragelse motstand i isolat korrelert godt med forhøyet i vitro MIC mot narkotika. MutasjonerS629P i FKS1 og S663P i FKS2 identifisert var tydelig knyttet motstand mot echinocandins. Begge mutasjoner er velkjente overdragelse fenotypiske motstand29,30. Samtidige genomet hele sekvensering avslørte også mutasjoner i gener knyttet til 5-flucytosine (Gen FCY2) og azole motstand (CgPDR1, CgCDR1 og CgFLR1) som er forbundet med motstand gjennom aktivering / overuttrykte som middelklasseinnbyggere pumper26,27,28. Men effekten av mutasjoner i gener knyttet til azole og 5-flucytosine motstand31 må bekreftes av mer funksjonelle analyserer for å vurdere uttrykk genet. Interessant, ble stort antall SNPs også funnet i celleveggen adhesins alle isolerer32,33. Mutasjoner i vedheft gen EPA6, som koder biofilm formasjon, oppstod relativt ofte33. I tillegg isolerer CMRL-3, CMRL-4 og CMRL-8 som manglet mutasjoner i azole motstand gener hadde ingen dokumentert SNPs i EPA1 og EPA624,34. Men generelt fant ingen bestemt sammenheng mellom SNPs i adhesins og narkotika mikrofoner på grunn av lavt antall test isolerer inkludert.

Gjennomføringen av WGS i klinisk mykologi krever implementeringen av robust kvalitetsledelsessystemer. Høy kvalitet genomisk DNA og kvalitetskontroll sjekkpunkter som følge hvert trinn i eksperimentet er viktig for en god WGS utfall. Renheten av C. glabrata eksempel DNA innsendt for biblioteket forberedelse kan valideres bruker UV absorbansen metoden (absorbans ved 260/280 nm og 260/230 nm25. I vår erfaring, for C. glabrata DNA er 260/280 ventet å være innenfor anbefalt område 1,8-2 og 260/230 mellom 2-2.2. Hvis DNA ekstrakter ikke oppfyller disse kvalitetskrav, utføres ekstra rensing av etanol nedbør. Tagmentation er et viktig skritt for å legge unik strekkode sekvenser kalt indeks primere Slik aktiverer differensiering av flere eksempler under sekvensering (multiplexing). Derfor i indekseringsprosessen, må ekstra forsiktighet tas for å unngå kryss-kontaminering mellom indeksen rør og eksempler for å opprettholde unike indekser. Normalisering i sekvensering sikrer at eventuelle forskjeller som oppstår i prøven DNA bibliotekene som skulle introdusere skjevhet i sekvensering data er eliminert. En normalisering trinn med en perle basert rydde opp vanligvis tillater fjerning av overflødig DNA biblioteket fragmenter og variasjoner i biblioteket størrelse som kan oppstå under bibliotek forberedelse. Derfor er den 30 min inkubering kritisk for optimal klynge tetthet. Klynge tetthet som er tettheten av klonal klynger av prøven biblioteker generert av massiv forsterkning under sekvensering påvirkninger datakvalitet som Q30 score og totalt utgang. Mens underclustering kan gi høy kvalitet, vil det også resultere i utgående mens overclustering lav Q30 score lavere data. DNA bibliotekene bør være fri for magnetisk perle rester under PCR opprydding og normalisering som som kan forstyrre sekvensering datakvaliteten. QPCR skal utføres på minst et par representativt utvalg biblioteker inkludert en referanse stamme som en positiv (ATCC stammen av C. glabrata i dette tilfellet) fra et bestemt sett av indekser. Ct gjennomsnittsverdiene må være mellom 15-18 sykluser. Enhver prøven innenfor dette området regnes som akseptabel for sekvensering kjøres. Men hvis Ct verdiene er utenfor dette området skal av qPCR gjentas. Eksempler kan mislykkes qPCR enten på grunn av lav kvalitet inn DNA eller feil under bibliotek forberedelse. Basert på beregninger fra kontrollen positiv, bør minimum konsentrasjonen av bibliotekene som vil gi god sekvens data opprettes. Bruker gjennomsnittlig konsentrasjonen av bibliotekene fra qPCR, kan volumet av siste biblioteket som skal legges til sekvensering beregnes. Dette bør gi anbefalte siste biblioteket konsentrasjonen mellom 1,4 - 1:8 pM. C. glabrata biblioteker, etablerte Ct området som bruker C. glabrata ATCC isolere var mellom 16-18 sykluser med en gjennomsnittlig biblioteket konsentrasjon rekke 300-500 pM. Det tilsvarende volumet av grupperte denaturert DNA biblioteker var innen 60-65 µL for et klynge tetthet mellom 200-250 K/mm2.

Sekvensen datafilene bør være demultiplexed før videre analyse. Dette kan oppnås ved sortering i sine respektive biblioteker bruke deres strekkoder etter sekvensering har funnet sted. Et valgfritt trinn kvalitet trimming FASTQ filer kan utføres før dataanalyse. Den sekvens lest isolert fra WGS ble analysert ved hjelp av en egendefinert arbeidsflyt som opprettes i en programvarepakke. Dette tillot trimming av lav kvalitet og deretter tilordne til referansen Candida genom. Referanse genomet, CBS138, ble lastet ned fra Candida genomet Database (CGD) og knyttet til arbeidsflyten før analyse. Tilstedeværelsen av DNA gjentar i Candida genomet (for eksempel adhesin gener har DNA gjentar) kan komplisere justeringen av kort-lese sekvenser og SNP kall. Dette kan forbedres ved mer lokale omstillingen av tilordnede sekvenser. Utdataene fra arbeidsflyten var en strukturelle varianter liste som kommenterte gener med ikke-synonymt og synonymt SNP posisjoner og dekning. Denne ble brukt til å identifisere SNPs i gener rundt og forberede siste analyserapporten isolert (tabell 6).

Noen begrensninger våre studier og tilnærming bør anerkjennes. Rapporten er basert på lite antall isolerer og det er ingen standard fungal resistome database for klinisk mykologi. Selv om Sanger DNA sekvensering er for tiden mer tilgjengelig for kliniske laboratorier, har den begrensede evne til å samtidig oppdage flere genet mutasjoner som overdrar resistens i Candida spp. (> 20 FKS mutasjoner for echinocandin motstand alene). Med konsolidering av patologi tjenester og synkende sekvensering kostnader, praktiske av benytter WGS over Sanger sekvensering, er trolig øke. En viktig faktor er imidlertid første laboratorium oppsett og kostnader WGS instrument implementering og sluttbrukeropplæring av laboratoriepersonell. Lang sikt kostnadene vil i hovedsak inkludere, skaffe sekvensering reagens kits og tilbehør. Ekstra kostnad og en høyere TAT bør forventes hvis WGS apparatet ikke er internt. Videre, tilstedeværelse av gjenta DNA-sekvenser i genomer kan komplisere justeringen av kort-lese sekvenser og SNP kall. Tilgjengeligheten av høy kvalitet referanse genomer sekvensert bruker lang lese teknologier vil bidra til å opprettholde kvaliteten på SNP identifikasjon.

I fremtiden forventes WGS å gi forbedringer i kliniske ved rask sporing rapportering tiden i diagnoseinnstillinger som er lett tilgjengelig og tolket av klinikere20,22. Dette kan oppnås med utvikling av kuratert og oppdatert WGS soppdrepende narkotika motstand databaser av romanen og bekreftende mutasjoner å antyde soppdrepende motstand. Når flere genomer av klinisk relevante gjær av kjente fenotypiske narkotika mottakelighet blir tilgjengelige for analyse, er romanen markører og mekanismer av soppdrepende resistens sannsynlig å bli oppdaget. Denne utviklingen vil vesentlig redusere risikoen for behandling feil multi resistens og medikament toksisitet. I konklusjonen, kan den neste generasjons sekvensering med riktig kvalitet DRM-protokoller genomet hele påvisning av mutasjoner overdragelse motstand i Candida glabrata som kan øke fenotypiske testing i mykologi laboratorier. Innsikt fra rask genomet sekvensering av klinisk relevante Candida spp kan fundamentalt endre vår forståelse av mekanismer for resistens til ulike klasser av soppdrepende midler og forbedre styring av pasienter med invasiv Fungal sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser og noen interessekonflikt avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Centre for infeksjonssykdommer og mikrobiologi, offentlig helse. Forfatterne har ikke mottatt andre midler til denne studien. Forfatterne takker Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann og Ranjeeta Menon for deres råd og hjelp med hele genomet sekvensering eksperiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DensiCHECK Plus BioMérieux Inc K083536 Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOne TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific YO10 Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific 22-363-605 Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma Aldrich, Merck T2795    Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus MP Biomedicals, LLC 8320921 Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit  Promega  A1120 Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific P7589  Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-131-1096 Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		 Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2  Illumina FC-404-2004 300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 Kit Illumina FC-404-2003 300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control Kit Illumina FC-110-3001 To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture Kit FC-130-1005  2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		 KAPA Biosystems KK4824 Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system  PerkinElmer YJS4NGS Used for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage Plate Thermo Scientific AB0765B MIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881  Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96 Thermo Fisher Scientific AM10027 Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP  Benchmark Scientific BT1502 96-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR Plate BioRad HSP9601 Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II  Roche  5015278001 Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical  BioRad  MSB1001 Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics Workbench Qiagen CLCBio Software for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrument Illumina  Illumina  Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

Tags

Medisin problemet 130 Candida glabrata hele genomet sekvensering soppdrepende resistens echinocandins azoles 5-flucytosine genomet-bredt analyse
Hele genomet sekvensering av <em>Candida glabrata</em> for gjenkjenning av markører av soppdrepende resistens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biswas, C., Chen, S. C. A.,… More

Biswas, C., Chen, S. C. A., Halliday, C., Martinez, E., Rockett, R. J., Wang, Q., Timms, V. J., Dhakal, R., Sadsad, R., Kennedy, K. J., Playford, G., Marriott, D. J., Slavin, M. A., Sorrell, T. C., Sintchenko, V. Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance. J. Vis. Exp. (130), e56714, doi:10.3791/56714 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter