Summary
Este estudo implementado sequenciamento do genoma inteiro para análise de mutações em genes que conferem resistência a drogas antifúngicas no Candida glabrata. Isolados de c. glabrata resistentes à echinocandins, azóis e 5-flucitosina, foram sequenciados para ilustrar a metodologia. Perfis de susceptibilidade dos isolados correlacionaram com a presença ou ausência de padrões específicos de mutação nos genes.
Abstract
Candida glabrata pode rapidamente adquirir mutações que resultam em resistência às drogas, especialmente de azóis e echinocandins. Identificação de mutações genéticas é essencial, como resistência detectada em vitro muitas vezes pode ser correlacionado com o fracasso clínico. Nós examinamos a viabilidade do uso de sequenciamento do genoma inteiro (WGS) para análise de todo o genoma de resistência a drogas antifúngicas no c. glabrata. O objectivo era torecognize facilitadores e barreiras na implementação do GTS e mede a sua eficácia. Este paper descreve os pontos de verificação de chave de controle de qualidade e componentes essenciais da metodologia WGS para investigar marcadores genéticos associados com reduzida susceptibilidade aos agentes antifúngicos. Também estima-se que a precisão da análise de dados e turn-around-time de testes.
Suscetibilidade fenotípica de 12 clínicos e uma cepa ATCC de c. glabrata foi determinada através de testes de susceptibilidade. Estes incluídos três isolam pares, de três pacientes, que se desenvolveu a ascensão em concentrações inibitórias mínimas de drogas. Em dois pares, o segundo isolar cada par desenvolvido resistência a echinocandins. O segundo isolado do terceiro par desenvolveu resistência ao 5-flucitosina. O restante composto por sensíveis e resistentes azólicos isolados. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes ligados à resistência echinocandin, AZOL e 5-flucitosina foram confirmados em isolados resistentes através de WGS utilizando o sequenciamento de geração seguinte. Non-sinônimo SNPs em resistência antifúngica genes tais como FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 e FCY2 foram identificados. Em geral, uma média de 98% das leituras WGS dos isolados de c. glabrata , mapeados para o genoma de referência com uma cobertura de cerca 75-fold leitura de profundidade. O tempo de retorno e custo eram comparáveis aos Sanger sequenciamento.
Em conclusão, WGS de c. glabrata era viável em revelar clinicamente significativas mutações envolvida na resistência à classes de diferentes drogas antifúngicas, sem a necessidade de múltiplas reações de PCR/DNA arranjar em sequência. Isto representa um passo positivo para estabelecer capacidade de WGS no laboratório clínico para a deteção simultânea de substituições confere resistência antifúngico.
Introduction
Candida glabrata é um patógeno encontrado cada vez mais importância como uma espécie que apresenta resistência as azóis bem mais recentemente, como o echinocandins1,2,3. Ao contrário do diploide c. albicans, o genoma haploide de c. glabrata pode permitir adquirir mutações e desenvolver resistência a múltiplas drogas mais facilmente. Co resistência para ambas as classes de drogas também tem sido relatado4. Portanto, avaliação precoce de susceptibilidade e detecção de resistência a drogas em c. glabrata são cruciais para a terapia correta, orientada, bem como no contexto da mordomia antifúngico para limitar os condutores de resistência antimicrobiana1 , 5 , 6. estabelecimento de um fluxo de trabalho eficiente para rapidamente detectar a presença de mutações confirmação ligado a biomarcadores de resistência em isolados resistentes irá também ajudar a melhorar a prescrever as decisões e os resultados clínicos.
Susceptibilidade é geralmente avaliada pela medição de concentração inibitória mínima (CIM), que é definida como a menor concentração da droga que resulta em uma redução significativa no crescimento de um microorganismo em comparação com o de um crescimento de drogas controle. Os clínicos e Laboratory Standards Institute (CLSI) e Comité Europeu em testes de susceptibilidade aos antimicrobianos (EUCAST) têm como padrão susceptibilidade, métodos de ensaio para determinação da MIC mais exata e consistente7, 8. No entanto, o utilitário de antifúngico MIC permanece limitado, especialmente para o echinocandins, em particular com relação a comparações interlaboratoriais onde metodologias variadas e condições são usadas9. Há também correlação incerta de microfones com resposta ao tratamento echinocandin e incapacidade de distinguir WT (ou sensíveis) isolados daqueles abrigando FKS mutações (echinocandin-resistentes)10,11. Apesar da disponibilidade de confirmação single-gene PCRs e Sanger sequenciamento dos marcadores de resistência antifúngicos, realização de resultados é muitas vezes adiada devido à falta de detecção simultânea de múltiplos resistência marcadores5,12. Daí, a deteção simultânea de mutações de resistência-conferindo em locais diferentes no genoma, habilitado por análise baseada no sequenciamento do genoma inteiro, oferece vantagens significativas sobre as abordagens atuais.
Genoma de sequenciamento (WGS) foi implementado com sucesso para controlar a transmissão da doença durante surtos, bem como uma abordagem para a resistência de avaliação e drogas de risco todo o genoma testes em bactérias e vírus13. Recentes avanços na tecnologia de sequenciamento de ácidos nucleicos fizeram o sequenciamento do genoma inteiro (WGS) de patógenos em um turn-around-time clinicamente acionável tanto técnica e economicamente viável. Sequenciamento de DNA oferece importantes vantagens sobre outros métodos de identificação do patógeno e caracterização empregadas em laboratórios de microbiologia14,15,16. Primeiro, ele fornece uma solução universal com qualidade, velocidade e alto rendimento. Sequenciamento pode ser aplicado a qualquer um dos microrganismos e permite economias de escala nos laboratórios locais ou regionais. Em segundo lugar, que produz dados em um formato de 'futuro' passível de comparação aos níveis nacionais e internacional. Finalmente, a potencial utilidade do WGS na medicina tem sido aumentada pelo rápido crescimento das bases de dados públicas contendo genomas de referência, que podem ser vinculadas a bases de dados equivalentes que contêm metadados adicionais clínicos e epidemiológicos17 ,18.
Estudos recentes têm demonstrado a utilidade da GTS para identificação de marcadores de resistência antifúngicos de isolados clínicos de Candida spp. 10 , 19 , 20. isto é principalmente devido à disponibilidade de sequenciadores de bancada de alta produtividade, dutos de Bioinformática estabelecida e diminuindo o custo do sequenciamento de21,22. A vantagem do WGS fúngicas sobre Sanger sequenciamento é que WGS permite sequenciamento de genomas múltiplas em uma única corrida. Além disso, GTS de genomas de Candida pode identificar mutações romance em alvos de drogas, rastrear a evolução genética e o surgimento de tipos de sequência clinicamente relevantes de22,20,23. Mais importante, em casos de multirresistência intrínseca, WGS pode auxiliar na deteção adiantada de mutações de resistência-conferindo antes da seleção de tratamento22,24.
Aqui, examinamos a viabilidade do WGS-habilitado o rastreio de mutações associadas com resistência de droga para diferentes classes de agentes antifúngicos. Apresentamos uma metodologia para a implementação do WGS do usuário final e perspectivas do laboratório de Micologia diagnóstica. Foram incluídos nesta análise três isolar pares cultivadas de três casos clínicos separados no qual em vitro resistência à echinocandins e 5-flucitosina desenvolvido ao longo do tempo após o tratamento antifúngico.
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Protocol
Nenhuma aprovação ética foi necessária para este estudo.
1. a subcultura e inóculo preparação para Candida glabrata
- Selecione um painel de isolados de C.glabrata a ser estudado, que também deve incluir pelo menos um c. glabrata americano tipo cultura Collection (ATCC) com padrão de susceptibilidade conhecido.
- Subcultura um isolado tocando uma única colônia com uma ansa de plástico descartável estéril e estrias em ágar de um meio de Sabouraud dextrose (ASD) placa8.
- Incube a placa SDA por 24-48 h a 35 ° C, para uma cultura pura de isolado com bom crescimento.
2. determinação da susceptibilidade
- Uso uma ansa de plástico descartável estéril para escolherem um recém repicagem c. glabrata colônias de 4-5 de aproximadamente 1 mm de diâmetro isolar na placa do SDA. Resuspenda em 3 mL de água destilada estéril. Misture bem pipetando suave para obter a suspensão uniforme.
- Ajuste a densidade de células de McFarland 0,5 que equivale a 1 x 106 a 5 x 106 células/mL, usando um densitômetro 8.
- Realizar testes de sensibilidade usando ensaio comercial (ver tabela de materiais e reagentes) em todos os c. glabrata isola seguindo as instruções do fabricante. Interpretar a susceptibilidade dos isolados com base em microfones resultantes de drogas antifúngicas de acordo com as diretrizes do CLSI e preparar o relatório (tabela 1)8.
3. genômica extração de DNA para sequenciação
- Resuspenda um loopful das colônias de uma placa SDA recém crescida em 300 µ l de 50 mM EDTA em um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 40 µ l de zymolyase (10 mg/mL) para a suspensão e suavemente a pipeta 5 vezes até que a suspensão é uniforme.
- Incube a amostra a 37 ° C, durante 1-2 h digerir a parede celular. Esfriar em temperatura ambiente por 5 min.
- Centrifugar a suspensão de 14.000 × g por 2 min e remova cuidadosamente o sobrenadante.
- Extrair DNA genômico, seguindo diretrizes de kit de extração de DNA (ver tabela de materiais).
- Ressuspender extraído pellet de DNA em 50 µ l de tampão Tris (pH 7,5-8,5) em vez de eluição buffer fornecido no kit de 10 mM.
- Verificar a pureza do DNA por medição da densidade óptica (d) no 260/280 nm25.
4. genomic quantificação de DNA
- Preparar um 1x Tris EDTA (TE) buffer fornecido no kit de ensaio com base nas orientações do fabricante para o ensaio de fluorescência (ver tabela de materiais).
- Dilua a amostra de DNA adicionando 2 µ l a 98 µ l de 1 x buffer de ensaio TE (volume final de 100 µ l, diluição fator 01:50) em uma placa de 96 bem descartável. Esta etapa de diluição pode ser executada ou manualmente usando uma pipeta multicanal ou pelo líquido automatizado, manipulação de estação de trabalho.
- Preparar a escala de padrões diluindo o ADN do lambda (100 µ g/mL) fornecido no kit de ensaio de fluorescência (tabela 2) e incluem para medição juntamente com amostras.
- Adicione 100 µ l do corante fluorescente a 100 µ l diluído amostras de DNA e padrões para a reação. Incube durante 5 min à temperatura ambiente, protegida da luz.
- Medir a fluorescência das amostras com base nas orientações do fabricante.
- Traçar a curva padrão utilizando as leituras de fluorescência e calcular a concentração original das amostras de DNA.
- Determine o volume de DNA e 10 mM de tampão Tris (pH 8) a ser adicionado para ajustar a concentração de DNA de 0,2 ng / µ l.
- Execute as diluições de DNA usando líquido automatizado, manipulação de estação de trabalho. Esta etapa pode ser também conseguida pipetagem manual.
5. preparação de biblioteca de DNA
Nota: Preparação de biblioteca e sequenciamento foi realizada seguindo as orientações fornecidas pela empresa (Figura 1A) e protocolos do fabricante (ver tabela de materiais).
- Tagmentation e PCR amplificação
- Rotule uma nova placa de parede fina rígida de 96 poços.
- Adicionar 5 µ l de DNA de entrada de quantificados em 0,2 ng / µ l (1 ng no total) para cada amostra bem da placa.
- Adicionar 10 µ l de tampão de tagmentation e 5 µ l de tampão de amplificação para cada bem contendo DNA e pipetar delicadamente para misturar. A placa do selo com um selo de placa adesiva.
- Coloque a placa em um termociclador e execute o seguinte programa PCR: 55 ° C por 5 min e segure a 10 ° C. Quando a amostra chega a 10 ° C, proceda imediatamente para neutralizar.
- Adicionar 5 µ l de tampão de neutralização para a placa para neutralizar a reação de amplicons, e pipetar suavemente a mistura. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
- Adicione 15 µ l de indexação PCR mastermix para as amostras.
- Use uma caixa de tubos de cartilha de índice disponíveis para uma configuração de formato da placa de 96 poços, para que cada amostra Obtém uma combinação única de índices com base em modelo de índice (tabela 3).
- Organizar os tubos de cartilha de índice na cremalheira de placa do índice (Figura 1B) usando a ordem fornecida no modelo na tabela 3 e gravar a posição dos índices no modelo.
- Coloque a placa de tagmentation com adicionado PCR mastermix sobre a cremalheira de placa do índice com os tubos de índice em ordem.
- Pôr tubos de cartilha 1 índice em arranjo vertical, índice primário 2 tubos e arranjo horizontal sobre o rack do índice. Usando uma pipeta multicanal, cuidadosamente Adicione 5 µ l de primers de índice para cada amostra.
- Substitua o velhas tampas dos tubos de índice com tampões novos para evitar contaminação cruzada entre os índices.
- Selar a placa usando aferidores de placa de 96 poços claros e executar a segunda PCR como segue: 95 ° C por 30 s, 12 ciclos de 95 ° C por 10 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s e 72 ° C por 5 min.
- Limpeza do PCR
- Transferir o produto PCR para a limpeza do PCR, da placa de tagmentation para uma placa de fundo (ver tabela de materiais).
- Vórtice a solução comercial grânulos magnético (ver tabela de materiais) com base nas instruções do fabricante e adicionar 30 µ l de grânulos para cada produto do PCR da placa de fundo.
- Agitar a placa num agitador microplacas a 1800 rpm por 2 min e incubar a temperatura ambiente sem tremer por 5 min.
- Coloque a placa em um carrinho magnético por 2 min até que o sobrenadante se dissipou.
- Desprezar o sobrenadante cuidadosamente com a placa ainda no stand magnético.
- Adicione 200 µ l de etanol a 80% acabadas com a placa sobre o suporte magnético.
- Incubar a placa magnética depor por 30 s e cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante sem perturbar os grânulos.
- Repetir a etapa de lavagem e permitem que os grânulos secar ao ar por 15 min. remover excesso etanol, se for o caso.
- Retire a placa do suporte magnético e adicionar 52,5 µ l de tampão de ressuspensão de grânulos.
- Agitar a placa num agitador microplacas a 1800 rpm por 2 min e incubar a temperatura ambiente por 2 min sem tremer.
- Colocar a placa sobre o suporte magnético e permitir que o sobrenadante limpar.
- Usando uma pipeta multicanal, cuidadosamente transferi 50 µ l do sobrenadante da placa de limpeza para uma nova placa rígida.
- Normalização de biblioteca
- Descongele os reagentes de normalização de biblioteca de acordo com as orientações do fabricante (ver tabela de materiais).
- Transferi 20 µ l do sobrenadante da placa de limpeza para uma nova placa de fundo.
- Adicionar 45 µ l de suspensão magnética do grânulo e a placa com um aferidor de placa do selo.
- Agite a placa num agitador microplacas a 1800 rpm por 30 min. Este tempo de incubação é crítico e não deve ser excedido.
- Colocar a placa em um carrinho magnético por 2 min e confirmar que o sobrenadante liberou (Figura 1B).
- Remover e descartar o sobrenadante em um recipiente adequado de resíduos perigosos com a placa ainda no stand magnético.
- Retire a placa do suporte magnético e lave os grânulos com tampão de lavagem 45 µ l.
- Agite a placa com o tampão de lavagem num agitador microplacas a 1800 rpm por 5 min.
- Coloque a placa magnética depor por 2 min e descarte sobrenadante quando verifica-se clara.
- Retire a placa do suporte magnético e repetir a lavagem com tampão de lavagem.
- Retire a placa do suporte magnético e adicione 30 µ l de 0,1 N de NaOH.
- Agitar a placa com 0,1 N de NaOH num agitador microplacas a 1800 rpm por 5 min e coloque a placa sobre o carrinho magnético por 2 min ou até que o líquido é claro.
- Adicione 30 µ l de tampão de eluição para cada poço de uma nova placa de 96 poços rígida parede fina final biblioteca normalizado.
- Transferi 30 µ l do sobrenadante da placa de normalização para placa final biblioteca normalizado para fazer volume final 60 µ l. As bibliotecas são agora prontas a ser sequenciado.
- Determinação da concentração de biblioteca de DNA por qPCR
- Descongele o mastermix, iniciadores e padrões fornecidos no kit de qPCR de acordo com as orientações do fabricante (ver tabela de materiais).
- Combinar o PCR mastermix de reagente e primer fornecidos no kit de qPCR seguindo as instruções do fabricante e alíquotas podem ser armazenadas a-20 ° C.
- Para determinar a concentração de biblioteca de DNA, fazer uma diluição de 1/8000 das bibliotecas de DNA usando 10 mM de tampão Tris (pH 8) através da realização de uma diluição de 1: 100 (1,5 µ l DNA biblioteca para 148,5 tampão Tris de µ l) seguido por uma diluição de 1:80 (2 µ l de 1: 100 para 158 tampão Tris de µ l).
- Agitar a placa de diluição a 700 rpm pelo menos 1 min e em seguida centrifugar a 14000 × g por 1 min.
- Prepare 20 µ l de reação de PCR final misturando 4 µ l de biblioteca de DNA diluída ou padrões de DNA e 16 µ l de mastermix.
- Realizar a PCR, seguindo as configurações do fabricante em thermocycler: 95 ° C por 5 min, 35 ciclos de 95 ° C por 30 s e 60 ° C durante 45 s e final 65 ° C e 95 ° C, para análise de curva de derreter.
- Obter os valores de Ct das bibliotecas de DNA de amostra e padrões do thermocycler qPCR.
- Gera uma curva padrão de valor Ct dos padrões (Figura 2). Defina o intervalo superior e inferior do QC ± 3 ciclos da média. Por exemplo, se o valor de Ct médio é de 13 ciclos faixa QC é entre 10 e 16 ciclos.
- Determine as concentrações de biblioteca individual e média (ALC) da curva padrão e valores de Ct.
- Determine o volume de bibliotecas em pool totais (PAL) para ser usado com base no cálculo dado abaixo para sequenciamento final, Considerando que a concentração de biblioteca de destino é entre 1,4-13:08.
Nota: Média de concentração de biblioteca Obtida de qPCR = ALC; Total de bibliotecas em pool (PAL) = ALC / 2; Desnaturado PAL (DAL) = PAL * 0.666
Dependendo do volume do DAL misturada com buffer, é a concentração da biblioteca a ser adicionado para a célula de fluxo. Por exemplo, se 65 µ l de biblioteca é adicionado a 835 µ l de tampão, depois desta diluição (Dil 1) 195 é adicionado a um volume total de 1300 µ l: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = concentração Final (deve ser entre 1,4-13:08)
6. Biblioteca pool e iniciar sequenciamento em sequenciador Benchtop
- Cartucho de reagente de degelo de acordo com as orientações do fabricante. Tirar uma nova célula de fluxo da embalagem de armazenamento de 4 ° C e trazer a temperatura atleast 30 min antes de sequenciamento. Tirar o cartucho do amortecedor e sequenciamento prechill buffer antes do uso (ver tabela de materiais).
- Prepare uma biblioteca de controle pela mistura de 5 µ l de biblioteca (1 nM) e 5 µ l de 0,2 N de NaOH. Vórtice brevemente e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar a biblioteca de controle em cadeias simples.
- Adicione 5 µ l de 200 mM Tris-HCl, pH 7 e vortex. Juntar 235 µ l de tampão de sequenciamento prechilled e misture delicadamente. O volume total é de 250 µ l, com concentração final de controle biblioteca em 20 pM.
- Bibliotecas de DNA de piscina através da transferência de 5 µ l de cada biblioteca de amostra a ser sequenciado da placa final biblioteca normalizado em um tubo único vincular baixa 1,5 mL.
- Adicione 30 µ l de biblioteca em pool e 30 µ l de 0,2 N NaOH para desnaturar as bibliotecas em outro tubo de ligação de baixa.
- Vórtice o bind-baixa do tubo e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar as bibliotecas em cadeias simples.
- Adicione 30 µ l de 200 mM Tris-HCl, pH 7 ao tubo com bibliotecas desnaturados para neutralizar a reação.
- Adicione 65 µ l de suspensão de bibliotecas desnaturado neutralizados e 835 µ l de tampão de sequenciamento pre-refrigerados e vórtice para misturar bem.
- Em um tubo de ligação baixa final combinar o seguinte: 195 µ l de bibliotecas desnaturadas neutralizadas, 1,30 µ l de biblioteca de controle e 1103.70 µ l de tampão de sequenciamento. Misture corretamente.
- Carrega a mistura final biblioteca (1300 µ l) para o local designado no cartucho de reagente.
- Set-up o sequenciamento execute inserindo detalhes do projeto e amostra no Sequencer designado site seguindo as diretrizes.
- Iniciar sequência seguindo orientações. Carregar a pilha de fluxo, reagente cartucho com bibliotecas e cartucho de reserva no sequencer de bancada.
- Gravar números de lote, de todos os kits de reagentes e cartuchos usados no sequenciamento.
7. dados baixar do site de sequenciamento
- Baixe arquivos FASTQ, seguindo as instruções do fabricante, fornecidas no site.
- Para uma boa qualidade, verificar que a percentagem de Q30 é ≥ 75% e cluster de densidade é entre 170-280 K/mm2 com ideal em 200-210 K/mm2 (tabela 4).
8. análise de dados de sequenciamento de
- Importar arquivos FASTQ de amostras sequenciadas no pacote de software integrado de análise de dados (consulte a tabela de materiais).
- Criar um fluxo de trabalho de sequenciamento em software, adicionando recursos de lista ou seja aparar, mapeamento de referência (referência selecione genoma), realinhamento local e análise variante (Figura 3A) usando as configurações listadas na tabela 5.
- Executar o fluxo de trabalho, selecionando uma única amostra ou um lote de amostra FASTQ arquivos e salvar arquivos de saída nas pastas exemplo designado.
- Gere relatório para profundidade de cobertura de sequência, regiões mapeadas e lista de variantes estruturais no genoma (Figura 3B).
- Use a lista de variantes estruturais para procurar polimorfismos não sinônimos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes que conferem resistência e virulência.
- Prepare o relatório listando SNP localização, gene e número de isolados resistentes ou suscetíveis (quadro 6).
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Representative Results
Treze c. glabrata , compreendendo isolados de c. glabrata ATCC 90030 e 12 do laboratório de referência de micologia clínica (isola CMRL1 para CMRL12), Hospital Westmead, Sydney foram estudados (tabela 1). Estes incluíram três pares de isolados CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 e CMRL-5/CMRL-6 obtidos antes e após a terapia antifúngica com sem ligações epidemiológicas entre eles 24 (tabela 1).
Os microfones foram determinados utilizando o ponto de interrupção interpretativo do CLSI para nove agentes antifúngicos, anfotericina (AMB), Anidulafungin (ANI), micafungina (MIF), caspofungina (CAS), 5-flucitosina (5-FC), posaconazol (POS), voriconazol (VRC), itraconazol ( ITR) e fluconazol (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 e Candida krusei ATCC 6258 foram usados como cepas de controle de qualidade. Entre o par isolado, CMRL-1 e CMRL-2, o segundo lugar isolado CMRL-2 foi resistente a caspofungina (MIC 8 vs 0,12 mg/L, tabela 1). CMRL-2 também teve semelhantes aumentos proporcionais nos microfones de anidulafungin e micafungina (≥ 0,5 mg/L) resultando em vitro resistência para todos os três echinocandins24. Da mesma forma, isolar CMRL-4 tinha desenvolvido resistência echinocandin do que aqueles de isolado CMRL-3 (tabela 1). Entre o terceiro par, isolar CMRL-6 teve um MIC 5-flucitosina (> 64 vs 0,06 mg/L)24. Ambos esses pares isolados foram sensíveis/selvagem-tipo (WT) de outros agentes antifúngicos testados. Isolar CMRL-6 e CMRL-12 foram encontrados para ser resistente ou não-WT para todos os azóis. CMRL-7 foi resistente ao fluconazol e não-WT para voriconazol (tabela 1). C. glabrata ATCC 90030 e isolados CMRL-8 CMRL-11 foram suscetíveis/WT suscetível a todos os agentes antifúngicos24.
GTS de 13 isolados foi realizada usando o sequenciador de bancada. Em média, uma corrida de sequenciamento de saída mid, rendeu em torno de 27-40 GB de dados com uma taxa de erro entre 0.5-1.4%. A percentagem média Q30 obtidos normalmente era ao redor 80-85%. A pilha de fluxo aglomerado densidade (K/mm2) variou entre 200-250 (tabela 4). Os dados de sequência primas deste estudo tenham sido depositados no NCBI sequência leitura arquivo (SRA) sob o número de projeto PRJNA310057. 98% de sequenciamento leituras mapeadas para o genoma de referência de c. glabrata (estirpe CBS138) através da análise em software de análise de dados integrado. A média Leia cobertura de profundidade foi 75 x com média ler comprimento de 143-BP estrutural detecção de variante identificada mais de 50, 000 SNPs por isolado. Particularmente, ao analisar os pares de estirpe CMRL1/CMRL-2, SNPs totais encontrados em cada isolado foram em torno de 79.000, para CMRL-3/CMRL-4, o número total de SNPs eram em torno de 60.000 e para CMRL-5/CMRL-6, mais de 56.000 quando comparado com CBS13824. A diferença SNP quando comparados entre isolados em um par de estirpe foi menor que 25.
Com base no perfil de susceptibilidade dos isolados, conhecida resistência biomarcadores foram selecionados para análise24, particularmente, FKS1, FKS2 e FKS3 (resistência de echinocandin), FCY1 e FCY2 (5- flucitosina resistência) e ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 e CgFLR1 (resistência de azólicos). Os genes foram verificados por mutações conhecidas e a frequência das ocorrências do SNP. Somente não-sinónimas SNPs em genes com ler cobertura de profundidade de ≥ 20 ou seja, SNPs de alta qualidade (hq-SNPs) foram especificamente estudadas.
Notavelmente, FKS mutações foram identificadas no genoma de ambos os isolados resistentes ao echinocandin24. Dos dois primeiros pares, os isolados resistentes echinocandin, CMRL-2 abrigou uma única mutação de FKS2 S629P e CMRL-4, a mutação FKS2 S663P (tabela 6). Do terceiro par, um SNP no FCY2 (Ala237Thr) foi encontrado em CMRL-5 (5-flucitosina suscetível) e CMRL-6 (resistente) (tabela 6). No entanto, SNPs em FCY2 também foram encontrados em outros fenotipicamente-WT isolados (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. Isolados CMRL-6 e CMRL-12 foram notáveis por sua pan-AZOL resistente/não-personagem WT e tinha SNPs em CgCDR1 (codificação de bombas de efluxo azólicos) e CgPDR1 (o fator de transcrição que regulam as bombas de efluxo de codificação) (tabela 6)26 ,,27. A presença de mutações em outro gene de bomba de efluxo, CgFLR1 ocorreu em ambos os isolados AZOL-sensíveis e resistente a azólicos26,28. Investigação por SNPs dentro do ERG9 (codificação esqualeno sintase) revelou mutações mas havia sem mutações identificadas no ERG1124.
Análise WGS também revelou vários SNPs não-sinônimo de genes de adesão de parede celular de Candida ou seja, EPA1, EPA6, PWP2 e PWP5. Mutações EPA6 estiveram presentes em 9/12 isolados. SNPs em PWP2 e PWP5 também estavam presentes em quase todos os isolados, exceto isolados CMRL-1 e CMRL-1124.
| Isolar | AMB | ANI | MIF | CAS | 5-FC | POS | VRC | ITR | FLC | Interpretação da susceptibilidade | Genes que conferem resistência identificada por WGS | ||
| CMRL-1 | 0,5 | 0,03 | < 0,008 | 0.12 | < 0,06 | 0,5 | 0.12 | 0.25 | 8 | Suscetíveis a todos | - | ||
| CMRL-2 | 0,5 | 1 | 1 | 8 | < 0,06 | 0.25 | 0,06 | 0.12 | 4 | Resistente a todos os echinocandins apenas | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0.25 | 0.015 | 0.015 | 0.12 | < 0,06 | 1 | 0.25 | 0,5 | 8 | Suscetíveis a todos | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0,06 | 0,5 | 0.12 | 0.25 | 8 | Resistente a todos os echinocandins apenas | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0.12 | 0.015 | 0.12 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Suscetíveis a todos | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0,06 | 0.015 | 0,06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | Resistente aos azóis e 5-FC | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0.25 | 0,06 | 0.015 | 0.25 | < 0,06 | 1 | 8 | 0,5 | 256 | Resistente a todos os azóis apenas | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0,5 | 0,03 | 0,008 | 0,06 | < 0,06 | 0,5 | 0.25 | 0.25 | 4 | Suscetíveis a todos | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0,03 | 0.015 | 0.25 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 1 | 16 | Suscetíveis a todos | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0,03 | < 0,008 | 0,5 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Suscetíveis a todos | - | ||
| CMRL-11 | 0,5 | 0,03 | < 0,008 | 0,03 | < 0,06 | 0,5 | 0.25 | 0,5 | 8 | Suscetíveis a todos | - | ||
| CMRL-12 | 0,5 | 0,03 | 0.015 | 0,06 | < 0,06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Resistente a todos os azóis apenas | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0,03 | 0.015 | 0,06 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 8 | Suscetíveis a todos | - | ||
| Abreviaturas: MIC, concentração inibitória mínima; AMB, anfotericina B; ANI, anidulafungin; CAS, caspofungina; FLC, fluconazol; ITR, itraconazol; MIF, micafungina; POS, posaconazol; VRC, voriconazol; 5-FC, 5-flucitosina. | |||||||||||||
Tabela 1. Susceptibilidade in vitro de 13 Candida glabrata isola incluindo CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 e CMRL-5/CMRL-6 isolar pares obtidos antes e após a terapia antifúngica
| Normas | Volume padrão de DNA (μL) | 1 tampão TE X | Reagente (μL) | Total em placa de 96 poços (μL) | Concentração final de DNA (ng/mL) |
| STD-Pico 1 | 8 (padrão DNA tubo 100 µ g/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| STD-Pico 2 | 10 (a partir de 1 Std-Pico) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| STD - Pico 3 | 5 (a partir de 1 Std-Pico) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| STD-Pico 4 | 2 (a partir de 1 Std-Pico) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| STD-Pico 5 | 10 (Std-Pico 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| Em branco | - | 100 | 100 | 200 | Em branco |
Tabela 2. Protocolo para a preparação de padrões para a geração de curva padrão para quantificação de DNA
Figura 1 . Fluxo de trabalho de sequenciamento: (A) um resumo das principais etapas analíticas para preparação de biblioteca e sequenciamento em um sequenciador de bancada. (B) componentes importantes para a preparação de biblioteca de DNA como (da esquerda para a direita) índice de placa cremalheira para arranjo de índices durante a indexação e rack magnético com placa de 96 poços profundos para grânulo magnético baseado limpar de bibliotecas de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Índice Conjunto A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | Amostra 1 | Amostra 2 | Amostra 3 | Amostra 4 | Amostra 5 | Amostra 6 | Amostra 7 | Amostra 8 | Amostra 9 | Amostra 10 | Amostra 11 | Amostra 12 |
| B | S503 | Amostra 13 | Amostra 14 | Amostra 15 | Amostra de 16 | Amostra 17 | Amostra 18 | Exemplo 19 | Amostra de 20 | Amostra 21 | Amostra 22 | Amostra 23 | Amostra de 24 |
| C | S505 | Amostra de 25 | Amostra de 26 | Amostra de 27 | Amostra de 28 | Amostra 29 | Amostra 30 | Amostra de 31 | Amostra de 32 | Amostra de 33 | Amostra de 34 | Amostra 35 | Amostra de 36 |
| D | S506 | Amostra 37 | Amostra de 38 | Amostra de 39 | Amostra de 40 | Amostra de 41 | Amostra 42 | Amostra de 43 | Amostra de 44 | Amostra 45 | Amostra de 46 | Amostra de 47 | Amostra 48 |
| E | S507 | Amostra de 49 | Amostra de 50 | Amostra de 51 | Amostra de 52 | Amostra de 53 | Amostra 54 | Amostra 55 | Amostra de 56 | Amostra 57 | Amostra de 58 | Amostra 59 | Amostra 60 |
| F | S508 | Amostra de 61 | Amostra de 62 | Amostra 63 | Amostra de 64 | Amostra de 65 | Amostra 66 | Amostra de 67 | Amostra de 68 | Amostra 69 | Amostra de 70 | Amostra 71 | Amostra de 72 |
| G | S510 | Amostra de 73 | Amostra de 74 | Amostra de 75 | Amostra de 76 | Amostra de 77 | Amostra 78 | Amostra de 79 | Amostra de 80 | Amostra de 81 | Amostra 82 | Amostra 83 | Amostra de 84 |
| H | S511 | Amostra 85 | Amostra de 86 | Amostra 87 | Amostra 88 | Amostra de 89 | Amostra de 90 | Amostra 91 | Amostra de 92 | Amostra de 93 | Amostra de 94 | Amostra de 95 | Amostra 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Índice conjunto B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Amostra 1 | Amostra 2 | Amostra 3 | Amostra 4 | Amostra 5 | Amostra 6 | Amostra 7 | Amostra 8 | Amostra 9 | Amostra 10 | Amostra 11 | Amostra 12 |
| B | S503 | Amostra 13 | Amostra 14 | Amostra 15 | Amostra de 16 | Amostra 17 | Amostra 18 | Exemplo 19 | Amostra de 20 | Amostra 21 | Amostra 22 | Amostra 23 | Amostra de 24 |
| C | S505 | Amostra de 25 | Amostra de 26 | Amostra de 27 | Amostra de 28 | Amostra 29 | Amostra 30 | Amostra de 31 | Amostra de 32 | Amostra de 33 | Amostra de 34 | Amostra 35 | Amostra de 36 |
| D | S506 | Amostra 37 | Amostra de 38 | Amostra de 39 | Amostra de 40 | Amostra de 41 | Amostra 42 | Amostra de 43 | Amostra de 44 | Amostra 45 | Amostra de 46 | Amostra de 47 | Amostra 48 |
| E | S507 | Amostra de 49 | Amostra de 50 | Amostra de 51 | Amostra de 52 | Amostra de 53 | Amostra 54 | Amostra 55 | Amostra de 56 | Amostra 57 | Amostra de 58 | Amostra 59 | Amostra 60 |
| F | S508 | Amostra de 61 | Amostra de 62 | Amostra 63 | Amostra de 64 | Amostra de 65 | Amostra 66 | Amostra de 67 | Amostra de 68 | Amostra 69 | Amostra de 70 | Amostra 71 | Amostra de 72 |
| G | S510 | Amostra de 73 | Amostra de 74 | Amostra de 75 | Amostra de 76 | Amostra de 77 | Amostra 78 | Amostra de 79 | Amostra de 80 | Amostra de 81 | Amostra 82 | Amostra 83 | Amostra de 84 |
| H | S511 | Amostra 85 | Amostra de 86 | Amostra 87 | Amostra 88 | Amostra de 89 | Amostra de 90 | Amostra 91 | Amostra de 92 | Amostra de 93 | Amostra de 94 | Amostra de 95 | Amostra 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Índice conjunto C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | Amostra 1 | Amostra 2 | Amostra 3 | Amostra 4 | Amostra 5 | Amostra 6 | Amostra 7 | Amostra 8 | Amostra 9 | Amostra 10 | Amostra 11 | Amostra 12 |
| B | S515 | Amostra 13 | Amostra 14 | Amostra 15 | Amostra de 16 | Amostra 17 | Amostra 18 | Exemplo 19 | Amostra de 20 | Amostra 21 | Amostra 22 | Amostra 23 | Amostra de 24 |
| C | S516 | Amostra de 25 | Amostra de 26 | Amostra de 27 | Amostra de 28 | Amostra 29 | Amostra 30 | Amostra de 31 | Amostra de 32 | Amostra de 33 | Amostra de 34 | Amostra 35 | Amostra de 36 |
| D | S517 | Amostra 37 | Amostra de 38 | Amostra de 39 | Amostra de 40 | Amostra de 41 | Amostra 42 | Amostra de 43 | Amostra de 44 | Amostra 45 | Amostra de 46 | Amostra de 47 | Amostra 48 |
| E | S518 | Amostra de 49 | Amostra de 50 | Amostra de 51 | Amostra de 52 | Amostra de 53 | Amostra 54 | Amostra 55 | Amostra de 56 | Amostra 57 | Amostra de 58 | Amostra 59 | Amostra 60 |
| F | S520 | Amostra de 61 | Amostra de 62 | Amostra 63 | Amostra de 64 | Amostra de 65 | Amostra 66 | Amostra de 67 | Amostra de 68 | Amostra 69 | Amostra de 70 | Amostra 71 | Amostra de 72 |
| G | S521 | Amostra de 73 | Amostra de 74 | Amostra de 75 | Amostra de 76 | Amostra de 77 | Amostra 78 | Amostra de 79 | Amostra de 80 | Amostra de 81 | Amostra 82 | Amostra 83 | Amostra de 84 |
| H | S522 | Amostra 85 | Amostra de 86 | Amostra 87 | Amostra 88 | Amostra de 89 | Amostra de 90 | Amostra 91 | Amostra de 92 | Amostra de 93 | Amostra de 94 | Amostra de 95 | Amostra 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Índice do conjunto D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | Amostra 1 | Amostra 2 | Amostra 3 | Amostra 4 | Amostra 5 | Amostra 6 | Amostra 7 | Amostra 8 | Amostra 9 | Amostra 10 | Amostra 11 | Amostra 12 |
| B | S515 | Amostra 13 | Amostra 14 | Amostra 15 | Amostra de 16 | Amostra 17 | Amostra 18 | Exemplo 19 | Amostra de 20 | Amostra 21 | Amostra 22 | Amostra 23 | Amostra de 24 |
| C | S516 | Amostra de 25 | Amostra de 26 | Amostra de 27 | Amostra de 28 | Amostra 29 | Amostra 30 | Amostra de 31 | Amostra de 32 | Amostra de 33 | Amostra de 34 | Amostra 35 | Amostra de 36 |
| D | S517 | Amostra 37 | Amostra de 38 | Amostra de 39 | Amostra de 40 | Amostra de 41 | Amostra 42 | Amostra de 43 | Amostra de 44 | Amostra 45 | Amostra de 46 | Amostra de 47 | Amostra 48 |
| E | S518 | Amostra de 49 | Amostra de 50 | Amostra de 51 | Amostra de 52 | Amostra de 53 | Amostra 54 | Amostra 55 | Amostra de 56 | Amostra 57 | Amostra de 58 | Amostra 59 | Amostra 60 |
| F | S520 | Amostra de 61 | Amostra de 62 | Amostra 63 | Amostra de 64 | Amostra de 65 | Amostra 66 | Amostra de 67 | Amostra de 68 | Amostra 69 | Amostra de 70 | Amostra 71 | Amostra de 72 |
| G | S521 | Amostra de 73 | Amostra de 74 | Amostra de 75 | Amostra de 76 | Amostra de 77 | Amostra 78 | Amostra de 79 | Amostra de 80 | Amostra de 81 | Amostra 82 | Amostra 83 | Amostra de 84 |
| H | S522 | Amostra 85 | Amostra de 86 | Amostra 87 | Amostra 88 | Amostra de 89 | Amostra de 90 | Amostra 91 | Amostra de 92 | Amostra de 93 | Amostra de 94 | Amostra de 95 | Amostra 96 |
Tabela 3. Modelo de arranjo de índice diferente
Figura 2 : Um padrão gráfico gerado com os valores de Ct de normas. Use os valores de interceptação e a inclinação da curva padrão para determinar a concentração média de biblioteca de valor de Ct de bibliotecas de amostra em duplicatas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Métricas de | Valores padrão | Valores obtidos (média) |
| Rendimento | 32.5-50 Gb por meio da saída | 42 Gb por meio da saída |
| 100-130 Gb para saída de alta | 120 Gb de alta saída | |
| Percentagem de Q30 | ≥ 75% | 80% |
| Densidade do aglomerado | 170-230 K/mm2, ideal em 200K/mm2 | 210 K/mm2. |
| Filtros de passagem de clusters | > 70% | 89.09% |
| Intensidade por ciclo | Acima de 1000 para cada telha em célula de vazão | Acima de 1500 para cada telha em célula de vazão |
| Taxa de erro | Abaixo de 1.5 | 1.4 |
Tabela 4. Métricas para um sequenciamento padrão executar no Benchtop Sequencer
Figura 3 : Software de análise de dados de sequenciamento. (A) criar um fluxo de trabalho desejado, incluindo filtragem de sequência, mapeamento de referência e de qualidade com base em detecção de variante. Execute o fluxo de trabalho selecionando arquivos FASTQ de amostra (individuais ou múltiplas amostras em lote). (B) lista de variantes estruturais, mostrando a posição de referência, cobertura, mudança de nucleotídeos e mudança de aminoácido obtidos para análise de sequências de amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1. corte as sequências | Configuração usada |
| Bases da guarnição | Configurações padrão |
| Filtrar em comprimento com número máximo de nucleotídeos em leituras | 1000 |
| Filtrar em comprimento com número mínimo de nucleotídeos em leituras | 50 |
| 2. mapeamento leituras para fazer referência | |
| Referência selecionada | CBS138 |
| Mascaramento de referência com o modo de máscara | Sem máscara |
| Opções de mapeamento | Configurações padrão |
| 3. local realinhamento | |
| Configurações de alinhamento | Configurações padrão |
| 4. qualidade com base em detecção de variante | |
| Raio de vizinhança | 5 |
| Contagem mínima de gap e incompatibilidade | 2 |
| Qualidade mínima do bairro | 15 |
| Qualidade mínima central | 20 |
| Filtros de leitura | Configurações padrão |
| Cobertura mínima | 4 |
| Frequência mínima variante (%) | 75 |
| Filtros de variantes | Configurações padrão |
| Máximo esperado de alelos (ploidia) | 2 |
| Código genético | Padrão |
Tabela 5. Parâmetros de fluxo de trabalho e as configurações do software
| Posição do nucleotídeo variante estrutural | Gene | Droga (s) | Encontrado em Número de Isolados |
Isolados resistentes | Isolados sensíveis | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
Tabela 6. Relatório de posição de variantes estrutural nos genes ligados à resistência a drogas antifúngicas encontrada no número de isolados de c. glabrata
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Discussion
Este estudo determinou a viabilidade, cronogramas aproximadas e precisão de detecção WGS-interativa de resistência às drogas em c. glabrata. O tempo de retorno (TAT) para a preparação de biblioteca e sequenciamento foi quatro dias e emissão de relatórios de dias de a dois resultados analisados. Isso se compara pelo menos uma quantidade similar TAT para ensaios de suscetibilidade de placas de cultura e Sanger sequenciamento significativamente maior número de amostras. Ao redor 30-90 c. glabrata genomas podem ser sequenciadas com base na capacidade de fluxo-célula, com 80-100% de cobertura de sequenciamento de sequenciamento. Desde o sequenciamento foi realizado em uma configuração de laboratório in-house WGS, os requisitos de custos/recursos neste estudo foi equivalente a custos correntes de Sanger ensaios de sequenciamento e baseada em investigação, com um custo estimado de AUD 80-100, por exemplo. Susceptibilidade de todos os isolados foram determinadas por um kit de ensaio comercial que foram lidos visualmente usando um espelho de leitura. Crescimento de cultura foi indicado pela mudança no indicador de crescimento colorimétrico de azul para rosa. MIC foi lido como o primeiro azul bem depois de uma série de rosa (crescimento) poços ou seja, a menor concentração do agente antifúngico que inibe o crescimento substancialmente. Para WGS, bibliotecas de DNA genômicas foram preparadas usando o kit de preparação de biblioteca. As bibliotecas isoladas foram quantificadas por qPCR. As bibliotecas quantificadas foram agrupadas para a sequência final executar executada no sequencer da bancada.
Em nossa análise, a presença de SNPs em genes que conferem resistência em isolados correlacionada com o elevado em vitro MIC contra as drogas. As mutaçõesS629P em FKS1 e S663P em FKS2 identificados foram claramente associadas com resistência à echinocandins. Ambas as mutações são conhecidas para conferir resistência fenotípica29,30. Sequenciamento de genoma-larga simultâneo também revelou mutações nos genes ligados à resistência de azólicos (CgPDR1, CgCDR1 e CgFLR1) e 5-flucitosina (gene FCY2) que estão associados com a resistência através de ativação / superexpressão como bombas de efluxo26,,27,28. No entanto, os efeitos de mutações em genes ligados a azólicos e 5-flucitosina resistência31 precisa ser confirmada pelo adicional funcional analisa para avaliar o nível de expressão do gene. Curiosamente, grande número de SNPs também foram encontrado na parede celular adesinas em todos os isolados de32,33. Mutações no gene de adesão EPA6, que codifica a formação de biofilmes, ocorreu relativamente frequentemente33. Além disso, isola CMRL-3, CMRL-4 e que faltava mutações em genes de resistência azólicos tinham SNPs não documentados em EPA1 e EPA624,34CMRL-8. No entanto, em geral, nenhuma associação específica entre os SNPs em microfones adesinas e droga podia ser encontrada devido ao baixo número de isolados de teste incluído.
A aplicação do WGS em micologia clínica exige a implementação do sistema de gestão de qualidade robusta. Alta qualidade genomic DNA e controle da qualidade postos de controle que acompanham cada passo no experimento é essencial para um bom resultado WGS. A pureza do DNA de c. glabrata amostra enviada para preparação de biblioteca pode ser validada usando o método de absorção de UV (absorvância a 260/280 nm e 260/230 nm25. Em nossa experiência, por c. glabrata DNA a 260/280 é esperado para estar dentro da faixa recomendada de 1,8-2 e 260/230 entre 2-2.2. Se extrai DNA não atender a esses requisitos de qualidade, purificação adicional pela precipitação do álcool etílico pode ser executada. Tagmentation é um passo essencial de adicionar sequências de código de barras único chamado primeiras demão índice assim como permitem a diferenciação da amostra múltiplas durante o sequenciamento (multiplexação). Portanto, no processo de indexação, extra cuidado deve ser tomado para evitar a contaminação cruzada entre os tubos de índice e amostras a fim de manter a exclusividade dos índices. Normalização no sequenciamento garante que quaisquer diferenças decorrentes em bibliotecas de DNA da amostra que podem apresentar viés em dados de sequenciamento é eliminada. Uma normalização passo usando que um talão com base limpar geralmente permite a remoção de excesso de fragmentos de DNA biblioteca e variações no tamanho da biblioteca que possam surgir durante a preparação da biblioteca. Portanto a incubação 30 min é crítica para densidade de cluster ideal. Densidade, que é a densidade dos clusters clonais de bibliotecas de amostra geradas pela amplificação maciça durante o sequenciamento influências dados qualidade como pontuações Q30 e saída total de dados de cluster. Enquanto underclustering pode dar dados de alta qualidade, também resultará em baixos dados de saída enquanto overclustering baixos escores de Q30. As bibliotecas de DNA devem ser livres de resíduo de grânulo magnética durante a limpeza do PCR e normalização como isso pode interferir na qualidade dos dados de sequenciamento. QPCR deve ser realizada pelo menos algumas bibliotecas de amostra representativa, incluindo uma estirpe de referência como um controle positivo (a cepa ATCC de c. glabrata neste caso) de um determinado conjunto de índices. Os valores médios de Ct devem ser entre 15-18 ciclos. Qualquer amostra dentro desta escala é considerada aceitável para a execução de sequenciamento. No entanto, se os valores de Ct são fora deste intervalo o qPCR deve ser repetido. Amostras às vezes podem falhar qPCR ou devido à baixa qualidade entrada DNA ou erro durante a preparação da biblioteca. Com base nos cálculos do controle positivo, a concentração mínima das bibliotecas que produzirá dados boa sequência deve ser estabelecida. Usando a concentração média das bibliotecas obtidos de qPCR, o volume da biblioteca final a ser adicionado para o sequenciamento pode ser calculado. Isto deve produzir a concentração recomendada biblioteca final entre 1,4-13:08. Para bibliotecas de c. glabrata , a gama de Ct estabelecida usando o isolado de c. glabrata ATCC foi entre 16-18 ciclos com um intervalo de concentração de biblioteca média de 300-500 pM. O volume correspondente de bibliotecas de DNA desnaturados em pool foi dentro da faixa de 60-65 µ l para uma escala de densidade do aglomerado entre 200-250 K/mm2.
Os arquivos de dados de sequência devem ser demultiplexed antes de uma análise mais aprofundada. Isto pode ser conseguido pela classificação em suas respectivas bibliotecas usando seus códigos de barra, depois de sequenciamento tem tido lugar. Um passo opcional de filtragem de qualidade dos arquivos de FASTQ pode ser realizado antes da análise de dados. As leituras de sequência dos isolados de WGS foram analisadas usando um fluxo de trabalho personalizado, criado em um pacote de software padrão. Isto permitiu que aparar de leituras de baixa qualidade e em seguida, mapeando a referência do genoma de Candida . O genoma de referência, CBS138, foi baixado de banco de dados do genoma de Candida (CGD) e vinculado ao fluxo de trabalho antes da análise. A presença de DNA se repete no genoma Candida (por exemplo, genes de adesina tem repetições de DNA) pode complicar o alinhamento de sequências curtas-leitura e chamando o SNP. Isso pode ser melhorado pelo realinhamento local adicional de sequências mapeadas. A saída do fluxo de trabalho foi uma lista de variantes estruturais que forneceu genes anotados com não-sinónimas e sinônimos SNP posições e cobertura. Isto foi usado para identificar SNPs em genes de interesse e preparar o relatório final de análise para os isolados (tabela 6).
Algumas limitações de nosso estudo e a abordagem devem ser reconhecidas. Nosso relatório baseia-se no pequeno número de isolados e não há nenhum banco de dados padrão resistome fúngica para micologia clínica. Apesar de sequenciamento de DNA de Sanger é atualmente mais acessível para laboratórios clínicos, tem uma capacidade limitada para detectar simultaneamente várias mutações genéticas que conferem resistência a drogas em Candida spp. (> 20 FKS mutações para echinocandin resistência sozinha). Com a consolidação dos serviços de patologia e diminuindo os custos de sequenciamento, a praticidade de usar WGS sobre Sanger sequenciamento, é provável que aumente. No entanto, uma consideração importante é a configuração de laboratório inicial e o custo de implementação do instrumento WGS, bem como treinamento dos usuários finais de pessoal de laboratório. Custos de longo prazo incluem essencialmente, aquisição de kits de reagentes de sequenciamento e acessórios. Custo adicional e um TAT superior devem ser esperado se o instrumento WGS não é interno. Além disso, a presença de repetição de sequências de ADN em genomas pode complicar o alinhamento de sequências curtas-leitura e chamando o SNP. A disponibilidade de referência de alta qualidade usando genomas sequenciados long-leitura tecnologias ajudarão a manter a qualidade da identificação do SNP.
No futuro, WGS é esperado para trazer melhorias em terapia clínica pelo monitoramento rápido tempo relatórios em configurações de diagnósticos que é facilmente acessível e interpretado por médicos de20,22. Isto pode ser conseguido com desenvolvimento de curadoria e actualizados WGS antifúngico resistência bancos de dados de romance e mutações confirmação para inferir a resistência antifúngica. Como mais genomas de leveduras clinicamente relevantes de sensibilidade ao fármaco fenotípicas conhecidos se tornam disponíveis para análise, novos marcadores e mecanismos de resistência a drogas antifúngicas são susceptíveis de ser descoberto. Estes desenvolvimentos reduzirá substancialmente os riscos de falhas de tratamento devido à resistência a drogas multi e toxicidade da droga. Em conclusão, o sequenciamento de próxima geração com protocolos de gestão de qualidade adequado permite detecção de todo o genoma de mutações que conferem resistência em Candida glabrata , que pode aumentar Testes fenotípicos em laboratórios de Micologia. Os insights fornecidos pelo sequenciamento do genoma rápida de clinicamente relevantes Candida spp fundamentalmente podem mudar nossa compreensão dos mecanismos de resistência para diferentes classes de agentes antifúngicos e melhorar a gestão dos pacientes com invasiva doenças fungosas.
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Disclosures
Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes e não há conflito de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo centro de doenças infecciosas e Microbiologia, saúde pública. Os autores não receberam qualquer outro financiamento para este estudo. Os autores Obrigado Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann e Ranjeeta Menon para seus conselhos de especialistas e assistência com o experimento de sequenciamento do genoma inteiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
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